KR102148963B1

KR102148963B1 - 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102148963B1
Application number: KR1020180108048A
Authority: KR
Inventors: 김대익; 김동섭; 성낙윤; 서인라; 박상윤; 김미라
Original assignee: 한국프라임제약 주식회사
Priority date: 2018-09-11
Filing date: 2018-09-11
Publication date: 2020-08-28
Also published as: KR20200029702A

Abstract

본 발명은 미선나무 추출물을 유효성분으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성에 관한 것이다.

Description

미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION INCLUDING ABELIOPHYLLUM DISTICHUM EXTRACT FOR PREVENTING OR TREATING LIVER INJURY}

본 발명은 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

미선나무(Abeliophyllum distichum)는 물푸레나무과(Oleaceae)에 속하는 화목관목으로 1속 1종이며 대한민국 고유종이다. 대한민국에서 천연기념물로 지정되어 특정 지역의 자생지에서 보호되고 있으며 충청북도 진천, 괴산군, 및 영동에 주로 분포하고 있다. 미선나무 추출물에 대한 연구가 비교적 최근에 활발하게 수행되기 시작하여, 미선나무 잎에서 추출한 글리코시드들이 혈압을 조절하는 안지오텐신 전환효소 (angiotensin converting enzyme)를 억제하는 것으로 보고된 바 있으며(Oh H, Kang D-G, Kwon T-O, Jang K K, Chai K-Y, Yun Y-G, Chung H-T, Lee H-S, Phytotherapy Research 17: 811-813, 2003), 박재호는 미선나무 잎 추출물의 항산화 및 산화적 DNA 손상억제 활성에 대해 보고한 바 있다(Kor. J. Herbology 2011；26(4)：95-99). 또한, 한국특허등록 제10-706131호 및 한국특허등록 제10-656287호는 미선나무추출물을 포함하는 항암제 및 항염증제에 관한 용도를 개시하고 있다. 또한, 한국공개특허 제2016-0089257호(2016.07.27. 공개)는 항산화 효과를 기술하고 있으며, 한국공개특허 제2016-0089256호(2016.07.27. 공개)와 한국공개특허 제2016-0114801호(2016.10.06. 공개)는 각각 미선나무추출물의 아토피개선 효과 및 악취제거 효과를 기술하고 있다.

본 발명자들은 미선나무 추출물의 기능성을 밝히고자 노력하였으며, 그 결과 미선나무추출물이 종래 알려진 기능성 이외에도 다양한 기능을 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

한국특허등록 제10-0706131호 한국특허등록 제10-0656287호 한국공개특허 제2016-0089257호 한국공개특허 제2016-0089256호 한국공개특허 제2016-0114801호

Oh H, Kang D-G, Kwon T-O, Jang K K, Chai K- Y, Yun Y-G, Chung H-T, Lee H-S, Phytotherapy Research 17: 811-813, 2003. 박재호, Kor. J. Herbology 2011；26(4)：95-99.

본 발명은 미선나무 추출물의 새로운 효능으로서 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함한다. 본 발명에서 정의되는 약학 조성물에 포함되는 미선나무 추출물은, 미선나무 추출물뿐만 아니라, 이의 용매 분획물, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.

일 실시예에서, 상기 미선나무 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매에 의한 미선나무 추출물일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 미선나무 추출물은 30% 내지 95% 에탄올에 의한 미선나무 추출물이거나 열수 추출물일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 미선나무 추출물은 70% 에탄올에 의한 미선나무 추출물 또는 열수 추출물일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 미선나무 추출물은 30% 내지 95% 에탄올에 의한 미선나무 추출물을 물, 탄소수 1 내지 6의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매에 의한 미선나무 추출물을 아세테이트 및 부탄올 중 적어도 어느 하나로 분획한 분획물일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 미선나무 추출물은 베타아밀로이드 응집 억제 또는 뇌 미세아교세포의 염증 억제능을 나타내고, 혈관성 치매 억제능을 나타낸다.

일 실시예에서, 상기 미선나무 추출물은 미선나무의 잎 또는 줄기의 추출물일 수 있다.

상기에서 설명한 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 유효성분인 미선나무 추출물이 베타아밀로이드 응집 억제 또는 뇌 미세아교세포의 염증 억제능을 나타내고, 혈관성 치매 억제능을 나타내는 것을 확인하였다. 이러한 미선나무 추출물을 포함하는 약학 조성물은 안정적이고 효과적인 치매 예방 또는 치료용으로 제공될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미선나무 잎 70% 주정 추출물 및 줄기 열수 추출물의 뇌세포 염증 억제 효과를 나타내기 위한 세포 생존율 평가 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 미선나무 잎 70%주정 추출물 및 미선나무 줄기 열수 추출물의 뇌 세포 염증 억제 효과를 나타내기 위한 NO분비 억제능 평가 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 미선나무 잎 70%주정 추출물 및 미선나무 줄기 열수 추출물의 뇌 세포 염증 억제 효과를 나타내기 위한 염증성 사이토카인 분비 억제를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 미선나무 잎 70%주정 추출물 및 미선나무 줄기 열수 추출물의 투여에 따른 혈관성 치매 유도 동물 모델의 뇌(해마)에서 뇌신경 세포 수 변화를 설명하기 위한 도면이다.

본 발명에서 미선나무 추출물을 얻기 위한 미선나무는, 국내에서 잎, 줄기, 열매, 뿌리, 껍질 및 종자 중 어느 하나 또는 2가지 이상의 부위로부터 수득한 것을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 미선나무 잎 추출물 또는 줄기 추출물이 사용된다. 또한, 바람직하게는 상기 잎 추출물 및 줄기 추출물은 봄에서 가을 사이의 기간 중에 특정 시점 또는 특정 기간 동안 수확한 잎/줄기를 이용한 것일 수 있고, 봄에서 가을 사이의 기간 중에 수확한 잎/줄기를 모두 이용한 것일 수 있다. 본 발명에서 미선나무로부터 유효성분의 추출은 일반적으로 널리 알려진 용매추출 방법으로 수행할 수 있다. 본 발명에서, 바람직하게는 미선나무 잎 주정 추출물이거나 미선나무 줄기 열수 추출물일 수 있다.

미선나무 추출물을 얻기 위해서, 미선나무를 채취하여 목적하는 부위, 예를 들어, 미선나무 잎 및/또는 줄기를 절단, 세척, 건조 및 분쇄하고; 미선나무 잎 또는 줄기 분쇄물 중량의 3 내지 30배, 바람직하게는 10 내지 20배의 물이나 저급 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 또는 이들의 혼합 용매로 60℃ 내지 75℃의 추출 온도에서 적어도 1시간 이상 추출 공정을 수행한다. 이때, 저급 알코올을 이용한 주정 추출은 30% 주정 내지 95% 주정일 수 있다. 30% 주정 미만일 경우, 알코올 용해성 유효성분들을 실질적으로 얻을 수 없고, 95% 주정 초과인 경우에는 수용해성 유효성분들을 거의 없을 수 없으므로, 30% 내지 95% 주정에서 수행되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 30% 내지 70% 주정일 수 있고, 가장 바람직하게는 70% 주정일 수 있다. 이때, 추출물은 가용성 고형물의 농도가 0 brix를 초과하되 30 brix에 이를 때까지 추출할 수 있다. 일례로, 추출물은 가용성 고형물의 농도가 20 내지 21 brix에 이를 때까지 추출할 수 있다.이때, 혼합 용매로서는 물과 저급 알코올의 혼합비가 1:1 내지 1:10이도록 혼합될 수 있다. 추출 방법으로서는 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 수증기 증류 추출 등의 방법으로 1회 내지 5회 연속하여 추출할 수 있다. 추출 후에, 40℃ 내지 60℃의 온도 조건에서 여과하고, 여액을 감압농축시킨 후 동결건조기로 건조시켜 미선나무 추출물을 얻을 수 있다.

이와 같이 얻은 미선나무 추출물을 물에 현탁시킨 후, 추출용매를 이용하여 계통분리하고, 감압농축하여 미선나무 추출물의 추출용매별 분획물을 얻을 수 있다. 미선나무 추출물을 얻기 위해 이용하는 용매의 예로서는, 정제수 또는 탄소수 1 내지 6을 갖는 유기용매를 이용할 수 있다. 상기 유기 용매의 예로서는, 에탄올(ethanol), 메탄올(methanol), 프로판올(propanol), 부탄올(butanol), 글리세린(glycerin), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부틸렌글리콜 (butylene glycol), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 디클로로메탄 (dichloromethane), 클로로포름 (chloroform), 에틸에테르(ethyl ether), 헥산 (hexane) 등을 들 수 있다. 이들은 각각 단독으로 또는 2 이상을 혼합하여 이용할 수 있다.

일 실시예에서, 미선나무 추출물의 분획물을 얻기 위해 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 수포화부탄올 및 물을 이용하여 계통분리할 수 있고, 이를 통해 미선나무 추출물의 헥산 층, 디클로로메탄 층, 에틸아세테이트 층, 부탄올 층 및 물 층의 분획물을 얻을 수 있다. 즉, 헥산을 처리하여 헥산가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있고, 다시 상기 수가용성 분획물을 디클로로메탄으로 추출하여 수가용성 분획물 및 디클로로메탄 가용성 분획물을 수득할 수 있으며, 이 수가용성 분획물에 에틸 아세테이트를 가하여 에틸 아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있고, 상기 수가용성 분획물을 부탄올로 추출하여 부탄올가용성 분획물과 수가용성 분획물을 수득할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 유효 성분으로서 미선나무 추출물의 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물로서의 효능을 확인하기 위해, 베타아밀로이드 응집억제평가 및 BV-2 뇌 미세아교세포의 염증 억제효과를 평가한 결과, 본 발명의 미선나무 추출물은 베타아밀로이드 응집을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 세포독성이 없고, 자연유래의 물질로서 독성 및 부작용이 거의 없으므로 치매를 예방 또는 치료하기 위해서 소정 기간 동안 안심하고 사용할 수 있으며, 염증 마커인 NO의 분비를 억제하는 것을 확인하였으며 사이토카인 억제능 또한 확인되었다. 이러한 미선나무 추출물의 효능을 통해, 미선나무 추출물이 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 미선나무 추출물을 유효 성분으로 하되, 약학적으로 허용가능한 부형제를 함께 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 미선나무 추출물을 유효 성분으로 하되, 치매 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위하여 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명에 따른 미선나무 추출물을 유효성분으로 전체 약학 조성물 중 상기 유효성분이 0.001 내지 90 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 15 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 이렇게 제조된 약학 조성물의 일회 투여양은 연령, 병변의 정도 등의 개인차이나 제형, 형태에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 일반의 성인에 대한 일일 투여량은 0.01 mg 내지 10,000 mg의 유효 함량으로 사용할 수 있고, 예를 들어, 일일 투여량은 0.01 mg 내지 1,000 mg일 수 있고, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제, 붕해제, 결합제, 활택제, 희석제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제 즉, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및 글리신, 활택제 즉, 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유 할 수 있다. 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다.

그러나 활성 성분의 실제 투여량은 증상의 중증도, 선택된 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에 따른 약학 조성물로서 적합한 투여량은 보통으로 숙련된 의사는 피부에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명에 따른 약물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 비만 진행 정도, 발병 시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만 성인을 기준으로 할 때 일반적으로는 상기 언급된 중량비로 조합된 조성물 1 내지 500 mg/kg, 바람직하게는 30 내지 200 mg/kg을 1일 1 내지 2회 분할하여 투여할 수 있으며, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

이하, 본 발명에 따른 실시예를 상세하게 설명한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해서 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해서 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

이하에서 추출물의 제조 및 실험을 위해 사용한 시약은 Sigma Aldrich에서 구입하여 그대로 이용한 것이다.

실시예: 미선나무 추출물의 제조

충북 괴산이 원산지인 미선나무 잎 2 kg를 음건하여 잘게 부순 후에 30%, 70%, 95% 에탄올 40 L를 넣고 75℃에서 4시간동안 추출한 후, 여과지로 여과한 다음, 50℃에서 감압 하에 추출물을 2L까지 농축하였다. 농축된 추출물을 동결건조기로 건조시켜 미선나무 잎 추출물(30%주정(30%에탄올): 0.89 kg, 70%주정: 1.02 kg, 95%주정: 0.48 kg)을 얻었다.

또한 미선나무 줄기 2 kg에 증류수를 40 L를 넣고 100℃에서 4시간동안 추출한 후, 여과지로 여과한 다음, 50℃에서 감압 하에 추출물을 2L까지 농축하였다. 농축된 추출물을 동결건조기로 건조시켜 미선나무 줄기 열수추출물(0.75 kg)을 얻었다.

상기에서와 같이 얻은 미선나무 잎 주정 70% 추출물 20 g을 증류수 200 mL에 현탁시키고 헥산, 디클로로메탄(메틸렌클로라이드), 에틸아세테이트, 수포화부탄올 및 물로 계통분리한 후 감압농축하여 미선나무 잎 추출물의 헥산 층(0.4 g), 디클로로메탄 층(1.5 g), 에틸아세테이트 층(2.0 g), 부탄올 층(10.0 g), 물 층(6.1 g)의 분획물을 얻었다. 모든 추출물은 세포 실험을 위하여 얻어진 분획물들을 100 mg/mL의 농도로 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해하여 사용하였다.

실험예 1-1: 베타아밀로이드 응집 억제능 평가-1

상기 실시예에 따라 얻은 미선나무 잎/줄기 추출물(주정 또는 열수)을 이용하여 베타아밀로이드 응집 억제능 평가 실험을 수행하였다. 베타아밀로이드(β-amyloid, Aβ)의 응집 정도 측정은 형광 분석법 (ThioflavinT assay)을 이용하였다. 베타아밀로이드(Aβ1-40) 펩티드는 영하 80℃에서 보관하였으며, 측정 시 사용한 최종농도는 5 μM의 농도로 사용하였다. 본 발명에 따라 얻어진 미선 추출물(주정 및 열수 추출물)은 실험직전 99.5%의 DMSO에 녹여 완충용액으로 농도별로 희석하여 사용하였으며, 형광물질로 사용하는 5 μM의 티오플라빈 T(thioflavin T)는 0.01M 인산소다완충용액에 녹여 제조하였다.

Aβ1-40 응집억제 정도를 측정하기 위하여 0.01 M 인산소다완충용액 92.5 ㎕에 다양한 용매조건별 분획물별 미선추출물을 5 ㎕씩 가하고, 5 μM Aβ1-40 2.5 ㎕를 가한 뒤, 37℃에서 26시간 배양하여 응집시키고, 5 μM 티오플라빈 T 2,000 ㎕를 가하여 형광 분광 분석기로 측정하였다. 이때 사용한 형광 분광분석기의 파장 값은 Ex = 446 nm (slit width = 5 nm), Em = 490 nm (slit width=10 nm)이며, 동일한 실험을 적어도 3회 이상 반복하여 평균값으로 나타내었다. 그 결과를 하기 표 1에 나타낸다.

시료구분	Sample Concentration (μg/mL)	β-amyloid 응집(aggregation) 억제(%)
Ab	0	0
Ab+0.4% DMSO	0	0
Ab+ovanillin	100	47.7
Ab+미선잎주정30%	100	40.3
Ab+미선잎주정70%	100	73.3
Ab+미선잎주정95%	100	50.7
Ab+미선줄기열수	100	78.5

표 1에서, "Ab"는 베타아밀로이드를 나타내고, "Ab+0.4% DMSO"는 베타아밀로이드에 DMSO만을 혼합한 경우를 나타내고, "Ab+ovanillin"은 양성대조구인 ovanillin의 처리를 나타내고, "Ab+미선잎주정30%"은 미선나무를 30%주정으로 추출한 추출물을 이용한 구를 나타내고, "Ab+미선잎주정70%"은 미선나무를 70%주정으로 추출한 추출물을 이용한 구를 나타내고, "Ab+미선잎주정95%"은 미선나무를 95%주정으로 추출한 추출물을 이용한 구를 나타내며, "Ab+미선줄기열수"는 미선나무의 줄기를 열수 추출한 추출물을 이용한 구를 의미하는 것이다.

표 1을 참조하면, 미선줄기 추출물 및 미선나무 잎 용매조건별(30%주정, 70%주정, 95%주정) 추출물의 처리구 중 70%주정 추출물 처리구에서 베타아밀로이드의 응집억제(%)가 가장 큰 값을 나타난 것을 확인할 수 있다. 응집억제(%)의 수치가 높을수록 Aβ1-40의 응집억제 효능이 높은 것을 의미하고, 수치가 낮을수록 응집억제 효능이 상대적으로 낮은 것을 의미한다. 미선줄기 추출물을 이용한 경우와 70% 주정 추출물을 이용한 경우에 30%나 95% 주정 추출물에 비해서 Aβ1-40의 응집억제 효능이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있다. ovanillin 처리구와 비교할 때, 본 발명에 따른 미선나무 추출물에 의해 베타아밀로이드의 응집억제효과가 있고, 특히 미선나무 잎의 70% 주정 추출물과 미선줄기의 열수 추출물의 경우 ovanillin 처리구보다도 높은 응집억제능이 있는 것을 확인할 수 있다.

실험예 1-2: 베타아밀로이드 응집 억제능 평가-2

상기 실시예에 따라 얻은 미선나무 잎/줄기 추출물(주정 또는 열수)을 이용하여 분획물 별 베타아밀로이드 응집 억제능 평가 실험을 수행하였다. 응집 억제능 평가 실험은 실험예 1-1에서 수행한 것과 실질적으로 동일하게 수행하고 분석하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.

시료구분	Sample Concentration (μg/mL)	β-amyloid aggregation 억제(%)
Ab	0	0
Ab+0.4% DMSO	0	0
Ab+ovanillin	100	47.7
Ab+미선줄기열수	100	78.5
Ab+미선잎 주정70%	100	73.3
Ab+미선잎헥산 분획	100	13.2
Ab+미선잎메틸클로라이드 분획	100	49.5
Ab+미선잎에틸아세테이트 분획	100	14.4
Ab+미선잎부탄올 분획	100	15.3
Ab+미선잎물 분획	100	47.5

표 2에서, "Ab"는 베타아밀로이드를 나타내고, "Ab+0.4% DMSO"는 베타아밀로이드에 DMSO만을 혼합한 경우를 나타내고, "Ab+ovanillin"은 양성대조구인 ovanillin의 처리를 나타내고, "Ab+미선줄기열수"는 미선나무 줄기를 열수 추출한 추출물을 이용한 경우를 나타내고, "Ab+미선잎주정70%"은 미선나무 잎을 70%주정으로 추출한 추출물을 이용한 경우를 나타내며, "Ab+미선잎헥산 분획", "Ab+미선잎메틸클로라이드 분획", "Ab+미선잎에틸아세테이트 분획", "Ab+미선잎부탄올 분획"및 "Ab+미선잎물 분획"은 각각 미선나무 잎을 70%주정으로 추출한 후 헥산, 메틸클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 각각 분획한 분획물을 이용한 경우를 나타낸다.

표 2를 참조하면, 미선나무 잎 70%주정 추출물 및 미선나무 잎 70%주정 분획물(헥산, 메틸클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올, 물)별 추출물의 처리구 중에서 미선잎 70%주정 추출물 처리구에서 베타아밀로이드의 응집억제가 가장 높게 나타났으며, 미선잎메틸클로라이드 분획물과 물 분획물에서도 양성 대조구인 ovanillin과 비교하여 볼 때 유사하거나 높게 나타나는 것을 확인할 수 있다.

표 1 및 표 2에서 살펴본 바에 따르면, 본 발명에 따른 미선나무 추출물에 의해 베타아밀로이드의 응집억제효과가 있는 것을 확인할 수 있다. 특히, 미선나무 잎 70%주정 추출물과 미선줄기 열수 추출물이 베타아밀로이드의 응집억제효과가 매우 높은 것을 확인할 수 있다.

실험예 2: BV-2 뇌 미세아교세포의 염증 억제 효과-세포생존율

미선 추출물의 세포독성 평가는 뇌 미세아교세포(BV-2 microglial cell)에 농도별 미선나무 추출물을 처리하여 BV-2에 대한 세포독성을 관찰하여 수행하였다.

구체적으로, 미세아교세포를 5% FBS가 들어간 DMEM 세포배양액(Dulbecco's Modified Eagle's medium)에 37℃, 5% CO₂조건에서 배양한 후 well당 2ㅧ10⁴ cell이 되도록 96 well plate에 깔아준 후, 12시간 동안 배양하면서 세포를 완전히 부착시키고, 미선나무 추출물을 50, 100 및 200 μg/mL의 농도로 24시간 동안 처리한 군과 미선나무 추출물을 50, 100 및 200 μg/mL 처리와 동시에 LPS(Lipopolysaccharide)를 1 μg/mL의 농도로 24시간동안 병용처리한 처리구의 세포생존율을 평가하였다. 세포생존율의 평가는 MTT 방법에 따라 수행되었으며 생존율은 무처리구대비 생존 %로 계산하였다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미선나무 잎 70% 주정 추출물 및 줄기 열수 추출물의 뇌세포 염증 억제 효과를 나타내기 위한 세포 생존율 평가 결과를 나타낸 도면이다.

도 1을 참조하면, 염증 유발물질인 LPS의 처리 및 무처리 조건별 미선나무 잎 70%주정 추출물 및 미선나무 줄기 열수 추출물의 농도(50, 100, 200 μg/mL)별 처리결과로서 세포 생존율을 통해, 뇌 미세아교세포(BV-2 microglial cell)에 대한 세포독성이 없음을 확인할 수 있다.

실험예 3: BV-2 뇌 미세아교세포의 염증 억제 효과-NO 억제능

96 well plate에 BV-2 cell을 2ㅧ10⁴ cell/well로 분주한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 12시간 동안 배양하면서 세포를 완전히 부착시키고, 미선나무 추출물을 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 24시간 동안 처리한 군과 미선나무 추출물을 50, 100, 200 μg/mL 처리와 동시에 염증유발 물질인 LPS를 1 μg/mL의 농도로 24시간동안 병용처리한 처리구의 배양 상층액을 분리하였다. 분리된 배양 상층액에서 NO의 함량을 측정하였다. NO의 함량은 분리된 배양 상층액 100 μL에 동량의 Griess (Sigma) 시약을 처리하여 10분 동안 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 산화질소의 농도는 sodium nitrite (NaNO₂, Sigma)를 사용하여 얻은 표준 직선과 비교하여 산출하였다. 그 결과를 도 2에 나타낸다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 미선나무 잎 70%주정 추출물 및 미선나무 줄기 열수 추출물의 뇌 세포 염증 억제 효과를 나타내기 위한 NO분비 억제능 평가 결과를 나타낸 도면이다.

도 2를 참조하면, 염증 유발물질인 LPS의 처리 시 미선나무 추출물 무처리구에서는 NO의 분비가 증가되었으나, 미선나무 잎 70%주정 추출물 및 미선나무 줄기 열수 추출물을 뇌 미세아교세포(BV-2 microglial cell)에 농도(50, 100, 200 μg/mL)별 처리하였 때 LPS에 의하여 분비 증가되는 염증 마커인 NO를 추출물의 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있다. 이러한 미선나무 추출물의 처리는 LPS의 처리에 의한 NO의 분비능을 감소시키는 것으로, 염증반응에 효과적인 것을 확인할 수 있다.

실험예 4: BV-2 뇌 미세아교세포의 염증 억제 효과-사이토카인 억제능

96 well plate에 BV-2 cell을 2×10⁴ cell/well로 분주한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 12시간 동안 배양하면서 세포를 완전히 부착시키고, 미선나무 추출물을 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 24시간 동안 처리한 군과 미선나무 추출물을 50, 100, 200 μg/mL 처리와 동시에 염증유발 물질인 LPS를 1 μg/mL의 농도로 24시간동안 병용처리한 처리구의 배양 상층액을 분리하였다. 분리된 배양 상층액에서 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 함량을 측정하였다. 사이토카인 함량은 ELISA kit (eBioscience Co.(회사명), San Diege, CA, USA)을 사용하여 측정 하였으며, 이때 사이토카인의 농도는 kit에 포함되어 있는 표준 용액으로부터 산출된 표준곡선으로부터 계산하였다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 미선나무 잎 70%주정 추출물 및 미선나무 줄기 열수 추출물의 뇌 세포 염증 억제 효과를 나타내기 위한 염증성 사이토카인 분비 억제를 나타낸 도면이다.

도 3을 참조하면, 염증 유발물질인 LPS의 처리 시 미선나무 추출물 무처리구에서는 염증성 사이토카인(TNF-α 및 IL-6)의 분비가 증가되었으나, 미선나무 잎 70%주정 추출물 및 미선나무 줄기 열수 추출물을 뇌 미세아교세포(BV-2 microglial cell)에 농도(50, 100, 200 μg/mL)별 처리하였 때 LPS에 의하여 분비 증가되는 염증 마커인 TNF-α 및 IL-6를 추출물의 농도 의존적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있다. 이러한 미선나무 추출물의 처리는 LPS의 처리에 의한 염증성 사이토카인의 분비능을 감소시키는 것으로 관찰되어 염증반응에 효과적인 것을 확인할 수 있다.

실험예 5: 혈관성 치매 억제 효능

8주령의 SD 웅성 rat을 대상으로 미선나무 추출물의 5일 동안 10 mg/kg/day로 투여하였고, 투여 3일차에 혈관성치매를 유도하였다. 혈관성 치매의 유도는 10분동안 양측 온목동맥을 결찰하여 생리적 혈류량의 30% 미만으로 뇌로가는 혈류량을 제한하는 모델을 이용하였다. 투여 종료 9일 후 실험동물로부터 뇌를 적출하기 위하여 4% paraformaldehyde로 심장관류고정을 하였으며, 적출된 뇌는 같은 용액으로 24시간 동안 후 고정 되었다. 수세한 뇌는 알코올 series를 거치며 탈수되고, 파라핀화 되었다. Microtome을 이용하여 이를 7 um로 박절하고 이 중 해마(hippocampus)가 있는 부분을 추려 슬라이드로 제작하였다. 이 중 마리 당 5개 이상의 슬라이드를 무작위 선택하여 H-E염색을 실시하고 해마 CA1 영역의 살아있는 신경세포수를 값으로 나타내었다. 그 결과를 도 4에 나타낸다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 미선나무 잎 70%주정 추출물 및 미선나무 줄기 열수 추출물의 투여에 따른 혈관성 치매 유도 동물 모델의 뇌(해마)에서 뇌신경 세포 수 변화를 설명하기 위한 도면이다.

도 4에서 "SHAM"은 위 수술구를 나타내고, "VD"는 혈관성 치매 유발구를 나타내고, "VD+compound 1"은 혈관성 치매유도구에 미선주정 70% 추출물을 5일동안 경구투여한 그룹을 나타내고, "VD+compound 2"는 혈관성 치매유도구에 미선줄기열수 추출물을 5일동안 경구투여한 그룹을 나타낸다.

도 4를 참조하면, 위 수술구에서 살아있는 뇌신경세포의 수가 가장 많이 존재하였으며, 혈관성 치매 유발구의 경우 뇌신경세포의 수가 확연하게 줄어드는 것으로 나타나고, 미선나무 잎 70%주정 추출물 투여구 및 미선나무 줄기 열수 추출물 투여구에서는 살아있는 뇌신경 세포의 수가 혈관성 치매 유발구 보다 높게 증가하는 것을 확인할 수 있다.

따라서 미선나무 잎 70%주정 추출물 투여구 및 미선나무 줄기 열수 추출물의 투여는 혈관성 치매 유발에 따른 뇌신경세포의 세포사를 막음으로서 혈관성 치매의 억제 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

하기에 본 발명의 약학 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1: 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

통상의 산제 제조방법에 따라 미선나무 추출물 500 mg, 유당 300 mg, 옥수수전분 190 mg 및 스테아르산 마그네슘 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다. 내용물의 최종 중량은 1,000 ㎎으로 하였다.

2. 정제의 제조

통상의 정제 제조방법에 따라 미선나무 추출물 250 mg, 유당 100 mg, 미결정셀룰로오스 130 mg, 전분글리콘산 나트륨 15 mg 및 스테아르산 마그네슘 5 mg을 혼합 및 과립하고 타정기로 타정하였다.

3. 주사제의 제조

통상의 주사제 제조방법에 따라 미선나무 추출물 10 mg, 만니톨 180mg, 주사용멸균증류수 2974 mg, Na₂HPO₄·12H₂0 26 mg으로 제조하여 앰플당 2 mL씩 분주하였다.

Claims

미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하되,
상기 미선나무 추출물이 미선나무 줄기 열수 추출물이고,
상기 미선나무 줄기 열수 추출물이 혈관성 치매 유도 동물 모델에서 혈관성 치매 억제능을 나타내는 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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제1항에 있어서,
상기 미선나무 추출물은 베타아밀로이드 응집 억제 또는 뇌 미세아교세포의 염증 억제능을 나타내는 것을 특징으로 하는,
혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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