KR101497276B1

KR101497276B1 - 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 및 척추디스크의 예방과 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR101497276B1
Application number: KR20140072599A
Authority: KR
Inventors: 장형석; 김상태
Original assignee: 장형석
Priority date: 2014-06-16
Filing date: 2014-06-16
Publication date: 2015-02-27

Abstract

본 발명은 생약재 추출물을 함유하는 관절염, 디스크 및 신경 염증의 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것으로서, 상기생, 속단, 독활, 당귀, 천궁, 부자, 현호색, 우슬 및 계지 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 및 척추디스크 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 생약추출물에 의해서 관절염 및 척추디스크 치료에 탁월한 효능을 가지므로 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 제제는 관절염 및 척추디스크 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 및 척추디스크의 예방과 치료용 약학조성물{A pharmaceutical composition comprising herbal extracts for prevention and treatment of arthritis and herniation of intervertebral discs}

본 발명은 생약 추출물을 함유하는 관절염 및 척추디스크의 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

골질환은 난치성 질환으로서, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염 등의 관절염과 추간판 탈출증, 척추관 협착증 등의 척추디스크 질환이 알려져 있다. 상기 질병들은 관절주변부의 염증으로 인한 파골세포의 이상증식, 활액세포의 비활성과 그로 인한 노화 및 자가면역에 의한 요인에 기인한 발병기전이 알려져 있다.

일반적으로 골질환은 조골세포의 사멸, 파골세포의 활성화로 생성하는 효소인 사이클로옥시젠에이스 Ⅱ(cyclooxygenase Ⅱ, COX-II)와 최근에 세균, 바이러스, 산화적 지방 및 요산에 의한 연골 및 관절내 조혈모세포가 이상반응을 나타내어 엔엘알피 3(NLRP 3)의 에이에스씨이 인플라마좀 (ASC inflammasome)의 활성화로 하부조절 영역인 케이스페이즈-1 (caspase-1), 아이엘-1비(IL-1b)와 아이엘-18 (IL-18)로부터 염증을 유발하는 엔에프카파비 (NFkB)가 활성화 된다고 University of Northe Carolina at Chapel Hill의 Jenny P-Y Ting 교수 연구팀이 발표하였다 (Nature Immunology 2011, 12(5):408).

이 경로는 미토콘드리아 활성화 산소종을 포함하고 AMP 활성화 단백질 카이네이즈와 유엔씨-51 유사 카이네즈-1(unc-51 like kinase-1 (ULK1), 자가포식 (autophagy) 신호전달의 연쇄반응을 포함하는데, NLRP 3의 ASC inflammasome 활성화에 기인한다고 알려져 있어서 따라서 NLRP 3의 발현을 억제 또는 저해하는 약물로부터 류마티스성과 퇴행성 관절염을 치료할 수 있다고 예측되어진다.

골관절염에 대한 치료방법은, 비스테로이드성 소염제 및 항류마티스 약제 등을 사용되고 있다. 골질환 관련 치료제로서 메토트레이트(MTX), 슬파사라진, 항말라리아 치료제, leflunomide, gold salt, bucillamine, 쎄레브렉스캡슐, 포스맥스정, azathioprine, cyclosporine, minocycline (류마티스 관절염 치료제시장 보고서 ; 범부처 신약개발사업단)등과 국내에서는 조인스정, 아크로펜정, 록스펜정, 셀틀리온의 레미케이트, SK의 트라스트, 태평양제약의 케토톱, 그리고 제일약품의 캐펜텍가 알려져 있다.

한편 항염증 작용의 약물개발에서 한걸음 더 나아가 관절연골보호, 연골분해방지 및 재생촉진에 관심을 두고 관절조직분해효소 저해제, 자유라디컬 소거제(SOD등 활성산소류 제거효소), 관절조직구성성분(Chondroitin, Glucosamine etc.)의 장기 복용에 의한 보호 요법(conservation therapy) 등에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Badger, A.M., Cook, M.N., et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 290, pp 587-593, 1999).

그러나 골질환 치료를 목적으로 사용하는 화학요법, 수술요법, 줄기세포 이식요법, 유전자 치료법 등은 아직 완벽한 성과를 거두지 못한 형편이다. 즉, 상기 요법들은 통증을 완화하고 염증을 억제하여 관절기능 소실을 지연하지만, 여러 장기의 기능저하, 우울증, 세균감염 등의 심각한 부작용이 초래하고 있다. 대표적 골관절 질환중 하나인 퇴행성 관절염은 항염증제 위주의 약물로는 완치가 어렵고, 또한 고령 환자일수록 소화장애, 위장관 장애 및 신장기능 감소 등과 같은 전신적인 부작용의 빈도가 높아서, 장기간에 전신 치료는 무리가 따르고 있다.

따라서 인구의 노령화에 비례하여 증가하는 퇴행성 관절염에 항염증작용 등의 대증요법적 접근보다는 좀더 적극적인 증상의 호전 및 예방을 위한 항염, 연골의 보호 및 재생효과를 목표로 한 신약의 개발이 그 어느 때보다 편리하고 부작용이 적으며 안전성이 확보된 관절염 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

본 발명자들은 수천년 동안 한국, 중국 및 일본 등의 동양권에서는 임상적 효능이 검증된 상기 질환 치료제의 처방을 토대로 생약재를 선별하고 보다 엄밀한 기초 연구을 통해 그 기전을 규명하고자 하였다.

본 발명에 따른 생약들은 한의서인 동의보감에 의하면 지혈, 치한(治寒), 평보제(平補劑), 치통, 격기(膈氣), 신경통, 자통(刺痛), 요통(腰痛), 자궁수축작용, 부인 산후 제증, 동상, 동맥경화, 소염기능, 장골성장기능, 중풍 치유, 활막염증 제거, 비만억제, 호로몬 분비인자, 혈당강하작용, 에스트로젠 분비촉진기능, 인슬린 유사성장인자 분비, 조직재생인자, 골길이 성장인자, 치조골 골수 유래 성체줄기세포의 골아세포 분화유도제, 피부재생, 항산화작용, 탈모방지작용, 해열작용, 진통작용, 진경작용, 소염작용, 혈액응고 촉진작용, 강심작용, 강압작용, 혈허위황, 현운심계, 월경불조, 폐경, 경통, 허한복통, 장조변비, 풍습비통, 타박손상, 옹저창양, 빈혈, 두통, 보혈강장 조혈, 골수형성, 보신, 보양, 산전후 관절, 요통, 건위, 소염, 활혈거습, 거풍, 해독, 지혈, 갱년기 장애, 통경, 자양, 보혈기능등 다양한 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

상기생(Loranthus yadoriki)은 참나무, 물오리나무, 밤나무, 팽나무 등에 기생하고 산의 나무에 해를 주지만 약용으로 쓰는데, 한방에서 줄기와 잎을 지혈, 치한(治寒), 평보제(平補劑), 치통, 격기(膈氣), 신경통, 자통(刺痛), 요통(腰痛), 자궁수축작용, 부인 산후 제증, 동상, 동맥경화에 사용하였고, 백등은 파골세포의 분화 흡수에 미치는 영향을 보고하였으며 (상기생 추출물이 파골세포 분화와 골흡수 억제에 미치는 효과.동의생리병리학회지 2013. 27권.4호,431-436), Osadebe등은 고혈압, 당뇨, 면역증강에 효능이 있다고 보고하였다(Journal of Ethnopharmacology, vol. 126, no. 2, pp. 287293, 2009, Fitoterapia, vol. 86, pp. 7883, 2013). 또한 상기생은 Linamarin gallate, Walsuraside B, Epicatechin, Catechin, Epicatechin 3-O-gallate성분이 포함하는 것으로 보고하였다 (Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.2013, 273712, p9).

속단 (Phlomis umbrosa)은 소염기능, 장골성장기능, 중풍 치유, 활막염증 제거, 비만억제, 호로몬 분비인자, 혈당강하작용, 에스트로젠 분비촉진기능, 인슬린 유사성장인자 분비, 조직재생인자, 골길이 성장인자, 치조골 골수 유래 성체줄기세포의 골아세포 분화유도제, 피부재생, 항산화작용, 탈모방지 작용 등이 알려져 있다. 백등은 천속단의 파골세포 분화에 미치는 영향에 대해 보고하였다 (천속단의 파골세포 분화에 미치는 영향, 대한체질인류학회 26권3호. 2013. 115-123).

독활 (Aralia contientalis)은 두릅나무과 (Araliaceae)에 속하는 다년생초본으로 줄기 곳곳에 짧은 털이 나 있다. 꽃은 연한 초록색으로, 암꽃과 수꽃이 따로 한 그루에 피는데, 7~8월에 가지 끝에 산형(傘形) 꽃차례로 핀다. 열매는 장과 (漿果)로 10월에 검은색으로 익는다. 흔히 약으로 쓰기 위해 심기도 하는데, 한방에서 독활은 봄과 가을에 뿌리줄기 및 뿌리를 캐서 겉껍질을 벗겨 햇볕에 말린 것으로 편두통 치료에 쓰인다. 맛은 맵고 성질은 따뜻하며 무독하며, 해열작용, 진통작용, 진경작용, 소염작용, 혈액응고 촉진작용, 강심작용, 강압작용 등의 효능이 있다. 민간에서는 전초를 해열제, 이뇨제 및 진통제로 사용한다. 약으로는 뿌리를 사용하는데 거풍제습, 통비지통의 효능이 있어 비증, 신경통, 두통, 중풍 후유증 등의처방에 사용한다. 뿌리에는 정유 (essential oil)가 함유되어 있고, 정유 중에는 엔젤리콘(Angelicon), 엔젤롤(Angelol), 베르가프텐(Bergapten), 엔젤리콜(Angelical), 소랄렌(Psoralen), 비아캉겔리신(Byakangelicin), 등의 쿠마린.리모넨 (limonen), 사비넨(sabnene), 알파-피넨 (α-pinene), 감마-테르피넨 (γ-terpinene), 미르센 (myrcene), 휴물렌 (humulene, α-caryophyllene), 알파-코페인 (α-copaene), 테르피넨-4-올 (terpinene-4-ol)이 함유되어 있다 (정보섭 및 신민교저, 도해향약 대사전, 영림사, p435, 1998). 윤등은 독활의 관절염치료효과를 보고하였다(Type Ⅱ Collagen으로 유도된 관절염에 대한 羌活, 獨活 배합약물의 억제 효과.대한한의학 방제학회지 21권 1호, 161-176).

당귀 (Angelica gigas nakai)는 근두 및 주근이 거칠고, 상단에 싹의 흔적이 있으며, 줄기밑 부분이나 엽병밑 부분, 뿌리 및 주근 하부에 십여개의 잔뿌리가 있다. 당귀는 꼬리 부분이 위가 굵고 아래가 가늘며 많이 꼬여 있다. 표면에 작은 뭉텅이 모양의 수염뿌리 흔적이 있다. 휘발성 유지는 산성성분인 2% 팔미트산, 프탈산무수물, 페놀성은 10% 카르바크롤, 중성은 88% 2개 시스퀴털펜스, n-부텐 프탈라이드, 안젤리콘이고 수용성은 페룰산, 안젤리카폴리사카타이드, 스티그마스테롤-D-글루코사이드등 콜산염, 17가지 아미노산 23가지 무기원소로 구성하고 있다. 약리작용으로 항혈전, 보혈, 간을 강하게 하고, 폐를 보하고 혈전의 형성을 늦추고, 헤모글로빈 및 적혈구의 생성을 촉진한다. 만성간병에서 간의 섬유화를 늦추고, 간세포 기능의 회복을 촉진한다. 폐의 통기 기능을 개선하고, 체력을 보강한다. 면역 능력을 높이고, 항암 역할을 하며, 항염 항균 역할을 갖고 있다. 페룰산 나트륨과 안젤리카 폴리사카라이드는 대식세포의 식균 능력을 높여준다. 임파세포의 전화를 촉진한다. 종양 치료, 특히 부인과 종양에 사용된다. 당귀 추출물은 혈관 투과성과 혈소판 억제 중에서 염증성 효과는 아스피린과 비슷하다. 금황색 포도당구균, 녹농간균 및 대장간균을 억제한다. 페놀산은 항지질과산화 작용을 갖고 있고, 라디칼을 직접 제거할 수 있다. 달고 매운 맛을 갖고 있고, 약성은 온화하다, 혈을 보하고, 혈액 순환을 촉진한다. 윤장통변의 효과를 갖고 있고, 혈허위황, 현운심계, 월경불조, 폐경, 경통, 허한복통, 장조변비, 풍습비통, 타박손상, 옹저창양에 사용된다. 술에 담근 당귀는 활혈통경에 사용되고, 폐경과 통경을 치료한다(박종희 등, 상용약용 식물도감, 2000; 중약본초학, 1998), 강등은 독활이 염증원인인 NOS억제 효과 (독활추출물의 Nitric Oxide Synthesis 저해효과. 2012, 한국식품과학회지 44권 5호, 621 - 627) 보고하였다.

천궁은 미나리과(Umbelliferae) 속 식물로서, 그 종류로는 한국자생의 천궁(Cnidium officinale MAKINO), 야생품인 토천궁(Ligusticum wallichii FRANCH var. officinale YOOK), 일본 천궁(Angelicagenuflexa MUTT) 및 중국 천궁(Ligusticum chuaxiong HORT)의 근경을 일컫는 것으로서, 예로부터 당귀와 더 불어 산부인과의 요약으로 빈혈, 두통, 보혈강장 등 각종 처방에 배합되어 왔다(박종희 등, 상용약용식물도감, 2000; 중약본초학, 1998). 미나리과(Umbelliferae)에 속하는 다년생 초본으로, 오랫동안 인체 안전성이 입증된 약재이다. 황등은 족삼리(足三里)에 염증을 유발하여 천궁(川芎)효과를 보고하였으며(천궁약침(藥鍼)이 Collagen-induced Arthritis에 미치는 영향, 2007 대한침구학회, 24권 4호. 81-97), 남은 천궁 추출물을 포함하는 항염증제를 보고하였고(대한민국 특허출원 제10-2004-0106174호), 소시에떼는 골 성장의 촉진 및 골 건강의 유지용 조성물(대한민국 특허출원 제10-2004-7008341호), 바이로메드는 연골 재생, 통증 억제 및 부종 억제용 생약조성물(대한민국 특허출원 제10-2010-7028847호)을 보고하였다.

본 발명자들은 상기생, 속단 , 독활 , 당귀, 천궁을 구성성분으로 하고 부자, 현호색, 우슬, 계지, 부자를 보조약으로 만성관절염, 염증치료제로서의 용도를 연구한 끝에 상기 생약제의 복합 추출물에서 염증수반 면역사이토카인의 과발현이 억제 및 말초신경과 척추신경으로 연결된 신경계통의 염증 및 통증억제등의 효과를 확인하고, 이와 관련하여 관절염 및 척추질환 치료 및 예방용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절염 및 척추디스크의 예방과 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기생(Loranthus yadoriki), 속단(Phlomis umbrosa), 독활(Aralia contientalis) , 당귀(Angelica gigas nakai), 천궁(Cnidium officinale), 부자(Aconitum carmichaeli), 현호색(Corydalis terna), 우슬(Achyranthes japonica) 및 계지(Cinnamomum cassia)의 생약추출물을 제공한다.

본 발명에 사용되는 상기생, 속단 , 독활 , 당귀, 천궁, 부자, 현호색, 우슬, 계지는 물로 추출하는 것이 좋으며, 상기 생약을 각각 추출하여 혼합하거나 이들을 혼합하여 추출할 수 있다.

또한, 상기 본 발명에 따른 상기생 : 속단 : 독활 : 당귀 : 천궁 : 부자 : 현호색 : 우슬 : 계지는 1:1:1:1:1:1:1:1:1 중량비로 혼합된다.

또한, 본 발명에 따른 생약 추출물은 관절염 및 척추디스크의 예방과 치료효능을 가지는 기존에 이미 약제로 사용되고 있는 메토트레이트(MTX), 슬파사라진, 항말라리아 치료제(chloroquine), 레플루노미드(leflunomide), 블씰라민(bucillamine), COX-2의 선택적 비스트레로이드 함염증제인 쎄레브렉스(Celecoxib), 포스맥스정(Fosamax, alendronate), 아자치오프린(azathioprine), 싸이클로스포린(cyclosporine A) 미노싸이클린(Minocycline) 등과 같은 약물과 병용하여 사용될 수도 있다.

본 발명에 따른 생약추출물을 함유하는 관절염 및 척추디스크 예방 및 치료용 생약조성물은 경구용 제제로서 예를들면 정제, 환제, 산제, 과립제, 시럽제, 액제, 현탁제, 에멀션 또는 캅셀제의 형태로 투여할 수 있으며, 비경구용 제제로는 주사제, 직장용 제제, 경피용 제제의 형태로 투여할 수 있다. 비경구용 제제의 투여방법으로는 정맥내, 피하근육내, 복강내 등의 경로로 투여될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 유효성분인 생약추출물을 일반적으로 허용되는 부형제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 용해제, 보존제, 안정제, 완충제, 코팅제 등과 혼합하여 원하는 투여형태로 만들 수 있다.

본 발명의 생약추출물을 함유하는 관절염 및 척추디스크 예방 및 치료용 생약조성물을 정상인(표준 체중 60kg)을 기준으로 0.1mg 내지 500mg 투여범위 내에서 1일 1회 내지 3회 나누어 투여할 수 있는 약학조성물로 제공될 수 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니며 환자의 연령, 질병의 정도, 치료유형 등에 따라 조절할 수 있다.

본 발명에 따른 생약추출물은 관절염 및 척추디스크의 치료에 탁월한 효능을 가지는 것으로서, 상기 생약추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 제제는, 관절염 및 척추디스크 질환의 예방과 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 실험예 1에서 a)에 관절염의 draining lymph node (DLN)와 b)에 paw joint의 총세포수를 측정하여 막대그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 실험예 2에서 a)에 혈청내 NLRP3 생성량을 분석한 결과, b)에 TNF-α생성량, c) 총 IgM를 분석한 결과를 막대그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 골관절 질환에서 대표적인 만성/퇴행성 관절염의 유발부위인 관절에서의 관절 형태적(a), 흰쥐의 염증 유발시 습관절 소주골 주변(b,상)과, 경골 주변의 조직해부학적 소견에 관하여 연골조직의 파괴정도를 H/E 조직염색으로 관찰한 것이다(b, 하).
도 4는 실험예 4에서 흰쥐의 족삼리에 ADJ/zymosan을 투여후 족삼리 주변 관절 부종양상(a)과 병리적 부종크기(b)를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 5에서 흰쥐의 족삼리에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리하여 관절염의 병변에 발현된 miRNA155와 염증인자 NFkB 단백질 발현을 공초점현미경으로 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 6에서 흰쥐의 족삼리에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리하여 관절염의 병변에 발현된 miRNA155와 초기 염증인자 단백질 발현을 공초점현미경으로 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 7에서 흰쥐의 족삼리에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리하여 관절염의 병변에 발현된 초기 염증인자 단백질 발현에 기인한 하부단계인 사이토카인인 IL-18발현을 공초점현미경으로 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 8은 실험예 8에서 흰쥐의 족삼리에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리한 다음 혈액내의 혈장으로부터 유세포분석기로 분석한 염증(a)과 퇴행성질환에 관여하는 초기 염증단백질 NLRP3과 miRNA155 발현 양상을 나타낸 그림이다(b).
도 9는 실험예 9에서 흰쥐의 족삼리에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리한다음 혈액내의 혈장으로부터 분리한 mRNA으로부터 실시간 유전자증폭 연쇄반응 (qPCR)으로 분석한 염증단백질과 사이토카인종류별 발현 양상을 나타낸 그래프이다 .
도 10은 실험예 10에서 흰쥐의 족삼리에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리한 다음 혈액내의 혈장으로부터 분리한 mRNA으로부터 실시간 유전자증폭 연쇄반응 (qPCR)으로 초기 염증에 기인한 염증단백질 NLRP3과 miRNA종류별 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 11에서 흰쥐의 족삼리에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리한 다음 혈액내의 혈장의 면역세포들의 염증단백질과 miRNA 발현을 confocal로 형광이미지를 나타낸 것이다.
도 12는 실험예 12에서 흰쥐의 족삼리에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리한 다음 혈액내의 혈장의 면역세포의 miRNA144와 miRNA155발현을 confocal로 형광이미지를 나타낸 것이다.
도 13은 실험예 13에서 흰쥐의 족삼리에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리한 다음 혈액내의 혈장의 면역세포내 발현되는 단백질 발현 양상을 WESTERN BLOT으로 나타낸 밴드그림이다.
도 14는 실험예 14에서 흰쥐의 척추 관절 주변에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리한 다음 척추의 조직 해부학적으로 miRNA200와 NLRP3발현을 confocal로 형광이미지를 나타낸 것이다.
도 15는 실험예 15에서 흰쥐의 척추관절주변에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리한 다음 척추의 조직해부학적으로 miRNA155와 NLRP3 발현을 confocal로 형광이미지를 나타낸 것이다.
도 16은 실험예 16에서 족삼리에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리한 다음 흰쥐의 척추 관절 하부와 족삼리상부상의 말초신경 주변에서 척추의 조직 해부학적으로 GFAP와 NLRP3 발현을 confocal로 형광이미지를 나타낸 것이다.
도 17은 실험예 17에서 흰쥐의 척추 관절 주변에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리한 다음 척추의 조직 해부학적으로 miRNA106b와 NLRP3발현을 confocal로 형광이미지를 나타낸 것이다.
도 18은 실험예 18에서 족삼리에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리한 다음 흰쥐의 척추 관절 하부의 DRG 영역에서 GFAP와 NLRP3 발현을 confocal로 형광이미지를 나타낸 것이다.
도 19는 실험예 19에서 족삼리에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리한 다음 흰쥐의 척추 관절 하부와 족삼리상부상의 말초신경 주변에서 척추의 조직해부학적으로 miRNA144와 miRNA155 발현을 confocal로 형광이미지를 나타낸 것이다.
도 20은 실험예 20에서 족삼리에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리한 다음 흰쥐의 척추관절 주변부의 척추신경영역에서 miRNA200a(a)과 miRNA155와 NLRP3 발현(b)을 confocal로 형광이미지를 나타낸 것이다.
도 21은 실험예 21에서 족삼리에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리한 다음 흰쥐의 척추 관절 하부의 DRG영역에서 miRNA144와 miRNA155 발현을 confocal로 형광이미지를 나타낸 것이다.
도 22는 실험예 22에서 족삼리에 ADJ/zymosan을 투여후 실시예 1의 물추출물을 250㎍/ml이 되게 2주간 경구투여 처리한 다음 흰쥐의 DRG주변 신경부에서 miRNA155와 NLRP3발현을 confocal로 형광이미지를 나타낸 것이다.

다음에 실험예 및 실시예로서 본 발명을 더욱 상세히 기재하며, 이들이 이 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1> 본 발명에 따른 생약추출물의 제조

상기생, 속단 , 독활 , 당귀, 천궁, 부자, 현호색, 우슬, 계지를 각각 2kg씩 혼합하여 증류수 5,000ml를 가하여 수욕상에서 8시간마다 4회씩 추출후 여과하여 농축기로 용매를 증발시켜서 혼합엑스 약 750g을 얻었다. 이 엑스를 동결건조기로 12시간 동안 동결 건조하여 분말화하여 건조분말(이하 물 추출물인 discergine이라 한다) 약 250g을 획득하였다.

<비교예 1 내지 9> 본 발명에 따른 생약재 각각의 추출물의 제조

상기생, 속단 , 독활 , 당귀, 천궁, 부자, 현호색, 우슬, 계지 각각을 2kg씩 증류수 5,000ml를 가하여 수욕상에서 8시간마다 4회씩 추출후 여과하여 농축기로 용매를 증발시켜서 각각 생약 엑스 약75g을 얻었다. 이 엑스를 동결건조기로 12시간 동안 동결 건조하여 분말화하여 건조분말 약 25g을 획득하였다. 이들 생약제 추출물(건조분말)을 각각 비교예 1 내지 9로 하였다.

<실험예 1> 관절염의 draining lymph node (DLN)와 paw joint의 총세포수 측정

ADj/zymosan으로 처리한 흰쥐(대조군)에 4주간 methotrexate(MTX, 3mg/kg), 본 발명에 따른 실시예 1 및 비교예 1 내지 9에서 제조된 추출물을 각각 처리하여 실험을 종료하고, 실험동물을 ethyl ether로 마취시킨 후 흰쥐에서 draining lymph node (DLN), paw joint를 각각 적출하여 100 mesh로 세포를 분리하여 D-PBS로 5분간 원심분리 (1700 rpm) 하여 2회 세척한 후 cell strainer (FALCON)에 통과시켜 세포 이외의 분해되지 않은 조직이나 불순물을 제거하였다. 그리고 관절은 잘게 chopping 한 후 collagenase 1 mg/ml (in 2% FBS+RPMI 1640)을 넣고 37℃ shaker (180rpm, 20min.) 배양기에서 배양한 후 상층액을 회수하는 방법으로 4회 반복하였다. 이것을 flow cytometer의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 백분율 (%)로 분석한 후 총세포수를 적용하여 각 조직에서의 절대 세포 수 (absolute number)를 산출하였다. thymus, draining lymph node (DLN), paw joint를 각각 적출하여 100 mesh로 세포를 분리하여 D-PBS로 5분간 원심분리 (1700 rpm)하여 2회 세척한 후 cell strainer에 통과시켜 세포 이외의 분해되지 않은 조직이나 불순물을 제거하였다. 그리고 관절은 잘게 chopping한 후 collagenase 1mg/ml (in 2% FBS+RPMI 1640)을 넣고 37℃ shaker (180 rpm, 20 min.) 배양기에서 배양한 후 상층액을 회수하는 방법으로 4회 반복하였다. flow cytometer의 cell quest 프로그램을 이용하여 백분율(%)로 분석한 후 총세포수를 적용하여 draining lymph node (DLN), paw joint에서의 절대세포 수 (absolute number)를 산출하여 도 1에 나타내었다.

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1 및 비교예 1 내지 9는 draining lymph node (DLN)에서는 저농도에서도 유의성 있게 감소하였으며 Paw joint에서는 정상군은 9±1.1% (x10⁶), 대조군은 23±6% (x10⁶), MTX는 9±3% (x10⁶), 비교예 1 내지 9 및 실시예 1 처리순으로 10±3% (x10⁶), 11±1% (x10⁶), 10±8% (x10⁶), 10±1% (x10⁶), 11±7% (x10⁶), 10±4% (x10⁶), 10±1% (x10⁶), 11±3% (x10⁶), 10±4% (x10⁶), 9.5±4% (x10⁶)각각 나타나 본 발명에 따른 실시예 1 및 비교예 1 내지 9에서 대조군에 비해 유의성 있게 감소되었다 (p<0.001).

<실험예 2> 혈청 내 사이토카인 및 rheumatoid factor (RF) 분석

ADj/zymosan으로 처리한 흰쥐(대조군)에 4주간 methotrexate(MTX, 3mg/kg), 본 발명에 따른 실시예 1 및 비교예 1 내지 9에서 제조된 추출물을 각각 처리하여 4주간 index 값을 측정 후 ethyl ether로 마취하여 심장 천자법으로 혈액을 채혈한 후 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청에서 NLRP3, TNF-α 그리고 RF인 총 IgM 농도 측정은 CIA 실험 종료 후에 enzyme-linked immuno-sorbent assay (ELISA, Endogen, U.S.A)로 생성량을 측정하였다. 각 well에 흰쥐의 혈청 100 ㎕(1/100dilution)씩 분주하고, 1시간 동안 실온에서 방치 한 후 2회 washing 완충 용액으로 세척한 다음 antibody Avidin-HRP conjugeted 100 ㎕를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. TMB 기질을 100 ㎕씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 후 50 ㎕의 stop 용액을 처리하고, ELISA reader 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 알 수 있는 바와 같이, a)에서 혈청내 NLRP3 생성량을 분석한 결과 정상군은 25±8(pg/ml), 대조군은 450±32(pg/ml), MTX는 52±10(pg/ml), 비교예 1 내지 9 및 실시예 1 처리순으로 180±12(pg/ml), 178±21(pg/ml), 121±23(pg/ml), 100±21(pg/ml), 54±4(pg/ml), 156±24(pg/ml), 210±34(pg/ml), 231±23(pg/ml), 240±14(pg/ml), 89.5±14(pg/ml)으로 각각 나타나 본 발명에 따른 실시예 1 및 비교예 1 내지 9에서 대조군에 비해 유의성 있게 감소되었다 (p<0.001).

b)에서 TNF-α생성량은 정상군은 8±1(pg/ml), 대조군은 60±12(pg/ml), MTX는 19±5(pg/ml), 비교예 1 내지 9 및 실시예 1 처리순으로 30±2(pg/ml), 48±1(pg/ml), 21±3(pg/ml), 20±1(pg/ml), 34±4(pg/ml), 32±4(pg/ml), 20±4(pg/ml), 31±2(pg/ml), 50±4(pg/ml), 18±4(pg/ml)으로 각각 나타나 본 발명에 따른 실시예 1 및 비교예 1 내지 9에서 대조군에 비해 유의성 있게 감소되었다 (p<0.001).

그리고 c)에서 RF인 총 IgM경우 정상군은 10±1(pg/ml), 대조군은 21±2(pg/ml), MTX는 10±2(pg/ml), 비교예 1 내지 9 및 실시예 1 처리순으로 12±2(pg/ml), 17±1(pg/ml), 12±3(pg/ml), 14±1(pg/ml), 9±4(pg/ml), 10±4(pg/ml), 13±4(pg/ml), 21±2(pg/ml), 11±2(pg/ml), 9±1(pg/ml)으로 각각 나타나 본 발명에 따른 실시예 1 및 비교예 1 내지 9에서 대조군에 비해 유의성 있게 감소되었다 (p<0.001).

따라서 이러한 결과를 유추해 볼 때, ADj/zymosan으로 처리한 관절염 유도흰쥐로부터 염증에 대한 억제효과와 면역변화의 완화가 조직 형태학적으로 변화를 분석하므로 본 발명의 생약추출물로 투여할 경우 염증에 관한 골조직과 신경조직의 변화가 유의성 있는지 분석할 필요가 있다고 사료된다.

<실험예 3> 연골조직의 형태학적 변화

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물을 경구투여하여 관절부위에 존재하는 연골의 마모상태 내지 연골조직, 연골세포의 파괴정도, 골소주의 파괴정도를 확인하기 위한 실험이다.

상기 실험예 1의 정상군, 대조군, 본 발명에 따른 실시예 1에 대하여 hematoxylin/eosin 염색을 통해 위상차 현미경 100 배율로 관찰한 후 사진 촬영하여 도 3에 나타내었으며, 정상군의 골관절부위의 골소주와 소주골의 길이가 촘촘하게 배열된 상태인 반면(도 3b 좌측) 대조군은 골소주의 파괴가 강하게 나타내었고(도 3b 중간), 본 발명에 따른 실시예 1은 골소주의 길이가 정상군에 미치지 않았지만 점점 길이가 회복되는 경향을 보였다(도 3b 우측).

<실험예 4> 관절염의 부종억제 효과

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물이 가지는 부종 억제효과를 관찰하기 위한 실험이다.

체중 200g 이내의 흰쥐를 실험군당 6마리를 대상으로 부종을 유도하기 위해 zymosan-A(20 mg/ml/kg) 0.5ml과 Freund's Adjuvant 0.5ml을 혼합하여 좌,우측 족삼리에 주사한 후 부종의 진행상태를 30일간 관찰하여 최종 30일 후에 부종양상을 촬영하였다.

또한 실시예 1의 물추출물을 약 25mg/kg이 되게 인산완충액 (PBS; Phosphate-buffered saline)으로 녹여 조제한 후 흰쥐 체중 1kg당 1ml씩 1일 1회 30일간 경구 투여하여 부종 억제여부를 조사하였다. 동물군은 정상군, 부종을 유도한 실험군인 대조군, 실시예 1 투여군 약 25mg/kg으로 나누어 수행하였다. 관찰된 결과는 부종은 4일부터 유도되었으며 최고정점에 도달하는데는 약 30일정도 경과하였으며 30일 경과할 때까지를 본 연구 기간으로 설정하여 추출물의 부종 억제효과를 관찰하였다. 측정된 결과는 정밀한 게이지를 사용하여 부종 크기를 조사하였다(도 4).

그 결과 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 정상군의 족삼리 부근의 부종은 전무한 반면(도 4a의 좌측) 대조군은 약 3.5cm이였으며(도 4a의 중간), 본 발명에 따른 실시예 1은 부종크기가 약 0.5cm으로 크게 감소하였다(도 4a 우측, 도 4b 우측).

<실험예 5> 미세환경 유도인자 확인 실험(1)

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물을 경구투여하여 관절부위에 존재하는 연골의 마모상태 내지 연골조직세포의 파괴와 골소주의 파괴를 야기하는 미세환경을 유도하는 인자를 확인하기 위한 실험이다.

miRNA-155/QD525와 NLRP3/QD565형광염색을 통해 공초점현미경 (LSM710, 칼자이즈,독일)으로 현미경렌즈 10X 배율로 관찰한 결과 정상군은 miRNA-155/QD525와 NLRP3/QD565형광염색의 발현이 아주 약하게 발현되었고, ADj/zymosan처리 대조군은 miRNA-155/QD525에 의한 강하게 녹색형광을, NLRP3/QD565은 적색형광이 강하게 나타내었으나, 실시예 1의 discergine 투여군은 miRNA-155/QD525에 의한 약한 녹색 형광을, NLRP3/QD565은 적색형광도 약하게 발현이 감소하였다(도 5).

이는 본 발명에 따른 실시예 1의 투여에 의해 골조직 세포의 파괴와 골소주의 파괴로부터 골소주 재생에 의해 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다.

<실험예 6> 미세환경 유도인자 확인 실험(2)

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물을 경구 투여하여 관절부위에 존재하는 연골의 마모상태 내지 연골 조직세포의 파괴와 골소주의 파괴를 야기하는 미세환경을 유도하는 인자를 확인하기 위한 실험이다.

정상군은 초기염증의 NLRP3하부 신호전달물질인 IL-18/QD525에 대해서 거의 녹색 형광이 나타나지 않았으며 NLRP3/QD565은 적색형광이 거의 나타 내지 않았으나 대조군은 강하게 형광을 나타내었고, 본 발명에 따른 실시예 1은 IL-18/QD525에 대해서 거의 녹색형광이 약하게 나타내었으나 NLRP3/QD565은 적색 형광이 거의 감소하였다(도 6).

이는 본 발명에 따른 실시예 1의 투여에 의해 골조직세포의 파괴와 골소주의 파괴를 야기하는 미세환경을 유도하는 인자로부터 골조직세포의 파괴와 골소주의 파괴를 억제하거나 재생에 의해 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다.

<실험예 7> 혈장내 염증반응물질의 억제효과

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물 투여로 골관절에 ADj/zymosan염증매개인자에 의한 염증반응에 관여하는 면역세포와 염증물질에 대하여 흰쥐를 실험 종결후, 마취후 복개후 심장으로부터 혈액을 취해서 원심분리기로 약 15분간 4,500RPM으로 원심분리를 수행하여 이를 인산완충액 1ml로 2번 세척후 이를 NLRP3/QD525, miRNA-155/QD565, miRNA-144/QD565을 투여하여 혼합하여 4℃에서 반응시킨 후 유세포분석기로 (Deckton Dickinson, USA)분석하였다.

그 결과 면역세포표면에 존재하는 NLRP3/QD525와 miRNA-155/QD565을 혼합한 것에서 정상군은 NLRP3/QD525는 거의 발현되지 않은 반면 miRNA-155/QD565는 약 5%정도 발현하였으며 대조군은 NLRP3/QD525는 약 35%가 발현되었고 miRNA-155/QD565는 약 18%정도가 발현되었으나 본 발명에 따른 실시예 1은 NLRP3/QD525는 약 9%정도 발현되었고 miRNA-155/QD565는 약 7.5%정도였다(도 7a).

또한 NLRP3/QD525과 miRNA-144/QD565을 혼합한 것에서 정상군은 NLRP3/QD525는 거의 발현되지 않은 반면 miRNA-144/QD565는 약 15% 정도 발현하였으며 대조군은 NLRP3/QD525는 약 35%가 발현되었고 miRNA-144/QD565는 약 3% 정도가 발현되었으나 본 발명에 따른 실시예 1은 NLRP3/QD525는 약 7% 정도 발현되었고 miRNA-155/QD565는 약 9% 정도였다(도 7b).

이는 본 발명에 따른 실시예 1의 투여에 의해 골조직 세포의 파괴와 골소주의 파괴를 야기하는 염증인자가 골조직의 미세 환경에 염증을 유도하여 골조직의 파괴로부터 연골과 골소주의 파괴를 억제하거나 재생에 의해 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다.

<실험예 8> 관절 골조직내 염증인자 확인 실험

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물을 경구투여하여 관절부위에 존재하는 연골의 마모상태 내지 관절 골조직의 파괴와 골소주의 파괴를 야기하는 미세 환경을 유도하는 염증인자를 확인하기 위한 실험이다.

miRNA-155/QD525와 NFkB/QD565형광염색을 통해 공초점 현미경 (LSM710, 칼자이즈,독일)으로 현미경 렌즈 10X 배율로 관찰한 결과 정상군은 miRNA-155/QD525와 NFkB/QD565 형광염색의 발현이 아주 약하게 발현되었으나, 대조군은 miRNA-155/QD525와 NFkB/QD565에 의한 강하게 녹색 형광과 적색 형광을 강하게 나타내었으나, 본 발명에 따른 실시예 1은 miRNA-155/QD525에 의한 약한 녹색 형광을, NFkB/QD565 적색 형광도 거의 발현되지 않았다(도 8).

이는 본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물 투여에 의해 골조직세포의 파괴와 골소주의 파괴를 야기하는 염증인자의 단백질발현으로부터 야기된 골조직의 염증과 골조직의 파괴로부터 억제하거나 골조직 재생에 의해 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다.

<실험예 9> 염증매개인자의 유전자 전사체 발현실험

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물을 골관절에 염증반응에 관여하는 면역세포와 염증물질의 유전자전사체에 대하여 흰쥐를 실험 종결후, 마취하여 복개후 심장으로부터 혈액을 취해서 원심분리기로 약 15분간 4,500RPM으로 원심분리를 수행하여 이를 인산완충액 1ml으로 2번 세척 후 이를 혈장 200μl을 EP tube에 분리하고 Trizol 용액 1ml와 혼합하여 이를 혼합 후 상하로 흔들어 준 다음 클로로포롬 200l을 첨가하여 상등액과 불용층으로 분리하고 원심분리기로 액 15000rpm으로 원심분리하여 상등액을 취하여 이를 이소프로파놀 동량을 첨가하여 침전시켰다. 침전물을 DEPC-dw로 50μl을 넣고 녹인 다음 nanodrop으로 정량화 하였다. 모두 260/280nm에서 약 1.8이었다. 이를 one stop qRT-PCR kit (바이오니아, 한국)로 사용하여 real-time PCR 머신(APPLIED BIOSYSTEM, USA)으로 합성하였다. 분석하기 위한 표적 mRNA는 NLRP3, NFkB, IL-1b, IL-18을 위해 프라이머를 디자인하여 바이오니아에서 합성하여 수행하였다.

분석결과 정상군은 NLRP3, NFkB, IL-1b, IL-18 경우 각각 약 5±0.5, 3±0.5, 2.5±0.5, 1.5±0.5이었고, 대조군은 각각 약 876±122, 168±25, 352±32, 424±34이었으나 본 발명에 따른 실시예 1은 각각 약 24±4, 18±3, 42±6, 78±11 c/t값 이었다(도 9).

이는 본 발명에 따른 실시예 1의 투여에 의해 골조직세포의 파괴와 골소주의 파괴를 야기하는 염증인자의 유전자 전사체 발현으로부터 골조직의 염증과 골조직의 파괴로부터 억제하거나 골조직 재생에 의해 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다.

<실험예 10> 염증인자와 소형 유전자전사체 발현에 미치는 영향

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물이 골관절에 염증반응에 관여하는 면역세포과 염증물질에 조절하는 소형 유전자 전사체를 확인하기 위하여 흰쥐를 실험 종결후, 마취하여 복개한 다음 심장으로부터 혈액을 취해서 원심분리기로 약 15분간 4,500RPM으로 원심분리를 수행하여 이를 인산완충액 1ml로 2번 세척 후 이를 혈장 200μl을 EP tube에 분리하고 Trizol용액 1ml와 혼합하여 이를 혼합 후 상하로 흔들어 준다음 클로로포롬 200μl을 첨가하여 상등액과 불용층으로 분리하고 원심분리기로 액 15,000rpm으로 원심 분리하여 상등액을 취하여 이를 이소프로파놀 동량을 첨가하여 침전시켰다. 침전물을 DEPC-dw로 50μl을 넣고 녹인 다음 nanodrop으로 정량화 하였다. 모두 260/280nm에서 약 1.8이었다. 이를 one stop qRT-PCR kit (바이오니아, 한국)로 사용하여 real-time PCR 머신(APPLIED BIOSYSTEM, USA)으로 합성하였다. 분석하기 위한 표적 mRNA에 대한 Ct값의 fold값은 염증에 대한 NLRP3, NFkB, miR-155, miR-144, miR-214을 위해 프라이머를 디자인하여 바이오니아에서 합성하여 수행하였다.

분석결과 정상군은 NLRP3, NFkB, miR-155, miR-144, miR-214경우 각각 약 9.2±0.5, 3±0.5, 0.2±0.15, 12.5±1.5, 10.2±0.5이었고, 대조군은 각각 약 16.5±1.2, 24.5±4.5, 13.4±2.2, 4.1±0.4, 2.1±0.3이었으나 본 발명에 따른 실시예 1은 각각 12.1±2.2, 7.5±2.5, 1.2±0.2, 11.1±0.2, 9.1±0.1 c/t값 이었다(도 10).

이는 본 발명에 따른 실시예 1의 투여에 의해 골조직세포의 파괴와 골소주의 파괴를 야기하는 염증인자에 관여하는 소형 유전자 전사체 발현으로부터 골조직의 염증과 골조직의 파괴로부터 억제하거나 골조직 재생에 의해 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다.

<실험예 11> 혈장내 염증 매개인자 분석

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물이 골관절에 염증반응에 관여하는 면역세포와 염증물질에 대하여 흰쥐를 실험 종결후, 마취하여 복개한 다음 심장으로부터 혈액을 취해서 원심분리기로 약 15분간 4,500RPM으로 원심분리를 수행하여 이를 인산완충액 1ml로 2번 세척후 이를 혈장 50μl을 슬라이드 글라스에 분주하고 miRNA-155/QD525와 NLRP3/QD565형광용액 10μl을 혼합하여 염색을 통해 공초점 현미경 (LSM710, 칼자이즈,독일)으로 현미경 렌즈 200X 배율로 관찰한 결과 정상군은 miRNA-155/QD525와 NLRP3/QD565 형광염색의 발현이 거의 발현되지 않았으며 대조군인 miRNA-155/QD525에 의한 강하게 녹색형광을, NLRP3/QD565은 적색형광이 강하게 나타내었으나 본 발명에 따른 실시예 1은 miRNA-155/QD525에 의한 거의 녹색형광이 나타내지 않았고 NLRP3/QD565은 적색형광도 거의 발현이 없었다(도 11).

이는 본 발명에 따른 실시예 1의 투여에 의해 골조직세포의 파괴와 골소주의 파괴를 야기하는 염증인자에 관여하는 염증인자와 소형 유전자전사체 발현관계에 완화시킴으로 골조직의 염증과 골조직의 파괴로부터 억제하거나 골조직 재생에 의해 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다.

<실험예 12> 혈장내 염증매개인자와 억제인자 분석

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물이 골관절에 염증반응에 관여하는 면역세포과 염증인자와 억제인자에 대하여 흰쥐를 실험 종결 후, 마취한 다음 복개한 다음 심장으로부터 혈액을 취해서 원심분리기로 약 15분간 4,500RPM으로 원심분리를 수행하여 이를 인산완충액 1ml으로 2번 세척후 이를 혈장 50μl을 슬라이드 글라스에 분주하고 miRNA-144/QD525와 miR-155/QD565 형광용액 10μl을 혼합하여 염색을 통해 공초점 현미경 (LSM710, 칼자이즈,독일)으로 현미경 렌즈 200X 배율로 관찰한 결과 정상군은 miRNA-144/QD525와 miR-155/QD565 형광염색의 발현에서 miRNA-144/QD525은 강하게 발현된 반면 miR-155/QD565는 거의 발현되지 않았으며 대조군은 miRNA-144/QD525은 약하게 발현된 반면 miR-155/QD565는 강하게 발현되었으나 본 발명에 따른 실시예 1은 miRNA-144/QD525은 강하게 발현된 반면 miR-155/QD565는 거의 녹색 형광이 나타내지 않았다(도 12).

이는 본 발명에 따른 실시예 1의 투여에 의해 골조직세포의 파괴와 골소주의 파괴를 야기하는 염증인자에 관여하는 염증인자와 억제 인자간 상호 역작용에 의해 골조직의 염증과 골조직의 파괴로부터 억제하거나 골조직 재생에 의해 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다.

<실험예 13> 면역블롯에 의한 염증인자 단백질 발현 확인

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물의 염증유발에 관여하는 사이토카인과 염증 유발 단백질 발현 정도를 분석하기 위하여 흰쥐의 심장으로부터 혈액을 취해서 원심분리기로 약 15분간 4,500RPM으로 원심분리를 수행하여 이를 인산완충액 1ml로 2번 세척 후 RIPA (단백질 용해액)액으로 0.5ml씩 첨가하여 혈장을 용해한 다음 원심 분리하여 상등액만 취하여 Bicinchoninate(BCA)용액을 첨가하여 대조군인 BSA(BOVINE SERUM ALBUMIN)을 표준물질로 표준곡선을 설정후 반응시킨 다음 nanodrop으로 분석량을 50μg이 되게 측정하였다. 10% SDS-PAGE GEL을 전기 영동하여 전개시킨 다음 nitrocellulose막에 옮긴 후 이를 1차 항체인 NLRP3, IL-4, IL-13, IL-1b, NFkB, IL-18, β-actin에 표지하고 2차항체인 HRP에 표지하고 ECL에 노출하여 인화시켰다.

그 결과 NLRP3, IL-4, IL-13, IL-1b, NFkB, IL-18에서 대조군 경우 대체로 모두가 발현이 증가된 반면 본 발명에 따른 실시예 1은 정상군과 유사하게 NLRP3, IL-4, IL-13, IL-1b, NFkB, IL-18이 발현이 감소함을 알 수 있었다(도 13).

이는 본 발명에 따른 실시예 1의 투여에 의해 골조직 세포의 파괴와 골소주의 파괴를 야기하는 염증인자에 관여하는 염증단백질에 의해 골조직의 염증과 골조직의 파괴로부터 억제하거나 골조직 재생에 의해 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다.

<실험예 14> 미세 척추 주변부에 미치는 영향(1)

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물을 경구투여하여 관절부위에 존재하는 골조직의 마모상태 내지 골조직 세포의 파괴와 골소주의 파괴를 야기하는 미세 환경에 의해 척추 주변부에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험이다.

우선 척추 골조직의 염증인자 발현양상을 확인하였다. 그 결과 miRNA-200/QD525와 NLRP3/QD565형광염색을 통해 공초점 현미경 (LSM710, 칼자이즈,독일)으로 현미경 렌즈 10X 배율로 관찰한 결과로는 정상군 경우에 miRNA-200/QD525와 NLRP3/QD565 형광염색의 발현이 거의 발현 되지 않았으나 대조군은 miRNA-200/QD525에서 강하게 녹색 형광을, NLRP3/QD565은 적색 형광이 강하게 나타내었으나 본 발명에 따른 실시예 1은 miRNA-155/QD525에 의한 아주 약한 녹색형광을, NLRP3/QD565은 적색형광은 거의 발현되지 않았다(도 14).

이는 본 발명에 따른 실시예 1의 투여에 의해 척추 골조직 세포의 장애에 미치는 염증단백질 발현에 의해 척추 조직의 주변부에서의 염증과 골조직의 파괴로부터 억제하거나 골조직 재생에 의해 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다.

<실험예 15> 척추 주변부에서의 소형 유전자 전사체에 미치는 영향

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물을 경구 투여하여 관절부위에 존재하는 척추조직의 마모상태 내지 염증인자가 척추주변부에 미치는 영향을 알아보기 위해 우선 척추 골조직의 초기 염증인자 발현양상을 확인하였다.

그 결과 miRNA-155/QD525와 NLRP3/QD565형광염색을 통해 공초점 현미경 (LSM710, 칼자이즈,독일)으로 현미경렌즈 10X 배율로 관찰한 결과로는 정상군 경우에 miRNA-155/QD525와 NLRP3/QD565 형광염색의 발현이 거의 발현 되지 않았으나 대조군은 miRNA-155/QD525에서 강하게 녹색 형광을, NLRP3/QD565은 적색 형광이 강하게 나타내었으나 본 발명에 따른 실시예 1은 miRNA-155/QD525에 의한 아주 약한 녹색형광이 발현되었고, NLRP3/QD565에 적색형광은 거의 발현되지 않았다(도 15).

이는 본 발명에 따른 실시예 1의 투여에 의해 척추 골조직세포의 장애에 미치는 염증유도에 의해 척추조직의 주변부에서의 염증과 골조직의 파괴에 미치는 소형 유전자전사체를 억제하거나 골조직 재생에 관여하여 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다.

<실험예 16> 좌골신경의 손상도에 미치는 영향(1)

관절부위에 존재하는 연골의 마모상태 내지 연골 조직세포의 파괴와 골소주의 파괴를 야기하는 미세 환경에 의해서 척추 주변부에도 영향을 미치는 것을 보아 중간 단계의 좌골신경의 손상도 예측할 수 있기에 이를 알아보기 위해 우선 본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물을 경구 투여하여 신경계의 염증에 관여하는 세포인 별아세포 (astrocyte)의 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)과 NLRP3를 표지하고, GFAP/QD525와 NLRP3/QD565 형광염색을 통해 공초점 현미경 (LSM710, 칼자이즈,독일)으로 현미경 렌즈 10X 배율로 관찰하였다.

그 결과로는 정상군 경우에 GFAP/QD525도 약하게 녹색 형광을, NLRP3/QD565 형광염색의 발현이 거의 발현 되지 않았으나 대조군은 GFAP/QD525에서 강하게 녹색 형광을, NLRP3/QD565은 적색 형광이 강하게 나타내었으나 본 발명에 따른 실시예 1은 GFAP/QD525에 의한 아주 약한 녹색 형광을, NLRP3/QD565은 적색 형광은 거의 발현되지 않았다(도 16).

이는 본 발명에 따른 실시예 1의 투여에 의해 관절조직의 통증에 의해 척추장애를 유발할 가능성이 있으므로 염증유도에 의해 척추조직으로 전달되는 좌골신경계에서에 미치는 염증단백질 발현정도를 억제하거나 골조직 재생에 관여하여 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다..

<실험예 17> 좌골신경의 손상에 미치는 소형 유전자 전사체 발현정도(2)

관절부위에 존재하는 연골의 마모상태 내지 연골조직세포의 파괴와 골소주의 파괴를 야기하는 미세 환경에 의해서 척추주변부에도 영향을 미치는 것을 보아 중간단계의 좌골신경의 손상도 예측할 수 있기에 이를 알아보기 위해 우선 본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물을 경구 투여하여 신경세포의 증식억제에 미치는 miRNA106b과 NLRP3를 표지하고, miRNA-106b/QD525와 NLRP3/QD565 형광염색을 통해 공초점 현미경 (LSM710, 칼자이즈,독일)으로 현미경 렌즈 10X 배율로 관찰하였다.

그 결과로는 정상군 경우에 miRNA-106b/QD525는 약하게, NLRP3/QD565는 거의 발현되지 않았으나 대조군은 miRNA-106b/QD525에서 강하게 녹색형광을, NLRP3/QD565은 적색 형광이 강하게 나타내었으나, 약물군은 miRNA-106b/QD525와 NLRP3/QD565G 모두에서 아주 강하게 녹색/적색 형광을 나타내었다. 본 발명에 따른 실시예 1은 miRNA-106b/QD525와 NLRP3/QD565 둘 모두에서 녹색/적색 형광은 거의 발현되지 않았다(도 17).

이는 본 발명에 따른 실시예 1의 투여에 의해 관절조직의 통증에 의해 척추장애를 유발할 가능성이 있으므로 염증유도에 의해 척추조직으로 전달되는 좌골신경계에서에 미치는 염증 소형 유전자 전사체 발현 정도를 억제하거나 골조직 재생에 관여하여 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다.

<실험예 18> 척추신경의 DRG (dorsal root ganglion)의 염증 정도 평가

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물을 경구 투여하여 척추신경의 DRG (dorsal root ganglion)의 염증도 수반되리라 예측되므로 이를 알아보기 위해 우선 DRG신경세포의 GFAP과 NLRP3를 표지하고, GFAP/QD525와 NLRP3/QD565 형광염색을 통해 공초점 현미경 (LSM710, 칼자이즈,독일)으로 현미경 렌즈 10X 배율로 관찰하였다.

그 결과로는 정상군 경우에 GFAP/QD525는 약하게, NLRP3/QD565는 거의 발현되지 않았으나, 대조군은 GFAP/QD525와 NLRP3/QD565는 강하게 녹색 형광을, NLRP3/QD565은 적색 형광이 강하게 나타내었고, 본 발명에 따른 실시예 1은 GFAP/QD525은 약하게 발현되나, NLRP3/QD565는 거의 발현되지 않았다(도 18).

이는 본 발명에 따른 실시예 1의 투여에 의해 관절조직의 통증에 의해 척추장애를 유발할 가능성이 있으므로 염증유도에 의해 좌골신경에서 척추의 운동과 감각신경이 교차하는 후근 신경절에 미치는 염증 단백질 발현정도를 억제하거나 통증완화에 관여하여 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다.

<실험예 19> 염증에 의한 신경세포의 증식에 미치는 영향 평가

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물을 경구 투여하여 척추신경의 DRG(dorsal root ganglion )의 염증에 의해 신경세포의 증식에 미치는 지를 알아보기 위해 miRNA-144과 miRNA-155를 표지하고, miRNA-144/QD525와 miRNA-155/QD565 형광염색을 통해 공초점 현미경 (LSM710, 칼자이즈,독일)으로 현미경 렌즈 10X 배율로 관찰하였다.

그 결과로는 정상군 경우에 miRNA-144/QD525은 강하게 miRNA-155/QD565 형광염색을 거의 발현되지 않았으며, 대조군은 miRNA-144/QD525은 거의 전무하고 miRNA-155/QD565 적색 형광이 강하게 나타내었고, 본 발명에 따른 실시예 1은 miRNA-144/QD525은 강하게 발현되고, miRNA-155/QD565은 거의 발현되지 않았다(도 19).

이는 본 발명에 따른 실시예 1의 투여에 의해 관절조직의 통증에 의해 척추장애를 유발할 가능성이 있으므로 염증유도에 의해 좌골신경에서 척추의 운동과 감각신경이 교차하는 후근 신경절에 미치는 염증유도 소형 유전자 전사체를 억제하거나 통증완화에 관여하여 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다.

<실험예 20> 척추신경의 DRG의 염증에 의해 신경조직에 미치는 영향

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물을 경구 투여하여 척추신경의 DRG (dorsal root ganglion)의 염증에 의해 조직표면에 미치는 영향을 알아보기 위해 miRNA-200(도 20a), NLRP3과 miRNA-155(도 20b)를 표지하고 관찰하였다.

그 결과로는 정상군 경우에 miRNA-200는 아주 약하게(도 20a), NLRP3는 거의 전무하고(도 20b) miRNA-155는 약하게 발현하였고(도 20b), 대조군은 miRNA-200는 아주 강하게(도 20a), NLRP3와 miRNA-155는 강하게 발현하였고(도 20b), 본 발명에 따른 실시예 1은 miRNA-200 (도 20a), NLRP3 와 miRNA-155는 모두 전무하게 발현하였다(도 20b).

<실험예 21> 척추신경의 DRG의 염증유발인자와 억제인자에 있어 신경에 미치는 영향

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물을 경구 투여하여 척추신경의 DRG (dorsal root ganglion)의 염증과 세포증식에 있어 조직표면에 미치는 영향을 알아보기 위해 miRNA-144과 miRNA-155를 표지하고 관찰하였다.

그 결과로는 정상군 경우에 miRNA-144는 아주 강하게, miRNA-155는 거의 발현되지 않았으나 대조군은 miRNA-144는 거의 발현되지 않았으며, miRNA-155는 강하게, 발현하였고, 본 발명에 따른 실시예 1은 miRNA-144는 약하게 발현되었고, miRNA-155도 약하게 발현되었다(도 21).

이는 본 발명에 따른 실시예 1의 투여에 의해 관절조직의 통증에 의해 척추장애를 유발할 가능성이 있으므로 염증유도에 의해 좌골신경에서 척추의 운동과 감각신경이 교차하는 후근신경절에서에 미치는 염증유도 소형유전자 전사체간 상호 역작용을 조잘하거나 통증완화에 관여하여 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다.

<실험예 22> 척추 DRG신경의 염증 유발인자들의 발현에 대한 NLRP3과 miRNA-155 관찰

관절부위에 존재하는 연골의 마모상태 내지 연골조직세포의 파괴와 골소주의 파괴를 야기하는 미세 환경에 의해서 척추 주변부에 영향을 미치는 것은 결국 척추신경의 DRG (dorsal root ganglion)의 주변 환경이 염증과 관련되기 때문에 일반적으로 통증을 수반하여 디스크의 손상과 통증을 느끼는 이유가 초래하므로 본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물을 경구 투여하여 척추신경의 염증 유발인자들의 발현에 대한 NLRP3과 miRNA-155를 관찰하였다.

그 결과, 정상군 경우에 NLRP3과 miRNA-155는 거의 발현되 않는 반면 대조군은 NLRP3 경우 강하게 miRNA-155도 강하게 발현되었고 본 발명에 따른 실시예 1은 NLRP3는 거의 약하게 발현되거나 miRNA-155는 약하게 발현되는 경향을 나타내었는데 이는 본 발명에 따른 실시예 1의 투여에 의해 염증인자의 억제와 신경보호효과를 통한 통증완화, 골관절의 염증유발 억제효과와 골소주 재생에 의해 관절염 및 척추디스크의 기능장애가 호전되는 경향을 나타냄이 사료된다(도 22).

이상의 실험 결과로부터 확인되는 바와 같이, 본 발명은 관절염 및 척추디스크의 예방과 치료효능을 가지고 있어, 의약품으로서 유용하게 사용될 수 있다.

다음에 제제 실시예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

<제제실시예 1>

실시예 1의 물추출물 5mg

주사용 멸균증류수 적량

pH조절제 적량

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물을 주사용 멸균증류수에 용해하고 pH 조절제로 pH약 7.6로 조절한 다음 전체를 2ml로 한후 2ml용량의 앰플에 충진하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

<제제실시예 2>

실시예 1의 물추출물 10mg

주사용 멸균증류수 적량

pH 조절제 적량

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물을 주사용 멸균증류수에 용해하고 pH조절제로 pH약 7.2로 조절하고 전체를 2ml로 한 다음 2ml용량의 앰플에 충진하여 주사제를 제조한다.

<제제실시예 3>

실시예 1의 물추출물 20mg

유당 100mg

전분 100mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

<제제실시예 4>

실시예 1의 물추출물 10mg

유당 100mg

전분 50mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

<제제실시예 5>

실시예 1의 물추출물 15mg

유당 50mg

전분 50mg

탈크 2mg

스테아린산마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.

<제제실시예 6>

실시예 1의 물추출물 25mg

유당 100mg

전분 93mg

탈크 2mg

스테아린산 마그네슘 적량

<제제실시예 7>

실시예 1의 물추출물 500mg

설탕 20g

이성화당 20g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 100ml

상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 100ml 의 갈색병에 충진하고 멸균시켜서 액제를 제조한다.

<제제실시예 8>

실시예 1의 물추출물 100mg

타목시펜 10mg

주사용 멸균증류수 적량

pH조절제 적량

본 발명에 따른 실시예 1의 물추출물 및 타목시펜을 주사용 멸균증류수에 용해하고 pH조절제로 pH약 7.2로 조절하고 전체를 2ml로 한 다음 2ml용량의 앰플에 충진하여 주사제를 제조한다.

<제제실시예 9>

실시예 1의 물추출물 20mg

설파살라진 20mg

유당 100mg

전분 100mg

스테아린산 마그네슘 적량

<제제실시예 10>

실시예 1의 물추출물 10mg

알렌드로네이트 50mg

유당 100mg

전분 50mg

스테아린산 마그네슘 적량

<제제실시예 11>

실시예 1의 물추출물 10mg

유당 50mg

전분 50mg

탈크 2mg

스테아린산마그네슘 적량

<제제실시예 12>

실시예 1의 물추출물 5mg

랄록시펜 10mg

유당 50mg

전분 50mg

탈크 2mg

스테아린산마그네슘 적량

<제제실시예 13>

실시예 1의 물추출물 5mg

파미드론산 디소디움 20mg

유당 100mg

전분 93mg

탈크 2mg

스테아린산 마그네슘 적량

<제제실시예 14>

실시예 1의 물추출물 1000mg

파미드로네이트 디소디움 1000mg

설탕 20g

이성화당 20g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 100ml

Claims

상기생(Loranthus yadoriki), 속단(Phlomis umbrosa), 독활(Aralia contientalis), 당귀(Angelica gigas nakai), 천궁(Cnidium officinale), 부자(Aconitum carmichaeli), 현호색(Corydalis terna), 우슬(Achyranthes japonica) 및 계지(Cinnamomum cassia) 추출물을 유효성분으로 하며, 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 함유하는 관절염 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1 항에 있어서, 상기생, 속단, 독활, 당귀, 천궁, 부자, 현호색, 우슬 및 계지 추출물은 물 추출물임을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1 항에 있어서, 상기생, 속단, 독활, 당귀, 천궁, 부자, 현호색, 우슬 및 계지는 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 중량비로 혼합됨을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학조성물은 정제, 액제, 캡술제 또는 주사제 제형으로 제조됨을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 약학조성물.
상기생(Loranthus yadoriki), 속단(Phlomis umbrosa), 독활(Aralia contientalis), 당귀(Angelica gigas nakai), 천궁(Cnidium officinale), 부자(Aconitum carmichaeli), 현호색(Corydalis terna), 우슬(Achyranthes japonica) 및 계지(Cinnamomum cassia) 추출물을 유효성분으로 하며, 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 함유하는 척추디스크 예방 및 치료용 약학조성물.
제 5 항에 있어서, 상기생, 속단, 독활, 당귀, 천궁, 부자, 현호색, 우슬 및 계지 추출물은 물 추출물임을 특징으로 하는 척추디스크 예방 및 치료용 약학조성물.
제 5 항에 있어서, 상기생, 속단, 독활, 당귀, 천궁, 부자, 현호색, 우슬 및 계지는 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 중량비로 혼합됨을 특징으로 하는 척추디스크 예방 및 치료용 약학조성물.
제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학조성물은 정제, 액제, 캡술제 또는 주사제 제형으로 제조됨을 특징으로 하는 척추디스크 예방 및 치료용 약학조성물.