KR101116852B1 - 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 ４-ｏ-메틸호노키올을유효성분으로 함유하는 항염, 항알러지 및 주름 개선용조성물 - Google Patents

후박 추출물 또는 이로부터 분리된 ４-ｏ-메틸호노키올을유효성분으로 함유하는 항염, 항알러지 및 주름 개선용조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 후박(Magnolia officinalis Rehd . et Wils .) 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항염, 항알러지 및 주름 개선 효과를 갖는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 후박 추출물 및 이로부터 분리된 4-O-메틸호노키올(4-O-methylhonokiol)은 iNOS 활성 저해 효과, iNOS, COX2 유전자 발현 저해효과, PGE2, IL-6, IL-8 생성억제 효과, 항히스타민 활성 증진, 엘라스타제 저해 효과 및 MMP-1 발현 저해 효과를 나타내므로 항염, 항알러지 및 주름 개선용 피부외용 약학조성물 및 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
후박추출물, 4-O-메틸호노키올, 항염, 항알러지, 주름

Description

후박 추출물 또는 이로부터 분리된 ４-Ｏ-메틸호노키올을 유효성분으로 함유하는 항염, 항알러지 및 주름 개선용 조성물{Composition comprising an extract of Magnolia officinalis Rehd. et Wils. or 4-O-methylhonokiol isolated therefrom having anti-inflammatory, anti-allergy and anti-wrinkle activity}
본 발명은 나타내는 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항염, 항알러지 및 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.
알러지는 면역불균형으로 인한 과민반응의 일종으로 이물질(항원)에 대한 특이하고 변형된 반응을 나타내는 생화학적 현상이며, 질환으로는 아토피성 피부염, 알레르기성 천식, 비염 및 식품 알러지 등이 있다. 전세계 인구의 10-40%가 다양한 알러지 질환을 앓고 있다. 정상적인 인체의 면역체계는 세포성 면역을 조절하는 Th1 반응과 체액성 면역을 조절하는 Th2 반응이 균형을 이루고 있으나. 알러지 환자에서는 Th2 반응이 과다해지면서 이러한 균형이 깨어져 혈중 IgE(면역 글로블린 E)의 과다한 증가나 히스타민의 과다 분비 등의 다양한 이상 반응을 초래한다.
항원에 노출되면 T-임파구에 전달되어 인터루킨 4, 5, 6과 같은 사이토카인과 과립구-마크로파지군 자극인자(GM-CSF)를 방출한다. 사이토카인은 임파선에서 B-임파구와 반응하고 B-임파구는 혈장세포를 자체 변형하여 IgE 항체를 분비한다. IgE 항체는 비만 세포 및 호염기성 세포에 부착되어 히스타민, 세로토닌, 류코트리엔 B4, C4, D4, E4, 혈소판 활성 인자, 프로스타글란딘 D, 인터루킨 1, 3, 4, 5, 6, GM-CSF, 종양괴사인자-a, 브라디키닌 등을 방출하여 염증 반응을 매개한다.
알러지를 치료 또는 예방하기 위해서는 과다한 Th2 반응은 억제하고 Th1 반응은 효율적으로 유도하여 T 면역 반응을 안정화하여야 하며 IgE를 과도하게 생산하는 B세포에 직간접적으로 작용하여 IgE에 의해 매개되는 염증반응을 차단하여야 한다.
알러지에 의해 유도되는 염증반응에 대해서 자세히 알아보면 다음과 같다.
염증은 상처나 질병에 반응하는 인체의 면역 반응으로, 자외선이나 활성산소, 유리 라디칼 등의 산화적 스트레스 등이 염증성 인자를 활성화시켜 각종 질병 및 피부의 노화를 일으킨다. 염증의 특징 중 하나는 프로스타글란딘을 생성하는 시클로옥시게나제(COX) 및 류코트리엔을 생성하는 5-리폭시게나제 경로에 의해 대사되는 아라키돈산(Arachidonic acid)의 산소첨가반응의 증가이다. 프로스타글란딘 및 류코트리엔은 염증의 매개체이다. 따라서, 시클로옥시게나제 및/또는 리폭시게나제 활성을 억제하도록 설계된 치료법은 큰 관심사이다. 시클로옥시게나제 효소는 시클로옥시게나제-1 및 시클로옥시게나제-2의 2개의 형태가 있다. 후자의 형태, 즉 시 클로옥시게나제-2는 염증 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 따라서, 시클로옥시게나제-2 효소를 억제하는 것이 비가역적인 시클로옥시게나제-1 억제와 관련된 부작용 없이 염증을 감소시킬 수 있는 효과적인 방법일 수 있다.
또 하나의 강력한 염증 매개물인 나이트릭 옥사이드 (Nitric oxide, NO)는 NO 합성 효소 (NOS)에 의해 L-알지닌으로부터 생성되며 UV와 같은 스트레스나 엔도톡신, 사이토카인에 의해 많은 타입의 세포에서 발생된다. 이러한 염증 자극들은 세포 내의 유도성 NOS의 발현을 증가시켜 NO를 발생시켜 대식 세포를 활성화시켜 염증 반응을 일으킨다.
인터루킨-8(IL-8)은 단핵세포, 섬유아세포, 내피 세포 및 각질 세포를 비롯한 몇몇 세포 유형에 의해 생성되는 주화성 인자이다. 내피세포로부터의 이의 생성은 인터루킨-1, 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor) 또는 리포폴리사카라이드에 의해 유도된다. IL-8은 시험관내에서 수많은 기능을 자극한다. 이는 호중구, T-림프구 및 호염기성 세포에 대해 화학 유인 특성을 갖는 것으로 나타나 있다. 게다가, 이는 정상 및 아토피성 개체 모두의 호염기성 세포로부터의 히스타민 방출을 유도할 뿐만 아니라, 호중구로부터 리소좀 효소 방출 및 호흡 폭발을 유도한다. IL-8은 또한 단백질 신생합성없이 호중구상에서 Mac-1(CD11b/CD18)의 표면 발현을 증가시키는 것으로 나타나 있고, 이는 혈관 내피 세포에 대한 호중구의 부착을 증가시키는 데 기여할 수 있다. 많은 질환은 호중구 대량 침투를 특징으로 한다.
피부의 제일 바깥부분인 표피층은 진피층으로부터 생성되며, 진피층은 콜라겐과 엘라스틴으로 구성된다. 피부에 윤택을 주고 탄력을 주는 것은 진피층의 이 두성분인데, 콜라겐을 분해하는 효소인 콜라게나제와 엘라스틴을 분해하는 효소인 엘라스타제가 활성이 되면, 피부가 탄력을 잃고 주름이 생기게 된다( Funtional Cosmetology , society of cosmetic chemists of Japan , p163 -180). 또한 메트릭스 메탈로프로티나제(Matrix Metallo-Preoteinase; MMP)-1은 활성중심부에 아연을 가지는 금속단백 분해효소로 생체 내에서 잠재성 전효소(zymogen)형태로 분비된다. 효소활성을 가지기 위해서 구조적 변형이 일어나 아미노 말단 부위가 절단, 활성화 되며 활성화된 MMP는 2-마크로글로불린(macroglobulin)이나 TIMPs(tissue inhibitors of metalloproteinase)같은 저해제에 의해 활성이 조절되고 피부의 케라티노사이트(keratinocyte), 섬유아세포(fibroblast)를 포함한 대다수의 많은 세포들이 MMP를 분비한다(Fisher, G. J. et al., Photochem . Photobiol . 69, 154, 1999). 1회의 UV조사에도 피부내의 MMP활성이 증가되며 피부내의 콜라겐을 현저하게 붕괴시킴으로써 MMP들이 진피층의 콜라겐 붕괴에 영향을 미치며 광 노화에 매우 중요한 역할을 한다.
기존 치료제는 크게 스테로이드성 소염제 또는 비스테로이드성 소염제와 항히스타민제 또는 항류코트리엔제로 나눌 수 있다. 전자는 대부분 강력한 면역억제 작용을 가지므로 단기간 내에 일시적인 진정 효과를 나타낼 수는 있지만 메스꺼움 등의 가벼운 부작용부터 성장 억제나 골다공증 등과 간은 심각한 부작용까지 있어 장기 복용에는 많은 문제가 따른다. 후자는 일시적인 완화 효과를 보일 수는 있으나, 졸림이나 어지러움 등의 부작용이 있어 사용에 제한이 따른다. 따라서 효능, 효과뿐만 아니라 보다 안전하게 적용할 수 있는 천연물에서 유래한 물질이 절실히 필요하다.
후박(厚朴, Magnolia officinalis Rehd . et Wils.)은 한국과 일본, 그리고 중국에서 오랜 기간 건위제로 사용되어 왔으며, 후박 잎은 한국과 일본에서 식용으로도 사용되어져 왔으며(정보섭, 신민교, 향약대사전, 영림사, p.469, 1998), 후박나무에는 알파, 베타-유데스몰(α,β-eudesmol), 마그놀올(magnolol), 호노키올(honokiol), 오보바톨(obovatol) 등이 포함되어져 있는 것으로 알려져 있다(생약학연구회, 현대생약학, 학창사, p.567, 2003).
현재 국내에서 쓰이고 있는 후박은 목련과에 속하는 중국산 후박(Magnolia officinalis Rehd . et Wils., Magnolia officinalis var. biloba)과 목련과(Magnoliaceae)에 속하는 낙엽 교목인 일본산 후박(Magnolia obovata ), 그리고 녹나무과(Lauraceae)에 속하는 상록 교목인 한국산 후박(Machilus thunbergii, Machilus thunbergii var. obovata)이 있으며 이것은 각각 산지에 따라 후박 또는 후박의 대용품으로 사용된다(Lee S. R. et al., Kor . J. Pharmacogn., 17, p199, 1986). 최근 국내에서 후박을 이용한 연구가 진행되어 마그놀올 성분의 효능을 활용한 당뇨억제제 특허(김진숙 외, 대한민국특허 출원번호 제2003-0039241호)가 출원된 바 있으며, 오보바톨 성분을 활용한 항불안 억제제 특허(홍진태 외, 대한민국특허 출원번호 제2005-0037854호)가 출원된바 있다. 1978년에 후박으로부터 4-O-메틸호노키올이 처음으로 분리 되었으며(El-Feraly, F. S. et al., Lloydia, 41, p493, 1978), 4-O-메틸호노키올은 마그놀올과 함께 항균효과가 있고, 모기 유충 및 브라인 슈림프(brine shrimp)에 살충효과가 있는 것으로 알려져 있으며(Nitao J. K. et al., Phytochemistry, 30, p2193, 1991), 신경보호 효과 및 신경영양 효과(neurotrophic effect)가 있는 것으로도 알려져 있다(Tomoyuki E. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 14, p2621, 2004). 대한민국특허 출원번호 제2003-0027093호는 녹나무과에 속하는 국내산 후박인 토후박(Machilus thunbergii)의 조추출물 또는 비극성용매가용추출물을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물에 관해 보고한 바 있다. 그러나, 아직까지 목련과에 속하는 중국산 후박나무(Magnolia officinalis )와 4-O-메틸호노키올에 의한 항염, 항알러지 및 주름 개선 효과에 대해서는 보고 된 바 없다.
이에 본 발명자들은 후박 추출물 및 이로부터 분리된 화합물이 iNOS 활성 저해 효과, iNOS, COX2 유전자 발현 저해효과, PGE2, IL-6, IL-8 생성억제 효과, 항히스타민 활성 증진, 엘라스타제 저해 효과 및 MMP-1 발현 저해 효과를 통한 항염, 항알러지 및 주름 개선에 탁월한 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항염, 항알러지 및 주름 개선용 피부외용 약학조성물 및 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 하기 화학식(I)로 표기되는 4-O-메틸호노키올(4-O-methyl honokiol)을 유효성분으로 함유하는 항염, 항알러지 및 주름 개선용 피부외용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 하기 화학식(I)로 표기되는 4-O-메틸호노키올(4-O-methyl honokiol)을 유효성분으로 함유하는 항염, 항알러지 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
Figure 112007040052956-pat00001
상기 후박 추출물은 후박의 줄기껍질, 종자, 잎 또는 뿌리, 바람직하게는 줄기껍질 또는 잎, 보다 바람직하게는 줄기껍질로부터 추출됨을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 추출물은 조추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 75 내지 100% 에탄올에 가용한 추출물을 포함한다.
본원에서 정의되는 상기 비극성용매 가용추출물은 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 또는 에테 르로부터 선택된 용매, 바람직하게는 헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트, 보다 바람직하게는 헥산에 가용한 추출물을 포함한다.
이하, 본 발명의 후박 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.
본 발명의 후박 조추출물은 후박의 잎 또는 줄기껍질을 건조하여 그 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 2 내지 5배 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 약 75 내지 100% 에탄올로 약 0 내지 100℃, 바람직하게는 약 10 내지 30℃의 추출 온도에서 약 1시간 내지 15일, 바람직하게는 약 2 내지 7일 동안 열수 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 등의 추출 방법, 바람직하게는 환류냉각추출 방법으로 추출한 추출액을 감압 여과하여 얻은 추출물을 약 20 내지 100℃, 바람직하게는 약 50 내지 70℃에서 감압 농축한 후 본 발명의 후박 조추출물을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 후박 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 후박 조추출물 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 2 내지 5배 부피의 물을 분산시킨 후, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 글리세린 또는 프로필렌글리콜, 바람직하게는 헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트, 보다 바람직하게는 헥산을 물의 0.1 내지 0.5배 정도의 부피를 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 본 발명의 후박 비극성용매 가용 추출물을 수득할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 하기와 같이 분리될 수 있다.
상기 수득 방법으로 얻어진 비극성용매 추출물 중 헥산 용매 추출물을 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 바람직하게는 메탄올에 녹이고, C18 컬럼에 흡착시킨 후 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 바람직하게는 메탄올 : 물이 약 10:1 내지 4:1이 되도록 혼합하여 분획물을 얻어 실리카겔에 흡착시킨 다음, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 2회 내지 5회 수행하여 활성분획을 분리하고, 최종적으로 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 본 발명의 4-O-메틸호노키올을 수득할 수 있다.
본 발명의 4-O-메틸호노키올은 시중 구입 가능하거나, 상기 방법으로 수득될 수 있다.
본 발명은 상기 제조방법으로 얻어지는 후박 추출물 또는 이로부터 분리되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 항염, 항알러지 및 주름 개선용 피부외용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 항염, 항알러지 및 주름 개선용 피부외용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함한다.
본 발명의 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부외용 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부외용 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리 콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항염, 항알러지 및 주름 개선용 조성물은 피부에 적용할 수 있는 피부 외용제 제형으로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 외용투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항염, 항알러지 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 본 발명의 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항염, 항알러지 및 주름 개선용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.
또한, 후박은 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어 오던 약재로서 이들로부터 추출된 본 발명의 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없으며, 피부 자극 시험에서 무자극 시료임이 입증되었으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 조성물은 항염, 항알러지 및 주름 개선 효과를 위한 화장품 및 샴푸 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를들어, 각종 크림, 로션, 스킨, 에센스 등과 같은 화장품류와 샴푸, 린스, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 팩, 미용액 등이 있다.
본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.
수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.
유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.
고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.
고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.
스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지 질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.
해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.
본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.
이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.
에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디 핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜 레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.
탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.
실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.
불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.
동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.
보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.
수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.
지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.
수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.
지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.
에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.
계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.
비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.
음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.
양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.
양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.
유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이 카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.
유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.
자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신 산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.
살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.
산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.
pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.
알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.
또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가 능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 - 5 % 중량 백분율, 보다 바람직하게는 0.01 - 3 % 중량 백분율로 배합된다.
본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.
본 발명의 항염, 항알러지 및 주름 개선용 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 헤어로션, 헤어토닉, 헤어에센스, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토 스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 후박 조추출물(hc-1)의 제조
경동시장에서 구입한 후박(Magnolia officinalis Rehd. et Wils.)나무의 줄기껍질을 건조 및 세절하여 얻은 줄기껍질 3kg에 95% 에탄올 9L를 가하여 실온에서 3회 반복 추출한 후 여과하여 얻은 여과액을 감압농축기(EYELA사, N-1000, 일본)로 감압농축하여 건조된 조추출물 450g을 얻었고, 하기 실험예에 사용하였다(이하, hc-1이라 명명함).
실시예 2. 후박 비극성 용매 가용 추출물(hc-2)의 제조
상기 실시예 1에서 수득한 후박 조추출물 중 200g을 2L 증류수로 현탁시켰고, 500ml의 헥산을 가하여 용해한 후, 이를 분별 추출하였으며, 이러한 과정을 2회 반복 수행하여 헥산층에 녹는 부분을 모은 뒤 헥산층을 감압농축하여 후박 헥산 가용 추출물 70g을 수득하였고, 하기 실험예에 사용하였다(이하, hc-2라 명명함).
실시예 3. 후박 추출물로부터 4-O-메틸호노키올의 분리
상기 실시예 2에서 수득한 후박 헥산 가용 추출물 70g을 300ml의 메탄올에 녹이고 300g의 C18 컬럼에 흡착시킨 후, 메탄올:물=4:1(v/v)의 혼합용액을 사용하 여 분획물을 수득하였으며, 용리액을 감압농축하여 황갈색의 농축액 40g을 얻었고, 이것을 메틸렌클로라이드에 용해시켰다. 그런 후, 헥산:초산에틸=9:1인 혼합 용액을 사용하여 칼럼(4.5x40cm)에 충진한 실리카겔(머크사, 상품명: 9385) 1kg에 분획물을 흡착시키고 헥산과 초산에틸의 비율을 9:1에서 6:4로 변환시키면서 총 2회의 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 분획물을 분리한 다음, 최종적으로 하기 표 1에 기재된 조건의 고성능 액체크로마토그래피를 이용하여 하기 물성치를 갖는 4-O-메틸호노키올 2g을 수득하였고, 하기 실험예에 사용하였다.
NMR 기기로 1H-NMR은 바리안사(Varian, GEMINI, 400 MHz), 13C-NMR은 바리안사(Varian, GEMINI, 100 MHz)로 그 구조를 분석하였으며, CDCl3(Chloroform-d, 알드리치사)를 용매로 사용하였고, 내부표준물질로는 트리메칠실란을 사용하여 δ값(ppm)으로 나타내었으며, NMR 결과는 이미 발표된 자료와 일치함을 확인할 수 있었다(Shoji Y. et al., Chem. Pharm. Bull. 39, p2024, 1991).
1H-NMR (400MHz, CDCl3): δ ppm 3.45(2H, d, J=6.0Hz, H-7'), 3.45(2H, d, J=6.0Hz, H-7), 3.90(3H, s, OMe), 5.10(4H, m, H-9 and H-9'), 6.01(2H, m, H-8 and H-8'), 6.95(1H, dd, J=8, 1.5Hz, H-3'), 6.97(1H, dd, J=8.0, 1.5Hz, H-3), 7.05(2H, m, H-2 and H-6'), 7.23(1H, dd, J=8.5, 1.6Hz, H-6), 7.30(1H, dd, J=8.5, 1.6Hz, H-4');
13C-NMR (100MHz, CDCl3): δ ppm 129.09(C-1), 130.67(C-2), 128.67(C-3), 156.94(C-4), 115.53(C-5), 127.86(C-6), 34.22(C-7), 136.48(C-8), 115.47(C-9), 127.83(C-1'), 150.79(C-2'), 110.88(C-3'), 129.64(C-4'), 132.09(C-5'), 130.46(C-6'), 39.36(C-7'), 137.77(C-8'), 115.77(C-9'), 55.47(OMe).
컬럼(column) 심팍 프렙-ODS(Shim-Pak prep-ODS) 컬럼,시마츄사
컬럼 온도
(column temperature)		 30 ℃
유속(flow rate) 18 mL/min
측정기(detector) UV 254 nm
주입 부피
(injection volume)		 400 ㎕
이동상(mobile phase) 80% 메탄올
참고예 1. 순도 분석
상기 실시예 1 내지 3에서 수득한 후박추출물 및 4-O-메틸 호노키올의 순도를 알아보기 위해, 하기 표 2에 기재된 조건의 고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC)를 이용하여 순도 분석을 하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
컬럼(column) 캅셀팍 C18 4.6 X 250mm, 시세이도사
컬럼 온도
(column temperature)		 30 ℃
유속(flow rate) 1.0 mL/min
측정기(detector) UV 254 nm
주입 부피
(injection volume)		 20 ㎕
이동상(mobile phase) 80% 메탄올
실험물질 4-O-메틸호노키올의 함량 (%)
실시예 1의 hc-1 12.50
실시예 2의 hc-2 30.28
분석결과, 상기 표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 hc-2는 30.28%로 12.50%인 실시예 1의 hc-1보다 4-O-메틸호노키올 함량이 훨씬 높았다.
실험예 1. 세포독성에 관한 실험
상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 시료로 사용하여 사람의 섬유아세포(ATCC 2076)에 대한 세포생존율을 측정함으로써, 이들이 독성이 있는지 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
사람의 섬유아세포(ATCC 2076)를 5x104 cells/ml의 농도로 하여 소혈청 10%를 함유한 IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, GIBCO) 24웰 배양판에 접종하여, 접종 후 24시간 후 혈청이 없는 배지로 교체한 다음, 시험 시료를 0.5, 1, 5 또는 10ug/ml의 농도로 첨가하여 하루 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 후 상등액을 제거 하고 다시 5% PBS(phosphate buffered saline)를 200ul씩 가하여 세척한 다음, MTT 용액을 웰당 1.0㎖씩 가한 후 4시간 후에 MTT를 제거한 다음, DMSO를 웰당 1.0㎖씩을 가하여 하룻밤 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 570nm에서 흡광도를 측정 하여 하기 수학식 1을 이용하여 세포 생존율을 구하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
세포 생존율 (%) = (B OD570 λ 값/A OD570 λ 값) × 100
A: 대조군 (시료를 첨가하지 않은 실험군)
B: 시료 (농도가 0.1, 0.5, 1, 5 또는 10ug/ml인 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc- 2 또는 실시예 3의 4-O-메틸호노키올)
시료 세포 생존률 (%)
대조군 100
실시예 1의 hc-1 0.1ug/ml 110.3
실시예 1의 hc-1 0.5ug/ml 103.4
실시예 1의 hc-1 1ug/ml 96.4
실시예 1의 hc-1 5ug/ml 97.2
실시예 1의 hc-1 10ug/ml 100.6
실시예 2의 hc-2 0.1ug/ml 112.1
실시예 2의 hc-2 0.5ug/ml 98.8
실시예 2의 hc-2 1ug/ml 97.3
실시예 2의 hc-2 5ug/ml 100.2
실시예 2의 hc-2 10ug/ml 107.4
실시예 3의 4-O-메틸호노키올 0.1ug/ml 108.1
실시예 3의 4-O-메틸호노키올 0.5ug/ml 99.8
실시예 3의 4-O-메틸호노키올 1ug/ml 102.9
실시예 3의 4-O-메틸호노키올 5ug/ml 105.3
실시예 3의 4-O-메틸호노키올 10ug/ml 100.7
실험결과, 상기 표 4에 나타난 바와 같이, 4-O-메틸호노키올을 처리하여 배양한 섬유아세포는 99.8 내지 108.1%로 세포생존율이 가장 높았고, 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 또는 실시예 3의 4-O-메틸호노키올을 처리한 섬유아세포는 모두 세포 생존율이 95%이상이었다. 따라서 후박추출물 및 이로부터 분리된 화합물은 독성이 거의 없는 안전한 물질임을 알 수 있었다.
실험예 2. 항알러지 실험
상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 후박 추출물 및 이로부터 분리된 화합물의 항알러지 효과를 측정하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
RBL-2H3 비만 세포(mast cell) 1 x 105를 15% FBS-MEM (Fetal Bovine Serum, 소태아혈청, Modified Eagle Medium, 기브코 사)배지에 현탁시켜 24웰 배양판에 접종하여 부착시킨 후, 0.5ug/ml의 IgE를 첨가하여 오버나이트(overnight)시킨 다음, 배지를 버리고 시라가니안 버퍼 I(siraganian buffer I, pH7.2, 119mM 염화나트륨, 5mM 염화칼륨, 0.4mM 염화마그네슘, 25mM PIPES, 40mM 수산화나트륨) 0.5ml로 씻은 후, 시라가니안 버퍼 II (시라가니안 버퍼 I에 5.6mM 포도당, 1mM 염화칼슘, 0.1% BSA 첨가) 160ul를 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시키고, 시료를 20ul 처리하여 10분간 37℃에서 반응시킨 후, 1ug/㎖ DNP-BSA를 20ul 처리하여 30분간 37℃에서 반응시킨 다듬, 이 용액을 이-튜브(e-tube)로 옮겨서 원심분리한 후, 상층액 20ul와 기질인 1mM ρ-니트로페닐-N-아세틸-β-D-글루코사미니드 20ul를 96웰 플레이트에 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 스탑 솔루션 (0.1M 탄산나트륨) 200ul를 처리하고 405nm에서 흡광도를 측정하여, 하기 수학식 2를 이용하여 항알러지 효과를 구하였고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
항알러지 효과(%) = {(D OD405 λ값 - B OD405 λ값 - C OD405 λ값)/ (A OD405 λ값 - B OD405 λ값- C OD405 λ값)} × 100
A: 대조군 (시료를 첨가하지 않은 실험군)
B: Blank (ELISA 플레이트에 시료와 기질만 첨가한 실험군)
C: Spontaneous (DNP-IgE와 시료를 첨가하지 않은 실험군)
D: 시료 (농도가 1, 5 또는 10ug/ml인 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 또는 실시예 3의 4-O-메틸호노키올)
시료 항알러지 효과(%)
실시예 1의 hc-1 1ug/ml 25
실시예 1의 hc-1 5ug/ml 33
실시예 1의 hc-1 10ug/ml 51
실시예 2의 hc-2 1ug/ml 29
실시예 2의 hc-2 5ug/ml 48
실시예 2의 hc-2 10ug/ml 74
실시예 3의 4-O-메틸호노키올 1ug/ml 37
실시예 3의 4-O-메틸호노키올 5ug/ml 66
실시예 3의 4-O-메틸호노키올 10ug/ml 102
DSCG (디소듐 크리모글리케이트) 100uM 55
실험결과, 상기 표 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 hc-1과 실시예 2의 hc-2는 10 ug/ml의 농도에서, 실시예 3의 4-O-메틸호노키올은 5ug/ml의 농도에서
알러지를 50% 저해하는데 필요한 농도인 IC50을 넘어섰으며, 실시예 3의 4-O-메틸호노키올은 10 ug/ml의 농도에서 항알러지 효과가 102%로 완벽하게 비만 세포의 탈과립을 저해하였다. 따라서 후박추출물 및 이로부터 분리된 화합물은 알러지 반응을 저해하는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 3. iNOS 활성 저해 실험
후박 추출물 및 이로부터 분리된 화합물의 염증 억제 효과를 알아보기 위해 생쥐의 대식세포인 Raw264.7 세포에서 iNOS(inducible Nitric Oxide Synthase, 유도성 나이트릭 옥사이드 생성 효소)의 활성을 측정하는 실험을 하기와 같이 수행하였다.
페놀-레드(phenol-red)가 들어있지 않은 10% FBS-DMEM(Fetal Bovine Serum, 소태아혈청, Dulbecco's Modified Eagle Medium, 기브코 사) 배지에 8 x 105의 밀도로 세포를 현탁시켜 24웰 배양판에 접종하여 부착시키고, 24시간 후 시료를 1, 5 또는 10ug/ml의 농도별로 처리하여 18시간 동안 인큐베이션한 후, 1ug/ml의 리포폴리사카라이드(LPS, lipopolysaccharide, 시그마 사)를 처리하여 24시간동안 인큐베이션한 다음, 상층액을 회수하여 96웰 플레이트에 100ul씩 넣고 그리에스 시약(Griess reagent, 시그마 사)을 동량 첨가하여 상온에서 10분간 가볍게 흔들어 주어 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 소디움 나이트리트를 표준품으로 하여 검량선을 작성하였고, 배지만 처리한 군을 대조군으로 하였으며, 리포폴리사카라이드(LPS)를 처리한 군의 나이트릭 옥사이드(NO)의 생성량을 100%로 하여 각 시료의 배양액 중 나이트릭 옥사이드(NO) 생성량을 구하였고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
시료 NO생성율(%)
대조군 8.64
리포폴리사카라이드(LPS) 100
LPS + 실시예 1의 hc-1 1ug/ml 88.9
LPS + 실시예 1의 hc-1 5ug/ml 61.3
LPS + 실시예 1의 hc-1 10ug/ml 48.9
LPS + 실시예 2의 hc-2 1ug/ml 79.8
LPS + 실시예 2의 hc-2 5ug/ml 53.5
LPS + 실시예 2의 hc-2 10ug/ml 20.7
LPS + 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 1ug/ml 70.1
LPS + 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 5ug/ml 44.5
LPS + 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 10ug/ml 9.7
실험결과, 상기 표 6에 나타난 바와 같이, 리포폴리사카라이드(LPS)를 처리한 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 및 실시예 3의 4-O-메틸호노키올은 농도 의존적으로 iNOS의 활성을 저해시켰다. 특히 실시예 3의 4-O-메틸호노키올은 10ug/ml의 농도에서 NO 생성율이 9.7%로 대조군과도 거의 차이가 없음을 확인할 수 있었고, 나이트릭 옥사이드의 생성 저해에 가장 큰 효과가 있었다. 따라서 후박 추출물 및 이로부터 분리된 화합물은 iNOS 활성을 저해함으로써 NO 생성을 억제하여 염증 반응을 억제하는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 4. iNOS 및 COX 2 유전자 발현 저해 실험
후박 추출물 및 이로부터 분리된 화합물의 염증 억제 효과를 알아보기 위해 생쥐의 대식세포인 Raw264.7 세포에 리포폴리사카라이드(LPS)를 처리하여 인위적으로 COX2(Cyclooxygenase2)유전자의 발현을 증가시킨 후, COX2 및 iNOS(inducible Nitric Oxide Synthase, 유도성 나이트릭 옥사이드 생성 효소)의 활성을 측정하는 실험을 RT-PCR 방법을 이용하여 하기와 같이 수행하였다.
10% FBS-DMEM (Fetal Bovine Serum, 소태아혈청, Dulbecco's Modified Eagle Medium, 기브코사) 배지에 8 x 105의 밀도로 세포를 현탁시켜 100mm 디쉬에 접종하여 부착시키고, 24시간 후에 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 또는 실시예 3의 4-O-메틸호노키올를 1, 5 또는 10ug/ml의 농도별로 처리하여 18시간 동안 인큐베이션한 다음, 1ug/ml의 리포폴리사카라이드(LPS, lipopolysaccharide , 시그마사)를 처리하여 8시간동안 인큐베이션한 후, 세포의 배지를 제거하고 트라이졸(Trizol, 인비트로젠사) 1ml을 첨가하여 인비트로젠사의 RNA 분리법(Chromczynski, P., and Sacchi, N. Anal . Biochem . 162, p156, 1987)에 따라 RNA를 분리하고 260nm에서 정량하여 역전사 중합 반응(리벌스 트랜스크립션 - 폴리머래이즈 체인 리액션)을 실시하였다. 역전사 중합 반응은 올 인 원 역전사 중합 반응 키트(All-in-one RT-PCR kit, 수퍼바이오사)를 사용하였고, 실험에 사용된 프라이머 조건은 하기 표 7에 기재하였으며, 올 인 원 역전사 중합 반응 키트의 매뉴얼(Gibbs, R.A. Anal. Chem., 62(13), p1202, Jul 1, 1990)에 따라 실험을 진행하여 COX2 및 iNOS의 활성 효과(%)를 측정하여, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
iNOS 프라이머 센스(sense) 5'-CAGTTCTGCGCCTTTGCTCAT-3'(서열번호 1)
안티센스
(antisense)		 5'-GGTGGTGCGGCTGGACTTT-3'(서열번호 2)
반응 조건 50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사효소를 불활성화시킨 후, 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분간 32회 중합 반응
COX 2 프라이머 센스(sense) 5'-CTGAAGCCCACCCCAAAC-3' (서열번호 3)
안티센스
(antisense)		 5'-AACCCAGGTCCTCGCTTATG-3' (서열번호 4)
반응 조건 50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화 시킨 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분간 32 회 중합 반응
액틴 프라이머 센스(sense) 5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3' (서열번호 5)
안티센스
(antisense)		 5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3' (서열번호 6)
반응 조건 50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화 시킨 후, 94℃ 1분, 62℃ 1분, 72℃ 1분간 22 회 중합 반응
시료 iNOS
(%) 		COX2
(%)
대조군 100 100
리포폴리사카라이드(LPS) 141.3 133.6
LPS + 실시예 1의 hc-1 1ug/ml 144.2 122.1
LPS + 실시예 1의 hc-1 5ug/ml 132.6 123.6
LPS + 실시예 1의 hc-1 10ug/ml 110.5 105.4
LPS + 실시예 2의 hc-2 1ug/ml 137.8 123.2
LPS + 실시예 2의 hc-2 5ug/ml 125.6 109.5
LPS + 실시예 2의 hc-2 10ug/ml 103.3 97.4
LPS + 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 1ug/ml 120.9 110.9
LPS + 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 5ug/ml 100.7 105.1
LPS + 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 10ug/ml 86.3 77.4
실험결과, 상기 표 8에 나타난 바와 같이, 리포폴리사카라이드(LPS)를 처리한 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 및 실시예 3의 4-O-메틸호노키올은 농도 의존적으로 iNOS 및 COX2의 활성을 저해시켰다. 특히 실시예 3의 4-O-메틸호노키올은 10ug/ml의 농도에서 iNOS 및 COX2 생성율이 86.3, 77.4 %로 대조군과도 거의 차이가 없음을 확인할 수 있었고, 가장 큰 iNOS 및 COX2 저해 효과가 있었다. 따라서 후박 추출물 및 이로부터 분리된 화합물은 iNOS 및 CIX2의 활성을 저해하여 염증 반응을 억제하는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 5. PGE 2 , IL-6, IL-8 생성 억제 효과
사람의 섬유아세포에서 염증 매개 물질인 PGE2, IL-6 및 IL-8의 생성 억제 효과를 측정함으로써 후박 추출물 및 이로부터 분리된 화합물의 염증 억제 효과를 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
사람 섬유아세포를 6웰 배양판에 1 x 105세포의 밀도로 접종하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 다음, 과산화수소(H2O2) 500uM을 웰에 처리하여 24시간 동안 자극을 준 후, 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 또는 실시예3의 4-O-메틸호노키올 시료를 1, 5 또는 10ug/ml 농도별로 처리하여 48시간동안 반응시키고 배양액을 수거하여 ELISA 에세이를 실시한 다음, PGE2는 에세이 디자인(Assay Design)사의 키트를, IL-6 및 IL-8은 엔도젠(Endogen)사의 키트를 사용하여, 각 회사의 메뉴엘대로 실험하였고(P. Tijssen, in Practise and Theory of Enz. Immunoassays, Elsevier, Amsterdam, 1985), 하기 수학식 3을 이용하여 PGE2, IL-6 및 IL-8의 생성 억제 효과를 구하였으며, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
억제 효과 ={1-(A-B)/(C-B)}X100
A: 과산화수소(H2O2)를 처리한 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 또는 실시예3의 4-O-메틸호노키올 처리군에서 PGE2, IL-6 또는 IL-8의 생성량(pg/ml)
B: 배지만 처리한 대조군에서 PGE2, IL-6 또는 IL-8의 생성량(pg/ml)
C: 과산화수소(H2O2) 처리군에서 PGE2, IL-6 또는 IL-8의 생성량(pg/ml)
시료 PGE2
생성량 (pg/ml)
 PGE2,
억제효과		 IL-6
생성량 (pg/ml)
 IL-6
억제효과		 IL-8
생성량 (pg/ml)
 IL-8
억제효과
대조군 156.1 23.9 123.2
H2O2 (500uM) 447.8 182.3 317.4
H2O2 + 실시예 1의 hc-1 1ug/ml 401.2 15.97% 170.9 7.20% 298.0 9.99%
H2O2 + 실시예 1의 hc-1 5ug/ml 366.9 27.73% 160.8 13.57% 255.6 31.82%
H2O2 + 실시예 1의 hc-1 10ug/ml 310.4 47.1% 135.5 29.55% 209.3 55.66%
H2O2 + 실시예 2의 hc-2 1ug/ml 302.5 49.81% 165.2 31.47% 280.4 19.05%
H2O2 + 실시예 2의 hc-2 5ug/ml 290.8 53.82% 123.5 51.70% 233.9 43.00%
H2O2 + 실시예 2의 hc-2 10ug/ml 220.4 77.96% 100.9 62.66% 191.0 65.09%
H2O2 + 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 1ug/ml 300.1 50.63% 150.2 20.27% 259.4 29.87%
H2O2 + 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 5ug/ml 205.4 83.10% 103.7 49.62% 199.2 60.87%
H2O2 + 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 10ug/ml 137.1 106.51% 55.9 79.80% 110.8 106.39%
실험결과, 상기 표 9에 나타난 바와 같이, 과산화수소를 처리한 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 및 실시예 3의 4-O-메틸호노키올은 농도 의존적으로 PGE2, IL-6 및 IL-8의 생성을 저해시켰다. 특히 과산화수소를 처리한 실시예 3의 4-O-메틸호노키올은 10ug/ml의 농도에서 PGE2, IL-6 및 IL-8의 억제 효과가 약 79.80 내지 106.51%로 가장 큰 효과가 있었다. 따라서 후박 추출물 및 이로부터 분리된 화합물은 염증 매개 물질인 PGE2, IL-6 및 IL-8의 활성을 저해하여 염증 반응을 억제하는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 6. 동물 실험을 이용한 항히스타민 활성 측정
동물 실험을 통해 히스타민 차단 효과를 측정함으로써 후박 추출물 및 이로부터 분리된 화합물의 항알러지 효과를 알아보기 위해 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 및 실시예 3의 4-O-메틸호노키올을 기니아픽에서 분리한 회장에 대해 평가하는 방법(Akah P.A. et al, Jounal of Ethnopharmacology, 55, pp87-92, 1997 )을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
400g 무게의 기니아픽(샘타코, 5주령)에게 48시간동안 먹이없이 물만 공급한 뒤, 실험 당일 치사시켜 회장을 분리하여 말단 10cm의 회장을 취한 다음, 2.5cm 간격으로 소절편한 회장을 티로데액이 담긴 수조에 넣고 가압 트랜스듀서를 연결하고 멀티채널 폴리그래프를 이용하여 그 흔적을 기록하여 1차 단계에서, 히스타민에 관련하여 0.5ug/35ml에서 출발하여 최고 2.5ug/35ml까지의 약량에 대해 수득하여, 조직이 활발하게 반응하고 있음을 확인한 후, 용해된 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2, 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 또는 항알러지 조성물인 DSCG(디소듐 크리모글리케이트)를 10ug, 100ug, 1mg, 2mg, 5mg 또는 10mg으로 첨가하여 IC50값을 측정하여 히스타민 차단효과를 구하였고, 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
시료 IC50 (ug/ml)
실시예 1의 hc-1 289
실시예 2의 hc-2 154
실시예 3의 4-O-메틸 호노키올 43
DSCG (디소듐 크리모글리케이트) 5
실험결과, 상기 표 10에 나타난 바와 같이, 실시예 3의 4-O-메틸 호노키올은 IC50값이 43ug/ml로 비록 임상에 직접 사용되고 있는 항알러지 약품인 DSCG보다 값이 높지만 화장품으로서의 항알러지 효과는 매우 뛰어남을 알 수 있었다. 따라서 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 및 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 히스타민을 억제함으로써 탁월한 항알러지 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 7. 동물 실험을 이용한 항염 효과 측정
동물 실험을 이용하여 후박 추출물 및 이로부터 분리된 화합물의 염증 억제 효과를 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
윈터의 실험방법(Winter C. A., Risley E.A., Nuss G. W., Proc . Soc . Exp . Biol. Med ., 111, p544, 1962)을 이용하여 급성 염증을 일으키는 카라기난을 쥐(샘타코, 5주령)에 주사하여 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2, 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 또는 항염물질인 인도메타신 처리군의 카라기난 주사 전후의 뒷발의 부피를 측정한 뒤 하기 수학식 4를 이용하여 염증 저해율을 구하였고, 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
염증 저해율={1-(A-B)/(C-B)}X100
A: 카라기난을 처리한 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2, 실시예3의 4-O-메틸호노키올 또는 인도메타신 처리군에서 뒷발의 부피
B: 용매만 처리한 대조군에서 뒷발의 부피
C: 카라기난 처리군에서 뒷발의 부피
시료 저해율(%)
실시예 1의 hc-1 120mg/kg 68.7
실시예 2의 hc-2 120mg/kg 57.3
실시예 3의 4-O-메틸호노키올 120mg/kg 50.4
인도메타신(Indomethacin) 120mg/kg 61.9
실험결과, 상기 표 11에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 및 실시예 3의 4-O-메틸호노키올은 염증 저해율이 약 50.4 내지 68.7%로 높은 염증 저해 효과를 나타내었으며, 특히 실시예 1의 hc-1은 68.7%로 항염 물질인 인도메타신보다도 높은 염증 저해율을 보임으로써 가장 높은 염증 저해 효과를 보였다. 따라서 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 및 실시예 3의 4-O-메틸호노키올은 염증반응을 저해하는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 8. 엘라스타제 억제 효과
엘라스타제 억제 효과를 측정함으로써 후박 추출물 및 이로부터 분리된 화합물이 주름 생성을 억제하는데 효과가 있는지 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
8-1. 용액의 제조
0.267M 트리스 용액을 pH가 8.0이 되도록 0.267M 염산액으로 조정하여 완충액을 만들었고, 석시닐-알라닌-알라닌-알라닌-피-니트로아니리드(Succ-Ala-Ala- Ala-p-nitroanilide) 표준품을 8.8mM 농도로 하여엘라스타제 기질액을 만들었으며, 돼지 췌장 엘라스타제(Porcine Pancreatic Elastase) 표준품을 10㎍/㎖ 농도로 하여 효소액을 만들었다.
8-2. 대조군의 흡광도 측정
실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 및 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 시료 대신 정제수 100㎕를 가지고 검액과 같은 방법으로 조작하여 얻은 액을 공시험액으로 하여 흡광도 A를 측정하였고, 효소액 및 검액 대신 정제수 120㎕를 넣어 검액과 같은 방법으로 조작하여 얻은 액을 색보정액으로 하여 흡광도 D를 측정하였으며 하기 수학식 5에 사용하였다.
8-3. 후박 추출물 및 이로부터 분리된 화합물의 흡광도 측정
상기 실험예 8-1에서 만든 완충액 60㎕에 기질액 20㎕, 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 또는 실시예3의 4-O-메틸호노키올 시료 100㎕를 넣어 섞은 뒤, 효소액 20㎕를 넣어 흔들어 섞어 25℃에서 15분간 반응시켜, p-니트로아닐린의 생성량을 410nm에서 흡광도 B로 측정하였고, 완충액 60㎕에 기질액 20㎕, 정제수 20㎕, 시료 100㎕를 넣어 위와 같은 방법으로 조작하여 얻은 액을 대조액으로 하여 흡광도 C를 측정하였으며, 하기 수학식 5를 이용하여 엘라스타제 저해율을 구하였고, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
엘라스타제 저해율(%) = [1-{(B-C)/(A-D)}]×100
A:실험예 8-2의 흡광도 A
B:실험예 8-3의 흡광도 B
C:실험예 8-3의 흡광도 C
D:실험예 8-2의 흡광도 D
시료 엘라스타제 저해율(%)
실시예 1의 hc-1 10ug/ml 15.9
실시예의 1hc-1 50ug/ml 33.5
실시예의 1hc-1 100ug/ml 48.8
실시예 2의 hc-2 10ug/ml 39.7
실시예 2의 hc-2 25ug/ml 54,8
실시예 2의 hc-2 50ug/ml 59.0
실시예 3의 4-O-메틸호노키올 10ug/ml 41.3
실시예 3의 4-O-메틸호노키올 25ug/ml 60.6
실시예 3의 4-O-메틸호노키올 50ug/ml 65.7
실험결과, 상기 표 12에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 및 실시예 3의 4-O-메틸호노키올은 엘라스타제 저해율이 약 15.9 내지 65.7%로 높은 엘라스타제 저해 효과를 나타내었으며, 특히 실시예 3의 4-O-메틸호노키올은 65.7%로 가장 높은 엘라스타제 저해 효과를 보였다. 따라서 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 및 실시예 3의 4-O-메틸호노키올은 엘라스타제를 저해하여 주름 생성을 억제하는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 9. MMP-1 mRNA 발현 저해 효과
MMP-1 mRNA 발현 저해 효과를 측정함으로써 후박 추출물 및 이로부터 분리된 화합물이 주름 생성을 억제하는데 효과가 있는지 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
소혈청 10%를 함유한 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, 깁코)을 사용한 배지를 사용하여 사람 섬유아세포(ATCC 2076)를 1x106 cells/ml의 농도로 60mm 디쉬에 접종한 다음, 24시간 후에 PBS로 교체하여 UVA 6J를 조사한 후 혈청이 없는 배지로 교체하여, 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 또는 실시예 3의 4-O-메틸호노키올를 1, 5 또는 10ug/ml로 첨가하여 하루 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 다음, 세포의 배지를 제거하였고, 트리졸 (Trizol; 인비트로젠 사) 1ml를 첨가하여 인비트로젠 사의 RNA 분리법(Chromczynski, P., and Sacchi, N. Anal. Biochem. 162, p156, 1987.)에 따라 RNA를 분리하였고, 자외선 검출기를 이용하여 260nm에서 RNA 양을 정량한 후, 올인원 역전사 중합 반응 키트 (All-in-one RT-PCR kit; 수퍼바이오 사)를 사용하여 역전사 중합 반응(Reverse transcription - polymerase chain reaction)을 실시하여 프라이머와 반응 조건은 하기 표 13에 나타내었고, 올인원 역전사 중합 반응 키트의 매뉴얼(Gibbs, R.A. Anal. Chem., 62(13), p1202, Jul 1, 1990)에 따라 실험하여 액틴에 대해 보정한 값으로 MMP-1의 발현 정도를 나타내었고, 그 결과를 하기 표 14에 나타내었다.
MMP-1 프라이머 센스(sense) 5'-TGGGAGCAAACACATCTGA-3' (서열번호 7)
안티센스
(antisense)		 5'-ATCACTTCTCCCCGAATCGT-3' (서열번호 8)
반응 조건 50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화 시킨 후, 94℃ 1분, 48℃ 1분, 72℃ 1분간 29회 중합 반응
액틴 프라이머 센스(sense) 5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3' (서열번호 5)
안티센스
(antisense)		 5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3' (서열번호 6)
반응 조건 50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화 시킨 후, 94℃ 1분, 62℃ 1분, 72℃ 1분간 22 회 중합 반응
시료 MMP-1 발현정도
(%, 액틴에 대해 보정한 값)
대조군 69.9
UVA 100
UVA + 실시예 1의 hc-1 1ug/ml 101.7
UVA + 실시예 1의 hc-1 5ug/ml 90.8
UVA + 실시예 1의 hc-1 10ug/ml 76.5
UVA + 실시예 2의 hc-2 1ug/ml 90.2
UVA + 실시예 2의 hc-2 5ug/ml 81.3
UVA + 실시예 2의 hc-2 10ug/ml 71.1
UVA + 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 1ug/ml 88.4
UVA + 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 5ug/ml 70.9
UVA + 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 10ug/ml 66.1
UVA + EGCG 25uM 74.3
실험결과, 상기 표 14에 나타난 바와 같이, UVA로 MMP-1의 발현을 유도한 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 및 실시예3의 4-O-메틸호노키올은 농도의존적으로 MMP-1 활성저해효과를 나타내었으며, 특히 실시예 3의 4-O-메틸호노키올은 10ug/ml에서 66.1%가 발현됨으로써 가장 높은 MMP-1 활성저해효과를 보였다. 따라서 실시예 1의 hc-1, 실시예 2의 hc-2 및 실시예3의 4-O-메틸호노키올은 MMP-1의 활성을 저해하여 주름 생성을 억제하는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
하기에 상기 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 유연 화장수(스킨)의 제조
후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유한 화장료 중 화장수(스킨로션)의 제제예를 하기 표 15에 나타내었다.
번호 원 료 제형예 1 비교제형예 1
1 실시예 1의 hc-1 1.0 -
2 부틸렌글리콜 4.0 4.0
3 글리세린 8.0 8.0
4 카르복시비닐폴리머 0.06 0.06
5 디소듐 에틸렌디아민테트라아세틱에시드 0.01 0.01
6 에탄올 7.0 7.0
7 트리에탄올아민 0.2 0.2
8 하이드로지네이티드 캐스터 오일 0.4 0.4
9 페닐트리메티콘 3.5 3.5
10 파라옥시안식향산프로필 0.2 0.2
11 파라옥시안식향산메틸 0.2 0.2
12 정제수 잔량 잔량
계 100.0 100.0
제제예 2. 영양화장수(로션)의 제조
후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유한 화장료 중 영양로숀의 제제예를 하기 표 16에 나타내었다.
번호 원 료 제형예 2 비교제형예 2
1 실시예 1의 hc-1 1.0 -
2 스테아린산 1.0 1.0
3 세틸알콜 1.0 1.0
4 글리세릴모노스테아레이트 1.0 1.0
5 폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트 1.0 1.0
6 솔비탄세스퀴올레이트 1.0 1.0
7 유동파리핀 4.0 4.0
8 스쿠알란 3.0 3.0
9 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0 4.0
10 카르목시비닐폴리머 0.1 0.1
11 부틸렌글리콜 5.0 5.0
12 트리에탄올아민 0.2 0.2
13 파라옥시안식향산프로필 0.2 0.2
14 파라옥시안식향산메틸 0.2 0.2
15 정제수 잔량 잔량
계 100.0 100.0
제제예 3. 영양크림의 제조
후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유한 화장료 중 영양크림의 제제예를 하기 표 17에 나타내었다.
번호 원 료 제형예 3 비교제형예 3
1 실시예 1의 hc-1 1.0 -
2 스테아린산 2.0 2.0
3 세틸알콜 2.0 2.0
4 글리세릴모노스테아레이트 2.0 2.0
5 폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트 0.5 0.5
6 솔비탄세스퀴올레이트 0.5 0.5
7 글리세릴모노스테아레이트/글리세릴테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트 1.0 1.0
8 왁스 1.0 1.0
9 유동파리핀 4.0 4.0
10 스쿠알란 4.0 4.0
11 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0 4.0
12 카르복시비닐폴리머 0.3 0.3
13 부틸렌글리콜 5.0 5.0
14 글리세린 3.0 3.0
15 트리에탄올아민 0.5 0.5
16 파라옥시안식향산프로필 0.2 0.2
17 파라옥시안식향산메틸 0.2 0.2
18 정제수 잔량 잔량
계 100.0 100.0
제제예 4. 맛사지 크림의 제조
후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유한 화장료 중 맛사지 크림의 제제예를 하기 표 18에 나타내었다.
번호 원 료 제형예 4 비교제형예 4
1 실시예 1의 hc-1 1.0 -
2 밀납 10.0 10.0
3 폴리솔베이트 60 1.5 1.5
4 솔비탄세스퀴올레이트 0.8 0.8
5 유동파라핀 40.0 40.0
6 스쿠알란 5.0 5.0
7 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0 4.0
8 부틸렌글리콜 3.0 3.0
9 프로필렌글리콜 3.0 3.0
10 트리에탄올아민 0.2 0.2
11 방부제 0.4 0.4
12 색소 0.001 0.001
13 향료 0.1 0.1
14 정제수 잔량 잔량
계 100.0 100.0
제제예 5. 에센스의 제조
후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유한 화장료 중 영양 에센스의 제제예하기 표 19에 나타내었다.
번호 원 료 제형예 5 비교제형예 5
1 실시예 1의 hc-1 1.0 -
2 시토스테롤 1.70 1.70
3 폴리글리세릴 2-올레이트 1.50 1.50
4 세테아레스-4 1.2 1.2
5 콜레스테롤 1.5 1.5
6 디세틸포스페이트 0.4 0.4
7 농글리세린 5.0 5.0
8 카르복시비닐폴리머 0.2 0.2
9 산탄검 0.2 0.2
10 방부제 0.4 0.4
11 향료 0.1 0.1
12 정제수 잔량 잔량
계 100.0 100.0
제제예 6. 친수성 연고제의 제조
번호 원 료 함량(중량%) 함량(중량%)
1 실시예 3의 4-O-메틸호노키올 0.5 -
2 백색 바세린 250 250
3 스테아릴 알콜 220 220
4 에칠(또는 메칠)p-옥시벤조에이트 0.25 0.25
5 프로필렌 글리콜 120 120
6 라우릴 황산 나트륨 15 15
7 프로필 p-옥시벤조에이트 0.15 0.15
임상 실험예 1. 항염증 효과
후박추출물 및 이로부터 분리된 화합물의 항염증 효과를 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
마우스 좌측 귀를 대조부위, 우측 귀를 에탄올로 귀를 깨끗하게 세척하고 시료(상기 제형예 1 내지 5 및 비교제형예 1 내지 5)를 20㎕씩 1일 1회 4일간 지속적으로 도포하고 마지막 도포 1시간 후에 좌측 귀에 에탄올을, 우측 귀에는 아라키돈산(Arachidonic acid)을 2㎎/ear을 도포하여 1시간 후 귀의 부종(ear edema)정도를 마이크로미터로 양쪽 귀를 3회씩 반복 측정하여 아라키돈산(Arachidonic acid) 처리군을 기준으로 하기 수학식 6을 이용하여 항염억제 효과를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 21에 나타내었다.
염증 억제율(%) = (A?B) / A × 100
A : 대조군귀의 평균 두께(아라키돈산 처리귀의 두께-처리 전 귀의 두께)
B : 시료도포군 귀의 두께(시료처리귀의 두께-처리 전 귀의 두께)
시료 농도(%) 용매 귀두께(㎛) 염증
억제율(%)
시료처리전 시료처리후
아라키돈산 - 에탄올 284 481 -
인도메타신 1 에탄올 276 342 66.50
1 제제예1의 제형예1 100 에탄올 280 379 49.75
2 제제예1의 비교제형예1 100 에탄올 283 479 0.51
3 제제예2 의 제형예2 100 에탄올 277 381 47.21
4 제제예2 의 비교제형예2 100 에탄올 283 467 6.60
5 제제예3의 제형예3 100 에탄올 270 335 67.01
6 제제예3 의 비교제형예3 100 에탄올 275 454 9.14
7 제제예 4의 제형예4 100 에탄올 266 349 57.87
8 제제예4의 비교제형예4 100 에탄올 279 463 6.60
9 제제예5의 제형예5 100 에탄올 288 358 64.47
10 제제예5 의 비교제형예5 100 에탄올 277 458 8.12
실험결과, 상기 표 21에 나타난 바와 같이, 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 원료로 만들어진 화장품들은 47.21 내지 67.01%로 그렇지 않은 제품이 0.51 내지 9.14%인 것과 비교하여 염증 억제 효과가 탁월히 뛰어나다는 사실을 확인할 수 있었다.
임상 실험예 2. 피부자극 시험
후박추출물 및 이로부터 분리된 화합물의 피부자극을 시험하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
제형 및 소디움라우릴설페이트 0.08% 수용액을 건강한 성인 남, 여 50명을 대상으로 등 부위에 각 시료(상기 제형예 1 내지 5 및 비교제형예 1 내지 5)의 일정량(0.2g)을 24시간 첩포한 후 핀챔버를 제거하고 4시간 경과한 다음 육안으로 피부상태 변화를 판독하고, 하기 수학식 7을 이용하여 자극도를 구하여 그 결과를 하기 표 22에 나타내었다.
자극도 ＝ [{(+-)수× 1} + {(+)수× 2} + {(++)수× 3}]/ 피시험자 수
시 료 피시험자수 판정결과 자극도
++ + +- -
소디움라우릴설페이트0.08% 50 1 5 12 32 0.50
제제예1의 제형예1 + 소디움라우릴설페이트0.08% 50 0 2 5 43 0.18
제제예1의 비교제형예1 + 소디움라우릴설페이트0.08% 50 1 4 10 35 0.42
제제예2 의 제형예2 + 소디움라우릴설페이트0.08% 50 0 2 6 42 0.2
제제예2 의 비교제형예2 + 소디움라우릴설페이트0.08% 50 1 2 13 34 0.40
처방예 3의 제형예3 + 소디움라우릴설페이트0.08% 50 0 1 6 43 0.16
제제예3 의 비교제형예3 + 소디움라우릴설페이트0.08% 50 1 3 5 41 0.28
제제예4의 제형예4 + 소디움라우릴설페이트0.08% 50 0 1 8 41 0.2
제제예4의 비교제형예4 + 소디움라우릴설페이트0.08% 50 0 6 10 34 0.44
제제예5의 제형예5 + 소디움라우릴설페이트0.08% 50 0 2 3 45 0.14
제제예5 의 비교제형예5 + 소디움라우릴설페이트0.08% 50 1 1 10 39 0.30
- ; 홍반이나 특이한 현상 없음
+- ; 주위보다 약간 붉어짐
+ ; 주위보다 현저히 붉어짐
++ ; 주이보다 심하게 붉어지고 부풀어 오름
실험결과, 상기 표 22에 나타난 바와 같이, 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 원료로 만들어진 화장품들은 자극도가 0.14 내지 0.2로 그렇지 않은 제품이 0.51 내지 9.14인 것과 비교하여 피부 자극도가 훨씬 작다는 사실을 확인할 수 있었다.
임상 실험예 3. 주름 깊이 감소에 의한 피부 탄력도 개선 효과 측정
후박추출물 및 이로부터 분리된 화합물의 피부 탄력도 개선 효과를 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
제제예 3의 제형예 3을 여성 20명씩 2그룹으로 나누어 왼쪽 눈 가장자리에 하루 동안 세안 후 아침, 저녁 두 번 적용하였고, 대조군은 영양크림을 오른쪽 눈 가장자리에 처리하여 적용 15일, 30일 후 피부 표면의 피부 주름 깊이를 큐토미터(Cutometer) SEM 474에 의해 측정하였고, 이것은 주름의 깊이를 측정하는 것으로서, 값이 적을수록 탄력성이 좋은 것임을 나타내며 피검자 20명의 평균값을 하기 표 23에 나타내었다.
시 료 주름 깊이(%)
0일 15일 30일
제제예 3의 제형예 3 0.51 0.43 0.29
대조군 0.49 0.46 0.40
실험결과, 상기 표 23에 나타난 바와 같이, 제제예 3의 제형예 3을 원료로 만들어진 화장품은 시간이 흐를수록 주름 깊이를 감소시킴으로써 피부 탄력을 개선시키는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
임상 실험예 4. 피부 상태 개선효과 확인 실험
제제예 5의 제형예 5를 이용하여 만든 에센스에 대한 피부상태 개선효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
36~69세의 건강한 여성층으로서 30명씩 2그룹으로 나누어 안면 왼쪽 부분에는 제제예 5의 제형예 5 에센스를, 안면 오른쪽 부분에는 대조군의 에센스를 매일 아침, 저녁 세안 후 피부에 1일 2회 4주간 도포한 후 하기 표 24의 평점법을 이용하여 30명의 평균점으로 피부상태 개선 정도를 측정하여, 하기 표 25에 나타내었다.
(가)피부의 탄력, 늘어짐에 대한 개선 효과의 평점
대단히 개선되었다 3점
개선되었다 2점
약간 개선되었다 1점
개선효과가 없다 0점
악화되었다 -1점
(나)주름, 잔주름에 대한 개선 효과의 평점
대단히 개선되었다 3점
개선되었다 2점
약간 개선되었다 1점
개선효과가 없다 0점
악화되었다 -1점
시료 (가) 피부의 탄력, 늘어짐 (나) 주름, 잔주름
제제예 5 (제형예 5) 79 82
대조군 40 41
실험결과, 상기 표 25에 나타난 바와 같이, 제제예 5의 제형예 5를 이용하여 만든 에센스는 피부 개선 효과가 79 내지 82점으로 40 내지 41점인 대조군과 비교하여 훨씬 뛰어난 피부 개선 효과가 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 후박 추출물 및 이로부터 분리된 화합물은 iNOS 활성 저해 효과, iNOS, COX2 유전자 발현 저해효과, PGE2, IL-6, IL-8 생성억제 효과, 항히스타민 활성 증진, 엘라스타제 저해 효과 및 MMP-1 발현 저해 효과를 나타내므로 항염, 항알러지 및 주름 개선용 피부외용 약학조성물 및 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
<110> bioland <120> composition comprising an extract of Magnolia officinalis Rehd. et Wils. or 4-O-methylhonokiol isolated therefrom having anti-inflammation, anti-allergy and anti-wrinkle activity <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for iNOS <400> 1 cagttctgcg cctttgctca t 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for iNOS <400> 2 ggtggtgcgg ctggacttt 19 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for COX2 <400> 3 ctgaagccca ccccaaac 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for COX2 <400> 4 aacccaggtc ctcgcttatg 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for actin <400> 5 gagaccttca acaccccagc c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for actin <400> 6 ggccatctct tgctcgaagt c 21 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for MMP-1 <400> 7 tgggagcaaa cacatctga 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for MMP-1 <400> 8 atcacttctc cccgaatcgt 20

Claims (8)

  1. 후박(Magnolia officinalis Rehd. et Wils.) 줄기껍질의 물 및 에탄올 혼합용매 가용 조추출물 또는 헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트로부터 선택된 용매에 가용한 비극성 용매 가용 추출물 또는 이로부터 분리된 하기 화학식(Ⅰ)로 표기되는 4-O-메틸호노키올(4-O-methylhonokiol)을 유효성분으로 함유하는 항염, 항알러지 및 주름 개선용 피부외용 약학 조성물.
    Figure 112011053015235-pat00002
  2. 삭제
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  7. 후박(Magnolia officinalis Rehd. et Wils.) 줄기껍질의 물 및 에탄올 혼합용매 가용 조추출물 또는 헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트로부터 선택된 용매에 가용한 비극성 용매 가용 추출물 또는 이로부터 분리된 하기 화학식(Ⅰ)로 표기되는 4-O-메틸호노키올(4-O-methylhonokiol)을 유효성분으로 함유하는 항염, 항알러지 및 주름 개선용 화장료 조성물.
  8. 삭제
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