CN109303790B - 刺山柑或刺山柑提取物的医药用途 - Google Patents

刺山柑或刺山柑提取物的医药用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及刺山柑或刺山柑提取物的医药用途，具体提供了刺山柑或刺山柑的提取物在制备降低雷公藤、雷公藤多苷或雷公藤甲素肝毒性中的药物或保健品中的应用，还提供了一种组合物及其在制备防治风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合征、红斑狼疮、口眼干燥综合征、白塞病、湿疹、银屑病、麻风病、疥疮、顽癣、桥本甲状腺或肿瘤的药物或保健品中的应用，所述组合物包含组分i)和组分ii)，所述组分i)选自：刺山柑或刺山柑的提取物；所述组分ii)选自：雷公藤多苷或雷公藤甲素。

Description

刺山柑或刺山柑提取物的医药用途
技术领域
本发明涉及医药保健品领域，特别涉及刺山柑或刺山柑提取物的医药用途，本发明的刺山柑、刺山柑提取物可用于制备雷公藤、雷公藤多苷片、雷公藤甲素增效减毒的药物或保健品。
背景技术
雷公藤(Tripterygium Wilfordii Hook.f.)及其提取物雷公藤多苷为临床常用抗风湿药物，是可用于治疗类风湿性关节炎、原发性肾小球肾病、肾病综合征、紫瘢性及狼疮性肾炎、红斑狼疮等疾病的中药。但是它们也可引起诸多不良反应，如消化道反应、肝肾毒性和心血管损害等并症，是单味药中肝毒性最严重的中药之一，其不良反应的临床特征为肝肿大、胆汁淤积、肝细胞脂肪样变、肝细胞凋亡及坏死等。雷公藤中主要活性物质是雷公藤甲素(Triptolide)，又名雷公藤内酯醇，它是一种强力免疫抑制剂及抗炎剂，在临床上主要用于治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮、皮肤病、恶性肿瘤、肾炎和器官排斥反应等多种疾病。雷公藤甲素除了有多种生物活性以外，它还具有一定的毒性，主要表现在对心、肝、骨髓、胸、脾、肾及生殖系统等的毒性。由于雷公藤甲素水溶性差、毒性强(其小鼠的半数致死量(LD50)为0.8mg/kg)，治疗窗窄，并具有严重的不良反应，使其临床应用受到了严重的限制。因此，有效降低雷公藤、雷公藤多苷以及雷公藤甲素毒性，同时维持或提高它们药理活性的方法，对于临床上合理安全的使用雷公藤甲素具有十分重要的意义。
刺山柑(Capparis spinose L.)为白花菜科Capparidaceae山柑属Capparis植物，又名野西瓜、老鼠瓜、槌果藤、菠里克果(维名)，主要分布于新疆、甘肃、西藏等地区。国外则主要分布于中东地区和地中海国家。刺山柑果实具有抗炎、抗菌、保肝、降脂和降糖等多种药理活性。
期刊《中国实验方剂学杂志》2015年第21卷第4期刊出的论文“维吾尔族药刺山柑果实抗炎活性部分的初步筛选”，公开了：分别采用蒸馏水、80％乙醇和石油醚对刺山柑果实进行提取，制备不同极性提取物，并以此分组。SPF级昆明种小鼠240只，分别采用小鼠右后肢足趾中部ih 1％的角叉菜胶致小鼠足肿胀实验、二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验，两组实验均分为维吾尔族药刺山柑果实水提部位高、中、低剂量组(7.903，3.952，1.976g·kg－1)，维吾尔族药刺山柑果实石油醚部位高、中、低剂量组(2.935，1.468，0.734g·kg－1)，80％乙醇高、中、低剂量组(5.644，2.822，1.411g·kg－1)及雷公藤多苷组(8.5mg·kg－1)，羧甲基纤维素纳(CMC-Na)组和食用油组，每组10只；每日给予相应药物1次，连续14d，第14天在给药60min后，两组实验分别给予造模剂。小鼠足肿胀实验注射角叉菜胶后30min，1，2，4，6h用足爪肿胀测量仪测定小鼠致炎右后足趾容积，同时将致炎足自踝关节以上1cm剪下，测定前列腺素E2(PGE2)含量；小鼠耳廓肿胀实验小鼠右耳涂抹二甲苯20μL致炎，1h后取左耳片和右耳片称重，计算耳肿胀度。结果：与食用油组和CMC-Na组比较，雷公藤多苷组和各提取部位组均能降低不同时间点的足肿胀，并能降低PGE2含量，尤其是水提部位高、中、低剂量组具有明显统计学差异(P＜0.05)；与食用油组和CMC-Na组比较，雷公藤多苷组和各提取部位组均能降低小鼠耳肿胀度，水提部位高、中、低剂量组具有明显统计学差异(P＜0.05)。结论：动物实验结果提示刺山柑果实水提取物具有良好的抗急性炎症作用，可初步确定为维吾尔族药刺山柑果实抗炎活性部分。
期刊《中国医药导报》2008年2月第5卷第6期刊出的论文“维药老鼠瓜中主要硫苷的提取及抗风湿作用”，公开了：干燥的老鼠瓜种子1000g，于沸水浴中处理5min。粉碎之后用1500ml 70％甲醇水溶液加热回流提取两次，合并提取液并过滤，滤液浓缩(500ml)，加入10ml 0.5mol/L的Pb(Ac)2-Ba(Ac)2溶液，放置后过滤，滤液浓缩至浸膏状。加入30％甲醇50ml，加热使之溶解，在0℃以下放置，得到粗提物结晶0.82g。用30％甲醇重结晶即得到针状甲基硫苷结晶0.55g。Freund’s完全佐剂诱导法建立风湿性关节炎大鼠模型，设立正常组、模型组、雷公藤组、硫苷低、中、高剂量组(25，50，100mg/kg)，测量各组大鼠继发侧足厚度，进行疼痛评分和多发性关节炎指数评分。结果表明，高、中、低剂量硫苷灌胃治疗，均能改善AA大鼠关节及关节外炎性症状，使关节肿胀程度和关节炎炎性指数显著下降，严重程度明显减轻。其中高、中剂量LG效果与雷公藤相近(P>0.05)。
《第十二届全国免疫学学术大会摘要汇编》2017年刊出的论文“维药槌果藤及传统中药对佐剂型关节炎大鼠模型组织中TNF-α及血清中IL-17a表达水平的影响”公开了维药槌果藤与雷公藤多甙均能有效降低AA大鼠模型的关节肿胀程度，改善足踝关节组织病理损伤，降低组织中TNF-α及血清中IL-17a的表达。
然而，目前未见刺山柑提取物与雷公藤、雷公藤多苷、雷公藤甲素联用能够增效减毒的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供刺山柑或刺山柑提取物的新的医药用途、组合物及其医药用途、新的疾病防治方法。
本发明的第一方面是提供了刺山柑或刺山柑的提取物在制备降低雷公藤、雷公藤多苷或雷公藤甲素的肝毒性中的药物或保健品中的应用。
作为本发明的一种实施方案，所述刺山柑选自刺山柑的果实、花、根、茎和/或叶。
作为本发明的一个实例，所述果实选自果实的果皮和/或种子。
作为本发明的另一实施方案，所述雷公藤、雷公藤多苷或雷公藤甲素的肝毒性是指雷公藤、雷公藤多苷和/或雷公藤甲素被施用给个体时对所述个体产生的肝脏损害。
作为本发明的另一实施方案，所述雷公藤、雷公藤多苷或雷公藤甲素的肝毒性是指雷公藤、雷公藤多苷和/或雷公藤甲素被施用给个体以治疗所述个体的疾病时对所述个体产生的肝脏损害。
作为本发明的一个实例，所述疾病选自风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合征、红斑狼疮、口眼干燥综合征、白塞病、湿疹、银屑病、麻风病、疥疮、顽癣、桥本甲状腺或肿瘤。
作为本发明的另一实施方案，所述刺山柑的提取物选自水提取物或醇提取物。
作为本发明的一个实例，所述醇提取物其提取溶剂为醇，该醇选自甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇中的一种。
本发明的第二方面是提供了一种组合物，所述组合物包含组分i)和组分ii)，所述组分i)选自：刺山柑或刺山柑的提取物；所述组分ii)选自：雷公藤多苷或雷公藤甲素。
本发明的第三方面是提供了所述组合物在制备防治风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合征、红斑狼疮、口眼干燥综合征、白塞病、湿疹、银屑病、麻风病、疥疮、顽癣、桥本甲状腺或肿瘤的药物或保健品中的应用。
本发明的第四方面是提供了一种中药组合物，所述中药组合物的原料药为刺山柑和雷公藤。
作为本发明的一种实施方案，所述刺山柑和雷公藤的重量配比为1:(0.001-1000)。较优地，所述刺山柑和雷公藤的重量配比为1:(0.01-100)。更优地，所述刺山柑和雷公藤的重量配比为1:(0.05-10)。更优地，所述刺山柑和雷公藤的重量配比为1:(0.05-0.2)。最优地，所述刺山柑和雷公藤的重量配比为1:0.1。
本发明的第五方面是提供了所述中药组合物在制备防治风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合征、红斑狼疮、口眼干燥综合征、白塞病、湿疹、银屑病、麻风病、疥疮、顽癣、桥本甲状腺或肿瘤的药物或保健品中的应用。
本发明的第六方面是提供了一种疾病的防治方法，所述疾病选自风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合征、红斑狼疮、口眼干燥综合征、白塞病、湿疹、银屑病、麻风病、疥疮、顽癣、桥本甲状腺或肿瘤，所述方法为向患有疾病的个体同时施用所述组合物或所述中药组合物。
本发明优点在于：
1、本发明发现刺山柑提取物对雷公藤致肝损伤具有显著保护作用，且优于市售复方甘草酸苷片，其乙酸乙酯萃取物效果非常显著。
2、本发明发现雷公藤与刺山柑组成的复方制剂具有显著的减毒增效作用，在抗炎方面可以显著减少刺山柑和雷公藤药材用量。
3、本发明发现刺山柑可以提高雷公藤、雷公藤多苷及雷公藤甲素用药安全性和有效性。
具体实施方式
本发明的问世部分是基于这样一个重要发现：通过经典的大鼠风湿模型实验发现刺山柑果实提取物和雷公藤、雷公藤多苷、雷公藤甲素联用，刺山柑果实提取物可以降低雷公藤、雷公藤多苷、雷公藤甲素引起的大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷丙转氨酶(AST)升高，抑制肝损伤，同时显著提高雷公藤、雷公藤多苷、雷公藤甲素的抗风湿作用。上述研究结果证明：刺山柑果实提取物除了能提高雷公藤甲素的抗风湿药效，还能降低雷公藤甲素的肝毒性，从而最大限度地发挥其药用价值。
本文中，所述刺山柑提取物是采用公知的提取方法制备的提取物，所用溶剂包括水或有机溶剂(包括甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚、丙酮等)，以冷浸或是加热回流提取后，减压挥干溶剂后，再经干燥所得提取物。如以下实施例记载，作为本发明的一个实例，所述刺山柑提取物为刺山柑水提取物。较优地，选用刺山柑果实作为原药材。水提取物的制备方法为常规操作。如以下实施例记载，作为本发明的另一实例，所述刺山柑提取物为刺山柑水提取物的石油醚萃取物(SY)，乙酸乙酯萃取物(YS)，正丁醇萃取物(ZD)或水部分。如以下实施例记载，作为本发明的另一实例，所述刺山柑提取物为刺山柑乙醇提取物，采用常规醇提方法。较优的，采用体积浓度70％-90％的乙醇溶液。研究中发现，上述不同类型的刺山柑提取物均可用于制备降低雷公藤、雷公藤多苷或雷公藤甲素的肝毒性中的药物或保健品。
所述组合物包含组分i)和组分ii)，所述组分i)选自：刺山柑或刺山柑的提取物；所述组分ii)选自：雷公藤多苷或雷公藤甲素，除此之外，还可进一步包含药学上可接受的药用载体。所述药学上可接受的药用载体是指本领域中通常接受用于将生物活性剂递送至动物(具体为哺乳动物)的介质，包括(即)佐剂、赋形剂或媒介物，包括但不限于粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、湿润剂、防腐剂、流动调控剂、乳化剂、悬浮剂、抗细菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂。适宜的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂；适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁；适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠等。
所述个体为优选包括但不限于哺乳动物(例如鼠类、猿/猴、马、牛、猪、犬、猫等)且最优选是指人类。
所述疾病的防治方法是指预防或治疗疾病的方法，所述治疗包括导致改善病症、疾病、障碍等的任何效果，例如减轻、减少、调节、改善或消除其症状。
适合的给药途径包括但不限于，口服、静脉注射、直肠、气雾剂、非肠道给药、眼部给药、肺部给药、经皮给药、阴道给药、耳道给药、鼻腔给药及局部给药。此外，仅作举例说明，肠道外给药，包括肌肉注射、皮下注射、静脉注射、髓内注射、心室注射、腹膜内注射、淋巴管内注射、及鼻内注射。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
实施例1刺山柑水提取物制备
取干燥、粉碎刺山柑果实，称取5kg，采用加水回流提取3h×3次(首次为8倍量水，后两次为6倍量溶剂)，合并回流液，减压回收至浓浸膏，冷冻干燥得干膏，备用。
实施例2刺山柑水提取物不同萃取物的制备
取干燥、粉碎刺山柑果实，称取1kg，采用加水回流提取3h×3次(首次为8倍量水，后两次为6倍量溶剂)，合并回流液，减压回收至适量，分别采用石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯和正丁醇萃取分别得到石油醚萃取物(SY)，乙酸乙酯萃取物(YS)，和正丁醇萃取物(ZD)以及水部分(ST)。分别将四个不同萃取部分浓缩成浸膏，冷冻干燥得干膏，备用。
实施例3刺山柑乙醇提取物制备
取干燥、粉碎刺山柑果实，称取5kg，采用85％乙醇加热回流提取3h×3次(首次为7倍量85％乙醇，后两次为5倍量溶剂)，合并回流液，减压回收至浓浸膏，冷冻干燥得干膏，即为本文所使用的刺山柑乙醇提取物。
实施例4刺山柑与雷公藤不同比例提取物制备
按表1提供的中药复方组合物重量配比称取原料，分别组成复方A、复方B、复方C三种中药复方组合物，表1中，用量每份100克。将每份中药粉碎成粗粉，加适量水煎煮2次，从沸腾计时，每次1小时，煎煮完毕后，合并两次煎煮液，服用方法为：一日内分二次服用。
表1中药复方组合物表
复方名称 物质 用量比例
复方A 刺山柑:雷公藤 10:1
复方B 刺山柑:雷公藤 5:5
复方C 刺山柑:雷公藤 1:10
实施例5雷公藤水煎剂制备
取雷公藤粉碎，称取1kg，加适量水，先大火煮开，加文火微沸煎煮1小时，煎煮2次，从沸腾计时，煎煮完毕后，合并两次煎煮液，离心取上清液，冷冻干燥得干膏，备用。
以下用试验例证明本发明中药的药效：
试验例1：刺山柑乙醇提取物及不同萃取物组对雷公藤致肝损伤的保护作用
试验药物：以“实施例3”所制备刺山柑乙醇提取物和“实施例2”所制备不同萃取物作为考察对象。
以BLC57/6小鼠(雌性，周龄8～9w，体重20～23g)作为实验动物，所有小鼠按体重分层随机分为9组：正常组(Normal)、雷公藤组(Model)、复方甘草酸苷组(GCS)、刺山柑乙醇提取物高剂量组(CSE-H)、刺山柑乙醇提取物低剂量组(CSE-L)、石油醚萃取物(SY)组、乙酸乙酯萃取物(YS)组、正丁醇萃取物(ZD)组以及水部分(ST)组，每组10只。小鼠造模前8天分别给予正常组和雷公藤组饮用水灌胃，其余各组按分组分别给予复方甘草酸苷片(商品名“美能”，卫材(中国)药业有限公司)、CSE-H和CSE-L、SY、YS、ZD和ST进行灌胃。最后一日给药9小时后，正常组仍给予饮用水灌胃，其余组均给予雷公藤水煎剂4g/(kg·d)灌胃，造模8h后禁食，摘眼球取血，离心取血清备用；取小鼠肝脏，用4％多聚甲醛固定、脱水、包埋，制成蜡块，采用HE染色进行形态学观察。
利用生化试剂盒检测ALT、AST、ALP水平；使用HE染色方式观察小鼠肝脏病理变化。
由表2可知，与正常组相比较，雷公藤组的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)均显著升高(P<0.01)；与雷公藤组相比，复方甘草酸苷组、CSE-H组、CSE-L组、SY组、YS组、ZD组和ST组的ALT、AST、AKP均有显著下降(P<0.01)。表明刺山柑乙醇提取物，以及水提取物的不同萃取物均显著抗雷公藤导致的肝损伤。另外，与CSE-H组、CSE-L组、SY组、ZD组和ST组相比较，乙酸乙酯萃取物(YS)组对ALT、AST、AKP的下降效果更佳(P<0.01)。提示乙酸乙酯萃取物具有最佳的抗肝损伤作用。并且，与阳性药复方甘草酸苷相比较，CSE-H、YS和ST组对ALT、AST、AKP的下降效果更佳(P<0.01)，提示刺山柑乙醇提取物高剂量、乙酸乙酯萃取物和水部分抗肝损伤效果优于复方甘草酸苷。
与正常对照组(Normal)相比较，雷公藤模型组(Model)大量细胞出现细胞胞体增大，胞核畸形，胞浆浅染，胞质疏松化小泡样变。肝细胞周围、汇管区周围均有炎细胞浸润、且肝板结构破坏；复方甘草酸苷组(GCS)肝细胞病变与模型组接近，但病变程度较轻；与模型组相比较，CSE-L组、SY组、YS组、ZD组和ST组变性细胞数量明显减少，变性程度减低，仅少量肝细胞出现细胞胞体增大、胞质疏松化，低剂量组中央静脉周围少量肝细胞坏死，周围散在炎细胞浸润。YS组以及刺山柑乙醇提取物高剂量组的保护作用优于刺山柑总提取物低剂量组，且优于复方甘草酸苷组，其中YS效果最佳。
表2刺山柑总提取物对雷公藤导致小鼠肝损伤的肝功能的影响(mean±SD，n＝10)
Figure BDA0001891177440000071
注：1)与正常组比较，有非常显著差异，P<0.01；2)与模型组比较，有非常显著差异，P<0.01；3)与乙酸乙酯组(YS)组比较，有非常显著差异，P<0.01；4)与CSE-L比较，有非常显著差异，P<0.01；5)与阳性药GCS组比较，有非常显著差异，P<0.01。
试验例2刺山柑对雷公藤多苷片和雷公藤甲素致肝损伤的保护作用
试验药物：“实施例1”所制备的刺山柑水提取物和“实施例3”所制备的刺山柑乙醇提取物。
以BLC57/6小鼠(雌性，周龄8～9w，体重20～23g)作为实验动物，所有小鼠按体重分层随机分为5组：正常组(Normal)、雷公藤甲素组(Model-1)、雷公藤多苷片组(Model-2)、刺山柑水提取物组(CSG-1)、刺山柑乙醇提取物组(CSG-2)，每组10只。小鼠造模前8天分别给予正常组、雷公藤甲素组和雷公藤多苷片组饮用水灌胃，其余各组按分组分别给予对应药物进行灌胃。最后一日给药9小时后，正常组仍给予饮用水灌胃；雷公藤甲素组和CSG-1组给予雷公藤甲素(上海融禾生物科技有限公司，纯度≥98.5％)1000μg/kg灌胃；雷公藤多苷片组和CSG-2组给予雷公藤多苷(上海复旦复华药业有限公司)(270mg·kg-1)；造模8h后禁食，摘眼球取血，离心取血清备用；取小鼠肝脏，用4％多聚甲醛固定、脱水、包埋，制成蜡块，采用HE染色进行形态学观察。利用生化试剂盒检测ALT、AST、ALP水平；使用HE染色方式观察小鼠肝脏病理变化。
由表3可知，与正常组相比较，雷公藤甲素组和雷公藤多苷片组的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)均显著升高(P<0.01)；与雷公藤甲素组和雷公藤多苷片组相比，刺山柑水提取物组(CSG-1)和刺山柑乙醇提取物组(CSG-2)的ALT、AST、AKP均有显著下降(P<0.01)。
与正常对照组相比较，雷公藤甲素组和雷公藤多苷片组大量细胞出现细胞胞体增大，胞核畸形，胞浆浅染，胞质疏松化小泡样变。肝细胞周围、汇管区周围均有炎细胞浸润、且肝板结构破坏；与模型组相比较，刺山柑水提取物组(CSG-1)与刺山柑乙醇提取物组(CSG-2)变性细胞数量明显减少，变性程度减低，仅少量肝细胞出现细胞胞体增大、胞质疏松化。研究结果表明，刺山柑水提取物和刺山柑乙醇提取物对雷公藤甲素和雷公藤多苷导致的肝损伤有显著的改善作用。
表3刺山柑总提取物对雷公藤甲素导致小鼠肝损伤的肝功能的影响(mean±SD)
组别 N ALT AST AKP
Normal 10 22.18±2.54 23.33±6.21 112.7±12.39
Model-1 10 415.26±37.58 512.82±40.22 172.38±15.48
CSG-1 10 85.38±12.22<sup>**</sup> 87.38±17.29<sup>**</sup> 130.07±11.14<sup>**</sup>
Model-2 10 451.18±36.78 489.36±29.18 167.21±14.32
CSG-2 10 78.21±7.58<sup>##</sup> 92.25±8.59<sup>##</sup> 120.39±9.24<sup>##</sup>
注：与Model-1组比较，*P<0.05，**P<0.01；与Model-2组比较，#P<0.05，##P<0.01。
试验例3：刺山柑与雷公藤联用减毒增效实验研究(抗风湿作用)
试验药物：“实施例3”所制备的刺山柑乙醇提取物、“实施例4”所制备的三种复方A、复方B、复方C和“实施例5”所制备的雷公藤水煎剂。
采用大鼠佐剂关节炎模型的小鼠考察不同配比的组合物治疗风湿性关节炎的效果。实验分组与剂量设计：随机挑选健康大鼠10只作为正常组，其余给予大鼠经弗氏完全佐剂(CFA)造模，造模13天选择发病明显的大鼠60只进行分组，每组10只，随机分为以下6组：模型组(M)、雷公藤水煎剂组(TW)，刺山柑乙醇提取物组(CSE)、复方A组、复方B组、复方C组。给药剂量见表4，给药时间及方法：造模后第13天开始给药，0.2mL/10g(体重)，每日一次，连续灌胃给药3周。正常组、模型组灌服同体积水。
观察指标：利用生化试剂盒检测ALT、AST、ALP等肝功能指标。足跖肿胀度(E)、关节炎指数(AI)的测定分别在造模前1天、致炎后第12天、给药后测量各组大鼠后足跖的容积，计算各组大鼠E。给药前E＝(造模后足趾容积－造模前足趾容积)/造模前足趾容积×100％；给药后E＝(给药后足容积－致炎后足容积)/致炎后足容积×100％。炎后第12天开始观察并记录全身病变。根据未注射佐剂的其余3只肢体的病变程度累积积分5级评分法评价。肢体或关节无红肿(0分)，小趾关节红肿(1分)，趾关节和足跖关节肿胀(2分)，踝关节以下的足爪肿胀(3分)，包括踝关节在内的全部足爪肿胀(4分)。
关节病理学观察：各组大鼠取后足远端趾间关节，用4％多聚甲醛固定24h后，10％乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙5周；石蜡包埋，切片，HE染色。显微镜观察大鼠关节滑膜及软骨组织病理形态变化。
实验结果：
1)治疗前后大鼠E和AI的变化
给药前，模型组(M)、雷公藤水煎剂组(TW)、刺山柑乙醇提取物组(CSG)、复方A、复方B、复方C组大鼠E和AI较正常组有非常显著升高(P＜0.01)。连续灌胃给药3周后，模型组大鼠E、AI较正常组升高(P＜0.01)，提示炎症依然在加重。而雷公藤水煎剂组(TW)、刺山柑乙醇提取物组(CSG)、复方A、复方B、复方C组E和AI较治疗前有非常显著下降(P＜0.01)，且E恢复到接近正常值，提示雷公藤水煎剂组(TW)、刺山柑乙醇提取物组(CSG)、复方A、复方B、复方C组均有显著的抗炎作用。另外，在经过复方A、B和C治疗后，E和AI下降比雷公藤水煎剂组下降更显著(P＜0.05)，提示两者协同增效的作用。并且与复方B、C组相比较，复方A对E和AI下降效果更优，提示复方A具有最佳抗炎效果。具体结果见表4。
表4各组大鼠足跖肿胀度和关节炎指数的比较(mean±SD，n＝10)
Figure BDA0001891177440000101
注：1)P<0.01'各组治疗后与治疗前比较有非常显著差异；2)P<0.01各组治疗后与模型组比较有非常显著差异；3)P<0.05各组治疗后与雷公藤水煎剂组比较有显著差异。4)与复方A比较，有显著差异，P<0.05。
2)治疗前后大鼠ALT和AST变化
由表5可知，与正常组相比较，雷公藤水煎剂组的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)均非常显著升高(P<0.01)；而加上刺山柑的复方A、B、C组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)均非常显著低于雷公藤水煎剂组，提示雷公藤水煎剂组可以导致肝损伤，而与刺山柑联用后可显著降雷公藤的肝毒性(P<0.01)。并且与复方B和C组比较，复方A组ALT和AST水平显著更低(P<0.05)，提示复方A肝毒低。
综上所述：雷公藤与刺山柑组成复方在各自剂量降低的情况具有良好抗炎效果，且肝毒更低，尤其是复方A减毒增效果最显著。
表5不同处理组小鼠肝功能的影响(mean±SD，n＝10)
Figure BDA0001891177440000102
Figure BDA0001891177440000111
注：1)与正常组比较，*P<0.01；2)与雷公藤水煎剂组比较，P<0.01；3)与复方A组比较，P<0.05。
3)大鼠关节病理形态学变化
给药3周后，通过光镜观察各组大鼠关节病变。模型组大鼠关节面模糊，部分关节软骨表面毛糙或缺如，关节滑膜大量炎性细胞浸润，滑膜血管翳增多，关节腔内可见呈绒毛状突起状的滑膜组织增生；雷公藤水煎剂组(TW)、刺山柑乙醇提取物组(CSG)、复方A、复方B、复方C组治疗后，与模型组比较，大鼠滑膜组织增生改善，部分血管翳减轻。进一步表明了复方A、复方B、复方C有显著的抗炎作用。
试验例4刺山柑与雷公藤多苷、雷公藤甲素联用减毒增效实验研究
本实施例采用大鼠佐剂关节炎模型考察“实施例3”所制备的刺山柑果实乙醇提取物与雷公藤多苷(上海复旦复华药业有限公司)、雷公藤甲素(上海融禾生物科技有限公司，纯度≥98.5％)联用抗类风湿关节炎的减毒增效作用。
依照“试验例3”以弗氏完全佐剂(CFA)复制大鼠风湿性关节炎模型。实验时，随机挑选健康大鼠10只作为正常组，其余大鼠经弗氏完全佐剂(CFA)造模，造模13天选择发病明显的大鼠60只进行分组，每组10只，随机分为以下6组：模型组、雷公藤多苷组(DG，10mg/kg)，雷公藤甲素组(JS，100μg/kg)，刺山柑乙醇提取物组(CSG)、刺山柑乙醇提取物(1.4g/kg)+雷公藤多苷联用组(5mg/kg)；刺山柑乙醇提取物(1.4g/kg)+雷公藤甲素组(50μg/kg)。给药时间及方法：造模后第13天开始给药，0.2mL/10g(体重)，毎日一次，连续灌胃给药3周。空白组、模型组灌服同体积水。观察指标依照试验例3：分别测定ALT、AST、ALP等肝功能指标，以及足跖肿胀度(E)、关节炎指数(AI)指标。
实验结果：
1)治疗前后大鼠E和AI的变化
给药前，模型组、DG、JS、CSG、CSG+DG、CSG+JS的大鼠E和AI较正常组有非常显著升高(P＜0.01)，提示造模成功。连续灌胃给药3周，模型组大鼠E、AI较正常组升高(P＜0.01)，提示炎症依然在加重。而DG、JS、CSG、CSG+DG、CSG+JS相比治疗前有非常显著下降(P＜0.01)，且E恢复到接近正常值，提示DG、JS、CSG、CSG+DG、CSG+JS均有显著的抗风湿性关节炎作用。并且，研究还表明，CSG+DG治疗组要显著优于DG组(P＜0.01)，CSG+JS要显著优于JS组(P＜0.01)。表明刺山柑与雷公藤多苷和雷公藤甲素具有协同增效的作用。具体结果见表6。
表6各组大鼠足跖肿胀度和关节炎指数的比较(mean±SD，n＝10)
Figure BDA0001891177440000121
注：1)P<0.01'各组治疗后与治疗前比较有非常显著差异；2)P<0.01各组治疗后与模型组比较有非常显著差异；3)P<0.05各组治疗后与对应的雷公藤组比较有显著差异。
2)治疗前后大鼠ALT和AST变化
由表7可知，与正常组相比较，DG组、JS组的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)均非常显著升高(P<0.01)；而CSG组、CSG+DG组、CSG+JS组的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)均显著低于DG组、JS组，几乎与正常组在同一水平值，提示DG组、JS组可以导致肝损伤，而与刺山柑联用无显著的肝毒性。
表7不同处理组小鼠肝功能的影响(mean±SD)
组别 ALT AST
正常组 24.58±3.46 26.26±7.55
模型组 27.28±3.19 28.92±3.59
DG 132.02±10.18<sup>**</sup> 110.47±18.16<sup>**</sup>
JS 145.32±9.08<sup>**</sup> 142.54±14.07<sup>**</sup>
CSG 29.11±3.27 28.13±5.46
CSG+DG 28.45±5.68 30.11±4.12
CSG+JS 29.17±4.68 28.18±6.22
注：与正常组比较，*P<0.05有显著差异，**P<0.01有非常显著差异。
3)大鼠关节病理形态学变化
连续灌胃给药3周，通过光镜观察各组大鼠关节病变。模型组大鼠关节面模糊，部分关节软骨表面毛糙或缺如，关节滑膜大量炎性细胞浸润，滑膜血管翳增多，关节腔内可见呈绒毛状突起状的滑膜组织增生；DG、JS、CSG、CSG+DG、CSG+JS组治疗后，与模型组比较，大鼠滑膜组织增生改善，部分血管翳减轻，并且CSG+DG、CSG+JS分别要比DG组和JS组改善显著。进一步表明了DG、JS、CSG、CSG+DG、CSG+JS有显著的抗风湿关节炎作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种治疗风湿性关节炎的组合物，其特征在于，所述组合物由相当于生药量1.4g的刺山柑乙醇提取物和5mg雷公藤多苷组成或由相当于生药量1.4g的刺山柑乙醇提取物和50μg雷公藤甲素组成。
2.权利要求1所述组合物在制备治疗风湿性关节炎的药物中的应用。
3.一种治疗风湿性关节炎的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物的原料药为刺山柑和雷公藤，所述刺山柑和雷公藤重量配比为10:1、5:5和1:10。
4.权利要求3所述中药组合物在制备治疗风湿性关节炎的药物中的应用。
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