KR102226119B1 - 백수오, 한속단 및 참당귀의 복합 추출물을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
백수오, 한속단 및 참당귀의 복합 추출물을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 백수오, 한속단 및 참당귀의 복합 추출물 분획물을 유효 성분으로 포함하는 항산화, 항염증 또는 파골세포 분화 억제용 조성물 및 관절염 (arthritis) 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은, 파골세포 분화 억제, 항산화 또는 항염증 용도와 관절염 (arthritis) 치료 용도로 효과적으로 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 백수오, 한속단 및 참당귀의 복합 열수추출물 분획물을 유효 성분으로 포함하는 항산화, 항염 또는 파골세포 분화 억제용 조성물에 관한 것이다.
파골세포(Osteoclast)는 골을 흡수하는 세포로 생체 내 다양한 요소에 의해 활성화되며, 골을 생성하는 조골세포와의 균형을 통해 양질의 골이 유지된다. 파골세포와 조골세포 간의 불균형은 여러 가지 골 질환을 야기하며, 특히 파골세포의 증가는 골다공증뿐만 아니라 류마티스 관절염, 치주염 등을 유발한다. 파골세포는 조혈모세포에서 유래하며 단핵/대식세포로부터 macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)와 receptor activator of nuclear factor-kB ligand (RANKL)에 의해 성숙한 다핵형세포로 분화한다. 파골세포의 분화는 단핵구/대식세포에서 발현하는 RANK와 조골세포에서 분비되는 분화인자인 RANKL의 결합을 시작으로, tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6)가 군집되고, 하위 경로인 MAP kinase의 p38, JNK, ERK와 NF-kB, Akt의 인산화 과정 경로를 통하여 NFATc1의 전사활동이 일어나게 됨으로써 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), osteoclast-associated receptor (OSCAR), cathepsin K 등의 파골세포 지표 유전자가 발현되는 일련의 과정을 통해 일어난다. 따라서 파골세포의 분화 과정을 억제하고 골 흡수 기능을 저해하는 것이 골다공증과 같은 뼈 질환을 치료 및 예방하는데 있어서 중요한 지표라 할 수 있다.
임상에서 골다공증을 치료하기 위해 여러 약제가 사용되고 있는데 가장 일반적으로 사용되는 약제가 bisphosphonate 계열의 약물이다. Bisphosphonate 약물은 파골세포 기능을 방해함으로써 골 흡수를 저하시키고 골다공증 환자에게서 골절의 유발율을 저해하는 효과가 있다고 입증된 약물이다. 그러나 bisphosphonate 약물로 치료를 받은 골다공증 환자들에게서 급성기 반응, 근골격의 심한 고통, 저칼슘혈증 등의 단기 부작용과 턱 부분의 골 괴사증, 심방 세동, 심한 골교체 억제 등의 장기 부작용이 발견되면서 골다공증 치료에 대한 문제점이 제기되었다. 근래에는 이러한 부작용을 최소화하기 위해 천연물 소재를 이용하여 독성 및 부작용은 적으면서 골다공증을 비롯한 여러 골 질환에 대한 치료효과는 높은 치료제를 개발하기 위한 시도가 활발히 이루어지고 있다.
한편, 백수오, 한속단, 참당귀 복합추출물 또는 이의 분획물이 항산화 및 아질산염(NO) 생성 억제를 통한 항염증 효능과 파골세포 분화 억제능에 효과가 있다는 연구나 보고는 없다.
본 발명자들은 항산화, 항염 또는 파골세포 분화 억제능을 갖는 천연물 유래의 신물질을 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 백수오, 한속단 및 참당귀 복합 추출물의 소정의 분획물이 항산화, 항염증 또는 파골세포 분화 억제능이 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 신규한 파골세포 분화 억제, 항산화, 또는 항염증용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 관절염 (arthritis) 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 관절염 (arthritis) 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명자들은 항산화, 항염 또는 파골세포 분화 억제능을 갖는 천연물 유래의 신물질을 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 백수오, 한속단 및 참당귀 복합 추출물의 소정의 분획물이 항산화, 항염증 또는 파골세포 분화 억제능과 관절염 (arthritis) 예방 및 치료 효과가 있음을 규명하였다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 백수오, 한속단 및 참당귀의 복합 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물 중 어느 하나 이상을 포함하는 파골세포 분화 억제, 항산화, 또는 항염증용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 백수오, 한속단 및 참당귀의 복합 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물 중 어느 하나 이상을 포함하는 관절염 (arthritis) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서 상의 백수오, 한속단 및 참당귀의 복합 추출물의 제조에 이용되는 백수오(Cynanchum wilfordii)는 마디풀과(Polygonaceae)에 속하는 다년생 초본을 의미하고, 그 높이는 1-3 m에 달하며 뿌리는 덩이뿌리로서 비후한 식물이다. 또한, 상술한 복합 추출물의 제조에 이용되는 한속단(Phlomis umbrosa)은 꿀풀과 (Labiatae)에 속하는 다년생 초본을 의미하고, 그 높이는 70-150 ㎝이며 비대한 덩이뿌리가 5개 정도 달리는 식물이다. 또한, 상술한 복합 추출물의 제조에 이용되는 참당귀(Angelica gigas)는 산형과(Umbelliferae)에 속하는 다년생 초본을 의미하고, 그 높이는 1-2 m에 달하며 굵은 뿌리와 함께 분지된 뿌리가 달린 식물이다. 본 발명에서 이용되는 백수오, 한속단 및 참당귀는 각각의 식물의 다양한 기관 또는 조직(예: 뿌리, 잎, 꽃, 줄기, 과실 및 종자 등)을 이용하여 수득할 수 있으며, 바람직하게는 백수오의 덩이뿌리, 한속단의 덩이뿌리, 참당귀의 뿌리를 이용할 수 있다.
본 발명의 백수오, 한속단 및 참당귀의 복합 추출물은 (i) 백수오, 한속단 및 참당귀의 혼합물을 추출 용매로 추출하는 단일 추출공정을 통해 제조되거나, (ii) 백수오, 한속단, 또는 참당귀 단일 성분의 추출물을 각각 제조한 후 세 성분의 추출물을 혼합하는 방식으로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 복합 추출물의 백수오, 한속단 및 참당귀의 배합 중량비(w/w/w)는 추출 공정을 거치기 전 각각의 성분들의 중량을 기준으로 0.5 내지 2 : 0.5 내지 2 : 0.5 내지 2이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 복합 추출물의 백수오, 한속단 및 참당귀의 배합 중량비(w/w/w)는 0.8 내지 1.5 : 0.8 내지 1.5 : 0.8 내지 1.5이다. 더욱 구체적으로 예를 들면, 백수오, 한속단 및 참당귀의 배합 중량비(w/w/w)가 0.9 내지 1.2 : 0.9 내지 1.2 : 0.9 내지 1.2인 복합 추출물을 이용할 수 있다. 본 명세서 상의 일 실시예에서는 백수오, 한속단 및 참당귀의 배합 중량비(w/w/w)가 1:1:1.08인 복합 추출물을 이용하였으나, 본 발명의 복합 추출물은 각 원료의 다양한 배합 중량비에 따라 제조될 수 있으며, 상술한 일 실시예에 기재된 중량비로 제한되지 않는다.
본 명세서 상의 용어 "배합 중량비(w/w)"는 추출 공정을 거치기 전 각각의 성분들의 중량비를 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 복합 추출물이 백수오, 한속단 및 참당귀의 혼합물을 추출 용매로 추출하는 단일 추출공정을 통해 제조되는 경우, 상기 혼합물에 포함된 백수오, 한속단 및 참당귀 각각의 단일 성분들의 중량비를 나타낸다. 또한, 본 발명의 복합 추출물이 백수오, 한속단 또는 참당귀 단일 성분의 추출물을 각각 제조한 후 세 성분의 추출물을 혼합하는 방식으로 제조되는 경우, 다음 계산식에 의해 계산되는 '단일 성분 기준 중량'들 간의 중량비를 나타낸다:
[계산식]
단일 성분 기준 중량 = 단일 추출물 제조에 이용된 단일 성분의 양Х(복합 추출물 제조를 위해 사용된 단일 추출물의 부피/최종 생성된 단일 추출물의 부피).
상기 백수오, 한속단 및 참당귀 복합 추출물은 다양한 추출 용매, 예를 들어, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 1,3-부틸렌글리콜, (h) 부틸 아세테이트를 추출 용매로 하여 얻을 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 복합 추출물은 물을 추출 용매로 하여 얻어진 것이다. 한편, 본 발명의 추출물은 상기한 추출 용매 뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.
또한, 본 발명의 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물 뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다. 보다 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 추출물로서, 백수오, 한속단 및 참당귀 추출물을 저분자량의 한외 여과막으로 여과해 얻어진 활성 분획이 이용될 수 있고, 보다 더 구체적으로, 백수오, 한속단 및 참당귀를 열수 처리한 다음 열수 추출액을 분자량 컷 오프가 6-10 ㎛인 한외 여과막, 더욱 더 구체적으로 분자량 컷 오프가 10 ㎛인 한외 여과막으로 여과하여 수득된 활성 분획이 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 백수오, 한속단 및 참당귀의 복합 추출물은 열수추출물이다. 본 발명의 일 실시예에서의 열수추출물을 제조하기 위한 열수 추출 공정은 당업자들이 일반적으로 이해하는 다양한 모든 공정들을 포함하는 의미이며, 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로 예를 들면, 40℃ 이상, 구체적으로 50℃ 이상, 더 구체적으로 60℃ 이상, 더욱 더 구체적으로 70℃ 이상, 더욱 더 구체적으로 80℃ 이상, 더욱 더 구체적으로 90℃이상의 물을 이용하여, 특별한 제한이 없는 소정의 시간 동안 추출 공정을 실시함으로써, 복합추출물이 제조될 수 있다. 구체적으로 2시간 내지 10시간, 더욱 구체적으로 4시간 내지 8시간 동안 추출 공정을 실시하여 복합 추출물을 제조할 수 있다. 일 구체예에서, 추출에 이용되는 추출 용매의 양은 백수오, 한속단 및 참당귀 원료의 3-20 배(w/v), 5-20 배(w/v), 5-15 배(w/v), 7-15 배(w/v), 7-13 배(w/v), 8-13 배(w/v), 또는 8-12 배(w/v)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 유효 성분으로서의 백수오, 한속단 및 참당귀 복합 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물은 백수오, 한속단 및 참당귀의 복합 추출물을 (1) 헥산, (2) 에틸아세테이트, (3) 부탄올, 및 (4) 물을 순차적으로 이용하여 분획하는 과정을 통해 각각 얻어지는 분획물을 의미한다. 분획 공정의 일 구체예는 본 실시예 2에 나타내었으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 파골세포 분화 억제, 항산화, 또는 항염증용 약제학적 조성물은 백수오, 한속단 및 참당귀의 복합 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 뼈의 손상, 골다공증 (osteoporosis), 치주 질환 (periodontal disease), 파제트병 (Paget's disease), 다발성 골수종 (multiple myeloma) 및 골전이암 (metastatic cancer)으로 구성된 군으로부터 선택되는 골질환의 예방 또는 치료용이다. 상술한 구체적인 질환들은 파골세포 분화와 연관되어 있으며, 파골세포 분화 억제에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질환인 것으로 잘 알려진 질환들에 해당한다 [Wagner, E. F., & Karsenty, G. (2001). Current opinion in genetics & development, 11(5), 527-532.; Durand, M. et al. (2011). Bone, 48(3), 588-596.; Bartold, P. M. et al. (2010). Periodontology 2000, 53(1), 55-69.; Zhai, Z. J. et al. (2014). British journal of pharmacology, 171(3), 663-675.; Heymann, D. et al. (2005). Drug discovery today, 10(4), 242-247.].
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 관절염 (arthritis) 예방 또는 치료용이고, 상세하게는 염증성 관절염 (inflammatory arthritis), 퇴행성 관절염 (degenerative arthritis)의 예방 또는 치료용이다. 바람직하게는 자가면역 진화의 일종으로서 염증성 질환인 류마티즘 관절염 (rheumatoid arthritis), 강직성척추염(ankylosing spondylitis), 레이터증후군(reiter's syndrome), 건선관절염(psoriatic arthritis)의 예방 또는 치료용이고, 더욱 바람직하게는 류마티즘 관절염 (rheumatoid arthritis)의 예방 또는 치료용이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remignton's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예컨대, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여)할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여경로, 배설속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-1000 mg/kg 범위 내이다. 또한 인체 내 투여량은 동물실험을 근거로 환산할 수 있다(Shin et al., J Korean Oriental Medicine 31(3):1-7, 2010).
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 백수오, 한속단 및 참당귀의 복합 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물 중 어느 하나 이상을 포함하는 파골세포 분화 억제, 항산화, 또는 항염증용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 백수오, 한속단 및 참당귀의 복합 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물 중 어느 하나 이상을 포함하는 관절염 (arthritis) 예방 및 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로텍스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 및 합성 향미제를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명인 식품 조성물은 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 약제학적 조성물에 포함되는 백수오, 한속단 및 참당귀의 복합 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물을 그대로 이용가능하며, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복되는 내용의 기재는 생략하도록 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 뼈의 손상, 골다공증 (osteoporosis), 치주 질환 (periodontal disease), 파제트병 (Paget's disease), 다발성 골수종 (multiple myeloma) 및 골전이암 (metastatic cancer)으로 구성된 군으로부터 선택되는 골질환의 예방 또는 개선용이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 관절염 (arthritis) 예방 또는 개선용이고, 상세하게는 염증성 관절염 (inflammatory arthritis), 퇴행성 관절염 (degenerative arthritis)의 예방 또는 치료용이다. 바람직하게는 자가면역 진화의 일종으로서 염증성 질환인 류마티즘 관절염 (rheumatoid arthritis), 강직성척추염(ankylosing spondylitis), 레이터증후군(reiter's syndrome), 건선관절염(psoriatic arthritis)의 예방 또는 개선용이고, 더욱 바람직하게는 류마티즘 관절염 (rheumatoid arthritis) 의 예방 또는 개선용이다.
본 명세서 상의 용어 "개선"은 인체의 정상기능이나 생물학적 활동 회복에 효과가 있어, 질병 상태를 완화시키는 것을 의미한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.
(a) 본 발명은 신규한 항산화, 항염증, 또는 파골세포 분화 억제용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 신규한 관절염 (arthritis) 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(c) 본 발명의 조성물을 이용하는 경우, 항산화, 항염증 또는 파골세포 분화 억제 효과를 부작용 없이 효과적으로 얻을 수 있다.
(d) 본 발명의 조성물을 이용하는 경우, 관절염 (arthritis)을 부작용 없이 효과적으로 개선, 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물을 및 분획물의 농도 별 처리에 따른 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물의 농도 별 처리에 따른 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물의 활성산소흡수능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물의 농도 별 처리에 따른 아질산염(NO) 생성 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물의 농도 별 처리에 따른 파골세포 분화 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 에틸아세테이트 분획물의 농도 별 처리에 따른 파골세포 분화 억제 활성을 사진으로 나타낸다.
도 7은 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물의 농도 별 처리에 따른 PGE2 (Prostaglandin E2) 생성 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물의 농도 별 처리에 따른 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6) 생성 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물의 농도 별 처리에 따른 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물의 활성산소흡수능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물의 농도 별 처리에 따른 아질산염(NO) 생성 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물의 농도 별 처리에 따른 파골세포 분화 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 에틸아세테이트 분획물의 농도 별 처리에 따른 파골세포 분화 억제 활성을 사진으로 나타낸다.
도 7은 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물의 농도 별 처리에 따른 PGE2 (Prostaglandin E2) 생성 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물의 농도 별 처리에 따른 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6) 생성 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 제조
천연 생약재인 백수오(Cynanchum wilfordii), 한속단(Phlomis umbrosa), 참당귀(Angelica gigas) 각각의 생물을 그대로 건조하여 세절하는 방식으로 제조한 원생약을 이용하였으며, 백수오 125 g, 한속단 125 g 그리고 참당귀 135 g을 혼합한 뒤 상기 혼합생약 중량의 10 배(w/v, 1/10)에 해당하는 물로 8시간 동안 열수 환류 추출하였다. 이후 분자량 컷 오프가 10 ㎛에 해당하는 한외 여과막을 이용해 감압여과를 진행하여 걸러진 여액을 20-40 brix까지 감압 농축 후 동결 건조하여 분말 형태인 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 172 g을 수득하였다.
실시예 2: 물 및 유기용매 분획물 제조
2-1. 헥산 분획물
상기 단계에서 제조한 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 중 100 g을 물 500 mL에 완전히 현탁하고 500 mL의 헥산을 첨가하여 4회 반복추출한 다음, 헥산 분획액을 모아 감압농축으로 용매를 완전히 제거하여 헥산 분획물 0.5 g을 수득하였다.
2-2. 에틸아세테이트 분획물
상기 2-1의 헥산 분획물을 제외한 남은 층(하층액)에 500 mL의 에틸아세테이트를 첨가하여 4회 반복추출한 다음, 에틸아세테이트 분획액을 모아 감압농축으로 용매를 완전히 제거하여 에틸아세테이트 분획물 3.2 g을 수득하였다.
2-3. 부탄올 분획물
상기 2-2의 에틸아세테이트 분획물을 제외한 남은 층(하층액)에 500 mL의 부탄올을 첨가하여 4회 반복추출한 다음, 부탄올 분획액을 감압농축으로 용매를 완전히 제거하여 부탄올 분획물 7.0 g을 수득하였다.
2-4. 물 분획물
상기 2-3의 부탄올 분획물을 제외한 남은 층(하층액)을 감압농축으로 용매를 완전히 제거하여 물 분획물 89.3 g을 수득하였다.
실시예 3: DPPH 라디칼 소거 활성 측정
자유라디칼인 DPPH에 대한 환원 또는 상쇄시키는 능력, 즉 산화 억제 활성을 확인함으로써 자유 라디칼 소거능의 항산화 활성을 측정하였다. DPPH는 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 자유 라디칼로 시료에 의해 환원되어 탈색되므로 항산화 활성을 측정하는 데 이용되었다. 구체적으로, 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물 20 ㎕에 100 μM DPPH 용액 180 ㎕를 가하여 암소에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 농도에 따른 DPPH 라디칼 소거능을 확인하였다. 양성 대조군 비교물질로 비타민 C를 사용하였고, 시료 무첨가군과 비교하여 자유라디칼 소거활성을 백분율로 나타내었다.
그 결과, 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물은 비타민 C와 비교하였을 때 DPPH 라디칼소거활성이 다소 낮았지만, 농도 의존적인 활성을 보였다. 특히 에틸아세테이트 분획물은 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 다른 분획물에 비해 모든 농도에서 라디칼 소거 활성이 높았으며, 1,000 ㎍/㎖ 농도에서의 에틸아세테이트 분획물은 비타민 C와 유사한 DPPH 라디칼소거 활성을 보였다(도 1).
실시예 4: ABTS 라디칼 소거 활성 측정
ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate)]라디칼 소거능은 2,2'-azinobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH)와의 반응에 의해 생성된 ABTS 유리라디칼이 시료의 항산화 물질에 의해 제거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 측정하였다. 구체적으로, 2.5 mM ABTS 용액에 1.0 mM AAPH를 넣고 70℃ 항온수조에서 30분간 반응시켰다.
이어서, 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물 20 ㎕에 ABTS 용액 180 ㎕를 가하여 10분 동안 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하여 농도에 따른 ABTS 라디칼소거능을 확인하였다. 양성 대조군 비교물질로 비타민 C를 사용하였고, 시료 무첨가군과 비교하여 자유라디칼 소거활성을 백분율로 나타내었다.
그 결과, 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물은 비타민 C와 비교하였을 때 ABTS 라디칼소거활성이 다소 낮았지만, 농도 의존적인 활성을 보였다. 특히 에틸아세테이트 분획물은 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 다른 분획물에 비해 모든 농도에서 라디칼 소거 활성이 높았으며, 500 및 1,000 ㎍/㎖에서의 에틸아세테이트 분획물과 1,000 ㎍/㎖의 부탄올 분획물은 비타민 C와 유사한 ABTS 라디칼소거활성을 보였다(도 2).
실시예 5: 활성산소 흡수능(Oxygen radical absorbance capacity, ORAC) 측정
ORAC(Oxygen Radical Absorbance Capacity) assay는 항산화 활성에 대해 미국 농림성이 표준화 한 실험 기법으로 버퍼와 시료 그리고 플루오레세인 용액(Fluorescein solution)을 섞은 후 자유 라디칼 이니시에이터 용액(Free radical initiator solution)을 첨가하여 자유 라디칼 이니시에이터 용액에 의한 형광 소멸 반응이 시료에 의하여 억제되는가를 측정하는 방법이다.
구체적으로, 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물 25 ㎕를 96 웰 플레이트에 넣은 다음 8.16 nM 플루오레세인 용액을 각 웰 마다 150 ㎕씩 넣고 37℃에서 10분간 반응시켰다. 다음, 153 mM AAPH 용액을 각 웰 마다 25 ㎕씩 넣고 잘 섞은 뒤 excitation 파장 480 nm와 emission 520 nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 형광의 감소 과정을 37℃에서 100 분 동안 1 분 간격으로 측정하였다. 비타민 C를 표준물질로 사용하여 모든 결과는 비타민 C 당량(VCE, vitamin C equivalent)으로 환산하여 나타내었다.
그 결과, 에틸아세테이트 분획물이 1954.0 mg VCE/g으로 가장 높은 ORAC 값을 보였으며, 그 다음으로 부탄올 분획물이 1090.3 mg VCE/g로 높게 나타났다(도 3).
실시예 6: 아질산염(NO) 생성 억제에 의한 항염증 효과 측정
6-1. 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물 처리에 따른 세포 생존율 확인
아질산염 형성 억제력 실험에 앞서, 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물의 세포독성을 확인하고자 MTT assay를 이용하여 세포생존율을 평가하였다. 구체적으로, RAW 264.7 세포를 96 웰 플레이트에 5 X 104 세포/웰의 농도로 분주한 다음 37℃, 5% CO₂에서 24 시간 동안 배양하였다.
이어서, 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물을 농도별로 희석하여 함유한 세포 배지로 교체한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide] 용액을 각 웰에 20 ㎕씩 넣고 4시간 동안 배양한 다음 상층액을 제거하고 형성된 포르마잔(formazan)을 DMSO(dimethylsulfoxide)용액 100 ㎕로 녹여 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 대조군의 흡광도와 비교하여 세포생존율을 백분율로 환산하였다.
그 결과, 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물은 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도에서 95% 이상의 세포생존율을 보여 세포독성이 거의 없음을 확인하였다.
6-2. 아질산염(NO) 생성 억제측정
백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물의 항염증 효과를 확인하기 위하여, RAW264.7 세포를 이용하여 GRIESS 법으로 아질산염(nitric oxide, NO) 형성억제력 실험을 실시하였다.
구체적으로, RAW264.7 세포를 96 웰 플레이트에 5×104 세포/웰이 되도록 분주한 후 24 시간 동안 배양하였다. 이어서, 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 그 분획물을 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 함유한 세포 배지로 교체하였다. 이때, 쎄레콕시브(celecoxib)를 양성 대조군으로 함께 처리하여 3시간 동안 전배양하였고, 자극원으로 LPS(Lipopolysaccharide)를 500 ng/㎖씩 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 상층액을 100 ㎕씩 취해 96 well plate에 옮기고, GRIESS 용액을 100 ㎕씩 가해 상온에서 10분간 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 NO 생성 억제 효과를 판단하였다.
그 결과, 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물에서 NO 생성이 농도 의존적으로 감소하였다. 특히 에틸아세테이트 분획물은 100 및 200 ㎍/㎖ 농도에서 NO생성이 38.2% 및 8.6%로 감소하여, 양성 대조군인 쎄레콕시브 12.5 uM에서의 46.7%보다 NO 생성 저해 효과가 우수하였다. 또한, 헥산 분획물은 200 ㎍/㎖ 농도에서 NO 생성이 21.5%로 감소하여 에틸아세테이트 분획물 다음으로 높은 NO 생성 저해 효과를 보여주었다(도 4).
실시예 7: 파골세포 분화 억제 효과 측정
7-1. 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물 처리에 따른 세포 생존율 확인
파골세포 분화 억제 효과를 측정하기에 앞서, 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물의 세포독성을 확인하고자 MTT assay를 이용하여 세포생존율을 평가하였다. 구체적으로, RAW 264.7 세포를 96 웰 플레이트에 5 X 103 세포/웰의 농도로 분주한 다음 37℃, 5% CO₂에서 24 시간 동안 배양하였다.
이어서, 농도 별로 희석한 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물과 분화인자인 RANKL 50 ng/㎖을 함유한 세포 배지로 교체한 후 24 시간 배양하였다. 배양 후 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide] 용액을 각 well에 20 ㎕씩 넣고 4시간 동안 배양한 다음 상층액을 제거하고 형성된 포르마잔(formazan)을 DMSO(dimethylsulfoxide)용액 100 ㎕로 녹여 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 대조군의 흡광도와 비교하여 세포생존율을 백분율로 환산하였다.
그 결과, 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 물 분획물은 10, 50, 100 ㎍/㎖ 농도에서 93% 이상의 세포생존율을 보여 세포독성이 거의 없음을 확인하였다.
7-2. 파골세포 분화 억제 효과 측정
백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물이 파골세포 분화에 미치는 효과를 확인하기 위하여, Raw 264.7 세포에 RANKL을 처리하여 파골세포 분화를 유도하고 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물을 처리한 후 분화된 파골세포의 수를 측정하였다.
구체적으로, Raw 264.7 세포를 96 well plate에 5 X 103 세포/웰의 농도로 분주한 후 37℃, 5% CO₂에서 24 시간 배양하였다. 이어서, 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 분획물 10, 50, 100 ㎍/㎖와 RANKL 50 ng/㎖을 함유한 세포 배지로 교체하였고, 골 흡수 억제제인 알렌드로네이트(alendronate)를 양성 대조군으로 함께 처리하여 4일 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 뒤 leukocyte acid phosphatase kit(Sigma)를 이용하여 세포를 고정 및 염색하였다. 염색 후, 현미경을 이용하여 파골세포수를 세었으며 시료의 파골세포 수를 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
그 결과, 에틸아세테이트 분획물은 50 및 100 ㎍/㎖ 농도에서 파골세포 분화를 78.3% 및 97.7% 억제하여 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 다른 분획물보다 높은 파골세포 분화 억제 효과를 보여주었으며, 양성 대조군인 알렌드로네이트 10 mM에서의 72.2% 보다 파골세포 분화 억제 효과가 높게 나타났다(도 5, 6).
실시예 8: PGE
2
(Prostaglandin E
2
) 생성 억제 효능 측정
백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물과 부탄올 및 물 분획물의 PGE2 생성 억제 효능을 측정하기 위해 ELISA kit를 이용하여 분석하였다. RAW 264.7 세포를 96 well plate에 5 ×104 cells/well이 되도록 분주하여 24시간 배양하였다. 이어서, 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물과 부탄올 및 물 분획물을 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 함유한 세포 배지로 교체하고, 3시간 후에 LPS 1,000 ng/㎖를 각각 처리한 다음 24시간 배양하였다. 그 후 세포배양 상층액을 취하여 ELISA kit 사용자 매뉴얼에 기재된 방법대로 정량하여 분석하였다.
그 결과, 부탄올 분획물에서 PGE2 생성이 농도 의존적으로 감소하였으며, 특히 100 및 200 ㎍/㎖ 농도에서 PGE2 생성이 54.1% 및 36.9%로 감소하여 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 물 분획물보다 높은 PGE2 생성 억제 효과를 보여주었다(도 7).
실시예 9: 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6) 생성 억제 효능 측정
백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물과 부탄올 및 물 분획물의 염증성 사이토카인 생성에 미치는 효과를 확인하기 위해 LPS 1,000 ng/㎖로 RAW 264.7 세포를 자극하기 전, 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물과 부탄올 및 물 분획물을 3시간 동안 전처리 하였다. LPS로 24시간 동안 자극한 뒤 사이토카인 측정을 위해 세포배양 상층액을 이용하여 ELISA kit의 매뉴얼대로 실험을 수행하였다.
그 결과, 부탄올 분획물은 100 및 200 ㎍/㎖ 농도에서 IL-1β 생성이 21.8% 및 14.0%로 감소하였으며, IL-6 생성은 65.4% 및 34.9%로 감소하여 백수오, 한속단, 참당귀 복합 열수추출물 및 물 분획물보다 염증성 사이토카인 생성을 농도의존적으로 크게 억제하였다(도 8).
Claims (14)
- 삭제
- 백수오, 한속단 및 참당귀의 복합 추출물의 에틸아세테이트 분획물 50 내지 100 ug/mL을 포함하는 골다공증(osteoporosis)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 삭제
- 제 2 항에 있어서, 상기 추출물은 열수추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 2 항에 있어서, 상기 에틸아세테이트 분획물은 백수오, 한속단 및 참당귀의 복합 추출물을 헥산 및 에틸아세테이트를 순차적으로 이용하여 분획하는 과정을 통해 얻어지는 분획물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
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KR20230111743A (ko) | 까마귀베개 열매 추출물 또는 그 분획물을 포함하는 면역조절용 약학적 조성물 |
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Date | Code | Title | Description |
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A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
AMND | Amendment | ||
E601 | Decision to refuse application | ||
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E902 | Notification of reason for refusal | ||
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X701 | Decision to grant (after re-examination) |