KR20160121074A - 만형자 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부미백 및 피부노화 방지용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 만형자 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 피부노화의 치료 및 예방용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 추출물은 DPPH 자유 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 양이온 소거능 저해활성, 크산틴 옥시다제(Xanthine oxidase) 저해활성 등의 항산화효과; 높은 세포 생존률; 티로시나제 (Tyrosinase) 저해활성, 세포내 티로시나제(Cellular tyrosinase) 저해활성, 멜라닌(melanin) 생합성 저해 활성, 미백과 관계되어진 티로시나제(tyrosinase) 단백질 발현억제 등의 미백활성; 엘라스타제 (Elastase) 저해활성, 섬유아 세포의 생존율증가, 프로-콜라게나제(pro-collagenase) 저해활성, ,세포내 항노화 관련 단백질 발현억제실험 등을 통한 주름개선효과 등을 확인하여 미백 및 피부노화 치료 및 예방용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

만형자 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부미백 및 피부노화 방지용 조성물 {A composition comprising an seed extract of Vitex trifolia L. for skin whitening and anti-aging activity}

본 발명은 만형자 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부미백 및 피부노화 방지용 조성물에 관한 것이다.

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현대인들은 자외선, 스트레스 등의 여러 가지 내외적인 요인에 의해 각종 피부 트러블 유발로 기미, 주근깨, 피부 색소 침착 등의 피부 노화 현상을 촉진한다(1. Voegeli, R. 1996. Elastase and typtase determination on human skin surface. Cosmetic &Toiletries. 111, 51-58.). 피부의 색소 침착은 멜라닌 색소의 생합성에서 tyrosinase 효소를 비롯하여 DHICA oxidase(TRP-1)등의 L-tyrosine을 DOPA(3,4-dihydroxyphenyla-lanine)으로 DOPA에서 DOPA quinone으로 초기반응을 조절하는 것으로 알려져 있다(2. Aroca, P., et al. 1993. Melanin biosynthesis patterns of following hormonal stimulation. J. Biol Chem 268, 25650-25655.). 이를 바탕으로 티로시나제(tyrosinase) 효소의 활성을 저해하여 멜라닌 생합성의 억제에 영향을 미칠 수 있는 천연물 탐색에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 결과 어성초 추출물을 이용하여 티로시나제(tyrosinase) 유전자 발현 억제 효과(3. Chin, J. E., et al. 2005. Effects of Houttuynia cordata extracts on tyrosinse gene expression. J. Korean Soc Food Sci Nutr 34, 1284-1288.) 등 천연물을 활용한 연구가 활발히 이뤄지고 있다. 그 외 현재 알려져 있는 항산화 및 미백원료는 아르부틴(Arbutin), 코지산(Kojic acid), 아스코르브산(Ascorbic acid) 등의 물질이 대표적이고 상백피, 닥나무, 감초 등의 식물 추출물이 널리 알려져 있다.

환경의 파괴로 인한 자외선 증가 및 각종 산화성 물질의 증가는 피부 손상과 단백질의 합성능 저하를 유발할 수 있다. 이러한 피부 세포의 손상이나 기능 저하는 피부 탄력의 감소, 피부 주름살의 증가, 기미와 주근깨 생성 등 피부 미용에 치명적인 현상들을 유발한다. 피부 탄력성은 진피조직의 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 히알루론산(hyaluronic acid) 등에 의해 유지되며, 콜라겐(collagen)을 합성하는 섬유아세포(fibroblast)는 핵심적인 역할을 한다(Oikarinen A, Karvonen J, Uitto J, Hannuksela M., Connective tissue alterations in skin exposed to natural and therapeutic UV-radiation. Photodermatol. 2(1), pp.15-26, Review, 1985. ). 섬유아세포 기능은 각종 성장인자(growth factor) 뿐만 아니라 케라티노사이트(keratinocyte)나 멜라노사이트(melanocyte)와 같은 피부 세포들에서 분비되는 싸이토카인(cytokine)에 의해서도 조절된다(Hirobe T., Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Res. 18(1), pp.2-12. Review, 2005;McKay IA, Leigh IM., Epidermal cytokines and their roles in cutaneous wound healing. Br J Dermatol . 124(6), pp.513-8, Review, 1991. ). 정상적인 상태에서 유리되는 케라티노사이트의 TGF-β, TβRII, SGad3는 피부 섬유아세포(dermal fibroblast)로 부터 프로콜라겐(procollagen), 피브릴린(fibrillin-1), tropoelastin의 발현을 증가시켜 콜라겐 생성을 증가시키며, MMPs의 발현을 억제하여 콜라겐 분해를 억제하는 것으로 보고되었다(Kim HH, Cho S, Lee S, Kim KH, Cho KH, Eun HC, Chung JH., Photoprotective and anti-skin-aging effects of eicosapentaenoic acid in human skin in vivo. J Lipid Res . 47(5),pp.921-30, 2006; Medina A, Ghaffari A, Kilani RT, Ghahary A., The role of stratifin in fibroblast-keratinocyte interaction. Mol Cell Biochem . 305(1-2), pp.255-64, Review, 2007)UV에 의해 케라티노사이트가 손상되면 TGF-β(transforming growth factor) 외에도 TNF-α(tumor necrosis factor), PGE₂ (prostaglandin E₂), α-MSH(melanocyte stimulating hormone), GSF(granulocyte stimulating factor), IL-1(interleukin-1), IL-6, IL-8, IL-10 등의 유리가 유발한다(문헌 6] Wang XJ, Han G, Owens P, Siddiqui Y, Li AG., Role of TGF beta-mediated inflammation in cutaneous wound healing. J Investig Dermatol Symp Proc . 11(1), pp.112-7, Review, 2006; Traidl-Hoffmann C, MI, Ring J, Behrendt H., Impact of desloratadine and loratadine on the crosstalk between human keratinocytes and leukocytes: Implications for anti-inflammatory activity of antihistamines. Int Arch Allergy Immunol . 140(4), pp.315-20, 2006.). 이중 α-MSH와 PGE₂는 멜라노사이트를 자극하여 멜라닌 생성을 촉진하여, 이 멜라닌은 피부 세포의 항산화 작용을 증강시켜 피부세포가 자외선으로 인해 손상되는 것을 방어하게 한다(Cannon JG, Tatro JB, Reichlin S, Dinarello CA., Alpha melanocyte stimulating hormone inhibits immunostimulatory and inflammatory actions of interleukin 1. J Immunol . 137(7), pp.2232-6, 1986.). IL-1, TNF-α(tumor necrosis factor) 등은 fibroblast에 작용하여 procollagen 발현을 억제하며, MMP-1 (martrix metalloproteinase-1), MMP-2, MMP-3, 히알루로니다아제(hyaluronidase)등의 활성을 증가시켜 콜라겐 분해를 촉진하게 된다( Yamamoto T, Eckes B, Mauch C, Hartmann K, Krieg T., Monocyte chemoattractant protein-1 enhances gene expression and synthesis of matrix metalloproteinase-1 in human fibroblasts by an autocrine IL-1 alpha loop. J Immunol . 164(12), pp.6174-9, 2000;Dai G, Freudenberger T, Zipper P, Melchior A, Grether-Beck S, Rabausch B, de Groot J, Twarock S, Hanenberg H, Homey B, Krutmann J, Reifenberger J, Fischer JW., Chronic ultraviolet B irradiation causes loss of hyaluronic acid from mouse dermis because of down-regulation of hyaluronic acid synthases. Am J Pathol . 171(5), pp.1451-61, 2007. 9-10). 또한, UV에 의해 직접적으로 섬유아세포 (fibroblast)가 상해를 받는 경우에도 콜라겐 관련 유전자는 억제되고 분해에 관련되는 MMPs류 발현은 촉진되어 주름살은 증가하게 된다. 따라서, 진피 섬유아세포 (dermal fibroblast)의 증식과 콜라겐 합성을 증가시키거나, MMPs을 억제하는 것은 주름살의 생성을 억제하는 수단이 될 수 있다.

최근 들어, 미백, 노화방지, 피부개선, 항암 및 항균 등 복합 기능성을 가진 화장료로써 한약재는 제품 유형과 제형에 관계없이 다양하게 이용되어지고 있으며, 화장품에 천연물을 직접 이용한 것은 1973년 아모레 퍼시픽이 인삼을 주원료로 한 진생상미라는 제품을 선보인 것이 원조라 할 수 있고 이 후 산삼, 홍삼, 감초, 녹두, 흑두한란, 단풍잎, 대나무, 닥나무, 주목(朱木), 귤나무, 오가피, 야자수, 생강, 영지버섯, 녹차, 우엉, 뽕나무 등 다양한 식물자원으로부터 효능 성분을 추출하여 화장품 개발에 적극적으로 활용하고 있으며, 소재개발로 이루어지고 있으며, 현재 세계 화장품 시장 규모 05년 약 2,500억불에서 매년 10% 성장세를 보이고 있으며, 단순미용에서 질병치료 개념으로 진화, 고기능 다기능성으로 확대, 한방화장품 시대로 변화고 있는 상황이며, 천연 기능성 소재의 세계시장 규모는 연간 판매액 150억 달러에 달하며 최근 매년 평균 10% 이상의 성장률을 보이고 있다. 피부 천연물 소재의 개발 시 세계적으로 연간 1조 원～2조 원의 매출과 매출의 20 ～ 50%의 순이익 창출이 가능할 것으로 예상됩니다.

특히, 주름개선 화장품의 원료개발에 있어 한방에 대한 연구는 우리 전통의학에 기반을 둔 원료개발이라는 점과 우리나라 소비자들의 화장품 선호도와 맞물려 국내 화장품 개발의 주력분야가 되고 있으며, 우리가 경쟁력을 확보할 수 있는 부분이므로 지속적인 개발이 필요하며, 기능성 화장품은 고기능성에 다기능성이 추가되는 방향으로 기술개발이 이루어지고 있으며, 이러한 기능성 소재와 관련 기술의 개발이 활발해질 것으로 예상됨. 피부재생 및 보호 효과가 우수한 한방재료를 이용한 제품화로 미용성형 및 필링 후 민감한 피부를 효과적으로 방어할 뿐만 아니라, 탁월한 피부재생 효과로 인한 기능성 화장품 또는 의약외품으로서의 가치를 지님으로서 상품화의 가치가 크고 피부 신약 개발은 임상 초기에 개발의 성공 여부를 신속하게 판단할 수 있어서 임상 후기 단계의 신약 실패에 따른 위험이 감소한다. 또한 피부질환은 신약개발에 대한 소요기간이 상대적으로 짧아서 개발 성과의 조기 가시화 및 빠른 투자 회수가 가능하므로 신약 개발의 새로운 패러다임 창출이 가능할 것이다.

현대인들은 자외선, 스트레스 등의 여러 가지 내외적인 요인에 의해 각종 피부 트러블 유발로 기미, 주근깨, 피부 색소 침착 등의 피부 노화 현상을 촉진한다(Voegeli, R. 1996. Elastase and typtase determination on human skin surface. Cosmetic &Toiletries. 111, 51-58.). 피부의 색소 침착은 멜라닌 색소의 생합성에서 tyrosinase 효소를 비롯하여 DHICA oxidase(TRP-1)등의 L-tyrosine을 DOPA(3,4-dihydroxyphenyla-lanine)으로 DOPA에서 DOPA quinone으로 초기반응을 조절하는 것으로 알려져 있다(Aroca, P., et al. 1993. Melanin biosynthesis patterns of following hormonal stimulation. J. Biol Chem 268, 25650-25655.; Jimenez-Cervantes C., et al. 1994. A new enzymatic function in the melanogenic pathway. J. Biol Chem 269, 17993-18001.; Paval, S. 1993. Dynamics of melanogenesis intermediates. J. Invest Dermatology 100, 162-165.).

피부는 시간이 지남에 따라 호르몬 분비가 감소하고, 면역세포의 기능 활성이 저하되어 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되어 생기는 내인성 노화와 외적으로 오염된 공기와 약물, 자외선에 의한 광노화로 나눠진다(Gilchrest BA (1990) Skin aging and photoaging. Dermatol Nurs, 2, 79-82;Ha TY (2006) Development of functional food materials for healthy life. Korean J Crop Sci , 51, 26-39).

노화가 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 collagen, elastin, hyaluronic acid 등 구조 단백질을 생성하는 능력이 감소하고 type-1 collagenase의 생합성이 증가하여 matrix metalloproteinase (MMPs)의 발현이 증가되면 진피 내 교원 섬유, 탄력 섬유, fibronectin 및 laminin과 같은 기질 단백질 분해를 유도하여 피부탄력을 떨어뜨리고 피부 주름생성을 야기한다(Brenneisen P, Sies H and Scharffetter-Kochanek K (2002)Ultraviolet-B irradiation and matrix metalloproteinases:from induction via signaling to initial events. Ann N Y Acad Sci 973: 31-43.). 최근 연구에 의하면 elastase가 피부 탄력성 섬유의 3차원적 뒤틀림에 중요한 역할을 한다고 보고 되어 있다(Philips N, Keller T, Hendrix C, Hamilton S, Arena R, Tuason M and Gonzalez S (2007) Regulation of the extracellular matrix remodeling by lutein in dermal fibroblasts, melanoma cells, and ultraviolet radiation exposed fibroblasts. Arch Dermatol Res 299: 373-379). Elastase의 활성 증가는 피부 탄력 섬유를 감소시켜 피부 주름 형성에 기여한다고 알려져 있으며 산화적 스트레스는 피부 노화를 더 촉진하게 된다(Emerit I (1992) Free radicals and aging of the skin. In Free Radicals and Aging. Emerit I,Chance B, eds. Experientia Supplementum, Birkhauser Basel, Basel, Switzerland. Vol 62, p 328-341). 피부 주름 개선 효과가 있는 다양한 소재 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 주름 개선으로 쓰이고 있는 물질로는 retinol, retinyl palmitate, adenosine, epigallocatechin gallate이 있다(Maeda K, Fukada M (1991) In vitro effectiveness of several whitening cosmetic components in human melanocytes. J Soc Cosmet Chem 42: 361-368).

만형자 (Vitex trifolia L.)는 마편초과의 순비기나무의 열매이다. 만형자의 기원 식물인 순비기나무는 독특하면서 강한 향기를 가지고 있어 예전부터 잎과 가지는 목욕용 재료나 실내의 습기를 제거하기 위한 흡습제 및 방매제로 사용하였으며, 종자인 만형자는 두통을 완화시키는 효과가 있다고 하여 민간에서는 베갯속으로 사용하였다. 또한 우리나라를 포함한 중국과 일본 등 동양의학에서 만형자는 성질이 차고 맛은 쓰면서 맵고 독이 없어 강장, 진정, 진통, 소염작용이 있어 감기, 만성중이염, 이명, 난청, 시력장애, 두통, 신경통, 습진 및 다양한 염증과 알러지성 질환의 치료에 사용하고 있다(Park JH and Lee CK (2000) The Encyclopedia of Medicinal Plants. Shinilbooks. 183~184, 248~249). 만형자에 관한 연구로는 monoterpene류를 포함한 약 76종의 정유성분과 골수성 백혈병 저해효과를 나타내는 flavonoids 와 식물생장을 조절하는 phenol 화합물 등이 분리 동정된 바 있다(Kang SS and Kim SJ (1994) Phytochemical Analysis of Viticis Fructus. Korean J. Pharmaco gn . 98: 214~220; Ono M, Sawamura H, Ito Y and Mizuki K (2000) Diterpenoids from the fruits of Vitex trifolia. Phytochemistry . 55(8): 873-87).

이에 본 발명자들은 만형자 추출물에 대하여 DPPH 자유 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 양이온 소거능 저해활성, 크산틴 옥시다제(Xanthine oxidase) 저해활성 등의 항산화효과; 높은 세포 생존률; 티로시나제 (Tyrosinase) 저해활성, 세포내 티로시나제(Cellular tyrosinase) 저해활성, 멜라닌(melanin) 생합성 저해 활성, 미백과 관계되어진 티로시나제(tyrosinase) 단백질 발현억제 등의 미백활성; 엘라스타제 (Elastase) 저해활성, 섬유아 세포의 생존율증가, 프로-콜라게나제(pro-collagenase) 저해활성, 세포내 항노화 관련 단백질 발현억제실험 등을 통한 주름개선효과 등을 확인하여 미백 및 피부노화 치료 및 예방용 조성물로 유용함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 만형자 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 피부노화의 치료 및 예방용 피부외용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 만형자 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 피부노화의 개선 및 예방용 화장료 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 만형자 추출물은 만형자의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 조추출물은 물, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 주정, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 함수부틸렌글리콜, 함수프로필렌글리콜, 함수글리세린으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 용매, 바람직하게는 물 또는 물 및 에탄올 혼합용매, 가장 바람직하게는 60% 내지 80% 에탄올 가용 추출물임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 비극성용매 가용 추출 분획물은 본원의 조추출물로부터 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 헥산, 또는 클로로포름 용매에 가용한 추출물만을 정제한 비극성 용매에 가용한 추출 분획물들을 포함한다.

본원에서 정의되는 극성용매 가용 추출물은 상기 조추출물로부터 비극성용매 가용분획물들을 제거하고 남은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 물 또는 부탄올, 보다 바람직하게는 부탄올에 가용한 추출 분획물을 포함한다.

본원에서 정의되는 "피부노화"는 주름살, 기미, 주근깨, 자외선에 의한 피부 손상, 피부암, 바람직하게는, 주름살 또는 기미를 포함한다.

상기 복합생약 추출물은 피부외용 약학조성물은 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%으로 포함함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 추출물들은 하기와 같은 제조방법으로 수득될 수 있다.

예를 들어, 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 만형자 추출물은 하기와 같이 제조될 수 있다. 건조된 만형자를 세척 및 세절 후 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 주정 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 주정 또는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 주정를 수회 섞은 다음에 30 내지 150, 바람직하게는 실온에서 12시간 내지 30일, 바람직하게는 1일 내지 7일 동안 초음파 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법 또는 환류추출법, 바람직하게는 상온 추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 본 발명의 조추출물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 조추출물, 바람직하게는 30 내지 90% 에탄올 조추출물 중량의 약 0.0005 내지 5배, 바람직하게는 0.05 내지 0.5배 부피 (v/w%)의 물을 가한 후, n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용한 통상적인 분획과정을 수행하여 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 등의 비극성 용매에 가용한 비극성 용매 가용 추출 분획물; 및 부탄올, 물 등의 극성용매에 가용한 극성용매 가용 추출 분획물을 수득할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 만형자 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백, 및 주름억제 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 제조방법에서 얻어지는 만형자 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백, 주름억제 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형을 포함한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형을 포함한다.

본 발명자들은 본 발명의 추출물에 대하여 DPPH 자유 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 양이온 소거능 저해활성, 크산틴 옥시다제(Xanthine oxidase) 저해활성 등의 항산화효과(실험예 1); 높은 세포 생존률(실험예 2); 티로시나제 (Tyrosinase) 저해활성, 세포내 티로시나제(Cellular tyrosinase) 저해활성 멜라닌(melanin) 생합성 저해 활성, 미백과 관계되어진 티로시나제(tyrosinase) 단백질 발현억제 등의 미백활성(실험예 3); 엘라스타제 (Elastase) 저해활성, 섬유아 세포의 생존율증가, 프로-콜라게나제(pro-collagenase) 저해활성, 세포내 항노화 관련 단백질 발현 억제를 통한 주름개선효과(실험예 4) 등을 확인하여 미백 및 피부노화 치료 및 예방용 조성물로 유용함을 확인하였다.

또한, 본 발명의 시료들은 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어 오던 약재로서 이들로부터 추출된 본 발명의 추출물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없으며, 피부 첩포 시험에서 무자극 시료임이 입증되었으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 피부외용 약학조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 복합생약 추출물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 미백 효과를 갖는 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 팩 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 dl-알파 토코페롤, 니코틴산 dl-알파 토코페롤비타민 E, dl-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 - 5 % 중량, 보다 바람직하게는 0.01 - 3 % 중량으로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 복합생약 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 추출물은 DPPH 자유 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 양이온 소거능 저해활성, 크산틴 옥시다제(Xanthine oxidase) 저해활성 등의 항산화효과; 높은 세포 생존률; 티로시나제 (Tyrosinase) 저해활성, 세포내 티로시나제(Cellular tyrosinase) 저해활성, 멜라닌(melanin) 생합성 저해 활성, 미백과 관계되어진 티로시나제(tyrosinase) 단백질 발현억제 등의 미백활성; 엘라스타제 (Elastase) 저해활성, 섬유아 세포의 생존율증가, 프로-콜라게나제(pro-collagenase) 저해활성, 세포내 항노화 관련 단백질 발현억제실험 등을 통한 주름개선효과 등을 확인하여 미백 및 피부노화 치료 및 예방용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1는 본 발명의 시료의 전자공여능 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 2는 본 발명의 시료의 ABTS 라디칼 소거활성 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 3는 본 발명의 시료의 크산틴-옥시다제에 대한 수퍼옥시드 음이온 라디칼 소거활성 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 4는 본 발명의 시료의 멜라노마 (B16F10)세포에 대한 세포 생존율에 미치는 영향을 나타낸 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 5는 본 발명의 시료의 티로시나제에 대한 억제활성을 나타낸 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 6는 본 발명의 시료의 멜라노마 (B16F10)세포에 대한 티로시나제 합성 억제 활성을 나타낸 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 7는 본 발명의 시료의 멜라노마 (B16F10)세포에 대한 멜라닌 합성 억제 활성을 나타낸 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄); 도 8는 본 발명의 시료(VR-EA)의 멜라노마 (B16F10)세포에서 MITF 단백질 발현 억제 활성을 나타낸 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, 세포는 5, 10, 25, 50 μg/ml 시료농도를 함유한 배지와 같이 배양하고, 개개 시료에서 MITF 단백질 수준은 β-액틴 (actin) 양으로 정상화하였고 동일한 열에서 상이한 윗첨자를 갖는 평균 수치는 유의적으로 상이함 p〈0.05);
도 9는 본 발명의 시료(VR-EA)의 멜라노마 (B16F10)세포에서 티로시나제 단백질 발현 억제 활성을 나타낸 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, 세포는 5, 10, 25, 50 μg/ml 시료농도를 함유한 배지와 같이 배양하고, 개개 시료에서 티로시나제 단백질 수준은 β-액틴 (actin) 양으로 정상화하였고 동일한 열에서 상이한 윗첨자를 갖는 평균 수치는 유의적으로 상이함 p〈0.05);
도 10는 본 발명의 시료의 엘라스타제에 대한 억제활성을 나타낸 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 11는 본 발명의 시료의 섬유아세포 (CCD-986sk)에 대한 세포생존율에 미치는 영향을 나타낸 도이며 (여기에서, 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 12는 본 발명의 시료의 콜라게나아제에 대한 억제활성을 나타낸 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 13는 본 발명의 시료(VR-EA)의 섬유아세포 (CCD-986sk)에서 MMP-1 단백질 발현 억제 활성을 나타낸 실험 결과를 나타낸 도이다 (여기에서, 세포는 5, 10, 25 μg/ml 시료농도를 함유한 배지와 같이 배양하고, 개개 시료에서 MMP-1 단백질 수준은 β-액틴 (actin) 양으로 정상화하였고 동일한 열에서 상이한 윗첨자를 갖는 평균 수치는 유의적으로 상이함 p〈0.05).

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: : 만형자 추출물 및 용매분획물의 제조

1-1. 조추출물 .

본 실험에 사용한 만형자는 (주)휴먼허브에서 직접 구입하였다. 건조한 만형자 3.0kg을 잘게 파쇄한 후 70% 에탄올 5L를 가하여, 상온에서 24시간 동안 3회 반복 추출하고, 추출 상층액을 여과한 후에 감압 농축 및 동결건조하여 건조 상태의 만형자 추출물 72.4g (VRE, 수율 2.4%)을 얻었다.

1-2. 유기용매 분획물

상기 만형자 조추출물 72.4g을 물 1L에 녹인 후, 헥산 2L, 에틸아세테이트 2L, 부탄올 2L로 순차적으로 분획하였다. 각 분획물을 농축 및 동결건조하여 최종적으로 헥산 분획물 6.5g (VR-H), 에틸아세테이트 분획물 (VR-EA) 12.1g, 부탄올 분획물 (VR-B) 15.6g, 물 분획물 10.2g (VR-W)을 수득하였다. 모든 건조 추출물 및 분획물들은 -4℃ 에 보관하고 필요한 농도로 녹여 사용하였다.

실험예 1. 항산화 효과 확인

1-1. 전자 공여능 (electron donating ability) 측정

상기 실시예 시료의 전자공여능을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 Blois의 방법을 변형하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Blois MS. (1958) Antioxidant determination by the use of a stable free radical. 26, 1199-1120.)

각 시료용액 2ml에 0.2mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 1ml 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

전자공여능 측정에 사용된 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)는 자체가 매우 안정한 free radical로서 517nm에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물이다. 자유라디칼은 인체 내에서 지질 또는 단백질등과 결합하여 노화를 일으키기 쉬운데 페놀성 화합물의 경우 자유라디칼을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 강해 인체 내에서 자유 라디칼에 의한 노화를 억제하는 척도로 이용할 수 있다. DPPH는 알코올 등의 유기용매에 매우 안정하며 항산화 기작 중 단백질 라디칼 소거제(proton radical scavenger)에 의하여 탈색되기 때문에 항산화 활성을 육안으로 쉽게 관찰할 수 있는 장점이 있어 다양한 천연소재로 항산화 물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다.

본 실험결과, 만형자 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물 10, 100, 1000μg/ml농도에서 DPPH free radical 소거활성을 도 1에서 나타내었다. 만형자 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물의 DPPH free radical 소거활성의 RC₅₀값을 표 1에 나타내었다. 만형자 분획물의 RC₅₀값은 에틸아세테이트(22.66μg/ml)〈부탄올(147.93μg/ml)〈물(219.50μg/ml)〈헥산(3419.14μg/ml)으로 만형자 에틸아세테이트에서 DPPH free radical 소거율이 높게 나타났다. 이는 에틸아세테이트 분획물 성분 중에 free radical 소거활성이 있는 유용성분이 함유되어 있는 것으로 생각된다.

DPPH free radical 소거활성

Sample	DPPH RC50 (μg/ml)
Vitamin C	3.52±047
Hexane fraction (VR-H)	3419.14±3.30
EtOAc fraction (VR-EA)	22.66±3.87
BuOH fraction (VR-B)	147.93±1.01
Water fraction (VR-W)	219.50±1.52

1-2. ABTS 라디칼 양이온 소거능 저해활성 측정

상기 실시예 시료의 ABTS 라디칼 양이온 탈색화(radical cation decolorization) 법에 의한 항산화 효능을 시험하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Roterta, R., P. Nicoletta, P. Anna, P. Ananth, Y. Min and R.E. Catherine. 1999. Antioxidant Activity Applying an Improved ABTS　Radical Cation Decolorization Assay. Radic . Biol . Med . 26, 1231-1237.)

ABTS 라디칼 소거능은 추출물들의 상대적인 항산화효과 측정인 hydrogen-donating antioxidant와 chain breaking antioxidant 모두를 측정할 수 있다.

또한 수상(aqueous phase) 모두에 적용이 가능하며 표준물질 사용으로 추출물의 상대비교가 가능하도록 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS+ free radical이 추출물속의 항산화 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한다. ABTS^＋ radical cation decolorization의 측정은 Pellegrin 등의 방법에 따라 측정하였다.

7mM ABTS {2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)}^＋ 5mL와 2.4mM K₂S₂O₈ 5mL를 혼합하여 실온에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+를 형성시킨 후, ethanol과 약 1:6 비율로 섞어 734nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7±0.002가 되도록 조절한 ABTS^＋ solution을 사용하였다. 각 시료용액 100 μl에 희석한 ABTS+ 용액 100 μl를 가하여 5분 동안 방치한 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.

ABTS radical cation 소거능은 2,2-azino-bis(3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS)와 potassium persulfate와의 반응으로 ABTS+radical이 생성되면 특유의 색인 청록색을 띄게 되며 hydrogen danating antioxidant와 chain breaking antioxidant 모두를 측정할 수 있다.

상기 실험 결과, 만형자 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물의 ABTS radical cation 소거활성의 RC₅₀값을 표 2에 나타내었다. 만형자 분획물의 RC₅₀값은 에틸아세테이트(13.69μg/ml)〈부탄올(219.47μg/ml)〈물(413.97μg/ml)〈헥산(2948.61μg/ml)으로 만형자 에틸아세테이트에서 ABTS radical cation 소거율이 높게 나타났다(도 2). 이는 에틸아세테이트 분획물 성분 중에 free radical 소거활성이 있는 유용성분이 함유되어 있는 것으로 생각된다.

ABTS radical cation 소거활성

Sample	ABTS RC50 (μg/ml)
Vitamin C	9.87±1.23
Hexane fraction (VR-H)	2948.61±1.91
EtOAc fraction (VR-EA)	13.69±2.47
BuOH fraction (VR-B)	219.47±0.90
Water fraction (VR-W)	413.97±3.47

1-3. 수퍼옥시드 음이온 라디칼(superoxide anion radical) 저해활성 측정

상기 실시예 시료의 수퍼옥시드 음이온 라디칼(superoxide anion radical) 저해활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 변형하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Stirpe F and Della Corte E. (1969) The regulation of rat liver xanthine oxidase. Conversion in vitro of the enzyme activity from dehydrogenase (type D) to oxidase (type O). J. Biol. Chem. 244(14), 3855-3863)

각 시료용액 0.1ml와 0.1M potassium phosphate buffer(pH 7.5) 0.6ml에 xanthine(2mM)을 녹인 기질액 0.2ml를 첨가하고 xanthine oxidase(0.2U/ml) 0.1ml를 가하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후 1N HCl 1ml를 가하여 반응을 종료시킨 다음에, 반응액 중에 생성된 uric acid의 양을 292nm에서 흡광도를 측정하였다. Xanthine oxidase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

수퍼옥시드 음이온 라디칼소거 능 측정은 크산틴 옥시다제(xanthine oxidase)가 크산틴(xanthine)을 기질로 하여 우릭산(uric acid)를 생성하는 과정에서 생성되는 수퍼옥시드 음이온 라디칼(superoxide anion radical)을 추출물과 반응시켜 소거능을 확인하는 방법이다.

본 실험 결과, 만형자 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물 10, 100, 1000μg/ml농도에서 수퍼옥시드 음이온 라디칼소거능을 측정하였다(도 3). 만형자 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물의수퍼옥시드 음이온 라디칼소거활성의 IC₅₀값을 표 3에 나타내었다. 만형자 분획물의 IC₅₀값은 에틸아세테이트(197.20μg/ml)〈부탄올(346.70μg/ml)〈헥산(756.30μg/ml)〈물(1487.10μg/ml)으로 만형자 에틸아세테이트에서 수퍼옥시드 음이온 라디칼소거율이 높게 나타났다. 만형자 분획물의 항산화능 측정결과, 에틸아세테이트 분획물이 대조 물질인 vit. c 와 비슷한 활성을 지니는 것을 확인하였으며, 이와 같은 결과로 만형자 에틸아세테이트 분획물이 가장 우수한 항산화능을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

수퍼옥시드 음이온 라디칼 소거능

Sample	Superoxide anion radical IC50 (μg/ml)
Vitamin C	7.30±0.92
Hexane fraction (VR-H)	756.30±1.30
EtOAc fraction (VR-EA)	197.20±3.87
BuOH fraction (VR-B)	346.70±5.90
Water fraction (VR-W)	1487.10±3.41

실험예 2. MTT assay에 의한 세포 생존능력 측정

상기 실시예 시료의 세포생존능을 확인하기 위하여 세포 생존률 측정은 Carmichael 등의 방법에 따라 측정하였다(Carmichael, J., W. G. DeGraff, A. F. Gazdar, J. D. Minna, and J. B. Mitchell. 1987. Evaluation of a tetrazolium based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosen- sitivity testing. Cancer Res . 47, 936-942.)

2-1. 세포 배양

B16F10 melanoma 세포는 Michikawa [Michikawa, M., K.T. Lim, J. G. McLarnon and S. U. Kim. 1994. Oxygen radical-induced neurotoxicity in spinal cord neuron cultures. J. Neurosci Res. 37, 62-70. 등의 방법에 따라 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin/ streptomycin (100U/ml)을 첨가한 dulbeco's modified eagle’s medium(DMEM) 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂ incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.

2.2. 적정 접종 세포수 결정

세포 생존율을 확인하기 위하여 96well plate에 5×10⁴cells/well이 되게 0.18ml 분주한 후 세포밀도를 1/2로 희석하면서 접종한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 4일간 배양하였다. 여기에 5mg/ml의 농도로 제조한 MTT (3-4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide) 용액 0.02ml를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고, 각 well당 DMSO 용액0.15ml를 가하여 30분간 교반한 뒤 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

2-3. 실험 과정

각 세포주[melanoma(B16F10), fibroblast(CCD-986sk) cell]을 96 well plate에 5×10³cells/well이 되게 0.18ml 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 0.02ml 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5mg/ml 농도로 제조한 MTT 용액 0.02ml를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 0.15ml를 가하여 실온에서 10분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다. 세포 독성 측정은 하기 수학식 1과 같이 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

세포 생존율을 확인하기 위한 MTT 검색법은 96 well plate를 사용하였으며, 검사결과를 ELISA reader(multiwell microplate reader)를 이용하여 많은 시료를 간단하게 판독할 수 있어 세포독성 및 세포증식 검색법으로서 널리 사용되고 있는 방법 중의 한 방법이다. 암세포의 경우 대사 과정에서 미토콘드리아의 탈수소 효소 작용에 의해 노란색 수용성 MTT tetrazolium을 자주색을 띠는 비수용성의 MTT formazan으로 환원시킨다. MTT formazan의 흡광도는 550nm 근처 파장에서 최대가 되며, 이는 대사적으로 왕성한 세포의 농도를 반영하는 것이다.

본 실험 결과, 만형자 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물에 의한 melanoma 세포의 생존율을 확인한 결과 도 4와 같이 대조군에 비해 5, 10, 25, 50μg/ml 농도에서 모두 80% 이상의 생존율이 나타났다. 이는 만형자 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물 모두 세포 독성이 없는 것으로 사료된다.

실험예 3. 미백 활성 실험

3-1. 티로시나제 저해활성

실시예에서 얻은 시료들의 티로시나제 (Tyrosinase) 저해활성을 시험하기 위하여 문헌에 개시된 Yagi 등의 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다 [Yagi A, Kanbara T and Morinobu N. (1986) The effect of tyrosinase inhibition for aloe. Planta Media. 3981, 517-519.]

반응구는 0.175M sodium phosphate buffer (pH 6.8) 0.5ml에 10mM L-DOPA를 녹인 기질액 0.2ml 및 시료용액 0.1ml의 혼합액에 mushroom tyrosinase (110U/ml) 0.2ml을 첨가하여 37℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475nm에서 측정하였다. Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

피부의 색조를 결정하는 주요한 인자인 melanin은 표피 기저층의 melanocyte라고 불리는 색소세포내의 melanosome에서 생합성 된다. 멜라닌을 합성하는데 있어서의 출발물질은 아미노산의 일종인 tyrosine이다. Tyrosine은 멜라닌 세포내에서의 tyrosinase에 의해 L-3,4-dihydroxyl phenylalanine(DOPA), DOPA quinone으로 산화된다. 그 후 DOPA quinone이 DOPA chrome, 5,6-dihydroxyindole, indole-5,6-quinone이 되고, 이어서 indole-5,6-quinone으로의 중합에 의해 멜라닌(melanin)을 생성하는 것으로 알려져 있다. 또한 tyrosinase는 피부 멜라닌 생성에 있어서 매우 중요한 역할을 하고 있으며, melanosome 내에서 tyrosine을 산화시켜 DOPA를 만드는 tyrosine hydoxylase로, DOPA를 산화시켜 DOPA quinone을 만드는 DOPA 옥시다제(oxidase)로서 작용하여 멜라닌 중합체를 합성하는데 중요한 효소로 작용하였다. 이렇게 피부 내에서 멜라닌 중합체 생합성을 효과적으로 저해할 수 있는 티로시나제(tyrosinase) 저해활성을 측정하기 위하여 mushroom유래의 tyrosinase 저해 활성 측정 결과는 도 5에 나타내었다.

만형자 분획물 10, 100, 1000μg/ml의 농도에서 에틸아세테이트 분획물이 40%의 저해율을 나타내어 가장 높은 저해능을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 만형자 분획물의 티로시나제 저해활성 IC₅₀값을 표 5에 나타난 결과, 에틸아세테이트(1089.93μg/ml)〈부탄올 (1609.10μg/ml)〈물 (2278.43 μg/ml)〈헥산 (4225.31μg/ml)로 만형자 에틸아세테이트 분획물의 티로시나제 저해 활성이 가장 뛰어난 것을 확인하였다.

티로시나제 저해활성

Sample	Tyrosinase IC50 (μg/ml)
Vitamin C	15.64±1.02
Hexane fraction (VR-H)	4225.31±1.21
EtOAc fraction (VR-EA)	1089.93±1.05
BuOH fraction (VR-B)	1609.10±5.90
Water fraction (VR-W)	2278.43±4.13

3-2. 세포내 티로시나제 저해활성

실시예에서 얻은 시료들의 세포내 티로시나제(Cellular tyrosinase) 저해활성을 시험하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다[Akiu S, Suzuki Y, Asahara T, Fujinuma Y and Fukuda M. (1991) Inhibitory effect of arbutin on melanogenesis-biochemical study using cultured B16 melanoma cells. Nippon Hifuka Gakkai Zasshi. 101(6), 609-613].

Melanoma(B16F10 ATCC) 세포를 각 culture dish에 가득 배양 한 후, 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. Lysis buffer(67mM sodium phosphate buffer, 1% triton X-100, 0.1mM phenylmethyl sulfonyfluoride)를 100μl 첨가한 후 얼음에 방치하여 세포를 파괴시키고, 세포를 수집하여 ultra sonication 하였다. 10분 동안 방치한 후 13,200rpm에서 20분간 원심분리 하여 얻어진 상층액을 효소용액으로 사용하였다. 이를 67mM phosphate buffer(pH6.8)에 녹인 8.0mM의 L-DOPA 120μl와 시료용액 40μl를 96-well plate에 넣은 후, 67mM phosphate buffer (pH 6.8)에 녹인 효소용액 40μl을 첨가하여 37℃에서 30분간 배양한 후, 생성된 DOPA chrome의 양을 490nm에서 측정하였다.

본 실험 결과, 만형자 분획물의 melanoma 세포에서의 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과, 도 6과 같이 나타내었다. Tyrosinase는 Cu^{2 +}와 결합한 효소로 동식물, 미생물 및 사람 등에 널리 분포되어 있는 polyphenol oxidase로 멜라닌 합성 과정에서 속도를 제한하는 등 멜라닌 합성의 주요한 조절적 단계를 나타내는 효소이다. 만형자 분획물의 경우 50μg/ml의 농도에서 에틸아세테이트 분획물이 38%의 저해효과를 나타내었으며, 대조물질인 vit. c 보다도 더 우수한 tyrosinase 저해 활성을 가짐을 확인 할 수 있었다.

3-3. 멜라닌( melanin ) 생합성 저해율

실시예에서 얻은 시료들의 피부 멜라노마 세포로부터의 멜라닌(melanin) 생합성 저해 활성을 시험하기 위하여 Hosoi 등의 문헌에 개시된 Melanoma cell(B16F10)에서의 멜라닌(melanin) 생합성 저해율 측정 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다 [Hosoi J. Abe E, Suda T and Kuroki T. (1985) Regulation of melanin synthesis of B16 mouse melanoma cells by 1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and retinoic acid. Cancer Res. 45(4), 1474-1478].

DMEM 배지로 배양된 멜라노마 세포(Melanoma cell, B16F10)를 100mm culture dish에 2×10⁶cell/dish가 되게 분주하고, 24시간 배양 후 시료를 농도별로 조제하여 2 ml 첨가하고, 48시간 후에 인산완충액 (pH 7.4)으로 세척하였다. 그 다음 0.25M trypsin-EDTA 용액으로 세포를 탈착한 후 수확한 세포를 1×10⁶세포 당 1ml의 5% TCA로 처리하고, 2,500rpm으로 2회 원심분리한 후 분리된 melanin을 인산완충액으로 세척한 뒤 ether:ethanol (1:3) 1ml를 가하여 2회 원심분리 한 후 ether 1ml로 세척 건조시켰다. Melanin에 1N NaOH를 1ml 가하여 80℃에서 1시간 반응시킨 후 분광 광도계 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. Melanin 생합성 저해는 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

사람의 피부색을 결정하는 가장 중요한 요인인 멜라닌(melanin)은 피부의 광노화나 일광각화증을 억제할 뿐만 아니라, 기미, 주근깨, 검버섯 등의 부분적인 hyperpigmentation을 일으키는 역할을 하고 있다. 멜라닌은 표피 기저층에 존재하는 melanocyte 내의 소기관인 melanosome에서 생합성되며, melanocyte의 수지상 돌기를 통하여 주위의 keratinocyte로 전달되고, 피부의 각질층으로 이행하였다. Melanosome 내에서의 melanin 생성과정은 tyrosine이 tyrosinase의 작용에 의해 DOPA, DOPA quinone으로 산화되고, 이들은 효소의 작용 및 자동산화 반응에 의해 DOPA chrome, indole carboxylic acid, indole quinone류 등으로 대사되어 최종적으로 melanin을 합성하였다. 상기의 색소 침착을 치유하기 위해 멜라닌 생성을 억제하는 hydroquinone, resorcinol 등의 페놀 유도체나, l-ascorbic acid와 그 유도체 및 kojic acid, arbutin, lactic acid, glucosamine, tunicamycin 등이 개발되었으나, 피부 저자극성이나 안정성에 문제가 있어 극히 제한된 양만 사용되고 있다.

본 실험 결과, 만형자 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물의 melanoma 세포에서의 멜라닌 생합성을 측정한 결과, 도 7과 같이 나타내었다. 대조군에 비해 만형자 에틸아세테이트 분획물의 경우 50 μg/ml의 농도에서 34%의 멜라닌 생합성을 나타내어 헥산, 부탄올, 물 분획물 중에 가장 우수한 효과를 나타내었다.

3-4. 세포내 미백관련 단백질 발현 양상 측정

실시예에서 얻은 시료들의 색소침착 효과를 알아보기 위하여 미백과 관계되어진 티로시나제(tyrosinase) 단백질의 양을 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Yamamura T, Onishi J and Nishiyama T. (2002) Antimelanogenic activity of hydrocoumarins in cultured normal human melanocytes by stimulating intracellular glutathione synthesis. Arch. Dermatol. Res . 294(8), 349-354.)

마우스흑색세포종(B16F10)을 이용하여 100mm tissue culture dish에 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. RIPA buffer 10ml에 complete mini 1 tab를 가하여 용해시킨 뒤, 4℃ 12,000rpm에서 20분간 원심 분리 하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 bradford assay로 정량하여 30μl의 단백질을 10%의 SDS-PAGE gel에서 전기 영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 semi dry transfer cell 기기 (Hofer, USA)를 이용하여 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer(5% skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing 하고 mouse anti-rabbit IgG HRP, bovine anti-goat IgG HRP의 각각의 2차 항체를 1:1,000로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 3회 washing한 뒤 LAS 4,000 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량 하였다.

본 실험 결과, 만형자 에틸아세테이트 분획물이 melanin 합성관련 MITF, tyrosinase, 단백질 발현에 미치는 영향을 도 8 및 도 9에 나타내었다. 만형자 에틸아세테이트는 MITF, tyrosinase 단백질 발현을 농도 의존적(5, 10, 25, 50 μg/ml)으로 억제하였다. 또한 미백제로 사용되고 있는 arbutin의 양성대조군(data not show)과 50μg/ml농도에서 비교한 결과 에틸아세테이트 MITF, tyrosinase의 단백질 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 이상의 결과, 만형자 에틸아세테이트 분획물은 tyrosinase 활성과 melanin 합성 억제효과를 갖고 있으며, 이러한 효과는 MITF 발현 억제를 통한 tyrosinase의 발현 감소를 확인하였다.

실험예 4. 주름 개선 효능 실험

4-1. 엘라스타제(Elastase) 저해활성 측정

실시예에서 얻은 시료들의 엘라스타제 (Elastase) 저해활성을 시험하기 위하여 카넬 (Cannell) 등을 응용하여 하기와 같이 실험하였다[Cannell RJP, Kellan SJ, Owsianks AM and Walker JM. (1988) Results of a large scale screen of microalgae for the production of protease inhibitors. Planta Media. 54(1), 10-14].

기질로서 n-succinyl-(L-Ala)₃-p-nitroanilide를 사용하여 37℃에서 20분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445nm에서 측정하였다. 즉, 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5ml씩 시험관에 취하고, 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase (2.5U/ml)용액 0.5ml을 가한 후 기질로 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 n-succinyl-(L-Ala)₃-p-nitroanilide (0.5mg/ml)을 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다. 엘라스타제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

인체의 중성구 과립구내에 존재하는 엘라스타제(elastase)는 진피 내 피부 탄력을 유지하는데 중요한 기질 단백질인 엘라스틴을 분해하는 효소이며, 다른 중요한 기질 단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비 특이적 가수분해 효소이다. 따라서 엘라스타제저해제는 피부 주름을 개선하는 작용을 나타내며, ursolic acid 등이 엘라스타제 저해제로 이용되고 있다. 또한 체내의 elastin을 분해하는 백혈구 과립 효소중의 하나로 이상조직에서는 그 효소의 활성이 극히 높아 조직 파괴에 직접적인 원인이 되어 피부의 주름 및 탄력성 소실을 유발하였다. 이러한 주름 생성과 관련된 엘라스타제 저해 활성을 만형자 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물 10, 100, 1000μg/ml농도에서 측정하였다.

본 실험 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이, 만형자 분획물의 IC₅₀값은 표 6에 나타낸 것과 같이 에틸아세테이트(1072.31μg/ml)〈헥산(4212.11μg/ml)〈물(4341.24μg/ml)〈부탄올(6485.23μg/ml)로 만형자 에틸아세테이트가 엘라스타제 저해활성이 가장 뛰어난 것을 확인하였다.

엘라스타제 저해활성

Sample	Elastase IC50 (μg/ml)
Vitamin C	746.80±1.60
Hexane fraction (VR-H)	4212.11±1.11
EtOAc fraction (VR-EA)	1072.31±2.01
BuOH fraction (VR-B)	6485.23±3.62
Water fraction (VR-W)	4341.24±1.81

4-2. 프로-콜라겐 생합성 측정

실시예에서 얻은 시료들의 프로-콜라겐(pro-collagen) 생합성에 미치는 영향을 시험하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다 [Kim JE. (2003) Effect of epigallocagechin-3-gallate on heat-modulated type Ⅰprocollagen, MMP-1, and TIMP-1 expression in cultured human dermal fibroblasts. Korea University. Seoul, Korea].

세포배양액내 콜라겐 생합성 정도는 procollagen type-ⅠC peptide(PIP) EIA kit(Takara)을 사용하여 propeptide의 양을 측정하였다.

CCD-986sk세포(ATCC)에 시료를 농도별로 처리했을 때 pro-collagen type Ⅰ의 합성양을 측정하기 위해 Procollagen Type-Ⅰ C-Peptide (PIP) EIA kit를 TAKARA Bio Inc. (Shiga, Japan)에서 구입하여 이용하였다. 96-well plate에 각 well당 1×10⁴ cells/well세포가 되도록 심어준 후 24시간을 안정화 하였다. 이렇게 실험한 세포의 배양액을 모아서 실험에 사용하였다. 세포배양액내 콜라겐 생합성 정도는 procollagen type-ⅠC peptide(PIP) EIA kit(Takara)을 사용하여 propeptide의 양을 측정하며, MMP-1의 측정은 amersham matrix metallproteinase-1, human, biotrak ELISA system(GE Healthcare)을 사용하여 측정하였다.

본 실험 결과, 선별된 만형자 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물에 의한 섬유아 세포의 생존율을 (도 11-Fig. 6)과 같이 확인하였다. 만형자 각각의 분획물을 5, 10, 15, 20, 25, 50μg/ml의 농도로 fibroblast 세포의 생존율을 확인한 결과, 대조군에 비해 25μg/ml 농도에서 헥산, 물 분획물의 경우 80%의 세포 생존율을 나타내었지만, 헥산 분획물의경우 50μg/ml의 농도에서도 60%에 가까운 독성을 나타내어 높은 세포 독성을 나타내었지만 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물의 경우 30%의 낮은 세포 독성을 나타내는 것을 확인하였다.

4-3. 콜라게나제 저해활성 측정

실시예에서 얻은 시료들의 콜라게나제(collagenase) 저해활성을 시험하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(WE and Heindrich HG. (1963) Zur quantitativen bestimmung der collagenase. Hoppe-Seyler's. Physiol. Chem. 333:149-151.)

반응구는 0.1M tris-HCl buffer (pH 7.5)에 4mM CaCl₂를 첨가하여, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (0.3mg/mL)를 녹인 기질액 0.25mL 및 시료용액 0.1mL의 혼합액에 콜라게나제 (collagenase; 0.2mg/mL) 0.15mL를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 6% citric acid 0.5mL을 넣어 반응을 정지 시킨 후, ethyl acetate 1.5mL을 첨가하여 320nm에서 흡광도를 측정하였다. 콜라게나제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

세포외 기질(extracellular matrix)의 주요 구성 성분인 collagen은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질이다. 또한 생체 단백질 총 중량의 약 30%를 차지하는 중요한 단백질로서 견고한 3중 나선구조를 가지고 있다. Collagen은 피부, 건(tendon), 뼈 및 치아의 유기물질의 대부분을 형성하는데, 특히 뼈와 피부의 진피에 그 포함량이 높다. Collagen의 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포분할과 분화의 유도등이 알려져 있다. 이러한 collagen은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하였으며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다. 또한 collagen은 트립신 등의 단백질 분해 효소의 작용을 받지 않으나, 콜라게나제에 의해 분해된다는 보고가 있어, 만형자 분획물 10, 100, 1000μg/ml농도에서 콜라게나제 저해 활성을 측정하였다.

만형자 에틸아세테이트 분획물이 가장 우수한 저해능을 나타내었다 (도 12). 만형자 분획물의 IC₅₀값은 표 7에 나타낸 것과 같이 만형자 에틸아세테이트 (283.43μg/ml)〈만형자 물 (324.00 μg/ml)〈만형자 부탄올(346.43μg/ml)〈만형자 헥산 (412.42μg/ml)로 만형자 부탄올에서 콜라게나제 저해활성이 가장 뛰어난 것을 확인하였다.

콜라게나제 저해활성

Sample	Collagenase IC50 (μg/ml)
Vitamin C (Vit. C)	179.92±5.48
Hexane fraction (VR-H)	412.42±1.23
EtOAc fraction (VR-EA)	283.43±0.13
BuOH fraction (VR-B)	346.43±3.06
Water fraction (VR-W)	324.00±2.23

4-4. 세포내 항노화 관련 단백질 발현 양상 측정

실시예에서 얻은 시료들의 세포내 항노화 관련 단백질 발현 양상에 미치는 영향을 시험하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(So SH, Lee SK, Hwang EI, Koo BS, Han GH, Lee MJ, Chung JH and Kim NM. (2008) Mechanisma of korean red ginseng herb extracts(KTNG0345) for anti-wrinkle antivity. J. Ginseng Res. 32(1), 39-47)

MMP-1의 측정은 amersham matrix metallproteinase-1, human, biotrak ELISA system(GE Healthcare)을 사용하여 측정하였다.

실시예 추출물의 항노화 효과를 알아보기 위하여 cell line(CCD-986sk)을 100mm tissue culture dish에 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. RIPA buffer 10ml에 complete mini 1 tab를 가함 100μl로 용해해서 4℃ 12,000rpm에서 20분간 원심 분리 하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 bradford assay로 정량하여 30μl의 단백질을 10%의 SDS-PAGE gel을 이용하여 분리하였다. 분리된 단백질은 semi dry transfer cell 기기 (Hofer, USA)를 이용하여 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (5% skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing 하고 mouse anti-rabbit IgG HRP, bovine anti-goat IgG HRP의 각각의 2차 항체를 1:1,000로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 3회 washing한 뒤 LAS 4,000 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량 하였다.

노화와 관련된 인자인 MAPK에 가장 많은 영향을 받은 인자는 c-fos이며 이는 p38의 영향을 받는다. 이러한 요인들이 활성화되면 MMPs의 발현을 강력히 조절한다. 본 연구에서는 MMP family 중 MMP-1의 단백질 발현을 측정하였다.

본 실험 결과, 만형자 에틸아세테이트 분획물 처리군에서 MMP-1의 protein 발현 모두 5, 10, 25μg/ml의 농도 의존적으로 억제 되었다(도 13).

이하, 본 발명의 제형예로서 크림, 맛사지크림, 로션, 스킨로션, 에센스, 팩, 클렌징폼의 제형을 예시하고 있으나, 본 발명의 화장품 조성물을 포함하는 제형은 이에 한정되는 것은 아니다.

제형예 1. 크림조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 2. 맛사지크림 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 용해 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 3. 로션 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합 유화한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 4. 스킨로션 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

제형예 5. 에센스 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

제형예 6. 팩 조성물

수상과 에탄올상을 각각 분산 용해하여 혼합시킨 후 실온으로 냉각한다.

제형예 7. 클렌징폼 조성물

수상과 오일상을 각각 분산 용해하여 혼합 검화한 후 실온으로 냉각한다.

Claims (8)

1. 만형자 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 피부노화의 치료 및 예방용 피부외용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 만형자의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 하는 피부외용 약학조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 조추출물은 물, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 주정, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 함수부틸렌글리콜, 함수프로필렌글리콜, 함수글리세린으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 용매 가용 추출물임을 특징으로 하는 피부외용 약학조성물.
4. 제 2항에 있어서, 상기 비극성용매 가용 추출 분획물은 본원의 조추출물로부터 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트에 가용한 추출 분획물임을 특징으로 하는 피부외용 약학조성물.
5. 제 2항에 있어서, 상기 극성용매 가용 추출물은 상기 조추출물로부터 비극성용매 가용분획물들을 제거하고 남은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매에 가용한 추출 분획물임을 특징으로 하는 피부외용 약학조성물.
6. 제 1항에 있어서, 상기 피부노화는 주름살, 기미, 주근깨, 자외선에 의한 피부 손상, 또는 피부암임을 특징으로 하는 피부외용 약학조성물.
7. 만형자 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 피부노화의 개선 및 예방용 화장료 조성물.
8. 제 7항에 있어서 상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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