KR20140033609A - 홍화자 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 홍화자 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 홍화자 추출물로부터 분리된 화합물은 피부노화와 관련된 엘라스타제(elastase) 저해 활성실험, 콜라게나제(collagenase) 저해 활성실험, 섬유아세포의 생존율 측정 실험, 프로-콜라겐(pro-collagen) 생합성 및 히알루론산 생합성에 미치는 영향 실험, MMP-1 저해율 측정실험, 및 UVB로부터 유도되어진 CCD-986sk에서의 MMPs의 protein 발현율을 측정함으로써 항 피부노화제로서의 효능을 확인한 바, 피부노화 관련 질환 치료 및 예방 효과를 나타내는 피부외용 약학 조성물 또는 화장료 조성물에 이용할 수 있다.

Description

홍화자 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 {A composition comprising the compounds isolated from extract of Carthamus tinctorious seeds as an active ingredient for preventing and treating skin aging related disease}

본 발명은 홍화자 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] 1. Kobayashi T, Urabe K, Winder AJ, Jimenez-Cervantes C, Imokawa G, Brewington T, Solano F, Garcia-Borron JC, Hearing VJ. (1994) Tyrosinase related protein-1(TRP-1) function as a DHICA oxidase in melanin biosynthesis. EMBO J. 3, 5818-5825.

[문헌 2] Hunt G, Todd C, Gresswell JE, Thidy AJ. (1994) α-MSH and its analog Nle⁴DPhe⁷ α-MSH affect morphology, tyrosinase activity and melanogenesis in cultured human melanocytes. J. Cell . Sci. 107, 205-211.

[문헌 3] Xia Z, Dickens M, Raingeaud J, Davis RJ, Greenberg ME. (1995) Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis. Science. 270(5240), 1326-1331.

[문헌 4] Karin M, Hunter T. (1995) Transcriptional control by protein phosphorylation signal transmission from the cell surface to the nucleus. Curr Biol. 5, 747-757.

[문헌 5]Rose Busca, Robert Ballotti. (2000) Cyclic AMP a key messenger in the regylation of skin pigmentation. Pigment Cell Res. 13, 60-69.

[문헌 6]Smith, LT, Holbrook, KA, Madri, JA. (1986) Collagen types Ⅰ,Ⅲ, and Ⅴ in human embryonic and fetal skin. Am J Anat. 175(4), 507-521.

[문헌 7] Wan YS, Wang ZQ, Voorhees J, fisher G. (2001) EGF receptor crosstalks with cytokine receptors leading to the activation of c-Jun kinase in reponse to UV irradiation in human keratinocytes. Cell Signal. 13(2), 139-144.

[문헌 8]Rosette C, Karin M. (1996) Ultraviolet light and osmotic stress: activation of the JNK cascade through muliple growth factor and cytokine receptors. Science. 274(2590), 1194-1197.

[문헌 9] 정태현. (1965) 한국동식물 도감, 식물편(목. 초본류), 문교부, p.1475.

[문헌 10] 이창복. (1979) 대한식물도감, 향문사, p.285.

[문헌 11] 강소 신의학원. (1985) 중약 대사전(제2권). 소학관. p.2383.

[문헌 12] 문화방송. (1987) 한국 민간요법대전. 금박출판사. p.31.

[문헌 13]堀田滿. (1989) 世界有用植物事典. 平丹社. p.341.

[문헌 14]이경순 외. (1989) 중약대사전 정담출판사. p.4585.

[문헌 15]Sakamura, A., T erayama, Y., Kawakat su, S., Ichihara, A. and Saito, H. (1980) Conjugated serotonins and phenolic constituent s in safflower seed (Carthamus tinctorius L.). Agric . Biol . Chem ., 44, 2951.

[문헌 16] Zhang, H. L., Nagat su, A. and Sakakibara, J. (1996) Novel antioxidant s from safflower (Carthamus tinctorus L.) oil cake. Chem . Pharm . B ull., 44, 874.

[문헌 17]Zhang, H .L., Nagat su, A., Watanabe, T ., Sakakibara, J . and Okuyama, H. (1997) Antioxidative compounds isolated from safflower (Cartham us tinctorus L.) oil cake. Chem . Pharm . B ull., 45, 1910.

[문헌 18] A physiology active minuteness chemical technique development road map. (2002) Ministry of Commerce , Industry and Energy. 229-322.

[문헌 19] Roth GJ, Siok CJ and Ozols J. (1980) Structural characteristics of prostaglandin synthetase from sheep vesicular gland. J. Biol . Chem . 255(4), 1301-1304.

[문헌 20] DeWitt DL, Rollins TE, Day JS, Gauger JA and Smith WL. (1981) Orientation of the active site, and antigenic determinants of prostaglandin endoperoxide of synthase in the endoplasmic reticulum. J. Biol . Chem . 256(20), 10375-10382.

[문헌 21] Kwak YJ, Lee DH, Kim NM and Lee JS. (2005) Screening and extraction condition of anti-skin aging elastase inhibitor from medicinal plants. Korean J. Medicinal Crop Sci. 13(6), 213-216.

[문헌 22] Kim MJ, Kim JY, Choi SW, Hong JT and Yoon KS. (2004) Anti-wrinkle effect of safflower (Cathamus tinctorius) seed extract. J. Soc . Cosmet . Scientisis Korea . 30(1), 15-22.

[문헌 23] Jeroma SP, Gabrielle L and Raul F. (1998) Identification of collagen fibrils in scleroderma skin. J. Invest . Dermatol. 90(1), 48-54.

[문헌 24]Grant NH and Alburn HE. (1959) Studies on the collagenases of Clostridium histolyticum. Arch . Biochem . Biophys . 82(2), 245-255.

[문헌 25] Kang KS, Kim D, Kwon RH, Heo YY, Oh SH, Kim MA, Jung HJ, Kang HY, Ha BJ (2007) The evalution of anti-wrinkle effects in oriental herb extract. J life science. 17,1147-1151

[문헌 26] Menzel EJ, Farr C (1998) Hyaluronidase and its substrate hyaluronan:biochemistry biological activities and therapeutic uses. Cancer Lett. 131,3-11

피부 노화(skin aging)는 피부 진피층에 존재하는 세포외기질(extracellular matrix)의 구조적인 변화로 발생되는데[1-4], 그 구성요소 중 탄력섬유(elastic fiber)의 변성과 교원질(collagen)양의 감소가 피부의 주름을 야기한다[5]. 또한, 피부의 노화를 이끄는 주요 요인 중에는 collagen의 감소와 관련하여 자외선이나 스트레스에 의한 활성산소의 생성을 들 수 있다. 피부에서의 활성 산소의 생성은 세포막을 공격함으로써 세포에 손상을 입혀 그 기능을 상실하게 한다[6,7]. 피부세포로써의 기능상실은 피부의 거친 상태를 형성하거나 유지시키고, 윤기를 없애는 결과를 초래함으로써 피부의 주름을 유발하게 된다[8]. 결국, 생체 내 활성산소의 새성은 MMPs 유전자와 collagen 분해효소의 연쇄적인 활성화를 유도함으로써 collagen의 구조적인 파괴를 유발하고, 피부의 탄력을 감소시키는 피부주름의 형성을 이끌게 된다[8]. 따라서 피부노화는 collagen 분해효소와 활성산소의 생성억제, collagen의 합성을 촉진시킴으로써 피부노화의 완화 효과를 나타낼 수 있다.

최근 약용식물의 재배는 높은 소득과 수출에 크게 기여할 작물로 평가되고 있다. 주요약용식물의 하나인 홍화(Carthamus tinctorious L.)는 국화과에 속하는 일년생 초목이다[9]. 홍화꽃은 수용성의 황색색소와 불용성의 적색색소를 함유하고 있어 예로부터 염료로 사용되어 왔으며, 아울러 한방에서 어혈, 통령 및 고지혈증 치료제로서 홍화탕, 활혈통경탕의 저방제로 널리 이용되어 왔다[10]. 한편, 홍화씨는 한국, 중국 및 일본 등지에서 진정 및 보혈등의 약용으로 사용되어 왔으며[11] 특히 미국 및 인도에서는 식용유 생산용으로 재배되고 있는 유용한 식물종자이다[12]. 홍화씨 기름에는 비타민 E, 리놀레산 등과 천연 미네랄(칼슘, 알루미늄 및 브롬)성분이 풍부하게 함유되어 있어 영양상으로 중요할 뿐 아니라[13], 특히 리놀레산 등의 불포화 지방산의 함량이 높아 항혈전 및 항고혈압성 신소재로서 주목을 받고 있다[14].

그러나 상기 문헌의 어디에도 홍화자로부터 분리된 화합물들의 항노화 효과에 대한 내용이 개시 또는 교시된 가 없다.

따라서, 본 발명자는 홍화씨로부터 분리된 화합물들의 피부에 미치는 항노화 효과를 조사하고 항노화제로서의 개발 가능성을 평가하기 위해 피부노화의 직접적인 원인인 MMP-1의 유전자 발현과 피부의 주요 구성인자인 콜라겐의 생합성 촉진 효과 측정함으로써 항노화제로서의 효능을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 홍화자 추출물로부터 분리된 아카세틴(acacetin), 코스모시인(cosmosiin), N-페룰로세로토닌(feruloylserotonin), 또는 N-(p-쿠마로일)세로토닌)로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 관련 질환의 예방 및 치료용 피부외용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 홍화자 추출물로부터 분리된 아카세틴(acacetin), 코스모시인(cosmosiin), N-페룰로세로토닌(feruloylserotonin), 또는 N-(p-쿠마로일)세로토닌)로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 관련 질환의 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 물, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 함수부틸렌글리콜, 함수프로필렌글리콜, 함수글리세린으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올, 가장 바람직하게는 60% 내지 90% 에탄올 가용 추출물을 포함한다.

상기 생약 추출물은 피부외용 약학조성물은 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%으로 포함함을 특징으로 한다.

상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형을 포함한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형을 포함한다.

본원에서 정의되는 피부노화 관련 질환은 피부 주름, 광노화증, 흑화증, 피부 색소침착증, 피부화상, 피부 염증, 또는 피부암, 바람직하게는 피부 주름 또는 광노화증을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 생약 추출물 및 분리 화합물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 홍화씨를 분쇄하고 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름 등의 비극성용매로 추출하고 이를 반복수행하여 지방을 제거하는 제 1단계: 상기 단계에서 지방을 제거하고 남은 잔사에 이의 건조중량의 약 1 내지 30배 부피량, 바람직하게는 5 내지 15배에 달하는 부피의 물, 에탄올 및 메탄올 등과 같은 C₁내지 C₄의 저급알코올의 극성 용매 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 50% 내지 90% 에탄올로, 약 50 내지 100℃, 바람직하게는 약 상온 내지 60℃에서 3시간 내지 12시간, 바람직하게는 4시간 내지 8시간, 동안 추출하여 얻어진 여액을 감압여과, 농축 및 동결 건조하여 홍화씨 조추출물을 수득하는 제 2단계; 상기 단계에서 얻은 조추출물을 상기 조추출물 중량의 약 0.05 내지 50배, 바람직하게는 0.5 내지 5배 부피 (v/w%)의 물을 가하여 현탁물을 제조하는 제 3단계; 상기 현탁물에 상기 현탁물 부피의 약 0.5 내지 20배 부피, 바람직하게는 1 내지 5배 부피 (v/w%)의 n-헥산, 헵탄, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트로부터 선택된 비극성용매, 바람직하게는 헥산 또는 에틸아세테이트 용매 및 부탄올 및 물을 가하여 순차적으로 분획과정을 반복수행하여 비극성 용매 가용분획물 및 극성용매 가용 분획물을 각각 수득하는 제 4단계; 상기 비극성용매 가용 분획물을 실리카겔 컬럼, 세파덱스 컬럼, 이온교환수지 등의 컬럼 크로마토그래피법 또는 재경화법 등의 정제법, 바람직하게는 전개용매 (클로포포름 및 물의 혼합용매를 극성을 올려 가면서 전개)를 이용한 실리카겔 컬럼및 재결정법을 이용한 정제과정을 반복수행하는 제 4단계 공정을 통하여 본 발명의 아카세틴(acacetin), 코스모시인(cosmosiin), N-페룰로세로토닌(feruloylserotonin), N-(p-쿠마로일)세로토닌) 등의 본 발명의 화합물을 분리가능하다.

또한, 본 발명의 생약들은 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어 오던 약재로서 이들로부터 추출된 본 발명의 생약 추출물 및 분리 화합물들은 독성 및 부작용 등의 문제가 없으며, 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 생약 추출물 및 분리 화합물을 함유하는 피부외용 약학조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 생약 추출물 및 분리 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 생약 추출물은 1일 0.0001 내지 100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 생약 추출물 및 분리 화합물을 함유하는 피부노화 관련 질환 방지용 조성물은 인체에 대한 부작용이나 독성이 없으면서 피부노화와 관련된 엘라스타제(elastase) 저해 활성실험, 콜라게나제(collagenase) 저해 활성실험, 섬유아세포의 생존율 측정 실험, pro-collagen 생합성 및 향hyaluronic acid 생합성에 미치는 영향 실험, MMP-1 저해율 측정실험, 및 UVB로부터 유도 되어진 CCD-986sk에서의 MMPs의 protein 발현율을 측정함으로써 항 피부노화제로서의 효능을 확인한 바, 피부노화 관련 질환 치료 및 예방 효과를 나타내는 피부외용 약학 조성물 또는 화장료 조성물에 이용할 수 있다

또한, 본 발명의 생약 추출물 및 분리 화합물은 피부노화 관련 질환 개선 효과를 갖는 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 팩 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 dl-알파 토코페롤, 니코틴산 dl-알파 토코페롤비타민 E, dl-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 - 5% 중량, 보다 바람직하게는 0.01 - 3% 중량로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 생약 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 홍화자 추출물로부터 분리된 화합물들은 엘라스타제(elastase) 저해 활성실험, 콜라게나제(collagenase) 저해 활성실험, 섬유아세포의 생존율 측정 실험, pro-collagen 생합성 및 hyaluronic acid 생합성에 미치는 영향 실험, MMP-1 저해율 측정실험, 및 UVB로부터 유도 되어진 CCD-986sk에서의 MMPs의 protein 발현율을 측정함으로써 항 피부노화제로서의 효능을 확인한 바, 피부노화 관련 질환 치료 및 예방 효과를 나타내는 피부외용 약학 조성물 또는 화장료 조성물에 이용할 수 있다.

도 1은 홍화자 추출물로부터 화합물들을 분리하는 분리동정을 나타낸 도이며,
도 2는 홍화자 추출물로부터 분리된 화합물들의 구조식을 나타낸 도이고,
도 3은 엘라스타제(elastase) 저해 활성실험 결과를 나타낸 도이며,
도 4는 콜라게나제(collagenase) 저해 활성실험 결과를 나타낸 도이며,
도 5은 섬유아세포의 생존율 측정 실험 결과를 나타낸 도이며,
도 6는 pro-collagen 생합성에 미치는 효과를 나타낸 도이며(3개의 개별적 실험 결과의 대표들을 표시),
도 7은 hyaluronic acid 생합성에 미치는 효과를 나타낸 도이며(3개의 개별적 실험 결과의 대표들을 표시),
도 8는 인체 피부 섬유아세포의 MMP-1 저해율을 측정한 결과를 나타낸 도이며(3개의 개별적 실험 결과의 대표들을 표시),
도 9은 UVB로부터 유도 되어진 CCD-986sk에서의 MMP-1 단백질 발현율에 대한 효과를 나타낸 도이며,
도 10은 UVB로부터 유도 되어진 CCD-986sk에서의 MMP-2 단백질 발현율에 대한 효과를 나타낸 도이며;
도 11은 UVB로부터 유도 되어진 CCD-986sk에서의 MMP-3 단백질 발현율에 대한 효과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 홍화자 추출 및 용매분획

건조한 홍화씨를 분쇄한 다음 100% n-hexane을 가하여 상온에서 추출하여 지방을 제거하였다. 위의 추출조작을 3회 반복 실시하여 남은 잔사에 70% Ethanol을 가하여 상온에서 추출·여과하였다. 위의 추출조작을 실시하여 얻은 70% Ethanol 추출액을 감압·농축한 다음 여기에 n-hexane을 넣고 n-hexane층과 수층으로 분획하고 수층에 Ethyl acetate(EtOAc)을 넣고 EtOAc층과 수층으로 분획하고 수층에 n-buOH을 넣고 n-buOH과 수층으로 분획하였다. 위의 과정 중 EtOAc층을 감압·농축하여 EtOAc 추출물(388.61g)을 얻었다. EtOAc 추출물을 HPLC로 측정하여 주요 물질의 대략적인 정보를 파악하였다. 이 추출물 중 200g을 CHCl₃:MeOH (10:1 to MeOH 100%) 혼액에 충진 시킨 후 Silicagel(230~400 mesh, Merck, Germany) column에 흡착시킨 후 7개 분획물을 얻었다. 이 중 Fr.E1과 Fr.E5는 MeOH를 이용한 재결정 유도법을 통하여 각각 acacetin(7.74mg), cosmosiin(4.76mg) 단일물질을 얻었다. Fr.E4 전량을 CHCl₃:MeOH (5:1 to MeOH 100%) 혼액에 충진 시킨 후 Silicagel(230~400 mesh, Merck, Germany) column에 흡착시킨 후 5개 분획물을 얻었다. 이 중 Fr.E4.2는 MeOH를 이용한 재결정 유도법을 통하여 N-feruloylserotonin(6.13mg) 단일물질을 얻었다. Fr.E4.3을 CHCl₃:MeOH (10:1 to MeOH 100%) 혼액에 충진 시킨 후 Silicagel(230~400 mesh, Merck, Germany) column에 흡착시킨 후 8개 분획물을 얻었다. 이 중 Fr.E4.3.4 전량을 CHCl₃:MeOH (15:1 to MeOH 100%) 혼액에 충진 시킨 후 Silicagel(230~400 mesh, Merck, Germany) column에 흡착시킨 후 8개 분획물을 얻었다. 이 중 Fr.E4.3.4.7로부터 N-(p-coumaroyl)serotonin(15.33mg) 단일물질을 얻었다(도 1 및 2 참조).

하기에 홍화자 추출물로부터 분리된 개개화합물들의 물성치를 기재하고 이 물성치를 문헌에 개시된 물성치들과 각각 비교하여 그 구조를 동정하였다. (Sakamura, A., T erayama, Y., Kawakat su, S., Ichihara, A. and Saito, H. (1980) Conjugated serotonins and phenolic constituent s in safflower seed (Carthamus tinctorius L.). A g ric . B iol . Chem ., 44, 2951.)

화합물 1: 아카세틴 ( Acacetin )

성상: 백색 무정형 분말(white amorphous powder)

분자량(Molecular Weight): 270.2369

¹H-NMR (500MHz, DMSO-d ₆+D₂O) : δ 6.86 (1H, H-3), 6.20 (1H, d, J=2Hz, H-6, ), 6.50 (1H, d, J=2Hz, H-8), 8.03 (2H, d, J=9Hz, H-2',6'), 7.10 (2H, d, J=9Hz, H-3',5')

¹³C-NMR (500MHz, DMSO-d ₆+D₂O) : δ 163.3 (C-2), 103.6 (C-3), 181.8 (C-4), 157.4 (C-5), 98.9 (C-6), 164.3 (C-7), 94.1 (C-8), 161.5 (C-9), 103.8 (C-10), 122.9 (C-1'), 128.4 (C-2',6'), 114.6 (C-3',5'), 162.3 (C-4'), 55.6 (-OCH₃)

화합물 2: 코스모신(Cosmosin)

성상: 백색 무정형 분말(white amorphous powder)

분자량(Molecular Weight):432.3775

¹H-NMR (500MHz, DMSO-d ₆+D₂O) : δ 6.82 (1H, H-3), 6.43 (1H, H-6), 6.86 (1H, d, J=2.5Hz, H-8), 7.94 (2H, dd, J=9Hz, 2.5Hz, H-2',6'), 6.93 (2H, dd, J=9Hz, 2.5Hz, H-3',5'), 5.10 (1H, d, J=7.5Hz, glucose-H)

¹³C-NMR (500MHz, DMSO-d ₆+D₂O) : δ 164.3 (C-2), 103.1 (C-3), 182.0 (C-4), 161.1 (C-5), 99.5 (C-6), 163.0 (C-7), 94.9 (C-8), 157.0 (C-9), 105.4 (C-10), 121.0 (C-1'), 128.7 (C-2',6'), 116.0 (C-3',5'), 161.4 (C-4'), 99.9, 77.2, 60.6, 69.6, 76.4, 73.1 (glucose-C)

화합물 3: N -페룰로세르토닌(feruloylserotonin)

성상: 백색 무정형 분말(white amorphous powder)

분자량(Molecular Weight): 352.3838

¹H-NMR (500MHz, Methanol) : δ 6.93 (1H, H-2), 6.88 (1H, d, J=2Hz, H-4), 6.58 (1H, dd, J=2.5Hz, 8.5Hz, H-6), 7.07 (1H, d, J=8.5Hz, H-7), 2.84 (2H, t, J=7Hz, H-10), 3.48 (2H, t, J=7Hz, H-11), 7.01 (1H, d, J=1.5Hz, H-2'), 6.69 (1H, d, J=8Hz, H-5'), 6.91 (1H, d, J=1.5Hz, H-6'), 7.35 (1H, d, J=15.5Hz, H-7'), 7.32 (1H, d, J=15.5Hz, H-8')

¹³C-NMR (500MHz, Methanol) : δ 124.4 (C-2), 112.8 (C-3), 103.7 (C-4), 151.3 (C-5), 112.5 (C-6), 112.7 (C-7), 133.3 (C-8), 129.6 (C-9), 26.6 (C-10), 41.6 (C-11), 128.5 (C-1'), 111.7 (C-2'), 149.4 (C-3'), 149.9 (C-4'), 116.6 (C-5'), 123.4 (C-6'), 142.1 (C-7'), 119.0 (C-8'), 169.4 (C-9'), 56.4 (-OCH₃)

화합물 4: N -( p -쿠마로일)세르토닌 ( N -( p -coumaroyl)serotonin)

성상: 백색 무정형 분말(white amorphous powder)

분자량(Molecular Weight): 322.3578

¹H-NMR (500MHz, Methanol) : δ 6.91 (1H, H-2), 6.86 (1H, d, H-4), 6.56 (1H, dd, J=2.5Hz, 8.5Hz, H-6), 7.05 (1H, dd, J=3.0Hz, 8.5Hz, H-7), 2.82 (2H, t, J=7Hz, H-10), 3.46 (2H, t, J=7Hz, H-11), 7.28 (1H, d, J=5.5Hz, H-2'), 6.67 (1H, d, J=5.5Hz, H-3'), 6.67 (1H, d, J=5.5Hz, H-5'), 7.28 (1H, d, J=5.5Hz, H-6'), 7.34 (1H, dd, J=2.5Hz, 15.5Hz, H-7'), 6.28 (1H, dd, J=3.5Hz, 15.5Hz, H-8')

¹³C-NMR (500MHz, Methanol) : δ 124.6 (C-2), 112.5 (C-3), 103.7 (C-4), 151.3 (C-5), 112.6 (C-6), 112.8 (C-7), 133.3 (C-8), 129.6 (C-9), 26.6 (C-10), 41.6 (C-11), 127.9 (C-1'), 130.7 (C-2'), 116.8 (C-3'), 160.6 (C-4'), 116.8 (C-5'), 130.7 (C-6'), 141.9 (C-7'), 118.7 (C-8'), 169.4 (C-9')

실험예 1. 엘라스타제(elastase) 저해 활성

실시예 1에서 수득한 홍화자 추출물로 분리된 화합물들의 엘라스타제(elastase) 저해 활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Cannell RJP, Kellan SJ, Owsianks AM and Walker JM. (1988) Results of a large scale screen of microalgae for the production of protease inhibitors. Planta Media. 54(1), 10-14.).

Elastase는 단백질인 엘라스틴을 분해하는 효소이며, 다른 중요한 기질 단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다. 엘라스타제 저해제로는 ursolic acid 등이 엘라스타제 저해제로 이용되고 있는데, ursolic acid는 물이나 오일 등의 용매에는 잘 녹지 않는 물성을 가지고 있기 때문에 제제화하기 어려워 일반적으로 사용하기 어려운 문제점이 있다[18]. 이러한 주름 생성과 관련한 엘라스타제 저해활성을 하기와 같이 측정하였다. 기질로서 N-succinyl-(L-Ala)₃- p-nitroanilide를 사용하여 37℃에서 20분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 405nm에서 측정하였다. 즉, 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5mL씩 시험관에 취하고, 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase (2.5U/mL)용액 0.5mL을 가한 후 기질로 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)₃-p-nitroanilide (0.5mg/mL)을 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다.

상기 실험 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 홍화자로부터 분리된 acacetin, cosmosin, N-feruloyl serotonin, N-(p-Coumaroyl) serotonin의 경우 각각 1,000 μM에서 13%, 16%, 13%, 40%로 elastase 저해 효과가 나타났다. 대조군인 EGCG의 경우 1,000 μM에서는 46%의 elastase 저해 효과를 나타내기에 홍화자 정제물 중 N-feruloyl serotonin이 EGCG와 유사한 저해 효과를 나타냄으로 엘라스타제 저해능에 높은 효능을 가지는 정제물임을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 콜라게나제 ( collagenase ) 저해 활성

실시예 1에서 수득한 홍화자 추출물로 분리된 화합물들의 콜라게나제(collagenase) 저해 활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(WE and Heindrich HG. (1963) Zur quantitativen bestimmung der collagenase. Hoppe-Seyler's. Physiol . Chem. 333:149-151.).

탄력 섬유인 collagen은 elastin과 함께 망상으로 존재하며 털을 세워주는 기모근과 함께 진피를 지지하고 있으며, 특히 진피 중에는 collagen type Ⅰ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ가 가장 많고, type Ⅴ는 type Ⅰ과Ⅲ의 anchor collagen으로 알려져 있으며, type Ⅰ과 Ⅲ은 hybrid 형태로 존재한다[19,20]. 이러한 collagen은 많은 섬유아세포 (fibroblast)에 의해 생성되며 ECM (extracellular matrix)의 70～80%를 차지하고, 2～4%의 elastin, glycosaminoglycans, 당 단백 등과 함께 ECM을 구성한다. 이러한 collagen은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다[21-23]. 또한 collagen은 collagenase에 의해 분해된다는 보고가 있기에[24] 본 연구의 콜라게나제 측정을 실시 하였다. 반응구는 0.1M tris-HCl buffer (pH 7.5)에 4mM CaCl₂를 첨가하여, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (0.3mg/mL)를 녹인 기질액 0.25mL 및 시료용액 0.1mL의 혼합액에 콜라게나제 (0.2mg/mL) 0.15mL를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 6% citric acid 0.5mL을 넣어 반응을 정지 시킨 후, ethyl acetate 1.5mL을 첨가하여 320nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기 실험 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 홍화자로부터 분리된 N-(p-Coumaroyl) serotonin의 경우 1,000 μM의 농도에서 89%, 각각의 다른 정제물인 acacetin, cosmosin, N-feruloyl serotonin은 같은 농도인 1,000μM에서 77%, 66%, 69%의 저해 효과가 나타났다. 대조군인 EGCG의 경우 1,000μM에서 97%의 저해능을 나타냄으로 N-(p-Coumaroyl) serotonin의 경우 대조군인 EGCG와 비슷한 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

실험예 3. 세포독성 측정 및 세포주 배양 실험

실시예 1에서 수득한 홍화자 추출물로 분리된 화합물들의 세포독성을 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 개시된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다.(Lee TW, Kim SN, Jee UK and Hwang SJ. (2004) Anti-wrinkle effect of pressure sensitive adhesive hydrogel patches containing Ulmicortex etract. J. Kor . Pharm . Sci. 34, 193-1999.)

세포 독성에 측정에 사용된 세포주는 섬유아세포 CCD-986sk 세포(Manassas, VA)는 ATCC에서 구입하여 사용하였다. 세포 독성 측정 및 배양을 위해 dulbecco's modified eagle medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin, 0.4% trypan blue stain은 Gibco BRL Co.(Grand Island, USA)에서 구입하였으며, haemacytometer(Marienfeld, Germany), 3-[4,5-dimethylthiazol]-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide(MTT)는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. MMP-1 primary antibody 와 secondary antibody는 Santacruz(CA, USA)에서 구입하였다. 본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 10% FBS과 1% penicillin/streptomycin (100U/mL)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂ incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.

CCD-986sk를 96 well plate에 5× 10⁴cells/well이 되게 0.18mL 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 0.02mL 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02mL를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 0.15mL를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

그 결과 acacetin, cosmosin, N-feruloyl serotonin, N-(p-Coumaroyl) serotonin에 의한 섬유아세포의 생존율을 MTT assay에 의해 확인한 결과, 도 5와 같이 나타내었다. 휴먼섬유아 세포에 홍화자 정제물 4가지를 농도별로 1, 10, 50, 100 μM의 농도로 처리한 결과 50 μM의 농도에서 약간의 세포 독성이 나타났으며, 100 μM의 농도에서는 세포 생존율이 40% 이하로 나타나 강한 독성을 나타내었다. 본 연구에서는 홍화자 정제물의 세포 생존율이 100%에 가까운 농도인 1, 10 μM의 농도에서 ELISA 실험 및 단백질 발현양 측정 실험을 진행하였다.

실험예 4. 프로-콜라겐( pro - collagen ) 생합성 측정

실시예 1에서 수득한 홍화자 추출물로 분리된 화합물들의 pro-collagen 생합성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(So SH, Lee SK, Hwang EI, Koo BS, Han GH, Lee MJ, Chung JH and Kim NM. (2008) Mechanisma of korean red ginseng herb extracts(KTNG0345) for anti-wrinkle antivity. J. Ginseng Res. 32(1), 39-47.).

세포를 1x10⁴ cells/well 농도로 96well plate에 접종한 후, 각 well에 시료를 첨가하여 CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 이렇게 실험한 세포의 배양액을 모아서 실험에 사용하였다. 세포배양액내 콜라겐 생합성 정도는 pro-collagen type-ⅠC peptide(PIP) EIA kit(Takara)을 사용하여 propeptide의 양을 측정하였다.

Collagen은 노화에 다른 세포활성의 감소와 같은 내적 요인과 여러 가지 유해환경에 의한 스트레스의 증가 및 태양 광선에 의한 활성 산소종의 증가와 같은 외적 요인에 의해 분해가 가속화되어 피부 기질이 파괴되면서 주름이 생성된다. 이러한 propeptide의 양을 측정함으로써, 세포내에서의 collagen 생합성 정도를 파악할 수 있다[25]. Human dermal fibroblast에 시료 처리 후 배양 시 collagen 생합성량을 조사한 결과, 도 6과 같이acacetin, cosmosin, N-feruloyl serotonin, N-(p-Coumaroyl) serotonin은 10μM의 농도에서 각 각 47%, 46%, 50%, 43%의 pro-collagen 생합성을 나타내었으며 그 중 N-feruloyl serotonin 정제물이 가장 높은 pro-collagen 생합성을 나타내는 것을 확인하였다. 이는 비교물질인 EGCG는 같은 농도에서 67%의 pro-collagen 생합성을 나타내어 N-feruloyl serotonin 정제물이 EGCG의 효능과 유사한 pro-collagen 생합성 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5. 히알루론산( hyaluronic acid ) 생합성 측정

실시예 1에서 수득한 홍화자 추출물로 분리된 화합물의 히알루론산 생합성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 개시된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다.(Shim JS, Han YS and Hwang JK. (2009) The effect of 4-hydroxypanduratin A on the mitogen-activated protein kinase-dependent activation of matrix metalloporteinase-1 expression in human skin fibroblasts. J. Dermatological science. 53, 129-134.)

세포를 2x10⁶ cells/well 농도로 6well plate에 접종하여 24시간 동안CO₂ 배양기에서 배양하였다. 24시간 뒤 홍화자 정제물을 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양 한 뒤, 실험이 끝난 뒤 상등액을 모아 히알루론산 발현량을 측정하였다. 히알루론산의 분석은 hyaluronan enzyme-linked immunosorbent assay kit를 이용하여 측정하였다. 그 결과는 UV-B를 조사한 음성 대조군을 100으로 하여 비교하였다.

상기 실험 결과, 고분자 다당인 hyaluronic acid(HA)은 진피층의 섬유아세포로부터 산출되어, 표피, 진피에 있어서 주요한 세포외 matrix로서 glucuronic acid와 glucosamine이 반복해서 연결된 점액성 moucopolysaccharide이다. 또한 hyaluronic acid는 염증 형성의 중요 요소인 machrophage의 phagocytic ability를 저해하는 한편, 저분자 hyaluronic acid는 상처 치유과정에서 염증(inflammation), 섬유화증(fibrosism collagen deposition)을 증가시키는 것으로 알려져 있다[26]. 홍화자 정제물의 섬유아세포에서의 HA 활성을 측정한 결과, 도 7과 같이 시료를 첨가하지 않은 군에 비해 10μM 농도에서 N-feruloyl serotonin이 85%로 가장 높은 HA 활성능을 가지는 것을 확인하였으며, 비교 물질인 EGCG와 거의 유사한 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 6. MMP -1 저해율 측정

실시예 1에서 수득한 홍화자 추출물로 분리된 화합물의 MMP-1 저해율을 측정하기 위하여 하기와 같이 문헌에 개시된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다.(Fanger GR, Johnson NL and Johnson GL. (1997) MEK kinases are regulated by EGF and selectively interact with Rac/Cdc42. EMBO J. 16, 4961-4972.)

세포를 1x10⁴ cells/well 농도로 96well plate에 접종한 후, CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 24시간 후에 UV-B를 조사한 다음, 홍화자 정제물을 농도별로 처리하여 48시간 배양하였다. 이렇게 실험한 세포의 상등액을 수확해서 ELISA방법을 사용하여 생성된 타입 Ⅰ콜라게나제의 양을 정량하였다. 그 결과는 UV-B 대조군을 100으로 하여 비교하였다.

상기 실험 결과, 체내에서 생성되는 수종의 MMPs 가운데 MMP-1은 collagen에 특이적으로 작용하는 protease로서 MMP-1의 활성을 억제하여 collagen의 분해를 감소시키면, 피부조직의 탄력을 유지하고 주름생성을 예방할 수 있는 것으로 알려져 있다[27]. UV-B를 조사한 섬유아세포에 홍화자 정제물을 처리하여 48시간 뒤 측정한 결과, 도 8과 같이 acacetin, cosmosin, N-feruloyl serotonin, N-(p-Coumaroyl) serotonin은 각각 10 μM 농도에서 37%, 22%, 30%, 22%로 각각 저해능을 나타내었으며, 앞선 실험에서처럼 N-feruloyl serotonin의 MMP-1 저해능이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

실험예 7. UVB 로부터 유도 되어진 CCD -986 sk 에서의 MMPs 의 protein 발현 측정

실시예 1에서 수득한 홍화자 추출물로 분리된 화합물의 UVB로부터 유도 되어진 CCD-986sk에서의 MMPs의 protein 발현 억제 활성을 측정하기 위하여 하기와 같이 문헌에 개시된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다.(Shim JS, Han YS and Hwang JK. (2009) The effect of 4-hydroxypanduratin A on the mitogen-activated protein kinase-dependent activation of matrix metalloporteinase-1 expression in human skin fibroblasts. J. Dermatological science. 53, 129-134.)

MMP-1, MMP-2, MMP-3의 활성을 보기 위하여 CCD-986sk세포를 100mm 조직 배양 디쉬(tissue culture dish)에 세포 접종(cell seeding) 후 48시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도별로(6.25, 12.5 및 25 μM) 처리한 배지로 48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. RIPA buffer 10ml에 complete mini 1 tab(Pierce, Rockford, IL)를 가하고 100μl로 용해해서 4℃ 12,000rmp에서 20분간 원심 분리 하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 Bradford assay로 정량하여 30ul의 단백질을 10%의 SDS-PAGE gel(Pierce, Rockford, IL)에서 전기 영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF membrane(Hercules, CA, USA)에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (5% skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. MMP-1 각각의 1차 항체를 1:1000으로 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST(Tris-Buffered Saline and Tween , Santa Cruz, CA)로 3회 세척하고 mouse anti-rabbit IgG HRP(Santa Cruz, CA)의 각각의 2차 항체를 1:1,000로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 3회 washing한 뒤 LAS 4,000 image analyzer (Fugifilm life science, Tokyo, Japan) 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량하였다.

본 실험결과, MMP-1, MMP-2, MMP-3의 protein 발현을 측정해 본 결과, 도 9 내지 11과 같이 acacetin, cosmosin, N-feruloyl serotonin, N-(p-Coumaroyl) serotonin 처리군에서 MMP-1, MMP-2, MMP-3의 protein 발현 모두 농도 의존적으로 억제 되었다. 그 중 N-feruloyl serotonin의 경우 MMP-1, MMP-2, MMP-3의 protein 발현양을 10 μM의 농도에서 각각 70%, 60%, 55%로 나타났으며, 비교 물질인 EGCG의 발현 억제율보다 더 높은 활성을 가지는 것을 확인하였다.

하기에 본 발명의 추출물 또는 분리 화합물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 헤어 토닉의 제조

아카세틴(acacetin) ----------------- 1%

에탄올 -------------------------- 55.0%

피마자유 ------------------------- 5.0%

글리세린 ------------------------- 3.0%

피록톤아민 ----------------------- 0.1%

향료, 색소 ----------------------- 적량

정제수 --------------------------- 잔량

계 ----------------------------- 100.0%

제제예 2. 헤어 로션의 제조

코스모시인(cosmosiin) ------------- 1.0%

세토스테아릴알코올 ---------------- 2.0%

염화스테아릴트리에틸암모늄 -------- 2.0%

히드록시에틸셀룰로오즈 ------------ 0.5%

피록톤올아민 ---------------------- 0.1%

향료, 색소 ------------------------ 0.5%

정제수 ---------------------------- 잔량

계 ------------------------------ 100.0%

제제예 3. 헤어 비누의 제조

N-페룰로세로토닌(feruloylserotonin) --- 0.1%

이산화티탄 ---------------------------- 0.2%

폴리에틸렌글리콜 ---------------------- 0.8%

글리세린 ------------------------------ 0.5%

에틸렌디아민테트라아세트산 ----------- 0.05%

나트륨 -------------------------------- 1.0%

색소, 비누향 -------------------------- 적량

화장비누베이스(수분 13%, 중량부) ------ 잔량

계 ---------------------------------- 100.0%

제형예 1. 크림조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 2. 맛사지크림 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 용해 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 3. 로션 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합 유화한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 4. 스킨로션 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

제형예 5. 에센스 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

제형예 6. 팩 조성물

수상과 에탄올상을 각각 분산 용해하여 혼합시킨 후 실온으로 냉각한다.

제형예 7. 클렌징폼 조성물

수상과 오일상을 각각 분산 용해하여 혼합 검화한 후 실온으로 냉각한다.

상기 조성비는 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (6)

1. 홍화자 추출물로부터 분리된 아카세틴(acacetin), 코스모시인(cosmosiin), N-페룰로세로토닌(feruloylserotonin), 또는 N-(p-쿠마로일)세로토닌)로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 관련 질환의 예방 및 치료용 피부외용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 추출물은 물, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 함수부틸렌글리콜, 함수프로필렌글리콜, 함수글리세린으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 용매인 피부외용 약학조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 피부노화 관련 질환은 피부 주름, 광노화증, 흑화증, 피부 색소침착증, 피부화상, 피부 염증, 또는 피부암인 피부외용 약학조성물.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형인 피부외용 약학조성물.
5. 홍화자 추출물로부터 분리된 아카세틴(acacetin), 코스모시인(cosmosiin), N-페룰로세로토닌(feruloylserotonin), 또는 N-(p-쿠마로일)세로토닌)로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 관련 질환의 예방 및 개선용 화장료 조성물.
6. 제 5항에 있어서
   상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 또는 팩의 제형인 화장료 조성물.

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