KR101483647B1

KR101483647B1 - 노린재나무 및 황기의 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101483647B1
Application number: KR20140160920A
Authority: KR
Inventors: 최수임; 오현욱; 황승환; 정경진; 최승민; 한지영; 김재윤; 최종길
Original assignee: (주) 와이디생명과학
Priority date: 2014-11-18
Filing date: 2014-11-18
Publication date: 2015-01-16
Also published as: CN106794212A; WO2016080691A1

Abstract

본 발명은 노린재나무 및 황기의 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 노린재나무 추출물 및 황기 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물과, 노린재나무 및 황기를 포함하는 생약재를 준비하는 단계; 및 준비된 생약재에 물 또는 C_1-4 알코올을 가하여 추출하는 단계를 포함하는 상기 조성물의 제조방법을 제공한다.

Description

노린재나무 및 황기의 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법 {COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING ARTHRITIS COMPRISING EXTRACT OF SYMPLOCOS CHINESIS FOR. PILOSA AND ASTRAGALUS MEMBRANACEUS AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 노린재나무 추출물 및 황기 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

관절염은 연골 관련 질환의 대표적인 것으로, 류머티스 관절염 (rheumatoid arthritis)과 퇴행성 관절염 (degenerative arthritis, osteoarthritis)으로 대별되며, 교통사고나 과도한 운동으로 무릎관절 연골이 손상된 경우도 흔히 발견된다. 현재, 우리나라에서 100만 명 정도의 관절염 환자가 있으며, 여성이 남성보다 배 이상 많고 그 중에서도 특히 갱년기 여성에게서 많이 볼 수 있는 질환이다 (Belmonte-S. MA et al; Arthritis Rheum, 30, pp 1214-1225, 1987).

퇴행성 골관절염 (osteoarthritis)은 관절 연골이 닳아 없어지면서 국소적인 퇴행성 변화가 나타나는 질환으로서, 골관절염 (osteoarthritis) 또는 골관절증이라고도 한다. 골관절염은 노령화와 밀접한 연관을 갖는 대표적인 퇴행성 질환으로, 전 인구의 10~15% 정도가 앓고 있으며, 특히 65세 이상의 고령인구 중 60~80% 정도가 골관절염을 앓고 있다. 퇴행성 관절염의 원인은 노쇠 현상이나 과다한 체중과 관계가 깊으며, 나이가 많아질수록 여성에게서 더 많이 그리고 더 심하게 나타난다 (Oliver, JE et al; Scand J Rheumatol, 35, pp 169-174, 2006). 초기 증상은 한 개 또는 두 개의 관절이 강직과 함께 쑤시는 듯한 동통으로 나타나며, 장기화되면 관절의 변형 등을 초래하게 된다.

관절연골의 퇴행성 변화의 원인은 아직 규명되어 있지는 않지만, 연골세포 수의 절대적 감소와 연골세포 (chondrocytes)에서 일어나는 연골기질 합성과 분해의 불균형이 하나의 원인으로 알려져 있다. 따라서 관절연골의 퇴행성 변화는 연골기질의 분해로 인하여 연골 강도와 쿠션으로서의 능력이 감소된다 (Loeser, RF et al; Arthritis Rheum, 54, pp 1357-1360, 2006).

현재 임상적으로 사용되고 있는 퇴행성 관절염의 치료는 약물치료제 (진통제, 스테로이드제, 비스테로이드계 항염제 등)나 연골 보호제 (히알루론산, 글루코사민, 콘드로이틴 등)를 이용하거나 수술적 처치 (관절경 수술, 경골 근위부 절골술, 관절 부분 치환술, 슬관절 전치환술 등)에 의한다 (Zhang, B et al; Eur J Pharmacol, 530, pp 166-171, 2006).

그러나 약물치료제의 경우는 통증이나 염증반응 자체를 비특이적으로 완화시키는 효과만을 가지며, 연골 보호제는 단지 연골세포에 영양을 공급해 주거나 충격을 완화시킴으로써 관절을 보호해 주는 역할을 할 뿐이다. 또한 스테로이드성 제제는 장기간 복용 시 칼슘의 손실로 골다공증, 고혈압, 당뇨병 등을 초래 할 수 있는 부작용이 있다. 따라서 약물치료는 대부분의 경우 통증을 감소시키는 목적으로만 사용되고 있고, 영구적인 인공관절 치환술이 주를 이루고 있지만 근본적인 치료 효과를 주는 약물이나 수술법은 현재까지 없는 실정이다.

이렇듯 지난 수십 년 동안 퇴행성 관절염의 치료를 위해 많은 연구와 노력이 있어 왔지만, 아직 그 병리적 원인이나 근본적인 치료방법은 개발되지 않고 있다. 이에 최근 들어서는 한방 치료제 및 영양 보조제를 통한 관절염 치료제가 개발되고 있지만 그 치료 효과와 작용기전에 관해서는 밝혀져 있지 않다 (Gaby, AR et al; Antern Med Rev, 4, pp 392-402, 1999). 따라서 이들 관절염 질환은 기존의 단순 대증요법제인 소염 진통제만으로는 그 질환을 효과적으로 조절하기가 어려울 뿐만 아니라 약물의 장기간 복용에 따른 부작용으로 인하여 현실적으로 환자의 대부분인 노년층에게는 치료에 많은 어려움을 초래하고 있다. 따라서 관절염의 치료를 위해서는 약제를 장기간 복용할 필요가 있기 때문에, 부작용이 적은 약제의 개발이 요구되고 있다.

한편, 노린재나무 (Symplocos chinensis for. Pilosa (Nakai) Ohwi)는 노린재나무과 (Symplocaceae)로 중국, 일본, 인도에 분포하며 우리나라 각처의 산과 들에 나는 낙엽 관목으로 키는 1-3m로 자라며 가지는 퍼지고, 작은 가지에는 털이 있다. 잎은 호생이며 난형 또는 긴 타원상 난형으로 양 끝이 뾰족하고, 보통 가장자리에 작은 톱니가 있으나 때로는 뚜렷하지 않고, 표면은 짙은 녹색이고 털은 없으며, 뒷면만 연두색으로 털이 있거나 없다. 열매는 길이 8mm로서 타원형이고 9월에 벽색 (碧色)으로 익는다. 원추화서는 길이 4~8cm로서 새로 난 가지 끝에 달리며 화경에 털이 있고 꽃잎은 긴 타원형이며 옆으로 터진다. 꽃은 지름 8~10mm이고 5월에 백색으로 핀다. 꽃잎은 장타원형으로 수술이 많고 약 보름간 감상할 수 있으며 은은한 향기가 있다.

황기 (黃耆, Astragalus membranaceus (Fisch) Bunge.)는 두과 (豆科)에 속한 다년생 초본 식물로서 주근 (主根)은 깊고 길며 막대기 모양이고 약간 목질을 띤다. 줄기는 직립하고 상부에서 많이 분지되며 매끄럽고 광택이 있거나 약간의 털로 덮여 있다. 황기의 주요 성분은 폴리사카라이드 (polysaccharide)와 사포닌 (saponin)이며 그 외에 수크로즈 (sucrose), 베타-시토스테롤 (β-sitosterol), 칼리코신 (calycosin), 포르모네틴 (formonetin), 베타-아미노부티릭산 (β-aminobutyric acid) 등이 함유되어 있다. 또한 황기의 생리활성으로는 세포성 및 체액성 면역 증강효과, 항산화 효과, 항노화 효과, 항염작용, 강장작용, 이뇨작용, 혈압강하작용 등이 보고된 바 있다. 황기는 오래전부터 인체를 보하는 약재로서 한방에서는 황기건중탕 (黃耆建中湯), 십전대보탕 (十全大補湯), 황기계지오물탕 (黃耆桂枝五物湯), 방기황기탕 (防己黃耆湯) 등의 많은 한방 처방에서 황기를 인삼 다음의 보기약 (補氣藥)으로서 사용해오던 재료로 인체에 대한 안정성이 이미 확인되어있다.

단삼 (Salvia miltiorrhiza BUNGE)은 쌍떡잎식물 통화식물목 꿀풀과의 여러해살이풀로서 중국, 한국(경북·강원), 일본 등에 분포한다. 높이 40~80 cm로 전체에 황백색의 부드러운 털과 선모로 뒤덮여 있다. 약재는 다년생 본초인 단삼의 뿌리를 건조한 것으로서, 근경이 짧고 거칠며 정단에는 보통 줄기가 붙었던 자국이 남아 있다. 뿌리는 긴 원주형으로 때로는 1~2개 또는 여러 개로 갈라졌고 길이 8~25 cm, 지름 3~10 mm이다. 단삼은 탄시논 (Tanshinone I, IIA, IIB), 15,16-디히드로탄시논 I(15,16-Dihydrotanshinone I), 크립토탄시논(Cryptotanshinone)등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다(정보섭, 신민교; 향약대사전, 영림사, pp860-862, 1998). 단삼은 혈관 확장 작용, 항균작용, 진정, 진통 작용의 효능을 가지고 있는데, 항암 실험 결과 암세포의 호흡(에너지 대사)을 억제하고 당발효 분해를 억제하는 효과가 있다고 한다. 이 외에도 단삼은 간경화, 알레르기성 자반증, 관상동맥경화, 자궁 질환에도 많이 사용되는 약재이다.

본 발명은 노린재나무 및 황기의 혼합 추출물을 포함하여 관절염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 조성물과 그 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 장기적으로 복용하거나 인체 내에 직접적으로 투여하여도 독성이나 부작용이 없는 관절염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 노린재나무 추출물 및 황기 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 노린재나무 추출물 및 황기 추출물은 노린재나무 및 황기를 물 또는 C_1-4 알코올로 추출한 것일 수 있다.

상기 노린재나무 및 황기는 5:1~1:5의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.

상기 노린재나무 및 황기는 1:3~5의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.

상기 조성물은 단삼 추출물을 더 포함할 수 있다.

상기 노린재나무 추출물, 황기 추출물 및 단삼 추출물은 노린재나무, 황기 및 단삼을 물 또는 C_1-4 알코올로 추출한 것일 수 있다.

상기 노린재나무, 황기 및 단삼은 1~3:1~3:1~3의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.

상기 노린재나무, 황기 및 단삼은 1:1:1~3의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 노린재나무 및 황기를 포함하는 생약재를 준비하는 단계; 및

준비된 생약재에 물 또는 C_1-4 알코올을 가하여 추출하는 단계를 포함하는, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 생약재는 단삼을 추가로 더 포함할 수 있다.

상기 추출하는 단계 시 물 또는 C_1-4 알코올은 생약재의 중량 대비 5~20배의 양으로 가해질 수 있다.

본 발명에서 제공하는 조성물은 노린재나무 추출물과 황기 추출물을 포함하여 관절염을 예방하고 치료하는 데에 효과적이다.

또한, 본 발명에서 사용하는 추출물은 천연 유래 물질로서, 이를 장기적으로 복용하거나 인체 내에 직접적으로 투여하여도 독성이나 부작용이 없다.

도 1은 실험예 2에서 각 조성물의 처리에 따른 SW1353 연골세포에서의 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 생성량의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 실험예 3에서 각 조성물의 처리에 따른 SW1353 연골세포에서의 MMP-3 mRNA 발현 분석 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 4에서 각 조성물의 처리 후 관절연골 조직의 사진을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시형태들을 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 노린재나무 추출물 및 황기 추출물을 유효 성분으로 포함한다.

본 발명에서 상기 노린재나무 추출물 및 황기 추출물은 식물 전체를 추출하여 얻어진 것이거나, 혹은 식물의 일부로, 뿌리, 잎, 꽃, 가지, 줄기 또는 열매 등을 추출하여 얻어진 것일 수 있다. 바람직하게는 노린재나무와 황기 각각의 잎, 가지 및 뿌리 중 적어도 하나를 추출하여 얻어진 것일 수 있다.

본 발명에서 사용하는 노린재나무 추출물 및 황기 추출물은 천연 유래 물질로서 독성이 없을 뿐만 아니라, 관절의 연골세포 및 조직에서 염증성 물질 유리와 기질 파괴 물질의 합성을 억제시키고, 관절염의 통증 및 부종 등의 병적 진행을 억제하는 활성을 나타내어 부작용 없이 관절염을 예방 또는 치료할 수 있다.

여기서, 상기 노린재나무 추출물 및 황기 추출물은 노린재나무와 황기 각각을 별도로 추출한 뒤 얻어진 추출물을 혼합한 것일 수 있으나, 바람직하게는 노린재나무와 황기의 혼합 생약재를 물 또는 C_1-4 알코올을 이용하여 추출한 것일 수 있다.

이때, 상기 노린재나무 추출물 및 황기 추출물은 노린재나무 및 황기가 5:1~1:5의 중량비로 혼합된 생약재로부터 추출하는 것이 높은 추출 수득률로 혼합 추출물을 얻을 수 있어 바람직하며, 보다 바람직하게는 노린재나무 및 황기가 1:3~5의 중량비로 혼합된 생약재로부터 추출하는 것이 관절염의 예방 또는 치료 효과를 더욱 높일 수 있다.

본 발명에서는 상기와 같은 관절염의 예방 또는 치료 효과를 더욱 높이기 위하여 단삼 추출물을 추가로 더 포함할 수 있다.

여기서, 상기 단삼 추출물 역시 단삼을 별도로 추출하여 얻어진 추출물을 노린재나무 추출물 및 황기 추출물과 혼합한 것일 수 있겠지만, 바람직하게는 노린재나무, 황기 및 단삼의 혼합 생약재를 물 또는 C_1-4 알코올을 이용하여 추출한 것일 수 있다.

이때, 상기 노린재나무 추출물, 황기 추출물 및 단삼 추출물은 노린재나무, 황기 및 단삼이 1~3:1~3:1~3의 중량비로 혼합된 생약재로부터 추출하는 것이 높은 추출 수득률로 혼합 추출물을 얻을 수 있어 바람직하며, 보다 바람직하게는 노린재나무, 황기 및 단삼이 1:1:1~3의 중량비로 혼합된 생약재로부터 추출하는 것이 관절염의 예방 또는 치료 효과를 현저히 높일 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하 등으로 투여될 수 있다.

여기서, 경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여에 의해 염증을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 조성물의 투여에 의해 염증에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 상기한 관절염의 예방 또는 치료용 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 노린재나무 및 황기를 포함하는 생약재를 준비하는 단계; 및 준비된 생약재에 물 또는 C_1-4 알코올을 가하여 추출하는 단계를 포함한다.

여기서 준비된 생약재 내 포함된 노린재나무 및 황기는 5:1~1:5의 중량비로 혼합된 것이 높은 추출 수득률로 혼합 추출물을 얻을 수 있어 바람직하고, 보다 바람직하게는 노린재나무 및 황기가 1:3~5의 중량비로 혼합된 것을 사용하는 것이 관절염의 예방 또는 치료 효과를 현저히 높일 수 있다.

또한, 본 발명에서는 관절염의 예방 또는 치료 효과를 더욱 높이기 위하여 생약재로, 노린재나무 및 황기와 함께 단삼을 추가로 더 포함할 수 있다.

여기서 준비된 생약재 내에 포함된 상기 노린재나무, 황기 및 단삼은 1~3:1~3:1~3의 중량비로 혼합된 것이 높은 추출 수득률로 혼합 추출물을 얻을 수 있어 바람직하고, 보다 바람직하게는 노린재나무, 황기 및 단삼이 1:1:1~3의 중량비로 혼합된 것을 사용하는 것이 관절염의 예방 또는 치료 효과를 현저히 높일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 추출하는 단계 시 물 또는 C_1-4 알코올은 생약재의 중량 대비 5~20배의 양으로 가해지는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서 상기 추출하는 단계는 15~30℃의 온도 하에서 24~72시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명은 필요에 따라 수득한 추출물에 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등의 공정을 추가로 수행하여 분말 상태의 추출물을 획득하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기와 같이 얻어진 노린재나무 및 황기의 혼합 추출물에 선택적으로 포함되는 단삼 추출물은 천연 유래 물질로서 독성이 없을 뿐만 아니라, 관절의 연골세포 및 조직에서 염증성 물질 유리와 기질 파괴 물질의 합성을 억제시키고, 관절염의 통증 및 부종 등의 병적 진행을 억제하는 활성을 나타내어 부작용 없이 관절염을 예방 또는 치료할 수 있다.

따라서, 본 발명에서는 필요에 따라 얻어진 추출물에 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등을 첨가하여 관절염의 예방 또는 치료용 조성물을 제조할 수 있다.

실시예

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

비교예 1: 황기 추출물의 제조

경동시장에서 구입한 황기 150 g에 30% 에탄올 3L를 가하여, 상온에서 48시간 동안 추출하고, 추출 상등액을 여과한 후 감압 농축 및 동결 건조하여 32.8g의 황기 추출물을 얻었다. 이때 얻어진 황기 추출물의 수득률은 하기 식으로 계산하여 표 1에 함께 나타내었다.

단, 본 발명에서 '수득률'은 아래와 같은 식으로 계산될 수 있다.

수득률(%) = 추출물/건조된 원료 x 100

비교예 2: 노린재나무 추출물의 제조

강원도 수목원으로부터 확보한 노린재나무 잎 150 g에 30% 에탄올 3L를 가하여, 상온에서 48시간 동안 추출하고, 추출 상등액을 여과한 후 감압 농축 및 동결 건조하여 34.7g의 노린재나무 추출물을 얻었다. 이때 얻어진 노린재나무 추출물의 수득률은 하기 표 1에 함께 나타내었다.

비교예 3: 단삼 추출물의 제조

경동시장에서 구입한 단삼 150 g에 30% 에탄올 3L를 가하여, 상온에서 48시간 동안 추출하고, 추출 상등액을 여과한 후 감압 농축 및 동결 건조하여 33.48g의 단삼 추출물을 얻었다. 이때 얻어진 노린재나무 추출물의 수득률은 하기 표 1에 함께 나타내었다.

실시예 1 내지 9: 노린재나무 및 황기의 혼합 추출물의 제조

건조 및 세절하여 얻은 노린재나무 잎 150 g에 대하여 황기를 하기 표 1에 나타낸 중량비로 혼합한 뒤 30% 에탄올 6L를 가하여 상온에서 48시간 동안 추출하고, 추출 상등액을 여과한 후 감압 농축 및 동결 건조하였다. 이때 얻어진 혼합 추출물의 수득률은 하기 표 1에 함께 나타내었다.

실시예 10 내지 17: 노린재나무, 황기 및 단삼의 혼합 추출물의 제조

건조 및 세절하여 얻은 노린재나무 잎 150 g에 대하여 황기 및 단삼을 하기 표 2에 나타낸 중량비로 혼합한 뒤 30% 에탄올 6L를 가하여 상온에서 48시간 동안 추출하고, 추출 상등액을 여과한 후 감압 농축 및 동결 건조하였다. 이때 얻어진 혼합 추출물의 수득률은 하기 표 1에 함께 나타내었다.

구분	혼합 중량비			수득률(%)
구분	황기	노린재나무	단삼	수득률(%)
비교예 1	1	0	0	23.1
비교예 2	0	1	0	21.9
비교예 3	0	0	1	22.3
실시예 1	1	1	0	22.2
실시예 2	2	1	0	19.2
실시예 3	3	1	0	19.2
실시예 4	4	1	0	19.4
실시예 5	5	1	0	18.4
실시예 6	1	2	0	19.2
실시예 7	1	3	0	19.2
실시예 8	1	4	0	19.4
실시예 9	1	5	0	18.4
실시예 10	1	1	1	29.4
실시예 11	1	1	2	26.1
실시예 12	1	1	3	38.6
실시예 13	2	1	2	32.7
실시예 14	2	1	3	38.6
실시예 15	3	1	3	35.4
실시예 16	1	2	1	29.0
실시예 17	1	3	3	28.4

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 실시예 1 내지 9에서 노린재나무와 황기가 5:1~1:5의 중량비로 혼합된 것을 추출한 결과 18% 이상의 높은 수득률로 노린재나무 및 황기의 혼합 추출물이 얻어진 것을 볼 수 있으며, 특히 실시예 1에서 노린재나무와 황기가 1:1의 중량비로 혼합된 것을 사용한 결과 22.2%의 매우 높은 수득률로 혼합 추출물이 얻어진 것을 볼 수 있다.

또한, 상기 실시예 10 내지 17에서 황기, 노린재나무 및 단삼이 1~3:1~3:1~3의 중량비로 혼합된 것을 추출한 결과 28% 이상의 높은 수득률로 노린재나무, 황기 및 단삼의 혼합 추출물이 얻어진 것을 볼 수 있으며, 특히 실시예 12 및 14에서 노린재나무, 황기 및 단삼이 각각 1:1~2:3의 중량비로 혼합된 것을 사용한 결과 38% 이상의 매우 높은 수득률로 혼합 추출물이 얻어진 것을 볼 수 있다.

실험예 1: 세포 배양 및 세포 독성 시험

SW1353 연골육종 세포주를 ATCC (HTB-94, Rockville, MD, USA)로부터 구입하였다. 세포를 측정하는 목적에 따라 다양한 크기의 세포배양용 플라스크(flask)에 우태아혈청(Fetal bovine serum: FBS, 1456396, Gibco^® Life Technologies)을 함유한 DMEM (Dubecco's Modified Eagle Medium) 배지(1509667, Gibco^® Life Technologies)로 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 48시간 동안 배양하였으며, 0.25%(w/v) 트립신 (Trypsin)-0.53mM EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid) 용액으로 처리하여 2일 간격으로 계대 배양하며 실험에 사용하였다. 96 well plate에 1 X 10⁵cell 개로 배양한 SW1353 세포에 실시예 1 내지 17에서 얻어진 혼합 추출물 각각을 25 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 및 200 ㎍/ml의 농도별로 처리하고 37℃ incubator에서 24시간 배양 후에 세포 생존율을 확인하였다. 이때, SW1353 세포에 대한 세포 생존율은 MTT (methylthiazol tetrazolium bromide) 검정법으로 측정하였고, 그 결과는 계대배양 조건인 10 % 우태아혈청 (FBS) 처리군을 대조군으로 하여 그에 대한 생존율(%)을 계산하였다.

상기와 같이 세포 생존율을 측정한 결과, 실시예 1 내지 17의 혼합 추출물을 25 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 및 200 ㎍/ml 농도로 처리한 SW1353 세포의 생존율은, 모두 대조군 대비 98% 이상으로 측정되었는 바, 본 발명에 따르는 조성물이 세포 사멸에는 직접적인 영향을 주지 않는 것을 볼 수 있다.

실험예 2: SW1353 연골세포에서의 MMP-1, MMP-3, MMP-13 생성량 분석

6 well에 4 X 10⁵ cell 배양한 SW1353 연골육종 세포에 IL-1β 20 ng/mL (R&D Systems, Inc., USA)를 처리한 후, 실시예 1 내지 17의 혼합 추출물과 비교예 1 내지 3의 단일 추출물을 각각 100 ㎍/mL의 농도로 세포에 처리하고 37 ℃ incubator에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 각각의 시료가 처리된 세포로부터 세포 배양액 (상층액)을 얻어 세포로부터 생성된 MMP-1 (71150), MMP-3 (71152), MMP-13 (71156)을 MMP fluoremetric assay kit (AnaSpec, Inc., USA)를 사용하여 60 분 동안 측정하고 증가되는 수치는 relative fluorescence unit (RFU)로 나타내어 그 결과를 도 1에 나타내었다.

단, 이 경우 본 발명에 따르는 혼합 추출물을 포함하는 조성물의 사용 시 MMP-1, 3, 13 생성량의 변화를 확인하기 위하여, 아무런 처리를 하지 않은 세포 배양액(normal)과, IL-1β 처리 후 추출물을 처리하지 않은 세포 배양액(IL-1 β 20 ng/mL)의 결과를 대조군으로 하여 도 1에 함께 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, IL-1β 만을 처리한 경우와 비교할 때, 비교예 1 내지 3의 단일 추출물을 처리한 경우와, 실시예 1 내지 17의 혼합 추출물을 처리한 경우 모두 MMP-1, MMP-3, MMP-13의 생성량이 감소한 것을 볼 수 있다.

다만, 비교예 1 내지 3의 단일 추출물을 처리한 경우보다 실시예 1 내지 17의 혼합 추출물을 처리한 경우 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 생성량이 더욱 감소한 것을 볼 수 있고, 특히 실시예 10 내지 17에서 노린재나무, 황기 및 단삼의 혼합 추출물을 처리한 경우가 실시예 1 내지 9에서 노린재나무 및 황기의 혼합 추출물을 처리한 경우보다 MMP-1, MMP-3, MMP-13 생성량이 더욱 감소한 것을 볼 수 있다.

더욱이, 실시예 1 내지 4의 혼합 추출물을 처리하였을 때에는 황기의 비율이 증가할수록 세포의 MMP-1, MMP-3, MMP-13 생성량이 더욱 감소(p<0.001)하는 경향을 볼 수 있고, 노린재나무 및 황기의 혼합 추출물을 처리한 경우 실시예 3 내지 5의 혼합 추출물을 처리한 세포에서 MMP-1, MMP-3, MMP-13 생성량이 가장 감소한 것을 볼 수 있다.

또한, 노린재나무, 황기 및 단삼의 혼합 추출물을 처리한 경우 실시예 10 내지 15의 혼합 추출물을 처리한 세포에서 MMP-1, MMP-3, MMP-13 생성량이 가장 감소(p<0.001)한 것을 볼 수 있다.

실험예 3: SW1353 연골세포에서의 RT-PCR mRNA 발현 분석

6 well에 4 X 10⁵ cell 배양한 SW1353 연골육종 세포에 IL-1β 20 ng/mL (R&D Systems, Inc., USA)를 처리한 후 비교예 1 내지 3에서 얻어진 추출물과, 실시예 1 내지 17에서 얻어진 혼합 추출물을 각각 100 ㎍/mL의 농도로 세포에 처리하였다. 이 후, 37 ℃ incubator에서 24 시간 배양하고, PBS로 세척하고 0.25 % (w/v) 트립신- 0.53 mM EDTA와 원심분리기를 이용하여 연골세포를 회수하였다. 회수된 세포로부터 RNA의 분리는 TRIzol 시약 (Invitrogen, Corp., USA)을 사용하여 추출하였고, 모든 RT reaction은 추출한 1 ㎍ RNA를 주형으로 하여 RT-PCR kit (Invitrogen, Corp., USA)의 프로토콜에 따라 실시하였다. 세포에서의 mRNA 발현은 MMP (Matrix metalloproteinases)-1 및 MMP-3에 대하여 실시하였다. PCR product는 2.0 % agarose gel을 이용하여 전기 영동한 후 ethidium bromide로 염색하여 mRNA 발현 정도를 측정해 그 결과를 도 2에 나타내었다.

단, 이 경우 본 발명에 따르는 혼합 추출물을 포함하는 조성물의 사용 시 MMP-1, 3 mRNA 발현 정도의 변화를 확인하기 위하여, 아무런 처리를 하지 않은 세포 배양액(normal)과, IL-1β 처리 후 추출물을 처리하지 않은 세포 배양액(IL-1β 20 ng/mL)의 결과를 대조군으로 하여 도 2에 함께 나타내었다.

실험에 사용한 primer와 반응 조건은 각각 다음과 같다.

MMP-1: (F) AGTGACTGGGAAACCAGATGA/ (R) CGTCTTGGCAAATCTGGCCTGTAA (Annealing Temperature: 57 ℃, 35 cycle), MMP-3: (F) ATTCCATGGAGCCAGGCTTTC/ (R) CATTTGGGTCAAACTCCACTGTG (57 ℃, 35 cycle), PCR 결과물은 2 % agarose gel에 30 분 동안 전기영동을 시행한 후, UV transilluminator (UVP ChemiDoc-It, USA)로 mRNA band를 관찰하였고 VisionWorksLS (version 7.1) 프로그램을 이용하여 밴드를 수치화하였다.

도 2 에서 보는 바와 같이 각각의 추출물에 대한 연골기질성분 콜라겐의 분해효소인 MMP-1과 MMP-3의 mRNA 발현 저해 수준을 PCR로 확인한 결과, 비교예 2의 노린재나무 잎 추출물에서 MMP-1 및 MMP-3 mRNA 발현에 대한 저해 활성이 강하게 나타난 것을 볼 수 있지만, 비교예 1 내지 3의 단일추출물에서 보다 실시예 1 내지 17의 혼합 추출물을 처리하였을 때 MMP-1 및 MMP-3의 mRNA 발현 억제 효과가 매우 높게 나타나는 것을 볼 수 있으며, 특히 실시예 1, 10 및 11의 혼합 추출물을 처리하였을 때 MMP-1 및 MMP-3의 mRNA 발현 억제 효과가 가장 높게 나타난 것을 볼 수 있다.

실험예 4: Monosodium iodoacetate 유도 관절염 랫드 모델을 이용한 항관절염 효능 평가 실험

본 발명에 따른 혼합 추출물이 골관절염의 병적 진행을 억제할 수 있는지를 확인하기 위하여, MIA 랫트 모델을 이용하여 항관절염 효능 평가 실험을 수행하였다.

실험예 4-1: MIA 유도 관절염 유발

120-140 g 내외의 수컷 Wistar계 흰쥐 (Orient-bio Inc., Korea)를 구입하여 청정동물사육실 (온도 23±1℃, 습도 55±5%) 내에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험기간 동안 사료와 음수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 흰쥐를 이용한 골관절염 유도 모델은 Bove 등 (2003)의 방법에 따라 유발시켰다. Monosodium iodoacetate (MIA) (Sigma-aldrich, USA) 용액은 주사용 생리식염수에 5 mg/mL의 농도로 제조하였다. 시험 개시일 (D0)에 Zoletile : Rumpun (2:1)을 근육주사하여 마취시키고 오른쪽 슬관절의 전면을 소독한 후, 슬관절강내로 각 개체당 MIA 용액 (1 mg/50 ㎕)을 hemilton syringe (26 gauge)에 취하여 무릎 연골 중앙부위에 정확히 주사하였다. 이때 정상군은 슬관절강내로 주사용 생리식염수 동일한 방법으로 주사하였다.

실험예 4-2: 노린재나무, 황기 및 단삼의 혼합 추출물의 경구 투여

8일째에 육안관찰을 통해 체중과 유발정도가 고르게 8마리씩 6그룹으로 나누어 각각의 시료를 경구 투여하였다. 정상군 (G1군, normal group)은 증류수만 경구투여하였고, 대조군 (G2군, MIA처리군, 관절염 유도 대조군)은 MIA 유발 후 증류수를 경구 투여하였다. 양성대조약물군과 처치군은 각각 관절염치료제 조인스정(G3군,

, 200 mg/kg)와 비교예 1 내지 3의 황기, 노린재, 단삼 개별 추출물 (G4-G6군, 200 mg/kg), 실시예 1 (G7군), 실시예 10 (G8군), 실시예 11 (G9군) 군에서 얻어진 추출물을 각각 증류수에 녹여서 2주간 1일 1회 경구투여하였다.

실험예 4-3: 병리조직학적 골관절염 지수의 평가

주 1회 체중을 측정하고 D22일째에 심장채혈한 후 혈청을 분리하여 -70 ℃에 보관하였고, MIA 유도 골관절염이 유발된 각 개체의 무릎연골을 분리하여 고정과 탈회 과정을 거친 후 H&E (Hematoxyline & Eosin) 염색 후 현미경을 통해 관절연골 조직을 관찰하였다.

이때, G1군, G2군 및 G4군 내지 G9군에서 현미경을 통해 관절연골 조직을 관찰한 사진은 도 3에 나타내었다.

또한, 조직병리 검경 항목은 Guzman 등 (2003)의 방법에 따라 연골하골 변화 (Subchondral bone change), 연골세포 괴사 (chondrocyte necrosis), 연골 침식 (cartilage erosion), 골극 형성 및 연골 갈라짐 (osteophyte and cartilage cleft)으로 각 항목당 0 ~ 5점까지로 하였다. 검경 스코어(score) 결과는 평균 및 표준편차로 나타내며, 그 결과는 비모수 통계법인 Kruskal-Wallis test를 이용하여 검정하였다. Kruskal-Wallis test 결과 유의수준이 p<0.05 일 경우, 각 군간의 통계는 Dunn's Multiple comparision test를 이용하여 검정하였다. 각 군간의 통계처리는 GraphPad PRISM®Version 4.0 (GraphPad Software, USA)을 사용하여 실시하였고, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

구분	투여량 (/체중 kg당)	관절염 지수 (Arthritis scoring)
G1. 정상군	-	-
G2. 대조군	-	16.17 ± 3.37
G3. 약물 대조군 (조인스정 투여군)	200 mg/kg	12.43 ± 2.23
G4. 비교예 1		9.86 ± 1.35 ^*
G5. 비교예 2		12.20 ± 3.49
G6. 비교예 3		11.29 ± 3.50
G7. 실시예 1		9.50 ± 4.59 ^*
G8. 실시예 10		9.00 ± 2.74 ^*
G9. 실시예 11		8.20 ± 2.95 ^*

각 개체의 관절염 유발 무릎연골을 상기의 조직 검경 항목을 기준으로 정성 분석한 결과, 각각 관절염 유도 대조군(G2군)은 16.17±3.37, 조인스정 투여군(G3군)은 12.43 ± 2.23, 단일 추출물을 투여한 비교예 1 내지 3 중에서는 황기추출물 투여군(G4군)이 9.86 ± 1.35의 점수로 가장 좋은 효과를 보였으나, 실시예 1, 10 및 11의 혼합 추출물을 사용한 경우, 각각 점수가 9.50 ± 4.59, 9.00 ± 2.74 및 8.20 ± 2.95로 단일 추출물을 투여한 경우보다 훨씬 우수한 관절염의 치료 효과를 갖는 것을 볼 수 있었다.

통계학적 분석 결과, Kruskal-Wallis test에서 유의성 (p<0.05)이 인정되며, 각 군간 Mann Whitney test 결과 관절염 유발 대조군(G2군) 대비 실시예 1(G7군), 실시예 10 (G8군) 및 실시예 11 (G9군)의 경우 통계적으로 유의적인 (p<0.05) 효과가 확인되었다. 이로써, 본 발명의 범위에 속하는 혼합 추출물은 MIA 유도 랫트 골관절염 모델에서 통계적으로 유의적인 항관절염 효능을 갖는 것을 알 수 있다.

더욱이, 도 3에서 보는 바와 같이, 상기 골관절염을 유발한 G2군은 정상군인 G1군에 비하여 관절염 손상이 관찰되었으나, 황기 추출물, 노린재나무 추출물 및 단삼 추출물의 단일 추출물과, 이들의 혼합 추출물을 2주간 경구 투여한 G4군 내지 G9군에서 항관절염 효능이 확인되었다.

다만, 혼합 추출물을 경구 투여한 G7군 내지 G9군이 단일 추출물을 경구 투여한 G4군, G5군 및 G6군 보다 효능이 현저히 뛰어난 것을 볼 수 있었다.

이로써, 본 발명의 범위에 속하는 혼합 추출물을 사용하는 경우 노린재나무 잎, 황기 및 단삼 각각의 단일 추출물을 사용하는 경우와 비교할 때 관절염 예방 또는 치료 효과가 현저히 상승하는 것을 알 수 있다.

이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims

노린재나무 추출물 및 황기 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 노린재나무 추출물 및 황기 추출물은 노린재나무 및 황기를 물 또는 C_1-4 알코올로 추출한 것인, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 노린재나무 및 황기는 5:1~1:5의 중량비로 혼합된 것인, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 노린재나무 및 황기는 1:3~5의 중량비로 혼합된 것인, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 단삼 추출물을 더 포함하는, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 노린재나무 추출물, 황기 추출물 및 단삼 추출물은 노린재나무, 황기 및 단삼을 물 또는 C_1-4 알코올로 추출한 것인, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 노린재나무, 황기 및 단삼은 1~3:1~3:1~3의 중량비로 혼합된 것인, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 노린재나무, 황기 및 단삼은 1:1:1~3의 중량비로 혼합된 것인, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물.
노린재나무 및 황기를 포함하는 생약재를 준비하는 단계; 및
준비된 생약재에 물 또는 C_1-4 알코올을 가하여 추출하는 단계를 포함하는, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 노린재나무 및 황기는 5:1~1:5의 중량비로 혼합된 것인, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법.
제10항에 있어서,
상기 노린재나무 및 황기는 1:3~5의 중량비로 혼합된 것인, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 생약재는 단삼을 추가로 더 포함하는, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 노린재나무, 황기 및 단삼은 1~3:1~3:1~3의 중량비로 혼합된 것인, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 노린재나무, 황기 및 단삼은 1:1:1~3의 중량비로 혼합된 것인, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 추출하는 단계 시 물 또는 C_1-4 알코올은 생약재의 중량 대비 5~20배의 양으로 가해지는, 관절염의 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법.