KR101896020B1

KR101896020B1 - 참당귀 추출물을 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101896020B1
Application number: KR1020170014596A
Authority: KR
Inventors: 권진환; 한민석
Original assignee: 이강헌
Priority date: 2016-02-01
Filing date: 2017-02-01
Publication date: 2018-09-06
Also published as: US20170258859A1; KR20170091535A; US10688144B2

Abstract

참당귀(Angelica gigas Nakai) 추출물을 포함하는 골관절염 예방 및/또는 치료용 약학 조성물 및 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물을 포함하는 골관절염 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

Description

참당귀 추출물을 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물{Composition for preventing or treating osteoarthritis containing an extract of Angelica gigas Nakai}

골관절염(osteoarthritis)은 관절연골을 구성하는 세포외기질 (extracellular matrix)의 변성으로 인하여 관절연골이 점진적으로 손상되어 염증 및 통증을 수반하는 만성 퇴행성 질환이다. 골관절염은 중년 또는 노년에서 주로 발생되는데, 우리나라 골관절염 유병률은 만 50세 이상에서 약 40%를 차지하며, 연령의 증가에 따라 남성보다는 여성에서 더 높은 유병률을 나타내고 있다. 골관절염의 원인으로는 퇴행성 변화, 면역계 이상, 감염, 외상 및 대사 장애 등 다양하며, 골관절염의 발병과 관련된 인자들로는 nitric oxide (NO), 사이토카인(cytokine) 및 단백질 가수분해효소 (proteolytic enzymes) 등이 알려져 있다.

또한, 골관절염은 염증 이외에도 국소적인 관절에 점진적인 관절연골의 소실 및 그와 관련된 2차적인 변호와 증상을 동반하는 질환이다. 관절연골의 손상은 여러 기계적인 자극, 염증으로 인한 효소반응 및 대사의 변화 등으로 시작되며, 프로테오글리칸(proteoglycan; PG) 함유량의 감소 및 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan; GAG) 사슬의 길이가 감소함으로써 수분 보유능력이 떨어져 추가적인 손상에 매우 약한 상태가 된다. 골관절염을 유발하는 연골 파손 과정에서, 일부 염증이 유발될 수 있으며, 이는 염증관련 효소의 방출을 야기하여 연골 손상을 가속시킨다. 골관절염이 진행되면, 염증 반응과 함께 연골이 파괴되어 활액 내로 PG가 방출되며, 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 농도가 증가하여 통증을 유발하게 된다. 또한 염증부위에서는 과다한 양의 NO가 발생하여 세포 조직의 괴사를 촉진시킨다. 골관절염이 진행되면 관절연골 내에 존재하는 PG와 GAG가 소실되어 관절연골의 탄력성 및 압축력과 같은 기계적 성질을 변화시키고, 이는 관절막과 관절액의 변화를 초래하여 윤활작용, 이화작용에 의한 대사물질 제거, 관절표면에 대한 영양공급 장애 등을 초래하는 것으로 알려져 있다.

즉, 골괄절염의 치료에 있어서 염증 치료뿐 아니라 더불어 관절 내 PG와 GAG의 파괴 및/또는 손실을 억제하여 연골의 기계적 성질을 정상적으로 유지하는 것이 중요하다.

따라서, 염증 치료 효과뿐 아니라 관절 내 PG와 GAG의 파괴 및/또는 손실을 억제하는 효과를 갖는 새로운 골관절염 치료제의 개발이 요구된다.

제병선. 당귀천궁탕가미방(富歸川芎湯加味方)이 관절염에 미치는 영향. 대전대학교 대학원 한의학과 한방재활의학과학전공. 석사학위논문. 2005년 2월

본 발명의 일 예는 참당귀(Angelica gigas Nakai) 추출물을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물은 참당귀 추출물 및 천궁 추출물의 혼합물, 참당귀 및 천궁의 혼합물의 추출물, 또는 이들의 조합일 수 있다.

다른 예는 참당귀 추출물을 포함하는 골관절염 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.

다른 예는 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 골관절염 개선용 건강기능성식품을 제공한다. 상기 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물은 참당귀 추출물 및 천궁 추출물의 혼합물, 참당귀 및 천궁의 혼합물의 추출물, 또는 이들의 조합일 수 있다.

다른 예는 참당귀 추출물의 제조 단계를 포함하는 골관절염의 예방, 치료 및/또는 개선 효과를 갖는 조성물의 제조 방법을 제공한다.

다른 예는 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 골관절염의 예방, 치료 및/또는 개선 효과를 갖는 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명자들은 토끼 연골조직세포와 MIA(monosodium iodoacetate)로 골관절염을 유발한 흰쥐에 참당귀 추출물을 처리하여, 염증매개물질인 NO 생성량, 및 iNOS, COX-2, 및 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현량 및 분비량을 측정한 결과, NO 생성과 상기 염증인자들의 발현 및 분비가 크게 억제되는 것은 물론이고, 관절 내 프로테오글리칸(PG) 및 글리코사미노글리칸(GAG)의 파괴 및/또는 소실을 유의적으로 억제함을 확인하여, 참당귀 추출물의 골관절염 예방, 치료 및/또는 개선 용도를 제안한다.

또한, 본 발명자들은 참당귀와 천궁의 혼합 추출물이 골관절염 예방, 치료 및/또는 개선에 있어서 상승된 효과를 나타냄을 확인하여, 참당귀와 천궁의 혼합 추출물의 골관절염 예방, 치료 및/또는 개선 용도를 제안한다.

당귀는 산형과에 속하는 다년생 초본식물로서, 주로 한국, 일본, 중국 등지에서 약용을 목적으로 재배되고 있다. 당귀는 그 산지에 따라 한국에서 생산되는 참당귀(Angelica gigas Nakai), 일본에서 생산되는 일당귀(Angelica acutiloba Kitagaw), 그리고 중국에서 생산되는 중국당귀(Angelica sinensis Diels)로 구분되고, 그 성분과 약리적 효과는 상이한 것으로 알려져 있다. 예로부터 당귀는 어린 순을 나물로 식용하고, 뿌리를 진통, 항암, 신장 독성경감, 간기능 개선, 당뇨성 고혈압 치료, 혈액순환 개선 등 다양한 질환에 대한 약재로 사용하고 있다.

본 발명은 참당귀(Angelica gigas Nakai) 추출물의 골관절염 골관절염 예방, 치료 및/또는 개선 효과와 관련된 것이다.

천궁(Cnidium officinale)은 중국이 원산이며, 한국, 일본 등지에 분포하는 다년생 초본 식물이다. 어린순은 나물로 먹고, 뿌리는 음위, 간질, 대하, 치풍 치료에 쓰며, 보익제, 진정제, 진통제, 강장제 등으로 사용한다. 한방 약제로 쓰는 천궁은 혹 모양으로 덩어리를 이룬 뿌리줄기이다.

본 명세서에서, '치료'는 증상의 경감 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태 또는 증상의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장, 기타 다른 이로운 치료 결과 등을 모두 포함하는 의미로 사용된다.

우선, 참당귀(Angelica gigas Nakai) 추출물을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다. 다른 예는 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

상기 참당귀 추출물은 참당귀(뿌리)를 물 및 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출하여 얻어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 참당귀 추출물은 참당귀 (예컨대, 뿌리)의 90 내지 100%(v/v), 92 내지 100%(v/v), 96 내지 100%(v/v), 또는 98 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액 (예컨대, 98%(v/v) 에탄올 수용액(주정)) 추출물일 수 있다. 또한, 상기 참당귀 추출물은 10 내지 80℃, 10 내지 70℃, 10 내지 60℃, 10 내지 50℃, 20 내지 80℃, 20 내지 70℃, 20 내지 60℃, 20 내지 50℃, 30 내지 80℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 40 내지 80℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 또는 40 내지 50℃에서 추출된 것일 수 있다.

본 명세서에 사용된 참당귀 추출물, 예컨대, 참당귀 에탄올 추출물(90 내지 100%(v/v), 92 내지 100%(v/v), 96 내지 100%(v/v), 또는 98 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액으로 10 내지 80℃, 10 내지 70℃, 10 내지 60℃, 10 내지 50℃, 20 내지 80℃, 20 내지 70℃, 20 내지 60℃, 20 내지 50℃, 30 내지 80℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 40 내지 80℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 또는 40 내지 50℃에서 추출)은, 추출물 총 100g당,

(1) 데커신 함량이 약 2000mg 이상, 약 2200mg 이상, 약 2400mg 이상, 약 2600mg 이상, 또는 약 2800mg 이상,약 3000mg 이상, 예컨대, 2000 내지 5000 mg, 2000 내지 4500 mg, 2000 내지 4000 mg, 2000 내지 3500 mg, 2200 내지 5000 mg, 2200 내지 4500 mg, 2200 내지 4000 mg, 2200 내지 3500 mg, 2400 내지 5000 mg, 2400 내지 4500 mg, 2400 내지 4000 mg, 2400 내지 3500 mg, 2600 내지 5000 mg, 2600 내지 4500 mg, 2600 내지 4000 mg, 2600 내지 3500 mg, 2800 내지 5000 mg, 2800 내지 4500 mg, 2800 내지 4000 mg, 2800 내지 3500 mg, 3000 내지 5000 mg, 3000 내지 4500 mg, 3000 내지 4000 mg, 또는 3000 내지 3500 mg이거나, 및/또는

(2) 데커시놀 안젤레이트 함량이 약 1200mg 이상, 약 1400 mg 이상, 약 1600 mg 이상, 또는 약 1800 mg 이상, 예컨대, 1200 내지 3000 mg, 1200 내지 2800 mg, 1200 내지 2600 mg, 1200 내지 2400 mg, 1200 내지 2200 mg, 1400 내지 3000 mg, 1400 내지 2800 mg, 1400 내지 2600 mg, 1400 내지 2400 mg, 1400 내지 2200 mg, 1600 내지 3000 mg, 1600 내지 2800 mg, 1600 내지 2600 mg, 1600 내지 2400 mg, 1600 내지 2200 mg, 1800 내지 3000 mg, 1800 내지 2800 mg, 1800 내지 2600 mg, 1800 내지 2400 mg, 또는 1800 내지 2200 mg 이거나, 및/또는

(3) 노다케닌 (Nodakenin) 함량이 약 800mg 이상, 약 1000mg 이상, 약 1200mg 이상, 약 1500mg 이상, 약 1700mg 이상, 약 2000mg 이상, 약 2200mg 이상, 약 2500mg 이상, 또는 약 2700 이상, 예컨대, 800 내지 5000 mg, 800 내지 4500 mg, 800 내지 4000 mg, 800 내지 3500 mg, 800 내지 3200 mg, 1000 내지 5000 mg, 1000 내지 4500 mg, 1000 내지 4000 mg, 1000 내지 3500 mg, 1000 내지 3200 mg, 1200 내지 5000 mg, 1200 내지 4500 mg, 1200 내지 4000 mg, 1200 내지 3500 mg, 1200 내지 3200 mg, 1500 내지 5000 mg, 1500 내지 4500 mg, 1500 내지 4000 mg, 1500 내지 3500 mg, 1500 내지 3200 mg, 1700 내지 5000 mg, 1700 내지 4500 mg, 1700 내지 4000 mg, 1700 내지 3500 mg, 1700 내지 3200 mg, 2000 내지 5000 mg, 2000 내지 4500 mg, 2000 내지 4000 mg, 2000 내지 3500 mg, 2000 내지 3200 mg, 2200 내지 5000 mg, 2200 내지 4500 mg, 2200 내지 4000 mg, 2200 내지 3500 mg, 2200 내지 3200 mg, 2500 내지 5000 mg, 2500 내지 4500 mg, 2500 내지 4000 mg, 2500 내지 3500 mg, 2500 내지 3200 mg, 2700 내지 5000 mg, 2700 내지 4500 mg, 2700 내지 4000 mg, 2700 내지 3500 mg, 또는 2700 내지 3200 mg이거나, 및/또는

(4) 베타-시토스테롤 함량이 30mg 이상, 50mg 이상, 100mg 이상, 150mg 이상, 200mg 이상, 250mg 이상, 또는 300mg 이상, 예컨대, 30 내지 1000 mg, 30 내지 800 mg, 30 내지 600 mg, 30 내지 500 mg, 30 내지 400 mg, 50 내지 1000 mg, 50 내지 800 mg, 50 내지 600 mg, 50 내지 500 mg, 50 내지 400 mg, 100 내지 1000 mg, 100 내지 800 mg, 100 내지 600 mg, 100 내지 500 mg, 100 내지 400 mg, 150 내지 1000 mg, 150 내지 800 mg, 150 내지 600 mg, 150 내지 500 mg, 150 내지 400 mg, 200 내지 1000 mg, 200 내지 800 mg, 200 내지 600 mg, 200 내지 500 mg, 200 내지 400 mg, 250 내지 1000 mg, 250 내지 800 mg, 250 내지 600 mg, 250 내지 500 mg, 250 내지 400 mg, 300 내지 1000 mg, 300 내지 800 mg, 300 내지 600 mg, 300 내지 500 mg, 또는 300 내지 400 mg

인 것일 수 있다.

상기 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물은 참당귀 추출물 및 천궁 추출물의 혼합물 또는 참당귀 및 천궁 혼합물의 추출물일 수 있다.

상기 참당귀 추출물은 앞서 설명한 바와 같다.

상기 천궁 추출물은 천궁 (전초 또는 뿌리)를 물 및 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출하여 얻어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 천궁 추출물은 천궁 (예컨대, 뿌리)의 90 내지 100%(v/v), 92 내지 100%(v/v), 96 내지 100%(v/v), 또는 98 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액 (예컨대, 98%(v/v) 에탄올 수용액(주정)) 추출물일 수 있다. 또한, 상기 천궁 추출물은 10 내지 80℃, 10 내지 70℃, 10 내지 60℃, 10 내지 50℃, 20 내지 80℃, 20 내지 70℃, 20 내지 60℃, 20 내지 50℃, 30 내지 80℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 40 내지 80℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 또는 40 내지 50℃에서 추출된 것일 수 있다.

상기 참당귀 및 천궁 혼합물의 추출물은 참당귀(뿌리)와 천궁 (전초 또는 뿌리)의 혼합물을 물 및 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출하여 얻어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 혼합 추출물은 (1) 참당귀 (뿌리) 및 천궁 (예컨대, 뿌리) 혼합물의 90 내지 100%(v/v), 92 내지 100%(v/v), 96 내지 100%(v/v), 또는 98 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액 (예컨대, 98%(v/v) 에탄올 수용액(주정)) 추출물, 또는 (2) 참당귀 (뿌리)의 90 내지 100%(v/v), 92 내지 100%(v/v), 96 내지 100%(v/v), 또는 98 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액 (예컨대, 98%(v/v) 에탄올 수용액(주정)) 추출물과 천궁 (예컨대, 뿌리)의 90 내지 100%(v/v), 92 내지 100%(v/v), 96 내지 100%(v/v), 또는 98 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액 (예컨대, 98%(v/v) 에탄올 수용액(주정)) 추출물의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 혼합 추출물은 10 내지 80℃, 10 내지 70℃, 10 내지 60℃, 10 내지 50℃, 20 내지 80℃, 20 내지 70℃, 20 내지 60℃, 20 내지 50℃, 30 내지 80℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 40 내지 80℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 또는 40 내지 50℃에서 추출된 것일 수 있다.

상기 참당귀 추출물과 천궁 추출물의 혼합물 내의 참당귀 추출물과 천궁 추출물의 혼합비 또는 참당귀와 천궁 혼합물 내의 참당귀와 천궁의 혼합비는 1:1 내지 5:1, 1.5:1 내지 5:1, 1.5:1 내지 4:1, 1.5:1 내지 3:1, 1.5:1 내지 2:1, 2:1 내지 5:1, 2:1 내지 4:1, 2:1 내지 3:1, 또는 3:1 내지 4:1 (이상, 참당귀 중량 또는 참당귀 추출물의 고형분 중량:천궁 중량 또는 천궁 추출물 고형분의 중량)일 수 있다. 상기 고형분 중량은 참당귀와 천궁의 중량, 또는 상기 혼합물이 추출물의 혼합물인 경우, 추출물의 용매 성분을 제거하고 남은 고형물의 중량을 의미하는 것이다. 이는 상기 혼합물이 참당귀 추출물과 천궁 추출물의 혼합물인 경우, 상기 혼합비가 추출물의 성상 및/또는 농도에 영향을 받지 않도록 추출용매를 제거한 유효성분 중량 간 비율을 의미함을 나타내기 위하여 사용된 용어이다.

상기 약학 조성물 내의 유효성분으로서 포함된 참당귀 추출물 또는 참당귀와 천궁의 혼합 추출물은 건조물, 농축물, 또는 농축 건조물 형태일 수 있다.

상기 약학 조성물 내의 유효성분으로서 포함된 참당귀 추출물 또는 참당귀와 천궁의 혼합 추출물의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 0.01 내지 70중량%, 또는 0.1 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 고형분 중량이라 함은 앞서 설명한 바와 같이 추출물에서 용매 성분을 제거한 고형물의 중량을 의미한다.

상기 약학 조성물은 인간, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 토끼, 마우스, 래트 등을 포함하는 포유동물 또는 이로부터 분리된 세포, 조직, 또는 이의 배양물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구 투여, 또는 정맥 투여, 근육 투여, 피하 투여, 복막내 투여, 병변 부위 (예컨대 관절) 국소 투여와 같은 비경구 투여일 수 있다. 상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 상기 참당귀 추출물 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 및/또는 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다. 상기 담체, 부형제, 또는 희석제의 예로서 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 시럽제, 분말제, 현탁제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 경피제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 약학 조성물의 1일 투여량은 유효성분 (참당귀 추출물 또는 참당귀와 천궁의 혼합 추출물)의 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 20 ㎎/kg범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.

본 발명의 다른 예는 참당귀 추출물을 제조하는 단계를 포함하는, 골관절염의 예방, 치료, 및/또는 개선 효과를 갖는 조성물의 제조방법을 제공한다. 상기 참당귀 추출물을 제조하는 단계는 참당귀 뿌리를, 10 내지 80℃, 10 내지 70℃, 10 내지 60℃, 10 내지 50℃, 20 내지 80℃, 20 내지 70℃, 20 내지 60℃, 20 내지 50℃, 30 내지 80℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 40 내지 80℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 또는 40 내지 50℃에서, 1 내지 10 부피배, 2 내지 8 부피배, 또는 4 내지 6 부피배의 물 및 탄소수 1-4의 직쇄 또는 분지형 알코올 (예컨대, 에탄올)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 예컨대, 90 내지 100%(v/v), 92 내지 100%(v/v), 96 내지 100%(v/v), 또는 98 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액 (예컨대, 98%(v/v) 에탄올 수용액(주정))으로 추출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 추출 시간은 추출이 충분히 이루어질 수 있는 시간이면 족하고, 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 또는 4시간 이상, 에컨대, 1 내지 24시간, 2 내지 24시간, 3 내지 24시간, 4 내지 24시간, 1 내지 12시간, 2 내지 12시간, 3 내지 12시간, 4 내지 12시간, 1 내지 6시간, 2 내지 6시간, 3 내지 6시간, 또는 4 내지 6시간 정도로 설정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

참당귀 및 천궁의 혼합 추출물을 제조하는 단계는 1) 참당귀 추출물과 천궁 추출물을 혼합하는 단계, 또는 2) 참당귀와 천궁을 혼합한 혼합물을 추출 용매로 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 추출하는 단계에 사용된 추출 용매 및 추출 온도는 앞서 참당귀 추출물에 대하여 사항을 참조할 수 있다.

예컨대, 상기 1) 참당귀 추출물과 천궁 추출물을 혼합하는 단계는 i) 참당귀 뿌리를, 10 내지 80℃, 10 내지 70℃, 10 내지 60℃, 10 내지 50℃, 20 내지 80℃, 20 내지 70℃, 20 내지 60℃, 20 내지 50℃, 30 내지 80℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 40 내지 80℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 또는 40 내지 50℃에서, 1 내지 10 부피배, 2 내지 8 부피배, 또는 4 내지 6 부피배의 물 및 탄소수 1-4의 직쇄 또는 분지형 알코올 (예컨대, 에탄올)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 예컨대, 90 내지 100%(v/v), 92 내지 100%(v/v), 96 내지 100%(v/v), 또는 98 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액 (예컨대, 98%(v/v) 에탄올 수용액(주정))으로 추출하는 단계, ii) 천궁 뿌리를, 10 내지 80℃, 10 내지 70℃, 10 내지 60℃, 10 내지 50℃, 20 내지 80℃, 20 내지 70℃, 20 내지 60℃, 20 내지 50℃, 30 내지 80℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 40 내지 80℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 또는 40 내지 50℃에서, 1 내지 10 부피배, 2 내지 8 부피배, 또는 4 내지 6 부피배의 물 및 탄소수 1-4의 직쇄 또는 분지형 알코올 (예컨대, 에탄올)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 예컨대, 90 내지 100%(v/v), 92 내지 100%(v/v), 96 내지 100%(v/v), 또는 98 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액 (예컨대, 98%(v/v) 에탄올 수용액(주정))으로 추출하는 단계, 및 iii) 상기 단계 i)에서 추출된 참당귀 추출물과 단계 ii)에서 추출된 천궁 추출물을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 2) 참당귀와 천궁을 혼합한 혼합물을 추출 용매로 추출하는 단계는 i') 참당귀 뿌리와 천궁 뿌리를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계, 및 ii') 상기 혼합물을, 10 내지 80℃, 10 내지 70℃, 10 내지 60℃, 10 내지 50℃, 20 내지 80℃, 20 내지 70℃, 20 내지 60℃, 20 내지 50℃, 30 내지 80℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 40 내지 80℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 또는 40 내지 50℃에서, 1 내지 10 부피배, 2 내지 8 부피배, 또는 4 내지 6 부피배의 물 및 탄소수 1-4의 직쇄 또는 분지형 알코올 (예컨대, 에탄올)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 예컨대, 90 내지 100%(v/v), 92 내지 100%(v/v), 96 내지 100%(v/v), 또는 98 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액 (예컨대, 98%(v/v) 에탄올 수용액(주정))으로 추출하는 단계를 포함할 수 있다.

상기한 추출 단계의 추출 시간은 추출이 충분히 이루어질 수 있는 시간이면 족하고, 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 또는 4시간 이상, 에컨대, 1 내지 12시간, 2 내지 12시간, 3 내지 12시간, 4 내지 12시간, 1 내지 6시간, 2 내지 6시간, 3 내지 6시간, 또는 4 내지 6시간 정도로 설정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 참당귀 추출물과 천궁 추출물의 혼합비 또는 참당귀와 천궁의 혼합비는 앞서 설명한 바와 같다.

상기 방법에 사용된 추출 과정은 통상적으로 사용되는 모든 추출 방법에 의하여 수생될 수 있으며, 예컨대, 열수 추출, 초음파 추출, 환류 추출법 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 참당귀 추출물을 함유하는, 골관절염 예방 및/또는 개선용 건강 기능성 식품을 제공한다. 다른 예는 참당귀와 천궁의 혼합 추출물을 함유하는 골관절염 예방 및/또는 개선용 건강 기능성 식품을 제공한다.

상기 건강 기능성 식품은 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분(이하, '기능성 원료')을 사용하여 제조한 식품으로, 건강을 유지하거나 소정의 질병 또는 증상을 예방 및/또는 개선하는데 도움을 주는 모든 식품을 의미하며, 최종 제품 형태에는 특별한 제한이 없다. 예컨대, 상기 건강 기능성 식품은 각종 식품, 음료 조성물, 식품 첨가제 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 건강 기능성 식품에 함유된 참당귀 추출물 또는 참당귀와 천궁의 혼합 추출물의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 전체 식품 중량의 0.001 내지 95 중량% 또는 0.01 내지 90 중량%일 수 있다.

상기 건강 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 또는 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 또는 그의 염, 알긴산 또는 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 함유할 수 있다. 그밖에, 상기 건강기능성 식품, 특히 건강 기능 음료 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 전체 건강 기능성 식품 100 중량부 당 0.001 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

참당귀 추출물은 골관절염이 유발된 무릎관절 연골조직에서 염증매개물질들의 생성을 억제하고, proteoglycan(PG) 및 glycosaminoglycan(GAG)의 파괴를 억제함으로써, 골관절염 치료에 우수한 효과를 나타낸다.

도 1은 토끼 연골조직세포에 참당귀 추출물을 처리하고 24시간 배양한 후의 세포 생존률을 참당귀 추출물 농도별로 보여주는 그래프이다.
도 2는 IL-1α로 염증이 유도된 토끼 연골조직세포에 참당귀 추출물을 처리하고 24시간 배양한 후의 NO 생성량을 참당귀 추출물 농도별로 보여주는 그래프이다.
도 3은 참당귀 추출물 처리에 따른 연골조직 내 iNOS 유전자(mRNA) 수준 변화를 참당귀 추출물 농도별로 보여주는 RT-PCR 결과이다.
도 4는 참당귀 추출물 처리에 따른 연골조직 내 iNOS 단백질 수준 변화를 참당귀 추출물 농도별로 보여주는 웨스턴 블라팅 결과이다.
도 5는 참당귀 추출물 처리에 따른 연골조직 내 COX-2 유전자(mRNA) 수준 변화를 참당귀 추출물 농도별로 보여주는 RT-PCR 결과이다.
도 6은 참당귀 추출물 처리에 따른 연골조직 내 COX-2 단백질 수준 변화를 참당귀 추출물 농도별로 보여주는 웨스턴 블라팅 결과이다.
도 7은 참당귀 추출물 처리에 따른 연골조직 내 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 유전자 수준 변화를 참당귀 추출물 농도별로 보여주는 RT-PCR 결과이다.
도 8은 참당귀 추출물 처리에 따른 혈청 내 TNF-α 함량 변화를 참당귀 추출물 투여 농도별로 보여주는 그래프이다.
도 9는 참당귀 추출물 처리에 따른 혈청 내 IL-1β 함량 변화를 참당귀 추출물 투여 농도별로 보여주는 그래프이다.
도 10은 참당귀 추출물 처리에 따른 혈청 내 IL-6 함량 변화를 참당귀 추출물 투여 농도별로 보여주는 그래프이다.
도 11은 참당귀 추출물 처리에 따른 시험동물의 체중을 처리 기간별로 나타낸 결과이다.
도 12는 참당귀 추출물 처리된 시험동물의 슬관절 활액 내의 글리코사미노글리칸 (Glycosaminoglycan; GAG) 함량을 대조군 및 정상군과 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 13은 참당귀 추출물 처리된 시험동물의 슬관절 활액 내의 Tumor necrosis factor (TNF-a) 함량을 대조군 및 정상군과 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 14는 참당귀 추출물 처리된 시험동물의 관절연골 조직 내의 프로테오글리칸(PG) 함유량을 대조군 및 정상군과 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 15는 참당귀 추출물의 HPLC 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 16은 IL-1α로 염증이 유도된 토끼 연골조직세포에 참당귀 추출물 또는 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리시의 NO 생성량을 보여주는 그래프이다.
도 17은 참당귀 추출물 또는 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리에 따른 연골조직 내 iNOS mRNA발현 수준 변화를 보여주는 그래프이다.
도 18은 참당귀 추출물 또는 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리에 따른 혈청 내 TNF-α 함량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 19는 참당귀 추출물 또는 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리에 따른 혈청 내 IL-1β 함량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 20은 참당귀 추출물 또는 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리에 따른 MMP-3 발현량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 21는 참당귀 추출물 또는 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리에 따른 MMP-13 발현량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 22는 참당귀 추출물 또는 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리에 따른 슬관절 활액 내 GAG 함량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 23은 참당귀 추출물 또는 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리에 따른 관절 연골 내 PG 함량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 24는 참당귀와 당귀의 혼합 추출물의 혼합비에 따른 MMP-3 발현량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 25는 참당귀와 당귀의 혼합 추출물의 혼합비에 따른 MMP-13 발현량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 26은 참당귀와 당귀의 혼합 추출물의 혼합비에 따른 슬관절 활액 내 GAG 함량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 27은 참당귀와 당귀의 혼합 추출물의 혼합비에 따른 관절 연골 내 PG 함량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 28은 에탄올 추출물 또는 에탄올 냉침 추출물 처리에 따른 MMP-3 발현량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 29는 에탄올 추출물 또는 에탄올 냉침 추출물 처리에 따른 MMP-13 발현량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 30은 에탄올 추출물 또는 에탄올 냉침 추출물 처리에 따른 슬관절 활액 내 GAG 함량 변화를 보여주는 그래프이다.
도 31은 에탄올 추출물 또는 에탄올 냉침 추출물 처리에 따른 관절 연골 내 PG 함량 변화를 보여주는 그래프이다.

실시예 1: 추출물의 제조

1.1. 참당귀 추출물의 제조

참당귀(Angelica gigas Nakai) 뿌리를 깨끗한 물을 이용하여 세척한 후 충분히 건조하였다. 건조된 참당귀 뿌리를 파쇄하고 얻은 분말 100g에 5 부피배(500ml)의 에탄올 (98%(v/v) 에탄올(주정))을 첨가하고, 40~50℃에서 4 시간 이상 추출한 후, 1um(micrometer) 필터로 여과한 여액을 원래 중량의 10%가 될 때까지 가온 농축하였다. 상기 얻어진 농축물에 결정셀룰로오스를 서서히 가하면서 계속 농축하여 완전히 건조시킨 후 분말화하여 참당귀 에탄올 추출물 분말을 제조하였다.

1.2. 천궁 추출물의 제조

천궁(Cnidium officinale) 뿌리를 깨끗한 물을 이용하여 세척한 후 충분히 건조하였다. 건조된 뿌리를 파쇄하고 얻은 분말 100g에 5 부피배 (500ml)의 에탄올 (98%(v/v) 에탄올(주정))을 첨가하고, 40~50℃에서 4 시간 이상 추출한 후, 1um(micrometer) 필터로 여과한 여액을 원래 중량의 10%가 될 때까지 가온 농축하였다. 상기 얻어진 농축물에 결정셀룰로오스를 서서히 가하면서 계속 농축하여 완전히 건조시킨 후 분말화하여 천궁 에탄올 추출물 분말을 제조하였다.

1.3. 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물의 제조 (1:1, 2:1, 4:1 및 5:1 혼합 추출물)

상기 실시예 1.1에서 준비된 참당귀 에탄올 추출물 분말과 실시예 1.2에서 준비된 천궁 에탄올 추출물 분말을 중량 기준으로 1:1, 2:1, 4:1, 및 5:1 (참당귀 중량:천궁 중량)의 비율로 혼합하여 참당귀 및 천궁의 1:1, 2:1, 4:1, 및 5:1 혼합 추출물을 각각 제조하였다.

비교예 1: 참당귀 물 추출물의 제조

참당귀 2kg에 증류수 5,000ml를 가하여 수욕조 (약 90℃)에서 8시간씩 4회 추출 후, 여과하여 농축기로 용매를 증발시켜서 생약 추출물을 얻었다. 상기 얻어진 추출물을 동결건조기로 12시간동안 동결 건조하고 분말화하여 건조 분말상태의 참당귀 물 추출물 분말을 준비하였다.

비교예 2: 참당귀 및 천궁의 혼합 물 추출물의 제조

천궁 2kg에 증류수 5,000ml를 가하여 수욕상에서 8시간씩 4회 추출 후, 여과하여 농축기로 용매를 증발시켜서 생약 추출물을 얻었다. 상기 얻어진 추출물을 동결건조기로 12시간동안 동결 건조하고 분말화하여 건조 분말 상태의 천궁 물 추출물 분말을 얻었다. 상기 얻어진 천궁 물 추?물 분말과 비교예 1에서 얻어진 참당귀 물 추출물을 중량 기준으로 2:1(참당귀 중량:천궁 중량)의 비율로 혼합하여 참당귀 및 천궁 혼합 물 추출물을 얻었다.

비교예 3: 참당귀 에탄올 냉침 추출물의 제조

1첩 분량(168g)의 참당귀를 한약재분쇄기를 이용하여 100-200메쉬 크기로 분쇄시킨 후 95%(v/v) 에탄올 약 1,500ml(약 1:10 weight/volume)를 가하여 5일간 냉침 추출한 다음, Whatman filter paper NO.4를 사용하여 추출물 내 고형분을 제거한 후, 회전감압농축기(rotary vacuum evaporator)를 이용해 감압 농축시켜 참당귀 에탄올 냉침 추출물을 얻었다. 상기 얻어진 추출물을 동결건조기로 12시간동안 동결 건조하고 분말화하여 건조 분말상태의 참당귀 에탄올 냉침 추출물을 제조하였다.

비교예 4: 참당귀 및 천궁의 혼합 에탄올 냉침 추출물의 제조

1첩 분량(168g)의 천궁을 한약재분쇄기를 이용하여 100-200메쉬 크기로 분쇄시킨 후, 95% 에탄올 약 1,500ml(약 1:10 weight/volume)를 가하여 5일간 냉침 추출한 다음, Whatman filter paper NO.4를 사용하여 추출물 내 고형분을 제거한 후, 회전감압농축기(rotary vacuum evaporator)를 이용해 감압 농축시켜 천궁 에탄올 냉침 추출물을 얻었다. 상기 얻어진 천궁 에탄올 냉침 추출물과 상기 비교예 3에서 얻어진 참당귀 에탄올 냉침 추출물을 중량 기준으로 2:1(참당귀 중량:천궁 중량)의 비율로 혼합하여 참당귀 및 천궁의 혼합 에탄올 냉침 추출물을 얻었다. 상기 얻어진 혼합 추출물을 동결건조기로 12시간동안 동결 건조하고 분말화하여 건조 분말상태의 참당귀 및 천궁의 혼합 에탄올 냉침 추출물을 제조하였다.

참고예 1: 실험동물 준비 1

6주령의 수컷 Sprague-Dawley계 흰쥐 (오리엔트바이오, 한국) 60마리를 구입하여 온도 23±2℃, 습도 55±5%, 12시간 주기의 명암 조건에서 1주간 적응시킨 후, 실험에 사용하였다. 실험기간 동안 사료는 실험동물용 사료 (삼양유지사료(주), 한국)와 멸균된 음용수를 자유로이 공급하였다.

1주간 적응을 거친 실험동물의 체중을 측정하여 각 군당 12마리씩 5개군(정상군, 대조군, 처리군 1, 처리군 2 및 처리군 3)으로 고르게 배정하였다. 골관절염 유발을 위하여 Zoletile(바이엘코리아(한국))과 Rumpun(바이엘코리아(한국))이 2:1의 중량비로 혼합된 마취제를 흰쥐에 투여하여 마취시킨 후, 양쪽 무릎주변을 깨끗이 제모하고 1 mL 주사기를 이용하여 양쪽 슬관절강 내에 생리식염수로 희석된 MIA (monosodium iodoacetate, 30 mg/mL; Sigma Chemical Co.(USA)) 용액 0.1 mL을 주사하였다.

정상군(N)은 양쪽 슬관절강 내에 각각 주사용 생리식염수 0.1 mL을 주사하고, 증류수 1 mL을 2일간 매일 1회씩 경구 투여하였다. 대조군(C)은 양쪽 슬관절강내에 MIA 용액 0.1 mL을 주사하여 골관절염을 유발시키면서 증류수 1 mL을 2일간 매일 1회씩 경구 투여하였다. 처리군(25, 50 및 100 mg/kg)은 양쪽 슬관절강 내에 MIA 용액 0.1 mL을 주사하여 골관절염을 유발시키고, 상기 실시예 1.1에서 제조된 참당귀 에탄올 추출물 분말 또는 실시예 1.3에서 제조된 참당귀 또는 천궁의 혼합 추출물 분말을 각각 25 mg/kg, 50 mg/kg, 및 100 mg/kg 농도로 증류수에 희석한 시험물질 1 mL을 2일간 매일 1회씩 경구 투여하였다.

참고예 2: 실험 세포 준비

2~3주령 New Zealand white 토끼 관절로부터 연골조직을 분리하고, 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)이 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium,Gibco BRL) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하여, 토끼 연골조직세포(chondrocyte)를 준비하였다.

참고예 3: 시험동물 준비 2

참고예 1과 같이 사육실에서 1 주간 적응을 거친 실험동물의 체중을 측정하여 각 군당 10 마리씩 3 개군 (정상군, 대조군 및 처리군)으로 고르게 배정하였다.

정상군은 양쪽 슬관절강 내에 각각 주사용 생리식염수 0.1mL을 주사하고, 증류수 1mL을 3 주간 1 일 1 회씩 경구 투여하였다. 대조군은 양쪽 슬관절강 내에 MIA 용액 0.1 mL을 주사하여 골관절염을 유발시키면서 증류수 1mL을 3주간 1 일 1 회씩 경구 투여하였다. 처리군은 양쪽 슬관절강 내에 MIA 용액 0.1mL을 주사하여 골관절염을 유발시키면서 상기 실시예 1.1에서 제조된 참당귀 추출물 분말, 실시예 1.3에서 제조된 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 분말, 또는 비교예 1에서 제조된 참당귀의 물추출물을 각각 100mg/kg 농도로 증류수에 희석한 시험물질 1mL을 3주간 1 일 1 회씩 경구 투여하였다.

참고예 4: 통계처리

하기 실시예 2 내지 6에서 얻은 정량적인 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's t-test를 이용하여 통계처리 하였으며, 유의성은 *p<0.05 및 **p<0.01수준에서 검정하였고, 그 값은 평균(mean)±표준편차(Standard deviation)로 표기하였다.

하기 실시예 7 내지 11에서 얻은 정량적인 결과는 SPSS (SPSS 10.1)를 이용하여 student's t-test를 실시하여 검증하였으며, 유의성은 p<0.01 수준에서 판단하였고, 그 값은 평균(mean)±표준편차(Standard deviation)로 표기하였다.

실시예 2: 세포독성 측정

참당귀 추출물의 세포독성 유무를 알아보기 위하여, Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan)를 이용하여 WST (water soluble tetrazolium salt) assay를 실시하였다. 상기 참고예 2에서 준비한 토끼 연골조직세포를 96 well plate에 1×10⁵ cells/well로 접종하고 12시간 배양한 다음, 상기 실시예 1.1에서 제조된 참당귀 에탄올 추출물 분말을 농도별(0, 5, 10, 25 및 50 ㎍/mL)로 각각 처리하여 24시간 배양하였다. 각 well 당 10 ㎕의 WST-8 용액(Dojindo, Japan)을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 3시간 반응시킨 후, ELISA reader (BIO-TEK Instruments Inc., Power wave X340, Winooski, VT, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여, 참당귀 추출물 처리에 따른 세포생존률을 구하였다. 실험값은 참당귀 추출물 분말을 처리하지 않은 대조군에 대한 백분율로 표시하였다.

　상기 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 실험에 사용된 모든 농도에서 100% 이상의 세포생존율을 보였으며, 이는 참당귀 에탄올 추출물이 세포독성이 없음을 보여주는 것이다.

실시예 3: NO (nitric oxide) 생성량 측정

참당귀 추출물의 NO 생성 억제능을 알아보기 위하여 Griess reagent 반응법을 이용하였다. 상기 참고예 2에서 준비된 토끼 연골조직세포를 96 well plate에 1x10⁵cells/well로 접종하고 12시간 배양한 다음, IL-1α (interleukin-1α, Miltenyi Biotec., Germany)와 상기 실시예 1.1에서 제조된 참당귀 에탄올 추출물 분말 (처리 농도: 0, 5, 10, 25 및 50 ㎍/mL)을 단독 또는 함께 처리하여 24시간 배양하였다. 상기 IL-1α는 염증을 유도하기 위한 것이며, 5ug(microgram)/ml의 양으로 사용하였다. 배양액에 동일한 양의 Griess reagent (1% sulfanilamide 및 0.1% N-[1-naphthy]-ethylenediamine dihydrochloride in 5% phosphoric acid)를 첨가하고 실온에서 10분간 반응시킨 후, ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO 농도는 NaNO₂ 표준액을 이용하여 정량곡선을 작성한 후, 이를 기준으로 계산하였다.

상기 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 토끼 연골조직세포에서 IL-1α만 처리한 군의 NO 생성량은 약 20 uM(micromole)로서 IL-1α를 처리하지 않은 군에 비해 약 10배 가량 NO 생성량이 증가되는 것으로 확인되었다. 여기에 다양한 농도의 참당귀 에탄올 추출물 처리 시, 시험된 모든 농도 범위에서 NO 생성량이 감소하는 것이 관찰되었으며, 이러한 결과로부터 참당귀 에탄올 추출물이 염증이 유도된 환경에서 NO 생성을 억제함을 확인할 수 있다.

또한, 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물의 상승된 NO 생성 억제 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1.1에서 준비된 참당귀 에탄올 추출물과 실시예 1.3에서 준비된 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물에 대하여 상기와 동일한 시험을 수행하였다. 이 때, 참당귀 에탄올 추출물과 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물의 처리량은 각각 50ug/mL로 하였다.

상기 얻어진 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에서 'N'은 정상 토끼의 연골 조직세포, 'C'는 IL-1α만 처리한 토끼의 연골조직세포, 'C+참당귀추출분말'은 IL-1α와 참당귀 에탄올 추출물을 처리한 토끼의 연골조직세포, 'C+참당귀,천궁 혼합추출물' IL-1α와 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물을 처리한 토끼의 연골조직세포를 각각 의미하며, 각 수치는 'IL-1α만 처리한 토끼의 연골조직세포'에서의 NO 생성량을 100%로 하여 이에 대한 상대값(%)으로 표시하였다. 도 16에서 확인되는 바와 같이, IL-1α만 처리한 토끼의 연골조직세포와 비교하여 참당귀 에탄올 추출물 또는 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물을 처리한 토끼의 연골조직세포에서의 NO 생성량이 현저히 감소하였으며, 특히 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물을 처리한 토끼의 연골조직세포에서의 NO 생성량 감소 정도가 높게 나타났다.

실시예 4: 연골조직 내 iNOS , COX-2, TNF -α, IL- 1β 및 IL-6 유전자 및 단백질 수준 측정

참당귀 추출물이 iNOS (inducible nitric oxide synthase), COX-2 (cyclooxygenase-2), TNF-α (tumor necrosis factor-α), IL-1β (interleukin-1β) 및 IL-6 (interleukin-6) 유전자 및 단백질 발현 억제에 미치는 영향을 시험하였다.

우선 참당귀 추출물이 iNOS (inducible nitric oxide synthase), COX-2 (cyclooxygenase-2), TNF-α (tumor necrosis factor-α), IL-1β (interleukin-1β) 및 IL-6 (interleukin-6) 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 상기 참고예 1에서 준비된 시험동물 (참당귀 에탄올 추출물 분말 투여군)에 MIA를 주사하고 2일이 경과한 시점에서 연골을 적출하여 분쇄한 후, total RNA extraction kit (iNtRON Biotechnology Inc., Korea)를 이용하여 연골조직으로부터 total RNA를 분리하였다. Total RNA를 정량하고, RT-PreMix (iNtRON Biotechnology Inc.)를 이용하여 동일한 양(1ug )의 각 total RNA로부터 각각의 cDNA를 합성하였다. iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 β-actin의 각각의 유전자에 해당되는 프라이머를 사용하여 94℃ 1분, 50~65℃ 45초, 72℃ 1분, 총 30 cycles 조건으로 RT-PCR을 수행하였다. 상기 RT-PCR에 사용된 프라이머를 아래의 표 1에 정리하였다.

Gene	Primer sequence	Product length (bp)
iNOS	Forward: TTCTTTGCTTCTGTGCTTAATGCG (SEQ ID NO: 1) Reverse: GTTGTTGCTGAACTTCCAATCGT (SEQ ID NO: 2)	1061
COX-2	Forward: CTGCATGTGGCTGATGTCATC (SEQ ID NO: 3) Reverse: AGGACCCGTCATCTCCAGGGTAATC (SEQ ID NO: 4)	1061
TNF-α	Forward: GTAGCCCACGTCGTAGCAAA (SEQ ID NO: 5) Reverse: CCCTTCTCCAGCTGGAAGAC (SEQ ID NO: 6)	346
IL-1β	Forward TGATGTTCCCATTAGACAGC (SEQ ID NO: 7) Reverse GAGGTGCTGATGTACCAGTT (SEQ ID NO: 8)	378
IL-10	Forward: CAGTCAGCCAGACCCACAT (SEQ ID NO: 9) Reverse: GCTCCACTGCCTTGCTTT (SEQ ID NO: 10)	322
β-actin	Forward: TTGTAACCAACTGGGACGATATGG (SEQ ID NO: 11) Reverse: GATCTTGATCTTCATGGTGCTAG (SEQ ID NO: 12)	764

또한, 참당귀 추출물이 iNOS 및 COX-2 단백질 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 western blot analysis를 수행하였다. 상기 참고예 1에서 준비된 시험동물(참당귀 에탄올 추출물 분말 투여군)에 MIA를 주사하고 2일이 경과한 시점에서 연골을 적출하여 분쇄한 후, Lysis buffer (Cell Signaling, Danvers, MA, USA)를 이용하여 연골조직 내 단백질을 수집하였다. BCA protein assay reagent kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 단백질 농도를 측정한 후, 동일한 양(20 ug)의 각 단백질을 10% SDS-PAGE gel에 전기영동하고, nitrocellulose membrane (Whatman, Dassel, Germany) 상으로 이동시켰다. 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위하여 membrane에 5wt% 탈지분유를 넣고 1시간 반응시킨 다음, 항-iNOS 항체 (BD, USA), 항-COX-2 항체 (Santa Cruz Biotechnology Inc, CA, USA) 및 항-β-actin 항체 (Sigma)가 첨가된 5wt% 탈지분유로 교체하여 4℃에서 12시간 반응시켰다. TBST (50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20)로 5분간 3회 세척하고 각각에 대한 이차항체로 실온에서 1시간 반응시킨 후, ECL 용액 (Amersham Pharmacia Biotech., NJ, USA)을 이용하여 각 단백질의 발현을 확인하였다.

상기 얻어진 참당귀 에탄올 추출물 처리에 따른 iNOS 유전자(mRNA) 및 단백질 수준 변화를 도 3 (mRNA 발현량) 및 도 4 (단백질 발현량)에 각각 나타내었다. 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군(C)에서는 iNOS의 mRNA 및 단백질 수준이 모두 크게 증가되었으나, 처리군(25, 50 및 100 mg/kg)에서는 iNOS mRNA 및 단백질 수준이 모두 참당귀 에탄올 추출물 투여 농도에 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있다.

상기 얻어진 참당귀 에탄올 추출물 처리에 따른 COX-2 유전자 및 단백질 수준 변화를 도 5 (mRNA 발현량) 및 도 6 (단백질 발현량)에 각각 나타내었다. 도 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 정상군(N)에서 COX-2 mRNA 및 단백질 발현이 관찰되지 않은 반면 대조군(C)에서는 COX-2의 mRNA 및 단백질 수준이 모두 크게 증가되었으나, 참당귀 에탄올 추출물 처리군(25, 50 및 100 mg/kg)에서는 COX-2 mRNA 및 단백질 수준이 모두 참당귀 에탄올 추출물 투여 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있다.

상기 얻어진 참당귀 에탄올 추출물 처리에 따른 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 유전자 수준 변화를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 정상군(N)에 비해 대조군(C)에서는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현이 모두 크게 증가되었으나, 참당귀 에탄올 추출물 처리 시, TNF-α, IL-1β, 및 IL-6의 mRNA의 수준이 모두 감소하는 것을 확인할 수 있다.

상기 도 3 내지 도 7의 결과는 참당귀 에탄올 추출물이 연골조직에서의 염증과 관련된 인자의 유전자 및 단백질 발현을 억제하여 그 수준을 크게 감소시키는 효과를 가짐을 입증한다.

또한, 참당귀와 천궁의 혼합 추출물의 iNOS 발현에 대한 효과를 확인하기 위하여, 상기 참고예 1에서 준비된 시험동물(참당귀 에탄올 추출물 분말 투여군 및 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 분말 투여군; 각각 100mg/kg의 양으로 투여함)에 대하여 상기와 동일한 방법으로 iNOS 발현량 시험을 위한 RT-PCR을 수행한 후, 이를 정량화하여 도 17에 나타내었다.

도 17에서 'N'은 정상 흰쥐의 연골 조직세포, 'C'는 MIA 주사 후 추출물 무처리군, 'C+참당귀추출분말'은 MIA 주사 후 참당귀 에탄올 추출물 처리군, 'C+참당귀,천궁 혼합추출물' MIA 주사 후 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리군을 각각 의미하며, 각 수치는 ' MIA 주사 후 추출물 무처리군'에서의 iNOS 발현량을 100%로 하여 이에 대한 상대값(%)으로 표시하였다. 도 17에서 확인되는 바와 같이, MIA 주사 후 추출물 무처리군과 비교하여, 참당귀 에탄올 추출물 처리군 또는 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리군의 연골조직에서의 iNOS 발현량이 현저히 감소하였으며, 특히 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리군의 연골조직에서의 iNOS 발현량 감소 정도가 높게 나타났다.

실시예 5: 혈청 내 TNF -α, IL- 1β 및 IL-6 함량 측정

MIA 주사 후 2일이 경과한 시험동물 (참고예 1의 참당귀 에탄올 추출물 분말 투여군)의 혈액에서 혈청을 분리한 뒤, 염증성 지표로서 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6의 함량을 ELISA assay kit (R&D Systems, Minneapolis, MI, USA)를 이용하여 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 8(TNF-α의 함량), 도 9(IL-1β 함량), 및 도 10(IL-6 함량)에 각각 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, TNF-α 함량은, 대조군(C)에서 100±4.9%였을 때, 정상군(N)은 63.2±5.2%, 처리군(25, 50 및 100 mg/kg)은 각각 95±3.8%, 87.6±5.1%, 및 79.2±6.7%로 나타나, 참당귀 에탄올 추출물 투여에 의하여 혈청 내 TNF-α 함량이 감소함을 확인할 수 있다. 도 9에 나타낸 바와 같이, IL-1β 함량은, 대조군에서 100±5.8%였을 때, 정상군은 61.2±6.4%, 처리군(25, 50 및 100 mg/kg)은 각각 90.5±8.2%, 73.1±4.1%, 및 68.4±6.0%로 나타나, 참당귀 에탄올 추출물 투여에 의하여 혈청내 IL-1β 함량이 감소함을 확인할 수 있다. 또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, IL-6 함량은, 대조군에서 100±3.9%였을 때, 정상군은 63.9±4.7%, 처리군(25, 50 및 100 mg/kg)은 각각 89.0±6.5%, 72.6±6.1%, 및 69.3±4.2%로 나타나, 참당귀 추출물 투여에 의하여 혈청 내 IL-6 함량이 감소함을 확인할 수 있다.

또한, MIA 주사 후 2일이 경과한 시험동물 (참고예 1의 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 분말 투여군: 투여량; 100mg/kg)에 대해서도 상기와 동일한 시험을 수행하여, 그 결과를 참고예 1의 참당귀 에탄올 추출물 분말 투여군 (투여량: 100mg/kg)의 결과와 함께 도 18 (TNF-alpha 발현량; %) 및 도 19 (IL-1beta 발현량; %)에 각각 나타내었다.

도 18 및 도 19에서 'N'은 정상 흰쥐의 연골 조직, 'C'는 MIA 주사 후 추출물 무처리군, 'C+참당귀추출분말'은 MIA 주사 후 참당귀 에탄올 추출물 처리군, 'C+참당귀,천궁 혼합추출물' MIA 주사 후 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리군을 각각 의미하며, 각 수치는 'MIA 주사 후 추출물 무처리군'에서의 TNF-alpha 발현량 또는 IL-1beta 발현량을 100%로 하여 이에 대한 상대값(%)으로 표시하였다. 도 18 및 도 19에서 확인되는 바와 같이, MIA 주사 후 추출물 무처리군과 비교하여, 참당귀 에탄올 추출물 처리군 또는 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리군의 연골조직에서의 TNF-alpha 발현량 및 IL-1beta 발현량이 현저히 감소하였으며, 특히 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리군의 연골조직에서의 TNF-alpha 발현량 및 IL-1beta 발현량 정도가 정상 연골조직 수준에 가깝게 감소한 것으로 나타났다.

실시예 6: matrix metalloproteinase ( MMP ) 발현에 미치는 영향 시험

6.1. 참당귀 에탄올 추출물 및 참당귀와 천궁의 혼합 에탄올 추출물의 MMP 발현에 미치는 영향 시험

matrix metalloproteinases (MMPs)는 연골 조직의 이화작용에 관여하는 주요 단백질로서, 그 중에서도 특히 MMP-3, MMP-13 등은 퇴행성 골관절염에서 발현 및 활성이 크게 증가되는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 실시예에서는 참당귀 추출물 및 참당귀와 천궁의 혼합 추출물의 MMP-3 및 MMP-13 발현에 미치는 영향을 시험하였다.

상기 참고예 3에서 준비된 골관절염 유발 흰쥐 (참당귀 에탄올 추출물 분말 투여군 (투여량: 100mg/kg) 및 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 분말 투여군 (투여량: 100mg/kg)의 슬관절연골을 적출하여 분쇄한 후, total RNA extraction kit (iNtRON Biotechnology Inc., Korea)를 이용하여 연골조직으로부터 total RNA를 분리하였다. Total RNA를 정량하고, RT-PreMix (iNtRON Biotechnology Inc.)를 이용하여 1 ㎍씩 동일한 양의 각 total RNA로부터 각각의 cDNA를 합성하였다. MMP-3 및 MMP-13 각각의 유전자에 해당되는 프라이머를 사용하여 94℃ 1분, 50~65℃ 45초, 72℃ 1분, 총 30 cycles의 조건으로 RT-PCR을 수행하였다.

프라이머

MMP-3

Forward: GAGTGTGGATTCTGCCATTGAG (SEQ ID NO: 13)

Reverse: TTATGTCAGCCTCTCCTTCAGAGA (SEQ ID NO: 14)

MMP-13

Forward: ACGTTCAAGGAATCCAGTCTCTCT (SEQ ID NO: 15)

Reverse: GGATAGGGCTGGGTCACACTT (SEQ ID NO: 16)

상기 얻어진 결과를 도 20 (MMP-3 발현량) 및 도 21 (MMP-13 발현량)에 나타내었다.

도 20 및 도 21에서 'N'은 정상 흰쥐의 연골 조직, 'C'는 MIA 주사 후 추출물 무처리군, 'C+참당귀추출분말'은 MIA 주사 후 참당귀 에탄올 추출물 처리군, 'C+참당귀,천궁 혼합추출물' MIA 주사 후 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리군을 각각 의미하며, 각 수치는 'MIA 주사 후 추출물 무처리군'에서의 MMP-3 발현량 또는 MMP-13 발현량을 100%로 하여 이에 대한 상대값(%)으로 표시하였다. 도 20 및 도 21에서 확인되는 바와 같이, MIA 주사 후 추출물 무처리군과 비교하여, 참당귀 에탄올 추출물 처리군 또는 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리군의 연골조직에서의 MMP-3 발현량 및 MMP-13 발현량이 현저히 감소하였으며, 특히 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 처리군의 연골조직에서의 MMP-3 발현량 및 MMP-13 발현량 감소 정도가 보다 현저한 것으로 나타났다.

6.2. 참당귀와 천궁의 혼합 추출물의 혼합비에 따른 MMP 발현에 미치는 영향 시험

상기 실시예 6.1과 동일한 방법으로, 참당귀와 천궁의 혼합 비율에 따른 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물의 MMP-3 및 MMP-13 발현에 미치는 영향을 시험하였다 (투여량: 100mg/kg).

상기 얻어진 MMP-3 발현량 결과를 하기의 표 2 및 도 24에 나타내었다:

	N	C	참당귀:천궁; 1:1	참당귀:천궁; 2:1	참당귀:천궁; 4:1	참당귀:천궁; 5:1
MMP-3 발현량, %	4.385	100	81.9016	32.4638	34.323	40.405

상기 얻어진 MMP-13 발현량 결과를 하기의 표 3 및 도 25에 나타내었다:

	N	C	참당귀:천궁; 1:1	참당귀:천궁; 2:1	참당귀:천궁; 4:1	참당귀:천궁; 5:1
MMP-13 발현량, %	7.7918	100	64.61499	31.5445	15.848	17.4016

표 2 및 3, 및 도 24 및 25에서, 'N'은 정상 흰쥐의 연골 조직, 'C'는 MIA 주사 후 추출물 무처리군을 각각 의미하며, 각 수치는 'MIA 주사 후 추출물 무처리군'에서의 MMP-3 발현량 또는 MMP-13 발현량을 100%로 하여 이에 대한 상대값(%)으로 표시하였다. 표 2 및 3, 및 도 24 및 25에서 확인되는 바와 같이, MIA 주사 후 추출물 무처리군과 비교하여, 참당귀와 천궁의 혼합 추출물의 처리군의 처리군의 연골조직에서의 MMP-3 발현량 및 MMP-13 발현량이 현저히 감소하고, 특히, 참당귀와 천궁의 2:1 혼합 추출물, 4:1 혼합 추출물 및 5:1 혼합 추출물의 처리군의 경우, 참당귀와 천궁의 1:1 혼합 추출물과 비교하여, 연골조직에서의 MMP-3 발현량 및 MMP-13 발현량이 보다 더 감소하는 것으로 나타났다.

6.3. 에탄올 추출물과 에탄올 냉침 추출물의 MMP 발현에 미치는 영향 시험

상기 실시예 6.1과 동일한 방법으로, 참당귀 에탄올 추출물 (실시예 1.1)과 참당귀와 천궁의 혼합 에탄올 추출물 (실시예 1.3; 2:1 혼합비)의 MMP-3 및 MMP-13 발현에 미치는 영향을 시험하여, 참당귀 물 추출물 (비교예 1) 참당귀 에탄올 냉침 추출물 (비교예 3), 참당귀와 천궁의 혼합 물 추출물 (비교예 2) 및 참당귀와 천궁의 혼합 에탄올 냉침 추출물(비교예 4)과 비교하였다 (투여량: 100mg/kg).

상기 얻어진 MMP-3 발현량(%) 결과를 하기의 표 4 및 도 28에 나타내었다:

	N	C	참당귀 물 추출물	참당귀 에탄올 냉침 추출물	참당귀 에탄올 추출물	참당귀 및 천궁 혼합 물 추출물	참당귀 및 천궁 혼합 에탄올 냉침 추출물	참당귀 및 천궁 혼압 에탄올 추출물
MMP-3	5.35289	100	91.6314	74.8041	55.3586	77.0822	39.5443	28.4804

상기 얻어진 MMP-13 발현량(%) 결과를 하기의 표 5 및 도 29에 나타내었다:

	N	C	참당귀 물 추출물	참당귀 에탄올 냉침 추출물	참당귀 에탄올 추출물	참당귀 및 천궁 물 추출물	참당귀 및 천궁 에탄올 냉침 추출물	참당귀 및 천궁 혼압 에탄올 추출물
MMP-13	4.9827	100	81.3088	42.5082	28.3135	63.4666	30.6137	20.5336

표 4 및 5, 및 도 28 및 29에서, 'N'은 정상 흰쥐의 연골 조직, 'C'는 MIA 주사 후 추출물 무처리군을 각각 의미하며, 각 수치는 'MIA 주사 후 추출물 무처리군'에서의 MMP-3 발현량 또는 MMP-13 발현량을 100%로 하여 이에 대한 상대값(%)으로 표시하였다. 표 4 및 5, 및 도 28 및 29에서 확인되는 바와 같이, MIA 주사 후 추출물 무처리군, 참당귀 물추출물, 참당귀 에탄올 냉침 추출물, 참당귀와 천궁의 혼합 물 추출물, 및 참당귀와 천궁의 혼합 에탄올 냉침 추출물과 비교하여, 참당귀 에탄올 추출물 및 참당귀와 천궁의 혼합 에탄올 추출물의 처리군의 연골조직에서의 MMP-3 발현량 및 MMP-13 발현량이 현저히 감소하는 것으로 나타났다.

실시예 7: 체중 측정

상기 참고예 3에서 준비된 시험동물 (참당귀 에탄올 추출물 분말 투여군)의 체중을 실험개시일, 4일, 8일, 12일, 16일, 및 20일에 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 아래의 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타난 바와 같이, 대조군(control)은 정상군 (normal group)에 비하여 실험 12일째부터 실험 20일까지 체중의 증가 속도가 유의성 있게 감소하였다. 처리군(treated group)은 실험 8일째부터 실험 20일까지 대조군에 비하여 체중이 높았으며 실험 16일부터는 대조군에 비하여 체중이 유의성있게 증가하였다. 상기 결과는 참당귀 에탄올 추출물이 시험동물 생체에 유해한 효과를 나타내지 않음을 보여준다.

실시예 8: 슬관절 활액 내 Glycosaminoglycan (GAG) 함량 측정

8.1. 참당귀 에탄올 추출물 및 참당귀와 천궁의 혼합 에탄올 추출물의 슬관절 활액 내 GAG 함량에 대한 영향 시험

골관절염으로 파괴되어 활액 내로 유입된 GAG 함량을 측정하면 관절연골 내 GAG의 손상 정도와 관절염이 진행 정도를 간접적으로 파악할 수 있다.

슬관절 활액 내 GAG 함량은 Sulfated Glycosaminoglycan Assay kit(Biocolor, UK; Blyscan^TM)를 이용하여 DMMB (1,9-dimethylmethylene blue) assay로 측정하였다.

상기 참고예 3 (참당귀 에탄올 추출물 분말 투여군)에서 준비된 시험동물에 MIA를 주사하고 3주째에 슬관절 활액을 채취하고, 여기에 염료(DMMB) 첨가하여 30 분간 반응시킨 후, 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하였다. 그 후, 반응하지 않은 염료가 포함된 상등액을 제거하고, GAG-염료 복합체를 얻은 다음, dissociation 용액 0.5 mL 를 첨가하여 용해시킨 후, 12,000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 시료를 획득하였다.

각 시료의 상등액 200uL(microliter)를 96 웰 플레이트에 넣고 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, USA)를 이용하여 656 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 GAG 함량은 표준물질로 사용된 bovine chondroitin sulfate 의 표준검량선으로부터 계산하였다 (n=8).

상기 얻어진 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에 나타난 바와 같이, 슬관절 활액 내 GAG 함량은 정상군에 비해 대조군 및 처리군 모두에서 유의성 있게 증가되었다. 이는 MIA로 인해 골관절염이 유도됨에 따라 관절연골에 존재하는 GAG가 활액 내로 빠져나가 생긴 현상이다. 그러나, 처리군의 GAG 함량은 대조군에 비해 유의성 있게 감소됨을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 참당귀 에탄올 추출물이 관절연골 내 GAG 소실을 억제함을 보여주는 것이다.

상기와 동일한 시험을 참고예 3에서 준비된 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물 분말 투여군 및 참당귀 물 추출물 투여군에 대해서도 수행하였다.

상기 얻어진 결과 (3회 수행 후의 평균 값)를 아래의 표 6 및 도 22에 나타내었다:

	N	C	C+참당귀 물추출물 투여군	C+참당귀 에탄올 추출물 투여군	C+참당귀 및 천궁 혼합 추출물 투여군
활액 내 GAG 농도 (ug/50uL)	0.513611	2.150499	1.886145	1.266347	0.966823

상기 표 6 및 도 22에서, 'N'은 정상 흰쥐의 연골 조직, 'C'는 MIA에 의한 골관절염 유발 흰쥐를 의미한다. 표 6 및 도 22에서 확인되는 바와 같이, 골관절염 유발 흰쥐에서 참당귀 에탄올 추출물 또는 참당귀와 천궁의 혼합 추출물을 투여한 경우, GAG 소실이 모두 억제되었으며, 특히, 참당귀 물 추출물을 투여한 경우와 비교하여도, 참당귀 에탄올 추출물을 투여한 경우 및 참당귀와 천궁의 혼합 추출물을 투여한 경우에 GAG 소실 억제 효과가 우수하게 나타났다 (P<0.01).

8.2. 참당귀와 천궁의 혼합 추출물의 혼합비에 따른 슬관절 활액 내 GAG 함량에 대한 영향 시험

상기 실시예 8.1과 동일한 방법으로, 참당귀와 천궁의 혼합 비율에 따른 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물(실시예 1.3)의 활액 내 GAG 농도에 대한 효과(관절 연골의 GAG 소실 억제 효과)를 시험하였다.

상기 얻어진 결과 (활액 내 GAG 농도)를 하기의 표 7 및 도 26에 나타내었다:

	N	C	참당귀:천궁; 1:1	참당귀:천궁; 2:1	참당귀:천궁; 4:1	참당귀:천궁; 5:1
활액 내 GAG 농도, ug/uL	0.5713	2.0702	1.8386	0.9456	1.1263	1.1018

상기 표 7 및 도 26에서, 'N'은 정상 흰쥐의 연골 조직, 'C'는 MIA에 의한 골관절염 유발 흰쥐를 의미한다. 표 7 및 도 26에서 확인되는 바와 같이, MIA 주사 후 추출물 무처리군 및 참당귀과 비교하여, 참당귀와 천궁의 1:1 혼합 추출물, 2:1 혼합 추출물, 4:1 혼합 추출물 및 5:1 혼합 추출물 (이상 실시예 1.3)의 처리군 모두에서 활액 내 GAG 농도가 현저하게 감소하고, 특히, 참당귀와 천궁의 2:1 혼합 추출물, 4:1 혼합 추출물 및 5:1 혼합 추출물의 경우, 참당귀와 천궁의 1:1 혼합물과 비교하여, 활액 내 GAG 농도가 보다 더 감소하는 것으로 나타났다. 이와 같은 활액 내 GAG 농도 감소는 우수한 관절 연골의 GAG 소실 억제 효과를 나타낸다.

8.3. 에탄올 추출물과 에탄올 냉침 추출물의 슬관절 활액 내 GAG 함량에 대한 영향 시험

상기 실시예 8.1과 동일한 방법으로, 참당귀 에탄올 추출물 (실시예 1.1)과 참당귀와 천궁의 혼합 에탄올 추출물 (실시예 1.3; 2:1 혼합비)의 활액 내 GAG 농도에 대한 효과(관절 연골의 GAG 소실 억제 효과)를 시험하여, 참당귀 물 추출물 (비교예 1) 참당귀 에탄올 냉침 추출물 (비교예 3), 참당귀와 천궁의 혼합 물 추출물 (비교예 2) 및 참당귀와 천궁의 혼합 에탄올 냉침 추출물(비교예 4)과 비교하였다 (투여량: 100mg/kg).

상기 얻어진 결과 (활액 내 GAG 농도)를 하기의 표 8 및 도 30에 나타내었다:

	N	C	참당귀 물 추출물	참당귀 에탄올 냉침 추출물	참당귀 에탄올 추출물	참당귀 및 천궁 혼합 물 추출물	참당귀 및 천궁 혼합 에탄올 냉침 추출물	참당귀 및 천궁 혼압 에탄올 추출물
활액 내GAG 농도 ug/uL	0.5801	2.2275	1.9747	1.4716	1.21	1.5928	1.352	1.0078

상기 표 8 및 도 30에서, 'N'은 정상 흰쥐의 연골 조직, 'C'는 MIA에 의한 골관절염 유발 흰쥐를 의미한다. 표 8 및 도 30에서 확인되는 바와 같이, MIA 주사 후 추출물 무처리군, 참당귀 물 추출물 (비교예 1) 참당귀 에탄올 냉침 추출물 (비교예 3), 참당귀와 천궁의 혼합 물 추출물 (비교예 2) 및 참당귀와 천궁의 혼합 에탄올 냉침 추출물(비교예 4)과 비교하여, 참당귀 에탄올 추출물 (실시예 1.1)과 참당귀와 천궁의 혼합 에탄올 추출물 (실시예 1.3; 2:1 혼합비)의 처리군 모두에서 활액 내 GAG 농도가 현저하게 감소한 것으로 나타났으며, 이는 상기 혼합비의 혼합 추출물이 우수한 관절 연골의 GAG 소실 억제 효과를 가짐을 보여준다.

실시예 9: 슬관절 활액내 Tumor necrosis factor( TNF -a) 함량 측정

슬관절 활액내 TNF-a 의 함량은 Rat TNF-a ELISA kit(Invitrogen, Camarillo, USA) 를 사용하였다. 상기 참고예 3에서 준비된 시험동물에 MIA를 주사하고 3주째에 슬관절 활액을 채취하였다. 상기 채취된 활액을 incubation buffer 와 1:2 의 비율로 희석한 후, 100 uL를 well-plate 에 가하고 상온에서 2 시간 반응시킨 후 상층액을 제거하였다. 4 회 세척후, Biotin conjugate (Invitrogen, Camarillo, USA) 100 uL와 1 시간 반응시키고, 4 회 세척후 Streptavidin-HRP(Invitrogen, Camarillo, USA) 100 uL를 가하고 30 분 반응시킨 후, 다시 4 회 세척하고 tetramethylbenzidine(TMB) 용액에서 30 분간 반응시켜 발색시키고, 여기에 stop solution을 넣어 반응을 정지시켰다. 상기 얻어진 반응액은 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, USA)를 이용하여 450nm에서의 흡광도를 측정하였다. 계열희석한 0~750 pg/mL 농도 범위의 8 개의 TNF-a 표준액 (0, 11.7, 23.4, 46.9, 93.8, 187.5, 375, 750 pg/mL)의 450nm 에서의 흡광도 범위 (0.05~3.29)에서 나온 검량선을 사용하여 활액 내 TNF-a 의 함량을 측정하였다 (n=8).

상기 얻어진 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에 나타난 바와 같이, 슬관절에서 채취한 활액 내 TNF-a 의 함량은 MIA 처리한 대조군이 정상군보다 2 배 이상 높게 나타난 반면, 참당귀 에탄올 추출물 처리군은 대조군에 비하여 TNF-a 함량이 감소함을 확인할 수 있다.

실시예 10: 관절연골의 프로테오글리칸 ( proteoglycan ; PG ) 함량 측정

10.1. 참당귀 에탄올 추출물 및 참당귀와 천궁의 혼합 에탄올 추출물의 관절 연골의 PG 함량에 대한 영향 시험

참고예 3에서 준비된 시험동물 (참당귀 에탄올 추출물 투여군)에 MIA 를 주사하고 3 주째에 모든 시험동물들을 에테르로 가볍게 마취시켜 좌측 대퇴골 및 경골을 척출하였다. 적출된 슬관절강 내에 생리식염수 0.5mL를 주사하여 세정하고, 세정된 활액을 250uL이상 채취하여 검사 전까지 -80℃에서 냉동보관하였다. 우측 슬관절은 적출 즉시 10% 중성 포르말린 용액에 24 시간 고정하였고, 10% 포름산으로 24 시간 간격으로 72 시간 동안 용액을 교환하면서 탈회를 실시하였다. 자동 포매장치 (Tissue-Tex 4701, Sakura Co., Japan)를 사용하여 파라핀 블록을 제작하였다. 제작된 파라핀 블록은 회전식 미세박절기 (Rotary Microtome 2040, Sakura Co., Japan)를 사용하여 조직을 수직방향으로 5um 두께로 연속 절편하여, 부유온수조와 신전기 과정을 거쳐 슬라이드에 부착시켰다.

제작된 조직 슬라이드는 관절연골의 PG 변성을 확인하기 위하여 기질인 당단백의 sulfur 기와 반응하는 원리를 이용한 Safranin-O 염색하였다. 박절한 조직 절편은 탈파라핀과 함수처리과정을 거친 후 Weigert's iron hematoxylin (Sigma, St. Louis, USA) 용액에 약 10 분간 염색한 후, 세척하고 이어서 0.02% fast green (FCF) (Sigma, St. Louis, USA) 용액으로 5분간 염색하였다. 이어서 0.1% acetic acid, 0.1% Safranin-O (Sigma, St. Louis, USA) 용액으로 염색한 후, 세척하였다.

칼라영상분석기 (Media Cybernetics, Image-Proplus, USA)를 이용하여 상기 염색된 조직절편 (관절연골)에서의 염색정도 (평균투과도)를 측정하였다. 칼라영상분석기를 통해서 측정된 각 군의 Safranine-O 염색정도를 관절연골내 프로테오글리칸(PG) 함유율로 평가하였으며, 정상군에서 측정된 평균투과도의 평균을 100% 로 설정하고, 대조군 및 처리군의 평균투과도를 환산하여 PG 함유율을 평가하였다 (n=8).

상기 얻어진 결과 (관절연골 조직에서의 PG 함유율)을 도 14에 나타내었다. 도 14에 나타난 바와 같이, 관절연골 조직 내의 PG 함유율은 정 상군에 비해 대조군 및 처리군 모두 감소되었으나, 처리군은 대조군에 비해 유의성 있게 덜 감소되었음을 확인할 수 있다. 이는 참당귀 에탄올 추출물이 관절연골 내 PG 파괴를 유의적으로 억제할 수 있음을 보여주는 것이다.

상기 얻어진 결과 (3회 수행 후의 평균 값)를 아래의 표 9 및 도 23에 나타내었다:

	N	C	C+참당귀 물추출물 투여군	C+참당귀 에탄올 추출물 투여군	C+참당귀 및 천궁 혼합 추출물 투여군
PG 함유율 (%)	100	42.78697	64.70708	77.16863	85.4988

상기 표 9 및 도 23에서, 'N'은 정상 흰쥐의 연골 조직, 'C'는 MIA에 의한 골관절염 유발 흰쥐를 의미한다. 표 9 및 도 23에서 확인되는 바와 같이, 골관절염 유발 흰쥐에서 참당귀 에탄올 추출물 또는 참당귀와 천궁의 혼합 추출물을 투여한 경우, 관절 연골에서의 PG의 파괴가 모두 억제되었으며, 특히, 참당귀 물 추출물을 투여한 경우와 비교하여도, 참당귀 에탄올 추출물을 투여한 경우 및 참당귀와 천궁의 혼합 추출물을 투여한 경우에 PG 파괴 억제 효과가 우수하게 나타났다 (P<0.01).

10.2. 참당귀와 천궁의 혼합 추출물의 혼합비에 따른 관절 연골의 PG 함량에 대한 영향 시험

실시예 10.1과 동일한 방법으로, 참당귀와 천궁의 혼합 비율에 따른 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물(실시예 1.3)의 PG 파괴 억제 효과 (관절 연골 조직에서의 PG 함유율로 측정)를 시험하였다.

상기 얻어진 결과 (관절 연골 조직에서의 PG 함유율)를 하기의 표 10 및 도 27에 나타내었다:

	N	C	참당귀:천궁; 1:1	참당귀:천궁; 2:1	참당귀:천궁; 4:1	참당귀:천궁; 5:1
PG 농도, %	98.9246	41.2661	50.2794	88.3526	81.036	67.6771

상기 표 10 및 도 27에서, 'N'은 정상 흰쥐의 연골 조직, 'C'는 MIA에 의한 골관절염 유발 흰쥐를 의미한다. 표 10 및 도 27에서 확인되는 바와 같이, MIA 주사 후 추출물 무처리군과 비교하여, 참당귀와 천궁의 1:1 혼합 추출물, 2:1 혼합 추출물, 4:1 혼합 추출물 및 5:1 혼합 추출물 (이상 실시예 1.3)의 처리군 모두에서 관절 연골 조직에서의 PG 함유율이 현저하게 높게 나타났으며, 특히, 참당귀와 천궁의 2:1 혼합 추출물, 4:1 혼합 추출물 및 5:1 혼합 추출물의 경우, 참당귀와 천궁의 1:1 혼합 추출물과 비교하여, 관절 연골 조직에서의 PG 함유율이 보다 높게 나타났다. 이와 같은 관절 연골 조직에서의 높은 PG 함유율은 우수한 PG 파괴 억제 효과를 나타낸다.

10.3. 에탄올 추출물과 에탄올 냉침 추출물의 관절 연골의 PG 함량에 대한 영향 시험

실시예 10.1과 동일한 방법으로, 참당귀 에탄올 추출물 (실시예 1.1)과 참당귀와 천궁의 혼합 에탄올 추출물 (실시예 1.3; 2:1 혼합비)의 PG 파괴 억제 효과 (관절 연골 조직에서의 PG 함유율로 측정)를 시험하여, 참당귀 물 추출물 (비교예 1) 참당귀 에탄올 냉침 추출물 (비교예 3), 참당귀와 천궁의 혼합 물 추출물 (비교예 2) 및 참당귀와 천궁의 혼합 에탄올 냉침 추출물(비교예 4)과 비교하였다 (투여량: 100mg/kg).

상기 얻어진 결과 (관절 연골 조직에서의 PG 함유율)를 하기의 표 11 및 도 31에 나타내었다:

	N	C	참당귀 물 추출물	참당귀 에탄올 냉침 추출물	참당귀 에탄올 추출물	참당귀 및 천궁 혼합 물 추출물	참당귀 및 천궁 혼합 에탄올 냉침 추출물	참당귀 및 천궁 혼압 에탄올 추출물
PG 농도, %	100	40.6595	53.9079	62.7918	77.3418	59.8087	77.7684	85.7119

상기 표 11 및 도 31에서, 'N'은 정상 흰쥐의 연골 조직, 'C'는 MIA에 의한 골관절염 유발 흰쥐를 의미한다. 표 11 및 도 31에서 확인되는 바와 같이, MIA 주사 후 추출물 무처리군, 참당귀 물 추출물 (비교예 1) 참당귀 에탄올 냉침 추출물 (비교예 3), 참당귀와 천궁의 혼합 물 추출물 (비교예 2) 및 참당귀와 천궁의 혼합 에탄올 냉침 추출물(비교예 4)과 비교하여, 참당귀 에탄올 추출물 (실시예 1.1)과 참당귀와 천궁의 혼합 에탄올 추출물 (실시예 1.3; 2:1 혼합비)의 처리군 모두에서 관절 연골 조직에서의 PG 함유율이 현저하게 높게 나타났으며, 이는 상기 혼합비의 혼합 추출물이 우수한 PG 파괴 억제 효과를 가짐을 보여준다.

실시예 11: 참당귀 추출물 조성 및 함량 분석

상기 실시예 1에서 제조된 참당귀 에탄올 추출물 분말 시료를 약 150 mg의 양으로 취하여 메탄올 100 mL에 잘 녹인 후, 0.45 um 멤브레인 필터로 여과하여 검액으로 하였다. 검액 5 uL를 C18 HPLC 에 주입하여 유속 1.3 mL/min 에서 50% 아세토니트릴 용액 (10 mM sodium lauryl sulfate, 25 mM disodium hydrogen phosphate, pH 5.0)의 isocratic elution 에 의하여 분리 하였다. 검출은 자외선(UV) 230 nm 에서 모니터링하였다.

상기 얻어진 결과를 도 15에 나타내었다. 참당귀의 지표 성분으로 사용되는 데커신(decursin) 및 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate)는 HPLC 조건에서 각각 16.5 분 및 17.2 분에 용출하였다. 상기 실시예 1에서 제조된 참당귀 에탄올 추출물 분말 시료 중 데커신 함량은 전체 시료 중량의 12.5±0.2중량% 이었다.

실시예 12: 추출 용매에 따른 참당귀 추출물의 유효성분 함량 비교 1

추출 용매에 따른 참당귀 추출물의 유효성분 함량을 비교하기 위하여, 상기 실시예 1.1에서 얻어진 참당귀 에탄올 추출물, 및 비교예 1에서 얻어진 참당귀 물 추출물의 유효성분을 상기 실시예 11과 같이 분석하였다.

상기 얻어진 결과를 아래의 표 12에 나타내었다:

Extracts	Decursin (중량%)
Hot water	5.05%
Ethanol	12.6%

상기 표 12에서 확인되는 바와 같이, 참당귀 에탄올 추출물이 참당귀 열수 추출물과 비교하여 유효성분인 데커신의 함량이 약 2.5배 높은 것을 알 수 있다.

실시예 13: 추출 용매에 따른 참당귀 추출물의 유효성분 함량 비교 2

13.1. 추출물의 준비

13.1.1. 참당귀 물 추출물의 제조

건조 절단된 참당귀 100g에 증류수 5,00ml를 가한 후 수욕조 (약 90℃)에서 8시간 추출하며, 같은 방법으로 4회 반복 추출한 액을 합하여 여과한 후 회전감압농축기(rotary vaccum evaporator)에서 농축하여 참당귀 물 추출물을 제조하였다.

13.1.2. 참당귀 에탄올 냉침 추출물의 제조

약 150g의 참당귀를 한약재 분쇄기를 이용해 100-200메쉬 크기로 분쇄하였다. 분쇄된 시료 100g에 95%(v/v) 에탄올 1,000ml (1:10 weight/volume)를 가하여 5일간 실온에서 추출한 다음, Whatman filter paper NO.4를 사용해 고형분을 제거한 후, 회전감압농축기를 이용해 농축하여 참당귀 에탄올 냉침 추출물을 제조하였다.

13.1.3. 참당귀 에탄올 추출물의 제조

참당귀 뿌리를 깨끗한 물을 이용하여 세척한 후 충분히 건조한 후, 분쇄기를 이용해 100-200메쉬 크기로 분쇄하였다. 건조 및 분쇄한 참당귀 분말 100g에 500ml 에탄올 (95%)을 첨가하고, 40~50℃에서 4 시간 이상 추출한 후, 1um 필터로 여과한 여액을 원래 중량의 약 10%가 될 때까지 회전감압농축기에서 농축하여, 참당귀 에탄올 추출물(AGE232)을 제조하였다.

13.2. 추출물의 성분분석

HPLC를 이용하여 각 추출물의 decursin, decursinol, decursinol angelate, nodakenin, β-sitosterol의 함량을 분석하였다.

13.2.1. Decursin 및 decursinol angelate 분석

<검액의 조제>

세 종류의 시료 (참당귀 물 추출물, 참당귀 에탄올 냉침 추출물, 참당귀 에탄올 추출물(AGE232)) 1g을 정확히 취하여 50ml 정용플라스크에 넣은 후 약 30 ml 메탄올(100%)을 넣어 용해시킨 다음, 표선까지 메탄올로 채워서 여과한 후 검액으로 사용하였다. 시료의 종류 및 분석항목에 따라 희석 정도를 달리하여 검액을 제조하였다.

<표준액의 조제>

데커신 표준품 (순도 98% 이상) 5mg, 및 데커신 안젤레이트 표준품 (순도 98% 이상) 5mg을 각각 취하여 25ml 플라스크에 넣은 후 100% 메탄올을 넣어 용해시킨 다음, 메탄올로 표선을 채워서 표준액으로 사용하였다. 이 표준용액으로부터 12.5 - 25 - 50 - 100 - 200 ug/ml 농도의 표준용액을 제조하여 검량선의 측정에 이용하였다.

검액 및 표준액을 사용하여 아래 액체크로마토그래피 조작조건에 따라 시험하여 데커신 및 데커시놀 안젤레이트의 함량을 계산하였다.

컬럼: Cadenza CW C18, (150*4.6mm, 3μm) 또는 이와 동등한 컬럼

검출기: 자외선 분광광도계 (검출파장 330nm)

유속: 0.7ml/분

이동상: Water(A %), Acetonitril(B %)

0-5min (20, B), 5-6min (20→40,B), 6-22min (40→55,B),

22-23min (55→80, B), 23-25min (80, B), 25-27min (20, B)

시료 주입량: 10ul(microliter)

13.2.2. Nodakenin 분석

<검액의 조제>

<표준액의 조제>

노다케닌 (CAS Number:495-31-8) 표준품(순도 98% 이상)을 메탄올에 녹인 후 각각 12.5-25 - 50 - 100 μg/ml의 농도로 희석하여 검량선을 작성하였다.

컬럼: Cadenza CW C18, (150*4.6mm, 3μm) 또는 이와 동등한 컬럼

검출기: .자외선 분광광도계 (검출파장 330nm)

유속: 0.7ml/분

이동상: Water (A %), Acetonitri l(B %)

0-5min (20, B), 5-6min (20→40,B), 6-22min (40→55,B),

22-23min (55→80, B), 23-25min (80, B), 25-27min (20, B)

시료 주입량: 10ul

13.2.3. 베타- sitosterol 분석

<검액의 조제>

각 농축 및 건조된 시료를 10배의 희석배수가 되도록 100% 메탄올에 초음파를 이용하여 잘 용해 시켰다. HPLC 분석전에 맴브레인 필터를 이용해 미립자를 제거하였다.

<표준액의 조제>

베타-sitosterol 표준품 (순도 98% 이상)을 초음파를 이용하여 메탄올에 잘 녹인 후 각각 12.5-25 - 50 - 100 ug/ml의 농도로 희석하여 검량선을 작성하였다.

컬럼: Cadenza CW C18, (150*4.6mm, 3μm) 또는 이와 동등한 컬럼

검출기: .자외선 분광광도계 (검출파장 205nm)

유속: 0.6ml/분

이동상: Water (A %), Acetonitri l(B %)

0-5min (20, B), 5-6min (20→40,B), 6-22min (40→55,B),

22-23min (55→80, B), 23-25min (80, B), 25-27min (20, B)

시료 주입량: 10ul

13.2.4. 결과

상기 얻어진 각 추출물의 성분 분석 결과를 아래의 표 13에 나타내었다.

참당귀의 추출 용매 및 추출 방법에 따른 주요 성분의 분석 결과

Extraction Method		물 추출물	에탄올 냉침 추출물	에탄올 추출물 (AGE232)
Ext. vol. before concent.(ml)		1,800	850	465
Ext. weight after concent. (g)		42.0	14.2	30.5
Total exracted compounds from 100g dried Angelica gigas Nakai (mg)	Decursin (mg)	19	1920	3243
	Decursinol angelate(mg)	10	1130	1995
	Nodakenin(mg)	559	765	2982
	β-Sitosterol(mg)	13	25	324

표 13에서와 같이, 참당귀의 에탄올 추출물은, 1) 추출 효율이 참당귀 물 추출물 및 참당귀 에탄올 냉침 추출물과 비교하여 현저하게 우수할 뿐 아니라, 2) 데커신, 데커시놀 안젤레이트, 노다케닌 (Nodakenin), 및 베타-시토스테롤과 같은 유효성분의 함량(중량 기준)이, 참당귀 물 추출물과 비교하여 약 5배 내지 약 200배 (구체적으로, 약 170배 (데커신), 약 200배 (데커시놀 안젤레이트), 약 5배 (노다케닌), 및 약 25배 (베타-시토스테롤)) 가량 높으며, 참당귀 에탄올 냉침 추출물과 비교하여 약 1.7배 내지 약 13배 (구체적으로, 약 1.7배 (데커신), 약 1.8배 (데커시놀 안젤레이트), 약 3.9배 (노다케닌), 및 약 13배 (베타-시토스테롤)) 가량 높은 것으로 나타났다.

<110> LEE, Kang Hyun <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating osteoarthritis containing an extract of Angelica gigas Nakai <130> <140> KR 10-2016-0012543 <141> 2016-02-01 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS forward primer <400> 1 ttctttgctt ctgtgcttaa tgcg 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS reverse primer <400> 2 gttgttgctg aacttccaat cgt 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 forward primer <400> 3 ctgcatgtgg ctgatgtcat c 21 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 Reverse primer <400> 4 aggacccgtc atctccaggg taatc 25 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha Forward primer <400> 5 gtagcccacg tcgtagcaaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha Reverse primer <400> 6 cccttctcca gctggaagac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1L-1beta Forward primer <400> 7 tgatgttccc attagacagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1L-1beta Reverse primer <400> 8 gaggtgctga tgtaccagtt 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1L-10 Forward primer <400> 9 cagtcagcca gacccacat 19 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1L-10 Reverse primer <400> 10 gctccactgc cttgcttt 18 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin Forward primer <400> 11 ttgtaaccaa ctgggacgat atgg 24 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin Reverse primer <400> 12 gatcttgatc ttcatggtgc tag 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-3 Forward primer <400> 13 gagtgtggat tctgccattg ag 22 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-3 Reverse primer <400> 14 ttatgtcagc ctctccttca gaga 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-13 Forward primer <400> 15 acgttcaagg aatccagtct ctct 24 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-13 Reevrse primer <400> 16 ggatagggct gggtcacact t 21

Claims

참당귀(Angelica gigas Nakai) 추출물을 유효성분으로 포함하고,
상기 참당귀 추출물은 참당귀를 90 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액으로 40 내지 80℃에서 추출한 참당귀 에탄올 추출물인,
골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 에탄올 수용액은 96 내지 100%(v/v)의 농도를 갖는 것인, 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
참당귀(Angelica gigas Nakai) 및 천궁(Cnidium officinale)의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하고,
상기 참당귀 및 천궁의 혼합 추출물은,
참당귀 추출물 및 천궁 추출물의 혼합물 또는
참당귀와 천궁 혼합물의 추출물이고,
상기 참당귀 추출물은 참당귀를 90 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액으로 40 내지 80℃에서 추출한 참당귀 에탄올 추출물이고,
상기 천궁 추출물은 천궁을 90 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액으로 40 내지 80℃에서 추출한 천궁 에탄올 추출물이며,
상기 참당귀와 천궁 혼합물의 추출물은 참당귀와 천궁의 혼합물을 90 내지 100%(v/v) 에탄올 수용액으로 40 내지 80℃에서 추출한 참당귀와 천궁 혼합물의 에탄올 추출물인, 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 참당귀 에탄올 추출물, 천궁 에탄올 추출물, 및 참당귀와 천궁 혼합물의 추출에 사용된 에탄올 수용액은 96 내지 100%(v/v)의 농도를 갖는 것인, 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 추출물의 혼합물 내의 참당귀 추출물과 천궁 추출물 간 혼합비 또는 참당귀와 천궁 혼합물 내의 참당귀와 천궁 간 혼합비는 중량 기준으로 2:1 내지 5:1 (참당귀 중량:천궁 중량)인, 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는, 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제5항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는, 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.