KR100656287B1 - 미선나무 추출물을 포함하는 항염증제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미선나무 추출물을 포함하는 항염증제에 관한 것이다. 특히 본 발명은 염증 반응을 효과적으로 억제하고 세포 독성이 없는 안전한 미선나무 추출물에 관한 것으로, 상기 미선나무 추출물은 염증성 질환의 치료 및 예방용도로 유용하게 사용할 수 있다.

미선나무, 항염증제

Description

미선나무 추출물을 포함하는 항염증제{ANTI-INFLAMMATORY AGENT CONTAINING EXTRACT FROM ABELIOPHYLLUM DISTICHUM}

도 1은 미선나무 잎 추출물(실시예 2) 및 열매 추출물(실시예 6)의 COX-2 발현 저해 활성을 나타낸 것이다.

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 미선나무 추출물을 포함하는 항염증제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 염증 반응을 효과적으로 억제하고 세포 독성이 없는 안전한 항염증제에 관한 것이다.

[종래기술]

염증은 외부에서 들어온 해로운 물질이나 유기체에 의하여 조직이 손상을 입거나 파괴되었을 때 국소적으로 일어나는 면역반응으로서 생체를 보호하고 조직 손상으로 생성된 산물들을 제거하는데 유용한 방어 메카니즘이다. 정상적인 경우에는 생체는 염증반응을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키지만, 만성염증과 같은 질병 상태로 진 행되기도 한다. 임상질환 가운데 거의 모든 질환에서 염증 반응을 관찰할 수 있을 뿐만 아니라, 암발생과정(carcinogenesis)에서도 염증 반응과 관련된 효소들이 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있다.

대부분의 비스테로이드성 소염제(nonsteroidal antiinflammatory drugs: NSAIDs)의 항염증 효과는 COX(cyclooxygenase) 효소 활성을 억제하는 것에 의해 매개된다(Vane 등, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 38, 97, 1998). COX는 생체 내에 존재하는 프로스타그란딘(prostaglandin)의 생합성에 관련하는 주 효소로서(Smith 등, J. Biol. Chem., 271, 33157, 1996), 두 종류의 이성 효소, COX-1과 COX-2가 존재한다. COX-1은 위나 신장과 같은 조직에 일정하게 존재하며, 정상적인 항상성을 유지하는데 관여하는 반면, COX-2는 염증이나 기타 면역 반응시 세포분열인자(mitogen)나 시토킨 (cytokines)류에 의해 세포 내에서 일시적이고 빠르게 발현되는 효소이다. 급성 또는 류마티스성 관절염과 같은 만성의 염증 질환의 치료에 사용되는 비스테로이드성 소염 약물들은 COX-2 효소를 억제할 뿐만 아니라 COX-1 효소도 억제함으로써 위장관 장애와 같은 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있다(Masferrer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3228, 1994; Seibert 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12013, 1994). 따라서 소염 약물의 효능을 높이고 부작용을 최소화하기 위해서는 COX-2 효소만을 선택적으로 억제하는 물질을 찾아 소염약물로 개발하는 것이 필요하다.

아울러, COX-2 저해제는 염증의 치료 뿐 아니라, 암 예방의 측면에서도 중요한 역할을 할 것으로 기대된다. 보고에 의하면 암세포 및 악성 종양 조직에서는 COX-2의 유도가 증대되어 정상 세포에 비해 훨씬 많은 양의 프로스타글란딘(prostaglandin)이 생성되며, 종양조직내의 프로스타글란딘(prostaglandin)량의 증가 대부분이 COX-2 발현의 증가로 인한 것이라고 한다(Kargman 등 Cancer Res., 55, 2556, 1995; Ristimaki 등 Cancer Res., 57, 1276, 1997). 프로스타그란딘 E2(prostaglandin E2: PGE2)와 같은 프로스타글란딘(prostaglandin)류는 혈관 생성을 촉진하고, 세포의 증식을 촉진할 뿐 아니라, 면역 능력을 억제하므로, 이들의 과잉 생성은 암세포의 성장에 좋은 환경을 형성하여 준다. 더욱이 COX-2의 과도한 발현은 세포사멸(apoptosis)을 억제하고 암세포의 전이 능력을 증대시킨다.

이와 관련하여, 최근 NSAIDs(비스테로이드성 항염증제)를 장기간 사용해온 사람들에서 결장암이 일어날 확률이 40-50% 감소된다는 연구가 있었으며, 가족성대장선종(familial adenomatous polyposis, FAP)를 가진 환자들에 있어 결장선종(colorectal polyposis)이 결장암으로 발전되는 단계가 NSAIDs계 약물에 의해 방지되는 것이 관찰되었다(Peleg 등, Arch. Intern. Med., 154, 394, 1994). 또한 결장암 실험모델인 Apc mouse에서도 결장암의 발생 단계인 APC 유전자의 변형 및 소실 단계에 있어 항상 COX-2 발현 및 활성의 증가가 선행되었다(Prescott 등, Cell, 87, 783, 1996). 이외에도 다양한 연구 결과에서 COX-2가 결장암의 발생단계에 큰 영향을 미치는 것이 밝혀졌으며, 또한 사람의 위암 및 유방암 조직에서도 COX-2 단백질이 정상 조직에 비해 훨씬 많이 발현되고, COX 저해제가 사람 유방암 세포의 성장을 억제하며, 동물모델에서도 유도시킨 암의 발생이 COX-2 저해제에 의해 크게 감소되는 것으로 보고된 바 있다(Noguchi 등, Fatty Acids, 53, 325, 1995; Thompson 등, Cancer Res., 57, 267, 1997). 따라서 COX-2 선택적 저해제는 새로운 항염증제 개발의 주요 목표가 될 뿐 아니라 암예방제로의 개발 가능성이 높다고 할 수 있다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 식물 추출물을 포함하며 부작용을 야기하지 않는 항염증제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 COX-2의 발현을 저해할 수 있는 항염증제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 염증 반응을 현저히 억제하는 미선나무 추출물 및 이를 포함하는 항염증제에 관한 것이다.

미선나무 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있다. 즉, 미선나무의 일부 또는 전체를 물 또는 유기용매로 추출 및/또는 분획하여 추출물을 제조할 수 있으며, 예컨대 미선나무의 잎, 가지, 뿌리, 열매, 줄기, 꽃, 껍질 등이나 이의 분쇄물에 용매를 가한 후 추출물을 수득하는 방법이다. 상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 5의 저가 알콜 또는 알콜희석수일 수 있으며, 상기 저가 알콜은 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올 및 이소프로판올 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 알콜희석수는 알콜을 50 내지 99 부피%로 물에 희석한 것일 수 있다. 또한 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수 있다. 상기 분획시 용매는 2종이상 사용할 수 있으며, 용매의 극성에 따라 순차적으로 사용하여 각 용매 추출물을 제조할 수 있다. 추출물 제조온도는 4 내지 120 ℃일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 추출시간은 특별히 한정되지는 않으나 10분 내지 30일일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 제조된 추출물은 이후 감압 여과 또는/및 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다.

일예로, 미선나무 추출물은 잎 또는 열매 100 g당 메탄올 0.1 내지 5 L를 가하여 추출하여 메탄올 추출물을 제조한다. 상기 메탄올 추출물은 추후 헥산 또는 메틸렌클로라이드를 가하여 각 용매별 분획물을 수득함으로써 헥산 추출물 또는 메틸렌클로라이드를 제조한다. 이후 잔류물에 에틸아세테이트, 부탄올을 순차적으로 가하여 분획함으로써 에틸아세테이트 추출물과 부탄올 추출물을 각각 제조하며, 상기 용매에서 추출되지 않은 물 분획은 물 추출물로 제조된다. 상기 용매를 이용한 분획시, 추출대상물에 대하여 용매를 1: 0.1 내지 10 부피비로 가하여 실시된다.

본 발명의 미선나무 추출물들 중, 특히 미선나무 잎 헥산 추출물과 미선나무 열매 메탄올 추출물은 염증 유발 물질인 TPA(12-O-tetra-decanoylphorbol-13-acetate)에 의한 부종 형성을 약 80 % 억제하며, TPA에 의하여 발현이 증가된 COX- 2(사이클로옥시게나제-2)의 발현을 현저하게 억제한다. 또한 미선나무 추출물은 정상 세포에 대한 독성이 없는 안전한 시료인 것으로 확인되었다.

본 발명은 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증제를 제공한다. 상기 미선나무 추출물은 바람직하기로는 미선나무 잎의 헥산 추출물, 미선나무 열매의 메탄올 추출물 또는 이들의 혼합물이 바람직하다. 상기 혼합물의 경우 각 추출물의 혼합비율은 미선나무 잎 헥산 추출물 : 미선나무 열매 메탄올 추출물이 0.1 내지 1: 0.1 내지 1 중량비일 수 있다.

본 발명의 항염증제는, 상기 유효성분을 단독으로 포함할 수 있으며, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 혼합물로 제공되는 경우, 상기 유효성분은 항염증제에 0.1 내지 99.9 중량%로 포함될 수 있으나, 통상 0.001 내지 50 중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 항염제는 류마티스 관절염, 루푸스, 다발성 경화증과 같은 각종 만성 염증 질환, 패혈증, 쇼크, 장기이식의 거부반응과 같은 각종 급성 염증 질환, 안과질환, 기관지염, 또는 염증성 장질환의 예방 및 치료의 목적으로 사용가능하다.

상기 담체 또는 부형제의 일예로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으나, 이 에 한정되는 것은 아니다. 담체 또는 부형제는 2종이상 사용될 수 있다. 또한 항염증제를 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 항염증제는, 미선나무 추출물 이외에 공지의 항염활성을 갖는 화합물 또는 식물 추출물을 더욱 포함할 수 있으며, 미선나무 추출물 100 중량부에 대하여 각각 5 내지 20 중량부로 포함될 수 있다.

항염증제의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 경고제, 과립제, 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 산제, 시럽제, 안연고제, 액제, 에어로솔제, 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 전제, 침제, 점안제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 크림제, 환제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.

본 발명에 따른 항염증제는 경구 또는 비경구로 사용될 수 있으며, 예컨대 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 코안, 경막외 및 구강경로를 통하여 사용될 수 있으며, 이의 투여량은, 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일예로, 본 발명의 항염증제는 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.1 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기한 투여량은 예시하기 위한 일예에 불과하며 상기 범위에 한정되지는 않는다.

본 발명의 항염증제는 약제 또는 화장료제로 사용될 수 있으며, 항염증제는 약제 또는 화장료 조성물에 0.001 내지 50 중량%으로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 화장료 조성물은 기초화장품, 메이크업 화장품, 바디 화장품, 두발용 화장품, 두피용 화장품, 면도용 화장품 또는 구강용 화장품의 용도로 제공될 수 있다. 상기 기초화장품의 예로는 크림, 화장수, 팩, 마사지 크림, 유액 등이 있으며, 상기 메이크업 화장품으로는 파운데이션, 메이크업 베이스, 립스틱, 아이새도, 아이라이너, 마스카라, 아이브로우 펜슬 등이 있으며, 바디 화장품으로는, 비누, 액체 세정제, 입욕제, 선스크린 크림, 선 오일 등이 있으며, 두발용 화장품으로는 샴푸, 린스, 헤어 트리트먼트, 헤어 무쓰, 헤어 리퀴드, 포마드, 헤어 칼라제, 헤어 블릿치제, 칼라 린스가 있으며, 두피용 화장품으로는 헤어 토닉, 스칼프 트리트먼트가 있으며, 면도용 화장품으로는 애프터셰이브로션, 셰이빙 크림 등이 있으며, 구강용 화장품으로는 치약, 마우스 워셔 등이 있다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1-5: 미선나무 잎 추출물 제조

미선나무 잎 200 g을 메탄올 1.5 L에 침지한 후 총 4시간 환류시켜 3회 추출하였다. 추출액은 모두 합한 후 감압농축하여 35 g의 메탄올 추출물(실시예 1)을 수득하였다.

상기 메탄올 추출물 30.5 g에 n-헥산 : 메탄올 : 물을 10 : 1 : 9의 혼합비율로 전체 200 ml를 가한 후 분획하여 헥산 분획을 얻고, 이를 감압농축 하여 5.5 g의 헥산 분획(실시예 2)을 수득하였다. 이후 잔류물에 에틸 아세테이트, 노르말-부탄올을 순차적으로 3회씩 가하여 분획하고 각각의 분획물들을 모두 모아 감압농축하여 에틸 아세테이트분획(실시예 3) 4.2 g 및 노르말-부탄올 분획(실시예 4) 11.3 g과 나머지 물 분획(실시예 5) 9.2 g을 각각 수득하였다.

실시예 6-9: 미선나무 열매 추출물 제조

미선나무 열매 55 g을 메탄올 500 ml에 침지한 후 총 4시간 환류시켜 3회 추출하였다. 추출액은 모두 합한 후 감압농축 하여 11.5 g의 메탄올 추출물(실시예 6)을 수득하였다.

메탄올 추출물 10.5 g에 물 200 ml를 가한 후, 메틸렌클로라이드 200 ml를 가하여 3회 추출하였다. 추출물은 감압농축하여 메틸렌클로라이드 분획(실시예 7) 4.2 g을 수득하였다. 이후 잔류물에 에틸아세테이트를 200 ml, 3회 가하여 분획하고 감압농축하여 에틸아세테이트 분획(실시예 8) 0.9 g과 나머지 물 분획(실시예 9) 4.9 g을 각각 수득하였다.

실험예 1: 미선나무 추출물의 항염증 효과 시험

TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)는 암촉진제(tumor promoter)일 뿐만 아니라 염증반응을 유도하는 약물로, 이를 처리하면 COX-2의 발현이 현저히 증가된다.

생쥐의 오른쪽 귀에 아세톤에 녹인 TPA 5 nmol를 국소도포하여 부종을 유발시켰으며, 왼쪽 귀에는 용매만 국소 도포하였다. 실시예 2 및 6의 미선나무 추출물을 각각 TPA를 국소도포하기 30분전에 아세톤/DMSO(1:1) 혼합용매에 각 1.0 mg 또는 5.0 mg으로 현탁하여 오른쪽 귀에 국소 도포하였고 왼쪽 귀에는 용매만 국소 도포하였다. 이후 TPA를 도포하고 4시간 후, 생쥐를 희생시키고 오른쪽 귀와 왼쪽 귀를 지름 6 mm 펀치로 잘라내어 무게를 측정하였다. 생성된 부종 정도는 오른쪽 귀의 무게에서 왼쪽 귀의 무게를 뺀 값으로 하고, 이를 하기 계산식 1에 대입하여 부종 억제율을 구하였다.

(계산식 1)

부종 억제율(%) = 100 - (미선나무 추출물 처리군의 부종 정도/TPA 처리군의 부종 정도) x 100

실험결과는 평균값 + SE로 나타냈으며, 통계적 분석은 Student t-test를 사용하였다. P 값이 0.05이하이면 유의성이 있는 것으로 평가하였다.

결과는 하기 표 1에 나타내었다.

처리	농도	부종정도	p-value	억제율(%)
음성대조군 양성대조군 실시예 2 처리군 실시예 6 처리군	TPA 5 nmol/50 ㎕ 1.0 mg/50 ㎕ 5.0 mg/50 ㎕ 1.0 mg/50 ㎕ 5.0 mg/50 ㎕	0 8.67+1.29 4.10+0.31 3.07+0.32 3.50+0.71 1.43+0.27	0.0267 0.0138 0.0251 0.0055	53 65 60 84

상기 표 1의 결과로부터, 본 발명의 실시예 2 및 6의 미선나무 추출물이 염증 유발을 현저히 억제하여 항염증제로 사용할 수 있음을 확인하였다.

실험예 2: 정상세포에 대한 독성 시험

실시예 2의 미선나무 잎 헥산 추출물과, 실시예 6의 미선나무 열매 메탄올 추출물의 정상 세포에 대한 독성 여부를 장음와세포(정상 소장 점막 세포)를 이용하여 확인하였다.

실험에 사용한 흰쥐의 장음와 (intestinal crypt) 유래 세포인 IEC-6은 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 세포 배양시 사용한 DMEM/F12 (Dulbecco's modified Eagle's medium/Nutrient Mixture Ham's F12), FBS (fetal bovine serum), 트립신-EDTA, 페니실린-스트렙토마이신 및 셀레늄은 Gibco/BRL (Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. 또한 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움브로마이드(MTT)와 BSA(bovine serum albumin), 트랜스페린은 시그마사(Sigma Chemical Co., St, Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

IEC-6 세포는 DMEM/F12 배지를 사용하여 37℃ 습윤한 CO₂배양기(5% CO₂/95% air)에서 배양하였고, DMEM/F12 배지에 10% FBS, 100 units/㎖의 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마신 및 10의 ㎍/㎖ 인슐린을 첨가하여 사용하였다. 세포는 배양접시를 80% 컨플루언트로 되게 배양한 후 PBS(pH 7.4)로 세포의 단층을 세척하고, 0.25% 트립신 및 2.65 mM EDTA을 처리하여 계대 배양하였다. 배지는 2일마다 교환하였다.

실시예 1 내지 9의 미선나무 추출물의 대장암세포 증식억제효과를 측정하였다. IEC-6 세포를 10% FBS가 포함된 배지에 희석하여 50,000 cells/well의 밀도로 24 웰 플레이트에 분주하였다. 24시간 경과 후 배지( DMEM/F12, 트랜스페린 5 ㎍/㎖, 셀레늄 5 ng/㎖, BSA 0.1 mg/㎖ 및 FBS)로 교체하여 24시간 배양하였고, 이후 미선나무 추출물이 각각 0, 12.5, 25 및 50 ㎍/㎖로 포함된 동일배지로 교환하여 배양하였다. 미선나무 추출물이 포함된 배지는 2일마다 교환하였다. 이때 미선나무 추출물은 DMSO에 녹여 사용하였으며, 미선나무 추출물 처리 후 시간 경과에 따른 세포 수를 MTT 분석으로 측정하였다. MTT 분석이란 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT 테트라졸리움을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT 포르마잔 크리스탈로 환원시키는 세포내 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다. 상기 사용한 DMSO는 미선나무 추출물의 용매로 사용되어 배지 내 0.1% 첨가되었으나, 세포배양에는 별다른 영향을 미치지 않는다. MTT 분석을 위하여, 세포배양물의 배지를 제거한 후 MTT를 1 ㎎/㎖로 포함하는 DMEM/F12 배지를 웰 당 1 ㎖씩 처리하고, 37℃ 습윤한 CO₂배양기에서 3시간 배양하였다. 이후 배지를 제거한 다음 0.5 ㎖ 이소프로판올을 첨가하여, 포르마잔 크리스탈을 용해시키고, 마이크로 플레이트리더 (BIO-RAD)에서 570 ㎚파장으로 흡광도를 측정하여 세포생존율을 확인하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

미선나무 추출물	처리시간(hr)	0 ㎍/mL	12.5 ㎍/mL	25 ㎍/mL	50 ㎍/mL
실시예 2	0	0.318+ 0.003	0.318+0.003	0.318+0.003	0.318+0.003
	24	0.516+ 0.008	0.478+0.009	0.461+0.006	0.450+0.002
	48	0.752+ 0.011	0.742+0.032	0.720+0.021	0.712+0.012
	72	0.927+ 0.029	1.054+0.038	1.026+0.019	0.976+0.024
실시예 6	0	0.318+ 0.003	0.318+0.003	0.318+0.003	0.318+0.003
	24	0.501+ 0.006	0.490+0.005	0.471+0.003	0.486+0.006
	48	0.740+ 0.012	0.747+0.005	0.732+0.020	0.713+0.026
	72	0.961+ 0.009	0.948+0.001	1.001+0.022	0.938+0.050

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 2 및 6의 미선나무 추출물들은 정상 소장세포의 증식을 억제하지 않아, 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다.

실험예 3: COX-2에 대한 저해 효과 검증

5주된 암컷 생쥐를 폴라스 인터내셔날(서울, 한국)에서 구입하여, 12시간을 주기로 빛과 어두운 환경에서 적응시켰다. 실험에는 6주 내지 7주령에 있는 생쥐를 사용하였다.

생쥐 등의 털을 제거한 다음 이틀 후에 실시예 2의 미선나무 추출물과 실시예 6의 열매 추출물을 1 및 5 mg으로 각각 용매(아세톤: DMSO = 1:1) 200 ㎕에 녹인 후, 이를 생쥐 피부에 국소 도포하였다. 30분 뒤 TPA (10 nmol/200 ㎕)를 아세톤에 녹여 국소 도포하고, 4시간 뒤에 생쥐를 희생시켰다. 대조군에는 용매만을 국소도포하였다. 생쥐의 피부를 잘라내어 얼음 위에서 지방조직을 제거하고, 액체 질소를 가한 후 유봉을 이용하여 분말로 만들었다. 분말에 단백질 용해(lysis) 용액(150 mM NaCl, 0.5 % Triton X-100, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 20 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM Na₃VO₄, protease inhibitor cocktail tablet)을 가하고, 3시간 동안 얼음 위에 방치한 뒤, 원심분리(12000 rpm, 10 min)하여 상층액을 수득하였다. 상층액의 단백질은 BIO-Rad 단백질 분석용액을 이용하여 정량하였다.

이후 상기 상층액은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 한 후, 분리된 단백질을 PVDF 막으로 이동시켰다. PVDP 막은 인산 완충액에 녹인 5% 탈지 분유액에 3시간 담근 다음, 1:1000으로 희석한 COX-1, COX-2 및 β-엑틴 각각에 대한 일차 항체를 4 ℃에서 12시간 반응시키고, 상기 일차 항체에 특이적으로 반응하는 이차 항체를 반응시켰다. 각 단계가 끝나면 0.1 % PBST(phosphate buffered salin Tween 20) 이차 항체를 붙인 후 ECL(Enhanced chemiluminesence) 용액으로 반응시킨 후, x-ray 필름에 노출시켜 COX-1, COX-2 및 β-엑틴의 변화를 확인하였다.

도 1은 미선나무 잎 추출물(실시예 2) 및 열매 추출물(실시예 6)의 COX-2 발현 저해 활성을 나타낸 것으로, TPA만을 처리한 군은 용매만을 처리한 대조군보다 COX-2의 발현이 현저히 증가되었다. 그러나 TPA를 국소도포하기 전에 미선나무 잎의 헥산 추출물과 미선나무 열매의 메탄올 추출물을 각각 1 및 5 mg씩 전처리한 군에서는 TPA에 의해 증가된 COX-2의 발현이 감소되었으며, COX-1의 발현에는 별다른 영향이 없는 것으로 관찰되었다. 다. 따라서 미선나무 추출물이 COX-2의 활성을 저해함으로써 항염증 효능가 있음을 알 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 미선나무 추출물들은 염증 반응을 효과적으로 억제하는 세포 독성이 없는 안전한 시료로, 염증성 질환의 치료 및 예방용도로 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (3)

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2. 미선나무의 잎 또는 열매를 물 및 탄소수 1 내지 5의 알콜로 이루어진 군 중에서 선택된 추출용매로 추출한 미선나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증제.
3. 제 2항에 있어서, 상기 미선나무 추출물은 물 및 탄소수 1 내지 5의 알콜로 이루어진 군 중에서 선택된 추출용매로 추출한 추출물을 에틸아세테이트, 헥산 및 메틸렌클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 분획한 것인 항염증제.

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