KR101954773B1 - 낙엽송 부산물로부터 다량의 유효성분을 효과적으로 분리하는 정제 방법 및 이 유효성분을 함유한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 낙엽송 원목의 제재과정에서 발생되는 부산물인 수피 및 톱밥으로부터 산업적으로 유용한 폴리페놀 계열의 프로안토시아니딘, 플라보노이드 계열의 탁시폴린, 다당류 계열의 아라비노갈락탄을 단계적으로 추출정제하여 각 추출정제물과 추출하고 남은 추출박을 활용하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 낙엽송의 제재 부산물로서 용도가 거의 없어 폐기되거나 연료용 펠렛 제조에 톱밥 또는 수피로부터 유용한 천연 소재들인 식물정유, 폴리페놀, 플라보노이드, 다당류를 추출 정제하여 각각 유용하게 산업적 용도로 사용하고 버섯배지로 사용할 수 없었던 추출박도 버섯재배용으로 사용할 수 있도록 하는 일련 공정에 관한 것으로서 우리나라 인공 조림 수종 중 수위를 차지하는 산림자원인 낙엽송을 보다 경제적으로 활용할 수 있도록 하는 방법에 관한 것이다.

Description

낙엽송 부산물로부터 다량의 유효성분을 효과적으로 분리하는 정제 방법 및 이 유효성분을 함유한 조성물 {The purification method for effectively isolating abundant active ingredient form larch tree by-products and the composition comprising the same}

본 발명은 낙엽송 부산물로부터 다량의 유효성분을 효과적으로 분리하는 정제 방법 및 이 유효성분을 함유한 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Voegeli, R. 1996. Elastase and typtase determination on human skin surface. Cosmetic &Toiletries. 111, 51-58

[문헌 2] Aroca, P., et al. 1993. Melanin biosynthesis patterns of following hormonal stimulation. J. Biol Chem 268, 25650-25655

[문헌 3] Chin, J. E., et al. 2005. Effects of Houttuynia cordata extracts on tyrosinse gene expression. J. Korean Soc Food Sci Nutr 34, 1284-1288.)

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[문헌 13] Voegeli, R. 1996. Elastase and typtase determination on human skin surface. Cosmetic &Toiletries. 111, 51-58

[문헌 14] Aroca, P., et al. 1993. Melanin biosynthesis patterns of following hormonal stimulation. J. Biol Chem 268, 25650-25655.;

[문헌 15] Jimenez-Cervantes C., et al. 1994. A new enzymatic function in the melanogenic pathway. J. Biol Chem 269, 17993-18001.;

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[문헌 22] 한국특허공개특허 제10-2010-0025992호

[문헌 23] 한국특허공개특허 10-2007-0103213호

[문헌 24] 한국특허공개특허 10-2014-0138882호)

[문헌 25] 한국특허공개특허 10-2014-0141593호

현대인들은 자외선, 스트레스 등의 여러 가지 내외적인 요인에 의해 각종 피부 트러블 유발로 기미, 주근깨, 피부 색소 침착 등의 피부 노화 현상을 촉진한다(1.Voegeli, R. 1996. Elastase and typtase determination on human skin surface. Cosmetic &Toiletries. 111, 51-58.). 피부의 색소 침착은 멜라닌 색소이 생합성에서 tyrosinase 효소를 비롯하여 DHICA oxidase(TRP-1)등의 L-tyrosine을 DOPA(3,4-dihydroxyphenyla-lanine)으로 DOPA에서 DOPA quinone으로 초기반응을 조절하는 것으로 알려져 있다(2.Aroca, P., et al. 1993. Melanin biosynthesis patterns of following hormonal stimulation. J. Biol Chem 268, 25650-25655.). 이를 바탕으로 티로시나제(tyrosinase) 효소의 활성을 저해하여 멜라닌 생합성의 억제에 영향을 미칠 수 있는 천연물 탐색에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 결과 어성초 추출물을 이용하여 티로시나제(tyrosinase) 유전자 발현 억제 효과(3. Chin, J. E., et al. 2005. Effects of Houttuynia cordata extracts on tyrosinse gene expression. J. Korean Soc Food Sci Nutr 34, 1284-1288.) 등 천연물을 활용한 연구가 활발히 이뤄지고 있다. 그 외 현재 알려져 있는 항산화 및 미백원료는 아르부틴(Arbutin), 코지산(Kojic acid), 아스코르브산(Ascorbic acid) 등의 물질이 대표적이고 상백피, 닥나무, 감초 등의 식물 추출물이 널리 알려져 있다.

환경의 파괴로 인한 자외선 증가 및 각종 산화성 물질의 증가는 피부 손상과 단백질의 합성능 저하를 유발할 수 있다. 이러한 피부 세포의 손상이나 기능 저하는 피부 탄력의 감소, 피부 주름살의 증가, 기미와 주근깨 생성 등 피부 미용에 치명적인 현상들을 유발한다. 피부 탄력성은 진피조직의 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 히알루론산(hyaluronic acid) 등에 의해 유지되며, 콜라겐(collagen)을 합성하는 섬유아세포(fibroblast)는 핵심적인 역할을 한다(Oikarinen A, Karvonen J, Uitto J, Hannuksela M., Connective tissue alterations in skin exposed to natural and therapeutic UV-radiation. Photodermatol. 2(1), pp.15-26, Review, 1985. ). 섬유아세포 기능은 각종 성장인자(growth factor) 뿐만 아니라 케라티노사이트(keratinocyte)나 멜라노사이트(melanocyte)와 같은 피부 세포들에서 분비되는 싸이토카인(cytokine)에 의해서도 조절된다(Hirobe T., Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Res. 18(1), pp.2-12. Review, 2005;McKay IA, Leigh IM., Epidermal cytokines and their roles in cutaneous wound healing. Br J Dermatol . 124(6), pp.513-8, Review, 1991..). 정상적인 상태에서 유리되는 케라티노사이트의 TGF-β, TβRII, SGad3는 피부 섬유아세포(dermal fibroblast)로 부터 프로콜라겐(procollagen), 피브릴린(fibrillin-1), tropoelastin의 발현을 증가시켜 콜라겐 생성을 증가시키며, MMPs의 발현을 억제하여 콜라겐 분해를 억제하는 것으로 보고되었다(Kim HH, Cho S, Lee S, Kim KH, Cho KH, Eun HC, Chung JH., Photoprotective and anti-skin-aging effects of eicosapentaenoic acid in human skin in vivo. J Lipid Res. 47(5),pp.921-30, 2006; Medina A, Ghaffari A, Kilani RT, Ghahary A., The role of stratifin in fibroblast-keratinocyte interaction. Mol Cell Biochem . 305(1-2), pp.255-64, Review, 2007)UV에 의해 케라티노사이트가 손상되면 TGF-β(transforming growth factor) 외에도 TNF-α(tumor necrosis factor), PGE₂ (prostaglandin E₂), α-MSH(melanocyte stimulating hormone), GSF(granulocyte stimulating factor), IL-1(interleukin-1), IL-6, IL-8, IL-10 등의 유리가 유발한다(문헌 6] Wang XJ, Han G, Owens P, Siddiqui Y, Li AG., Role of TGF beta-mediated inflammation in cutaneous wound healing. J Investig Dermatol Symp Proc . 11(1), pp.112-7, Review, 2006; Traidl-Hoffmann C, MuI, Ring J, Behrendt H., Impact of desloratadine and loratadine on the crosstalk between human keratinocytes and leukocytes: Implications for anti-inflammatory activity of antihistamines. Int Arch Allergy Immunol . 140(4), pp.315-20, 2006.). 이중 α-MSH와 PGE₂는 멜라노사이트를 자극하여 멜라닌 생성을 촉진하여, 이 멜라닌은 피부 세포의 항산화 작용을 증강시켜 피부세포가 자외선으로 인해 손상되는 것을 방어하게 한다(Cannon JG, Tatro JB, Reichlin S, Dinarello CA., Alpha melanocyte stimulating hormone inhibits immunostimulatory and inflammatory actions of interleukin 1. J Immunol . 137(7), pp.2232-6, 1986.). IL-1, TNF-α(tumor necrosis factor) 등은 fibroblast에 작용하여 procollagen 발현을 억제하며, MMP-1 (martrix metalloproteinase-1), MMP-2, MMP-3, 히알루로니다아제(hyaluronidase)등의 활성을 증가시켜 콜라겐 분해를 촉진하게 된다( Yamamoto T, Eckes B, Mauch C, Hartmann K, Krieg T., Monocyte chemoattractant protein-1 enhances gene expression and synthesis of matrix metalloproteinase-1 in human fibroblasts by an autocrine IL-1 alpha loop. J Immunol . 164(12), pp.6174-9, 2000;Dai G, Freudenberger T, Zipper P, Melchior A, Grether-Beck S, Rabausch B, de Groot J, Twarock S, Hanenberg H, Homey B, Krutmann J, Reifenberger J, Fischer JW., Chronic ultraviolet B irradiation causes loss of hyaluronic acid from mouse dermis because of down-regulation of hyaluronic acid synthases. Am J Pathol . 171(5), pp.1451-61, 2007. 9-10). 또한, UV에 의해 직접적으로 섬유아세포 (fibroblast)가 상해를 받는 경우에도 콜라겐 관련 유전자는 억제되고 분해에 관련되는 MMPs류 발현은 촉진되어 주름살은 증가하게 된다. 따라서, 진피 섬유아세포 (dermal fibroblast)의 증식과 콜라겐 합성을 증가시키거나, MMPs을 억제하는 것은 주름살을 생성을 억제하는 수단이 될 수 있다.

최근 들어, 미백, 노화방지, 피부개선, 항암 및 항균 등 복합 기능성을 가진 화장료로써 한약재는 제품 유형과 제형에 관계없이 다양하게 이용되어지고 있으며, 화장품에 천연물을 직접 이용한 것은 1973년 아모레 퍼시픽이 인삼을 주원료로 한 진생상미라는 제품을 선보인 것이 원조라 할 수 있고 이 후 산삼, 홍삼, 감초, 녹두, 흑두한란, 단풍잎, 대나무, 닥나무, 주목(朱木), 귤나무, 오가피, 야자수, 생강, 영지버섯, 녹차, 우엉, 뽕나무 등 다양한 식물자원으로부터 효능 성분을 추출하여 화장품 개발에 적극적으로 활용하고 있으며, 소재개발로 이루어지고 있으며, 현재 세계 화장품 시장 규모 05년 약 2,500억불에서 매년 10% 성장세를 보이고 있으며, 단순미용에서 질병치료 개념으로 진화, 고기능 다기능성으로 확대, 한방화장품 시대로 변화고 있는 상황이며, 천연 기능성 소재의 세계시장 규모는 연간 판매액 150억 달러에 달하며 최근 매년 평균 10% 이상의 성장률을 보이고 있다. 피부 천연물 소재의 개발 시 세계적으로 연간 1조 원～2조 원의 매출과 매출의 20 ～ 50%의 순이익 창출이 가능할 것으로 예상됩니다.

특히, 주름개선 화장품의 원료개발에 있어 한방에 대한 연구는 우리 전통의학에 기반을 둔 원료개발이라는 점과 우리나라 소비자들의 화장품 선호도와 맞물려 국내 화장품 개발의 주력분야가 되고 있으며, 우리가 경쟁력을 확보할 수 있는 부분이므로 지속적인 개발이 필요하며, 기능성 화장품은 고기능성에 다기능성이 추가되는 방향으로 기술개발이 이루어지고 있으며, 이러한 기능성 소재와 관련 기술의 개발이 활발해질 것으로 예상됨. 피부재생 및 보호 효과가 우수한 한방재료를 이용한 제품화로 미용성형 및 필링 후 민감한 피부를 효과적으로 방어할 뿐만 아니라, 탁월한 피부재생 효과로 인한 기능성 화장품 또는 의약외품으로서의 가치를 지님으로서 상품화의 가치가 크고 피부 신약 개발은 임상 초기에 개발의 성공 여부를 신속하게 판단할 수 있어서 임상 후기 단계의 신약 실패에 따른 위험이 감소한다. 또한 피부질환은 신약개발에 대한 소요기간이 상대적으로 짧아서 개발 성과의 조기 가시화 및 빠른 투자 회수가 가능하므로 신약 개발의 새로운 패러다임 창출이 가능할 것이다.

현대인들은 자외선, 스트레스 등의 여러 가지 내외적인 요인에 의해 각종 피부 트러블 유발로 기미, 주근깨, 피부 색소 침착 등의 피부 노화 현상을 촉진한다(Voegeli, R. 1996. Elastase and typtase determination on human skin surface. Cosmetic &Toiletries. 111, 51-58.). 피부의 색소 침착은 멜라닌 색소이 생합성에서 tyrosinase 효소를 비롯하여 DHICA oxidase(TRP-1)등의 L-tyrosine을 DOPA(3,4-dihydroxyphenyla-lanine)으로 DOPA에서 DOPA quinone으로 초기반응을 조절하는 것으로 알려져 있다(Aroca, P., et al. 1993. Melanin biosynthesis patterns of following hormonal stimulation. J. Biol Chem 268, 25650-25655.; Jimenez-Cervantes C., et al. 1994. A new enzymatic function in the melanogenic pathway. J. Biol Chem 269, 17993-18001.; Paval, S. 1993. Dynamics of melanogenesis intermediates. J. Invest Dermatology 100, 162-165.). 이를 바탕으로 티로시나제(tyrosinase) 효소의 활성을 저해하여 멜라닌 생합성의 억제에 영향을 미칠 수 있는 천연물 탐색에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 결과 어성초 추출물을 이용하여 티로시나제(tyrosinase) 유전자 발현 억제 효과(Chin, J. E., et al. 2005. Effects of Houttuynia cordata extracts on tyrosinse gene expression. J. Korean Soc Food Sci Nutr 34, 1284-1288.), 머루 포도씨 추출물의 α-MSH으로 자극한 B16세포에서 멜라닌(melanin) 생성억제 효과(Lee, P. J. 2009. Inhibitory effect of muscat bailey a seed extract on melanin production in α-MSH stimulated B16 cell. J. Kor Plant Res 22, 477-482.) 등 천연물을 활용한 연구가 활발히 이뤄지고 있다. 그 외 현재 알려져 있는 항산화 및 미백원료는 아르부틴(Arbutin), 코지산(Kojic acid), 아스코르브산(Ascorbic acid) 등의 물질이 대표적이고 상백피, 닥나무, 감초 등의 식물 추출물이 널리 알려져 있다.

염증 반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균 감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상 부위를 수복 재생하려는 기전이다[1]. 일단 자극이 가해지면 국소적으로 염증성 성분과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발하지만 지속적인 염증반응은 도리어 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 여러 질환을 발생시키는 원인이 된다[Willoughby DA. (1975) Human arthritis applied to animal models. Towards a beter therapy. Annals of the Rheumatic Disease. 34, 471-478.]. 대식세포는 선천면역 뿐만 아니라 획득면역 등 다양한 숙주반응에 관여하여 항상성 유지에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 염증반응 시에는 nitric oxide (NO)와 cytokine을 생산하여 감염초기에 생체방어에 중요한 역할을 한다[Higuchi M, Hisgahi N, Taki H and Osawa T. (1990) Cytolytic mechanisms of activatged macrophages. Tumor necrosis factor and L-arginine-dependent mechanismsact synergistically as the major cytolytic mechanisms of activated macrophages. The Journal of Immunology. 144, 1425-1431.]. 포유동물 세포의 nitric oxide synthase (NOS)의 경우, 유사형태가 3가지 존재하는데 neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS), 그리고 inducible NOS (iNOS)이다. 그 중에서 특히 iNOS가 염증반응에 관여한다. nNOS와 eNOS는 항상 발현되어 있으며, iNOS의 경우 Interferon-γ, lipopolysaccharide (LPS) 그리고 여러 가지 염증성 사이토카인의 자극이 있을 때 발현된다. 또한 NO는 급성, 만성 염증반응을 조절하기도 한다. PGE₂는 cyclooxygenase (COX)에 의해서 arachidonic acid로부터 생산된다. COX에 대해서는 1990년대 초반에 주로 연구되었는데, 이 또한 유사형태가 2가지 존재한다. COX-1은 거의 모든 조직에 발현되어 있고, prostaglandin을 생산하여 신장의 혈액흐름을 조절하거나 위장의 세포를 보호하는 등의 생리적인 기능을 조절한다. 반대로 COX-2의 경우는 미생물에 의한 감염이나 손상 혹은 여러 요인의 스트레스에 반응한 대식세포 (Macrphage)에서 발현된다. 즉 iNOS와 COX-2의 발현과 NO, PGE2는 면역세포의 대표적인 염증인자이다. 또한 염증인자로 염증성 사이토카인 (proinflammatory cytokine)인 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)등이 포함된다[Yun HJ, Heo SK, Yi HS, Kim CH, Kim BW and Park SD. (2008) Anti-inflammatory effect of injinho-tang in Raw264.7 Cells. Kor. J. Herbology. 23(2), 169-178.].

낙엽송(일본잎갈나무, Larix kaempferi(Lamb.) Sarg. 이명 Larix leptolepsis (냐듀. et Zucc.) Endl.)은 소나무과에 속하는 침엽수로서 소나무와 함께 우리나라 인공조림 산림의 대부분을 차지하는 대표적 수종으로서 수령이 30-40년에 달해 많은 양이 벌채되어 목재로 가공되고 있다.원목을 목재로 가공하는 제재과정에서 상당량의 수피 및 톱밥이 부산물로 발생되는데 효율적으로 활용되지 못하고 일부가 축사 바닥 깔개 및 과수원의 잡초 성장억제용 깔개로 사용되고 대부분 펠렛 제조용으로 소비되어 땔감으로 소비되고 있다.최근 펠렛 연소시 초미세먼지가 대량으로 발생되는 사실이 밝혀짐에 따라 펠렛으로의 용도도 제한되게 되었다.엄청난 양의 수피 및 톱밥이 발생되는데 유용한 용도 개발이 요구된다. 수피중에 미세한 가시가 존재하여 축사용으로는 사용이 제한된다. 통상 톱밥은 버섯재배용 배지로 사용되는데, 낙엽송 톱밥은 함유된 정유성분 및 수지성분 때문에 6개월 이상 정치하여 정유를 휘산 제거하든지 또는 밀폐공간에 넣고 가열 수증기를 통과시켜 정유성분을 제거하지 않고서는 사용되지 못한다.

탁시폴린의 유용성이 알려진 이후 여러 추출정제방법들이 특허로 등록되었다. 그러나 사용되는 낙엽송이 대부분 만주 잎갈나무 (Larix gmelini, dauhurian larch) , 시베리아 잎갈나무 (Larix siberica , siberian larch), 유럽 잎갈나무 (Larix decidua,european larch ) 들이고 일본 잎갈나무(Larix kaempferi,japanese larch)는 일부특허에서만 인용되고 있다. 식물의 성분은 동속이라 하더라도 함량 및 패턴이 서로 상이한 경우가 많다. 고려인삼과 죽절인삼 및 삼칠근에서 모두 Panax 속이지만, 사포닌의 종류 및 함량이 전혀 다른 것처럼 성분이 상이한 경우가 많다. 일본 잎갈나무는 상기 언급한 들종과는 달리 일본에 자생하는 종을 인공림으로 조림하였고 일본의 북해도 및 동북지방 그리고 한반도에 많이 조림되어 있다. 본 발명은 유럽, 러시아 및 중국 북동부에 자라는 잎갈나무류와는 다른 일본 잎갈나무를 원료로 사용하여 성분을 추출함을 특징으로 한다.

벌채후의 그루터기 자원을 활용하는 방법도 가능하다. 그대로 방치하거나 새롭게 조림하기 위해 뽑아내는 그루터기 부분으로부터 탁시폴린을 추출하여 정제할 수 있다. 낙엽송의 줄기중 탁시폴린의 함량은 지표면에 가까울수록 높기 때문에 유용하게 활용도할 수 있다. 종래기술로는 적송잎에 대하여 아임계 추출과정을 수행하여 얻은 추출물에 대하여 열수 추출과정을 수행하여 프로안토시아니딘(proanthocyanidin)을 추출하는 방법에 관한 발명(한국특허공개특허 제10-2010-0025992호); 소나무 수피를 열수 추출하여 추출물을 얻은 후 이를 여과, 농축한 후 저급 알코올을 이용하여 추출하는 단계를 포함하는 소나무 수피로부터 프로안토시아니딘의 분리방법에 관한 발명(한국특허공개특허 10-2007-0103213호); 원목 및 껍질을 비롯한 목재로부터 아라비노갈락탄 및 플라보노이드 디히드로퀘르세틴 (탁시폴린)을 갖는 아라비노갈락탄을 단리하기 위한 방법에 관한 발명(한국특허공개특허 10-2014-0138882호); 원목, 나무껍질과 뿌리로서 지칭되는 나무 몸통의 아래쪽 부분을 비롯한 목재 일부로부터 플라보노이드 디히드로퀘르세틴 (탁시폴린)을 단리하기 위한 방법에 관한 발명(한국특허공개특허 10-2014-0141593호)가 알려진 바 있다.

본 발명은 낙엽송 원목의 제재과정에서 발생되는 부산물인 수피 및 톱밥으로부터 산업적으로 유용한 폴리페놀 계열의 프로안토시아니딘, 플라보노이드 계열의 탁시폴린, 다당류 계열의 아라비노갈락탄을 단계적으로 추출정제하여 각 추출정제물과 추출하고 남은 추출박을 활용하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 낙엽송의 제재 부산물로서 용도가 거의 없어 폐기되거나 연료용 펠렛 제조에 톱밥 또는 수피로부터 유용한 천연 소재들인 식물정유, 폴리페놀, 플라보노이드, 다당류를 추출 정제하여 각각 유용하게 산업적 용도로 사용하고 버섯배지로 사용할 수 없었던 추출박도 버섯재배용으로 사용할 수 있도록 하는 일련 공정에 관한 것으로서 우리나라 인공 조림 수종 중 수위를 차지하는 산림자원인 낙엽송을 보다 경제적으로 활용할 수 있도록 하는 방법에 관한 것이다.

낙엽송 중에는 유용한 성분들이 다량 함유되어 있음에도 목재로만 활용될 뿐, 국내에선 전혀 활용되고 있지 않고 있다. 본 발명은 제재과정에서 발생되는 수피 및 톱밥 등의 부산물로부터 일련의 공정을 걸쳐 산업적으로 활용될 수 있는 고부가가치의 유용 성분들을 동시에 효율적이며 저렴하게 얻는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

정유를 얻기 위해 가열하는 과정에서 동시에 얻을 수 있는 아라비노갈락탄은 식품 및 화장품 제조시 사용되는 점증제 및 가용화제로 사용된다. 물 추출후의 잔사를 에탄올로 추출하여 얻어지는 탁시폴린은 항산화활성이 우수하여 유럽 및 러시아에서 건강기능식식품, 식품첨가제 및 화장품으로 사용되고 있다. 에탄올 추출 후 남는 추출박은 버섯의 성장을 저해하는 정유 및 수지가 함유되어 있지 않아 버섯 재배용 톱밥으로 활용이 가능하다.

거피한 수피의 50%에탄올 엑스로부터 용이하게 정제되는 프로안토시아니딘은 프랑스 해안송, 포도씨, 카카오닙스 등으로부터 제조되는 프로안토시아니딘과 화학적 조성이 유사하여 노화억제 및 질병 예방 건강식품 및 화장품 소재로 사용될 수 있다.이러한 유용성분을 추출하는 데 사용되는 용매는 주로 물과 에탄올이고 정제공정도 간단하고 경제적인 방법으로 산업적으로 적용할 수 있고 대량 생산이 가능하다.

특허 *******는 소나무 류의 수피로부터 프로안토시아니딘을 추출정제하는 방법을 개시하고 있다. 소나무는 재선충의 확산억제 때문에 벌채 후에 자유로운 이동이 제한되어 활용에 제한이 있다.

유용하게 활용되지 않는 낙엽송 제재 부산물로부터 연속된 공정을 거쳐 항산화 소재 프로안토시아니딘, 부향제 식물정유, 점증제 아라비노갈락탄, 항산화 소재 탁시폴린 및 정유 및 수지가 제거된 톱밥 등 5종의 유용한 천연 성분들을 동시에 얻을 수 있는 방법을 발명하였다. 이들 5종의 천연 화합물 및 소재는 현재 현장에서 사용되고 있는 성분들로서 곧바로 상품화가 가능하다. 연간 수만톤씩 발생되지만 유용하게 활용되지 못하는 제재 부산물로부터 고부가치의 천연소재를 한꺼번에 생산할 수 있는 일련의 공정을 개발하였다는데 의의가 있다.

이에 본 발명자들은 낙엽송 부산물로부터 다량의 유효성분을 함유한 낙엽송 부산물 정제 추출물을 효과적으로 분리하는 정제 방법을 개발하고 상기 정제방법으로 제조된 정제 추출물에 대하여 낙엽송 수피 추출물(PAC)의 프로안토시아니딘(Proanthocyanidin) 정량 분석법, 낙엽송 심재 추출물(TAX)의 택시폴린(Taxifolin) 정량 분석 실험 (실험예 1); DPPH 라디칼(radical) 소거능 측정법, ABTS 라디칼 양이온(radical cation) 소거능 측정법, SOD 유사활성 즉정법, 슈퍼옥시드(Superoxide) 양이온 라디칼(anion radical) 소거능 측정법, Nitric oxide(NO) 저해능 측정법, 히드로겐 과산화물(Hydrogen peroxides) 소거능 측정법에 의한 항산화 효능 실험 (실험예 2); 엘라스타제(Elastase) 저해활성 측정실험, 콜라게나제 저해활성 측정법 등의 주름 개선 효능 실험 ( 실험예 3); 생육 저해환 (Clear zone) 측정응 통한 항균력 측정실험(실험예 4); MTT assay에 의한 세포 생존능력 측정실험(실험예 5); Nitric oxide 저해활성 측정실험, Western blot을 통한 iNOS, COX2 단백질 발현 확인 실험 등의 항염 효과 검증실험(실험예 6) 등을 통하여 항염, 주름개선 및 피부노화 치료효과를 확인하여, 항염, 주름개선 및 피부노화의 치료 및 예방용 조성물로 유용함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 낙엽송 부산물로부터 다량의 유효성분을 함유한 낙엽송 부산물 정제 추출물을 효과적으로 분리하는 정제 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 정제방법으로 제조된 낙엽송 부산물 정제 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 및 피부노화의 치료 및 예방용 피부외용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 정제방법으로 제조된 낙엽송 부산물 정제 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 및 피부노화의 개선 및 예방용 화장료 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 “낙엽송”은 일본잎갈나무 (Larix kaempferi(Lamb.) Sarg. 이명 Larix leptolepsis (냐듀. et Zucc.) Endl.), 만주 잎갈나무 (Larix gmelini, dauhurian larch) , 시베리아 잎갈나무 (Larix siberica , siberian larch), 유럽 잎갈나무 (Larix decidua,european larch ) 등의 소나무과에 속하는 낙엽송, 바람직하게는, 일본 잎갈나무(Larix kaempferi,japanese larch)을 포함한다.

본원에서 정의되는 “부산물”은 낙엽송 원목의 제재과정에서 발생되는 부산물인 수피, 톱밥 또는 이의 혼합물을 포함하다.

본원에서 정의되는 “유효성분”은 폴리페놀 계열의 프로안토시아니딘, 플라보노이드 계열의 탁시폴린, 다당류 계열의 아라비노갈락탄 등을 포함한다.

구체적으로, 본 발명의 하나의 일례로서, 본 발명은 음건한 낙엽송, 바람직하게는 일본잎갈나무 (Larix kaempferi(Lamb.) Sarg. ) 목재 중 목부에서 변재를 최대한 제거한 심재 목부를 대패밥으로 가공한 것 및 수피를 곱게 분쇄하여 분말원료를 제공하는 제 1단계; 제 1단계의 분말원료 중량의 1 내지 50배 부피(v/w), 바람직하게는, 3 내지 30배 부피(v/w), 보다 바람직하게는, 5 내지 10배 부피(v/w)의 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 주정 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 또는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 또는 10 내지 99%, 보다 더 바람직하게는, 20 내지 70% 물 및 에탄올 혼합용매를 수회 섞은 다음에 30 내지 150℃, 바람직하게는 40 내지 120℃에서 30분 내지 48시간, 바람직하게는 1시간 내지 24시간 동안 초음파 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법 또는 환류냉각추출법, 바람직하게는 환류냉각추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 조추출물을 얻는 제 2단계; 2 단계의 조추출물을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 건조 조추출물을 얻는 제 3단계; 제 3단계의 건조 조추출물 중량의 1 내지 100 배 부피(v/w), 바람직하게는, 3 내지 50 배 부피(v/w), 보다 바람직하게는, 7 내지 20 배 부피(v/w)의 에탄올을 넣고 가용화하고 원심 분리한 뒤, 상등액과 침전물을 분리하고, 동일한 방법으로 3회 반복한 뒤, 상등액을 감압 농축하여 프로안토시아니딘(Proanthocyanidin)를 다량 함유하는 낙엽송 수피 분획물을 얻는 제 4단계; 상기 낙엽송 수피 분획물을 건조 및 분쇄하여 낙엽송 수피 분획물 건조물(이하, “PAC-1”이라 함)을 얻는 제 5단계 공정을 포함하는 프로안토시아니딘(Proanthocyanidin)를 다량 함유하는 낙엽송 수피 분획물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 하나의 일례로서, 본 발명은 음건한 낙엽송, 바람직하게는 일본잎갈나무 (Larix kaempferi(Lamb.) Sarg. ) 목재 중 목부에서 변재를 최대한 제거한 심재 목부를 대패밥으로 가공한 것 및 수피를 곱게 분쇄하여 분말원료를 제공하는 제 1단계; 제 1단계의 분말원료 중량의 1 내지 50배 부피(v/w), 바람직하게는, 3 내지 30배 부피(v/w), 보다 바람직하게는, 5 내지 10배 부피(v/w)의 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 주정 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 또는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 또는 10 내지 99%, 보다 더 바람직하게는, 20 내지 70% 물 및 에탄올 혼합용매를 수회 섞은 다음에 30 내지 150℃, 바람직하게는 40 내지 120℃, 보다 바람직하게는 60 내지 90℃에서 30분 내지 24시간, 바람직하게는 1시간 내지 6시간 동안 초음파 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법 또는 환류냉각추출법, 바람직하게는 환류냉각추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 조추출물을 얻는 제 2단계; 2 단계의 조추출물을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 건조 조추출물을 얻는 제 3단계; 제 3단계의 건조 조추출물 중량의 0.1 내지 10 배 부피(v/w), 바람직하게는, 0.5 내지 5 배 부피(v/w), 보다 바람직하게는, 1 내지 3 배 부피(v/w)의 물을 넣고 가용화하고 분획 추출하여 탁시폴린을 다량 함유하는 낙엽송 심재 추출물(Taxifolin Rich Extract) 를을 얻는 제 4단계; 상기 낙엽송 심재 추출물을 건조 및 분쇄하여 낙엽송 심재 추출물 건조물(이하, “TAX”이라 함)을 얻는 제 5단계 공정을 포함하는 탁시폴린을 다량 함유하는 낙엽송 심재 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 하나의 일례로서, 본 발명은 상기 낙엽송 수피 분획물 건조물(이하, “PAC-1”이라 함) 또는 낙엽송 심재 추출물 건조물(이하, “TAX”이라 함) 에 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 메탄올, 물 및 이들의 혼합용매 등의 극성을 증가시키는 방법을 이용하여 소량 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법, 플래쉬 컬럼크로마토그래피, RP C18 컬럼크로마토그래피 또는 실리카겔 오픈 컬럼크로마토그래피 등의 크로마토그래피를 이용한 정제방법을 선택적으로 수회 반복 수행하여 재결정법 등의 정제 방법을 반복 수행하여 본 발명의 유효성분 화합물들 즉, 폴리페놀 계열의 프로안토시아니딘, 플라보노이드 계열의 탁시폴린, 다당류 계열의 아라비노갈락탄 등을 각각 정제 및 수득할 수 있다.

본원에서 정의되는 “낙엽송 부산물 정제 추출물”은 탁시폴린을 다량 함유하는, 1 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 5%, 보다 바람직하게는 1 내지 4%(w/w)을 함유하는 낙엽송 심재 추출물 건조물(Taxifolin Rich Extract: “TAX”) 또는 프로안토시아니딘을 다량 함유하는, 1 내지 15%, 바람직하게는 5 내지 12%, 보다 바람직하게는 6 내지 10%(w/w)을 함유하는 낙엽송 수피 분획물 건조물(Proanthocyanidin Rich Extract; PAC-1) 등을 포함한다.

본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 낙엽송 부산물 정제 추출물, 바람직하게는 탁시폴린을 다량 함유하는, 1 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 5%, 보다 바람직하게는 1 내지 4%(w/w)을 함유하는 신규 낙엽송 심재 추출물 건조물(Taxifolin Rich Extract: “TAX”) 또는 프로안토시아니딘을 다량 함유하는, 1 내지 15%, 바람직하게는 5 내지 12%, 보다 바람직하게는 6 내지 10%(w/w)을 함유하는 신규 낙엽송 수피 분획물 건조물(Proanthocyanidin Rich Extract; PAC-1)을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 낙엽송 부산물 정제 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화, 항염, 및 주름억제 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 낙엽송 부산물 정제 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화, 항염, 및 주름억제 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 제조방법에서 얻어지는 낙엽송 부산물 정제 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화, 항염, 주름억제 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 상기 피부노화는 주름살, 기미, 주근깨, 자외선에 의한 피부 손상, 또는 피부암을 포함함을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 상기 항염은 피부염, 피부 알레르기, 접촉염, 담마진 등을 포함함을 특징으로 한다.

상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형을 포함한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형을 포함한다.

본 발명자들은 본 발명의 낙엽송 부산물 정제 추출물에 대하여 낙엽송 수피 추출물(PAC)의 프로안토시아니딘(Proanthocyanidin) 정량 분석법, 낙엽송 심재 추출물(TAX)의 택시폴린(Taxifolin) 정량 분석 실험 (실험예 1); DPPH 라디칼(radical) 소거능 측정법, ABTS 라디칼 양이온(radical cation) 소거능 측정법, SOD 유사활성 즉정법, 슈퍼옥시드(Superoxide) 양이온 라디칼(anion radical) 소거능 측정법, Nitric oxide(NO) 저해능 측정법, 히드로겐 과산화물(Hydrogen peroxides) 소거능 측정법에 의한 항산화 효능 실험 (실험예 2); 엘라스타제(Elastase) 저해활성 측정실험, 콜라게나제 저해활성 측정법 등의 주름 개선 효능 실험 ( 실험예 3); 생육 저해환 (Clear zone) 측정응 통한 항균력 측정실험(실험예 4); MTT assay에 의한 세포 생존능력 측정실험(실험예 5); Nitric oxide 저해활성 측정실험, Western blot을 통한 iNOS, COX2 단백질 발현 확인 실험 등의 항염 효과 검증실험( 실험예 6); 등을 통하여 항염, 주름개선 및 피부노화 치료효과를 확인하여, 항염, 주름개선 및 피부노화 치료 및 예방용 조성물로 유용함을 확인하였다.

또한, 본 발명의 시료들은 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어 오던 약재로서 이들로부터 추출된 본 발명의 추출물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없으며, 피부 첩포 시험에서 무자극 시료임이 입증되었으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 피부외용 약학조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 복합생약 추출물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 항염 효과를 갖는 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 팩 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 dl-알파 토코페롤, 니코틴산 dl-알파 토코페롤비타민 E, dl-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 - 5 % 중량, 보다 바람직하게는 0.01 - 3 % 중량로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 복합생약 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

낙엽송 부산물로부터 다량의 유효성분을 함유한 낙엽송 부산물 정제 추출물을 효과적으로 분리하는 정제 방법 및 상기 낙엽송 부산물 정제 추출물은 낙엽송 부산물 정제 추출물에 대하여 낙엽송 수피 추출물(PAC)의 프로안토시아니딘(Proanthocyanidin) 정량 분석법, 낙엽송 심재 추출물(TAX)의 택시폴린(Taxifolin) 정량 분석 실험 (실험예 1); DPPH 라디칼(radical) 소거능 측정법, ABTS 라디칼 양이온(radical cation) 소거능 측정법, SOD 유사활성 즉정법, 슈퍼옥시드(Superoxide) 양이온 라디칼(anion radical) 소거능 측정법, Nitric oxide(NO) 저해능 측정법, 히드로겐 과산화물(Hydrogen peroxides) 소거능 측정법에 의한 항산화 효능 실험 (실험예 2); 엘라스타제(Elastase) 저해활성 측정실험, 콜라게나제 저해활성 측정법 등의 주름 개선 효능 실험 ( 실험예 3); 생육 저해환 (Clear zone) 측정응 통한 항균력 측정실험(실험예 4); MTT assay에 의한 세포 생존능력 측정실험(실험예 5); Nitric oxide 저해활성 측정실험, Western blot을 통한 iNOS, COX2 단백질 발현 확인 실험 등의 항염 효과 검증실험( 실험예 6); 등을 통하여 항염, 주름개선 및 피부노화 치료효과를 확인하여, 항염, 주름개선 및 피부노화의 치료 및 예방용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1는 본 발명의 낙엽송 수피로부터 PAC 정제물을 분리하는 정제과정을 나타낸 도이며;
도 2는 본 발명의 낙엽송 수피로부터 얻는 PAC 정제물의 TLC 실험결과를 나타낸 도이며(여기에서, La : Proanthocyanidin rich Ext B(PAC) of Larix kaempferi , 1 : Grape seed Ext. degraded by enzyme treatment. 2 : French maritime pine bark Ex., 3 : Cacao nibs 50% EtOH extract을 의미함);
도 3는 본 발명의 낙엽송 수피로부터 PAC-1 정제물을 분리하는 정제과정을 나타낸 도이며;
도 4는 본 발명의 낙엽송 심재로부터 TAX 정제물을 분리하는 정제과정을 나타낸 도이며;
도 5는 본 발명의 낙엽송 수피로부터 얻는 TAX 정제물의 TLC 실험결과를 나타낸 도이며(여기에서도 S(Sample) : TAX, T(Standard) : Taxifolin (98%, Biopurify)을 의미함);
도 6는 본 발명의 낙엽송 수피로부터 TCR 정제물을 정제하는 정제과정을 나타낸 도이며;
도 7는 본 발명의 낙엽송 수피로부터 얻는 Column fraction 정제물의 TLC 실험결과를 나타낸 도이며(여기에서, T : Taxifolin Standard, Q : Quercetin Standard, L : Loading sample, ① : DM 15:1 Fraction-1, ② : DM 15:1 Fraction-2, ③ : DM 15:1 Fraction-3, ④ : DM 7:1 Fraction-1, ⑤ : DM 7:1 Fraction-2, ⑥ : DM 7:1 Fraction-3을 의미함);
도 8는 본 발명의 낙엽송 수피로부터 얻는 Column fraction으로부터 얻은 TCR 정제물의 TLC 실험결과를 나타낸 도이며(여기에서, T : Taxifolin Standard, Q : Quercetin Standard, L : Loading sample, ② : DM 15:1 Fraction-2, ③ : DM 15:1 Fraction-3, C② : TCR from ② Flask, C③ : TCR from ③ Flask을 의미함);
도 9는 본 발명의 낙엽송 수피로부터 얻는 Column fraction으로부터 얻은 TCR 정제물의 사진이며
도 10는 본 발명의 낙엽송 수피로부터 얻는 TAX 정제물의 HPLC 실험조건을 나타낸 도이며(자체 분석);
도 11는 본 발명의 낙엽송 수피로부터 얻는 TAX 정제물의 HPLC 실험조건을 나타낸 도이며(외부 기관분석);
도 12는 본 발명의 시료의 전자공여능 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, TAX : Taxifolin Crystal, PAC : Proanthocyanidin Rich Extract, BHA : Butylated Hydroxy Anisole를 각각 의미하고 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 13는 본 발명의 시료의 ABTS 라디칼 소거활성 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, TAX : Taxifolin Crystal, PAC : Proanthocyanidin Rich Extract, BHA : Butylated Hydroxy Anisole를 각각 의미하고 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 14는 본 발명의 시료의 SOD-유사 활성 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, TAX : Taxifolin Crystal, PAC : Proanthocyanidin Rich Extract, AA : ascorbic acid를 각각 의미하고 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 15는 본 발명의 시료의 크산틴-옥시다제에 대한 수퍼옥시드 음이온 라디칼 소거활성 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, TAX : Taxifolin Crystal, PAC : Proanthocyanidin Rich Extract, AA : ascorbic acid를 각각 의미하고 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 16는 본 발명의 시료의 Nitiric oxide 소거활성 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, TAX : Taxifolin Crystal, PAC : Proanthocyanidin Rich Extract, AA : ascorbic acid를 각각 의미하고 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 17는 본 발명의 시료의 Hydrogen peroxide 소거활성 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, TAX : Taxifolin Crystal, PAC : Proanthocyanidin Rich Extract, AA : ascorbic acid를 각각 의미하고 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 18는 본 발명의 시료의 엘라스타제 억제활성 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, TAX : Taxifolin Crystal, PAC : Proanthocyanidin Rich Extract, EGCG : Epigallocatechin gallate를 각각 의미하고 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 19는 본 발명의 시료의 콜라게나제 억제활성 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, TAX : Taxifolin Crystal, PAC : Proanthocyanidin Rich Extract, EGCG : Epigallocatechin gallate.를 각각 의미하고 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 20는 본 발명의 시료의 항균 활성 실험 결과를 나타낸 도이며
도 21는 본 발명의 시료의 세포 생존율에 미치는 영향을 나타낸 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, TAX : Taxifolin Crystal, PAC : Proanthocyanidin Rich Extract를 각각 의미하고, 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 22는 본 발명의 시료의 RAW264 . 7세포에서의 Nitric oxide 소거활성을 나타낸 실험 결과를 나타낸 도이며 (여기에서, Con : Control, LPS : Lipopolysaccharide, TAX : Taxifolin Crystal, PAC : Proanthocyanidin Rich Extract를 각각 의미하고, 결과는 3중치 평균(means) ± S.D.로 나타냄);
도 23는 본 발명의 시료의 LPS-자극 RAW264 . 7세포에서의 iNOS 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 실험 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: : Proanthocyanidin(PAC)시료의 추출 및 분리

1-1. 낙엽송 추출

본 실험에서 사용한 Larix Kaempferi (落葉松,낙엽송)은 2016년 10월 경기도 여주시 농산로에 위치한 산림조합중앙회 목재유통센터로부터 구입한 것으로, 음건한 낙엽송 목재 중 지상부 1m부위의 목부에서 변재를 최대한 제거한 심재 목부를 대패밥으로 가공한 것 과 수피를 실험 재료로 사용하였다. 실험에 사용된 낙엽송 심재 대패밥 과 수피는 모두 제분소에서 햄머밀로 곱게 분쇄한 분말을 추출에 사용하였다.

1-2. 추출 및 정제

(1) Proanthocyanidin(PAC)시료의 추출

물 추출의 경우 낙엽송 수피 분말 300g을 8배의 양(24L)을 가하여 100℃에서 2 시간동안 열수 추출하여 여과하고, 이 과정을 3회 반복하여 물 추출물 13.68g(4.6%)을 얻었다.

50% 에탄올 추출의 경우 낙엽송 수피 분말 500g을 8배의 양(40L)을 가하여 75℃ 에서 1시간동안 환류 냉각 추출하여 여과하고, 이 과정을 2회 반복하여 50%에탄올추출물 53.1g(10.62%)을 얻었다.

(2) PAC추출을 위한 낙엽송 수피 추출물의 정제

Proanthocyanidin Rich Extract을 얻기 위하여, 물 추출물 13.68g을 10배의(약 140ml)의 에탄올을 넣고 가용화하여 원심 분리한 뒤, 상등액과 침전물을 분리하고, 동일한 방법으로 3회 반복한 뒤, 상등액을 감압 농축하여 Proanthocyanidin다량 함유하는 낙엽송 수피 분획물 5.74g(2%)을 얻었다. 이 추출물은 유발에서 곱게 분쇄하여 powder(PAC)로 만들어 냉장보관하여 sample로 사용하였다(도 1 및 도 2).

또한 50% 에탄올 추출물 53.1g을 10배의 에탄올(5,310ml)을 넣고 가용화하여 원심 분리한 뒤, 상등액과 침전물을 분리하고, 동일한 방법으로 3회 반복한 뒤, 상등액을 감압 농축하여 프로안토시아니딘을 다량 함유하는 낙엽송 수피 추출물(Proanthocyanidin Rich Extract 2) 42.5g(8.5%)을 얻었다. 이 추출물은 유발에서 곱게 분쇄하여 powder(PAC-1)로 만들어 냉장보관하여 sample로 사용하였다(도 3 ).

실시예 2: : Taxifolin(TAX)시료의 추출 및 분리

2-1. Taxifolin(TAX)시료의 추출

Taxifolin Rich Extract의 경우, 낙엽송 심재 대패밥 분말 3kg를 95% 에탄올 6배 양(18L=14.5kg)을 가하여 초음파 처리 된 80℃수욕 에서 중탕하여 1시간동안 환류 냉각 추출하여 침전물과 상등액을 분리하고, 동일한 방법으로 1회 반복하여 조 추출물155.8g (5.2%)을 얻었다.

이 조 추출물에 동량의 물(156ml)을 넣고 분획 추출하여 탁시폴린을 다량 함유하는 낙엽송 심재 추출물(Taxifolin Rich Extract) 108.64g (3.6%)얻었다. 이 추출물은 dry oven에 건조하고 유발에서 곱게 분쇄하여 powder(TAX)로 만들어준 다음 시약 병에 넣어 냉장실에 보관하면서 본 연구의 sample로 사용하였다 (도 4 및 도 5).

2-2. Taxifolin 추출을 위한 낙엽송 심재 추출물의 정제

낙엽송 심재 에탄올 추출물을 시료로 하여 극 소량 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용해 Taxifolin을 고 순도로 정제 하는 공정을 확립했다(Fig.6=도 6).

극 소량 실리카겔 컬럼 크로마토그래피란, 일반적으로 컬럼 크로마토그래피에 사용하는 실리카겔 양의 1/10만 사용하여 물질을 분리하는 정제 방법으로, 충진재인 실리카겔의 사용량이 일반적인 사용량에 비해 1/10만큼 적기 때문에 경제적으로 산업에 이용 될 것으로 기대 된다.

낙엽송 심재 (지상부 1m) 분말 500g을 6배 용량의 95% 에탄올에 2차례 추출한 조 추출물21.1g 중 절 반을 약 2배 (52ml)의 95% 에탄올에 다시 녹여 액상으로 만들어 주었다. 이 액상에 2배의 실리카겔(21.1g)을 넣고 흡착시켜 검체를 제조 하였다. 실리카겔(21.1g)을 DM(15:1)에 진탕해둔 뒤 컬럼을 제작하고(1BV=100ml), 제조 해 둔 검체를 로딩시켜 DM(15:1) 용매를 3BV (300ml) 흘려 용리 해 주었다. 250ml 삼각 플라스크 3개에 용출액을 1BV(100ml)씩 나누어 수집하고(①②③), 다시 DM(7:1) 용매를 3BV (300ml) 흘려준 뒤, 250ml 삼각 플라스크 3개에 용출액을 1BV(100ml)씩 나누어 수집하였다(④⑤⑥). 각 용출액들을 모두 TLC 비교해본 결과, DM(15:1) 두번째 플라스크(②) 에서 부터 Taxifolin이 관찰되었고 , DM(7:1) 두 번째 플라스크(⑤)까지 Taxifolin spot이 나타났다(Fig.7=도 7). 각 분획들의 플라스크입구를 휴지로 막고 후드에서 하루 정치한 뒤, ②,③,④,⑤ 플라스크 바닥에 백색~미황색의 좁쌀형 결정이 생성된 것을 확인 하였다.

탁시폴린 조 결정(백색~미황색) 중 TLC상에서 퀘르세틴으로 추정되는 황색 결정이 함께 혼합되어 있는 것 으로 보아 향후 추가 공정을 거쳐 95% 이상의 고순도 탁시폴린 결정을 분리할 수 있을 것이다(도 8)).

낙엽송 심재 추출물중 탁시폴린을 고 순도로 정제하기 위해 컬럼 크로마토 그래피를 실시하였고, 분획을 수집한 각 플라스크마다 결정이 생성됨을 확인하였다. 이 결정을 에탄올에 녹여 검액으로 만들어TLC상에서 점검하고 탁시폴린 결정(TCR) 임을 확인 한 뒤, 감압 여과 하여 상등액과 분리하여 모두 합쳐 총 1.8g을 얻었다 (수율 1.7%)(도 9).

실험예 1: : 정략분석실험

1-1. 낙엽송 수피 추출물(PAC)의 Proanthocyanidin 정량 분석

낙엽송 수피 추출물(PAC)의 경우, 96well에서 ELISA (micro plate reader)를 이용해 흡광도를 측정하여 PAC함량을 알아보는 Vanillin- H₂O₄ 비색 정량 분석법을 사용하여 카테킨 대비 PAC 함량을 하기 수학식 1의 계상방법으로 확인하였다.

(1) 분석 기기: ELISA (micro plate reader)

(2) 분석 방법: Vanillin-H₂O₄법

검액 및 표준액을 메탄올에 녹여 0.7mg/ml 농도로 제조하였다. 제조된 각 용액을 30ul씩 분취한 후 1%바닐린메탄올 용액과 25%황산 메탄올 용액을 각각 75ul씩 가하였다. 20동안 실온에서 정치한 후 500nm에서 흡광도를 측정하였다. Blank는 검액 30ul에 메탄올 150ul를 가한 후 흡광도를 측정하였다.

(3) 계산방법

[수학식 1]

검액 내 PAC의 양(mg/ml):

=(표준액 중 카테킨 농도) x (검액의 흡광도) / (표준액의 흡광도)

검체 내 PAC의 함량(%):

= (검액 중 PAC농도) x (검액의 양) x 1/ (검체의 양)

1-2. 낙엽송 심재 추출물(TAX)의 Taxifolin 정량 분석.

낙엽송 심재 추출물(TAX)의 경우, 탁시폴린을 표준품으로 하여 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)기기를 이용해 정량분석 하였다.

(1) 분석 기기 : HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

(2) 분석 방법

- 자체 HPLC 분석 조건 및 컬럼 규격

○ 분석 시 유속은 1ml/min이고, Injection volume은 10㎕로 하였으며, 0.5% Acetic Acid /Water (A)와 0.5% Acetic Acid/Acetonitrile (B)를 이동상으로 하였다. 85(A)/15(B)에서 80(A)/20(B)로 30분동안 Gredient 한 뒤, PDA Detector 288nm에서 chromathogram을 확인 하였다(도 10).

- 외부 기관 HPLC 분석 조건 및 컬럼 규격

○ 분석 시 유속은 0.5ml/min이고, Injection volume은 10㎕로 하였으며, Water(A)와 Acetonitrile(B)를 이동상으로 하였다. 85(A)/15(B)에서 80(A)/20(B)로 30분동안 Gredient 한 뒤, PDA Detector 288nm에서 chromathogram을 확인 하였다. (도 11).

실험예 2. 항산화 효과 확인

2-1. DPPH radical 소거능 측정

상기 실시예 시료의 전자공여능(electron donating ability) 을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 Blois의 방법을 변형하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Blois MS. (1958) Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature, 26, 1199-1120.))

전자공여능(EDA; electron donating ability)은 Blois의 방법(1958)에 따라 측정하였다. 각 시료용액 2ml에 0.2mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 1ml 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여 능은 시료용액의 첨가구와 무 첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

1,1 Diphenyl-2-picryl-hydrazil (DPPH) 라디칼을 이용한 항산화능 측정법은 주로 phenolic 구조와 aromatic amine 화합물에서 많이 사용되는 방법이다. DPPH alcohol 용액은 517nm에서 가장 강한 UV 흡수가 있으며 실온에서 매우 안정한 유리 라디칼이다. 전자공여체로부터 전자나 hydrogen radical을 받아 phenoxy radical을 생성하게 됨으로써 517nm에서 나타났던 DPPH의 특이적인 흡수 band가 사라지게 된다. 가시적인 DPPH의 보라색은 안정해진 분자의 몰수에 비례하여 노란색으로 변하게 된다. 낙엽송 추출물(TAX, PAC) 양성 대조군인 BHA와 유사한 전자공여능의 활성을 나타내었다. 특히 TAX의 경우 100ug/ml농도에서 85.76%로 가장 높은 전자공여능 활성을 나타내었다(도 12).

2-2. ABTS radical cation 소거능 측정

상기 실시예 시료의 ABTS 라디칼 양이온 탈색화(radical cation decolorization) 법에 의한 항산화 효능을 시험하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Roterta, R., P. Nicoletta, P. Anna, P. Ananth, Y. Min and R.E. Catherine. 1999. Antioxidant Activity Applying an Improved ABTS　Radical Cation Decolorization Assay. Radic . Biol . Med . 26, 1231-1237.)

ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS⁺ cation decolorization assay 방법(Roberta, et al., 1999)에 의하여 측정하였다. 7mM 2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulfonic acid)와 2.4mM potassium persulfate를 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS⁺을 형성시킨 후 ethanol로 희석 하여 ABTS⁺100 ul에 시료 100ul를 가하여 1분 동안 방치한 후 732nm에서 흡광도를 측정 하였다.

- ABTS radical cation 소거능 결과

ABTS 라디칼 소거능은 추출물들의 상대적인 항산화효과 측정인 hydrogen-donating antioxidant와 chain breaking antioxidant 모두를 측정할 수 있다. 또한 aqueous phase 모두에 적용이 가능하며 표준물질 사용으로 추출물의 상대비교가 가능하도록 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS⁺ free radical이 추출물속의 항산화 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한다. 낙엽송 추출물 모두 50ug/ml 농도에서 97% 이상의 ABTS 라디칼 소거능의 활성을 나타내었다. 10ug/ml농도에서 TAX의 경우 76.6%로 높은 ABTS 라디칼 소거능을 나타내었다(도 13).

2-3. Superoxide dismutase(SOD) 유사활성 측정

상기 실시예 시료의 SOD 유사활성법에 의한 항산화 효능을 실험하였다

SOD 유사활성은 Marklund의 방법에 따라 측정한다. 각 시료용액 0.2ml에 Tris-HCl 완충용액 (50mM tris+10mM EDTA, pH 8.5) 2.6mL와 7.2mM pyrogallol 0.2ml 가하여 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1M HCl 0.1ml를 가하여 반응을 정지시키고 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양을 420nm에서 측정한다. SOD 유사활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타낸다.

항산화 효소 중의 하나인 superoxide dismutase(SOD)는 생체에 매우 유해한 superoxide anion radical과 반응하여 hydrogen peroxide(H₂O₂)를 생성하는 효소로, 산소를 소비하는 모든 생물 종에 존재하여 생체 내에서 활성산소 장애에 대한 방어 작용을 하는 대표적인 활성산소 저해제이다. 또한 SOD는 자유 라디칼을 근본적으로 제거하는 효소이고 다른 종류의 항산화제보다 우수한 효과를 나타내기 때문에 의약제재로서 많은 관심을 일으키고 있으며, 현재 항염증제재나 피부 노화방지를 위한 미용제재로 화장품 등에 이용되고 있다. 낙엽송추출물의 Superoxide dismutase(SOD)를 측정한 결과 PAC 1,000ug/ml의 농도에서 79.84%의 높은 유사활성능을 나타내었으며, TAX의 경우 양성대조군에 비해 낮은 유사활성을 나타었다. (도 14).

2-4. Superoxide anion radical(O ^2- ) 소거능 측정

상기 실시예 시료의 Superoxide anion radical 소거능법에 의한 항산화 효능을 시험하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Stirpe F and Della Corte E. 1969)

Superoxide anion radical 소거능은 nitroblue tetrazolium (NBT) 환원방법에(Stirpe F and Della Corte E. 1969) 의해 측정하였다. 각 시료용액 0.1ml와 0.1M potassium phosphate buffer (pH 7.5) 0.6ml에 xanthine (0.4mM)과 NBT (0.24mM)을 녹인 기질액 1ml를 첨가하고 xanthine oxidase (0.049U/ml) 1ml를 가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 1N HCL 1ml를 가하여 반응을 종료 시킨 다음, 반응액 중에 생성된 superoxide anion radical의 양을 560nm에서 흡광도를 측정하였다.

- Superoxide anion radical(O^2-) 소거능 결과

활성산소는 생물학적 반응에서 세포내 효소 또는 대부분의 전자 운반과정에서 만들어지며 안정되지 못하여 강한 활성을 가진다. 활성산소는 분자나 이온과 다르게 1개 이상의 짝 없는 전자를 갖는 화학물질로서 여러 가지 물질대사를 영위하는데 이용되지만 자외선, 생화학적 반응 등으로 ¹O₂, O^2-, OH, hydrogen peroxide 등 free radical의 생산이 과잉되면 생체에 대하여 독성을 나타내어 여러 가지 질환의 발생기전에 관여한다고 한다.

Superoxide anion radical 실험에서는 ascorbic acid(AA)를 대조물질로 사용하였으며 실험결과는 도 15에 나타내었다. 대조군으로 사용한 AA의 경우 100ug/ml 에서 26.95%의 효과를 나타낸것에 비해, TAX의 경우 58.54%의 높은 소거능을 나타내며, 추출물 모두 농도가 증가할수록 Superoxide anion radical 소거능이 우수하게 나타났다.

2-5. Nitric oxide(NO) 저해능 측정

상기 실시예 시료의 Nitric oxide(NO) 저해능 측정법에 의한 항산화 효능을 시험하기 위하여 하기와 같이 실험하였다. Nitric oxide radical 저해활성은 Marcocci등의 방법에 따라 측정한다. Sodium nitroprusside solutions는 10mM sodium nitroprusside을 20mM Phosphate buffer (pH 7.4)에 녹여 제조한다. 50μl의 시료와 50μl의 Sodium nitroprusside solutions를 25℃에서 150분간 반응시킨다. 반응액 0.1ml과 Griess reagent solution을 1 : 1로 반응시켜 540nm에서 흡광도를 측정한다.

Nitric oxide (NO)는 gas상의 단순한 무기 radical로 자연계에 존재하고 있다. NO는 L-arginine으로부터 nitric oxide synthase (NOS)에 의해 만들어지며, NOS는 항상성 유지에 필요한 NO를 생성하는 endothelial NOS (eNOS) 및 neuronal NOS (nNOS)와 염증성 인자 등에 의해 유도되는 inducible NOS (iNOS)로 분류할 수 있다. iNOS (inducible nitiric oxide synthase)는 macrophage, 혈관내피세포, 혈관 평활근 세포, 소화관 상피세포, 간세포 등에서 많이 발현되어 장시간 동안 NO를 형성하며, 생성된 NO는 염증반응에 있어서 중요한 mediator로 작용한다. 고농도의 NO는 DNA에 손상을 줄 수 있으며, superoxide ion과 반응 시에 peroxynitrite를 만드는데, peroxynitrite는 hydroxyl radical을 형성하여 조직의 파괴를 일으킬 수 있다.

염증과 항산화에 관련된 nitric oxide radical 소거능을 측정한 결과 도 16과 같이 나타내었다. TAX의 경우 100, 500, 1,000ug/ml에서 각각 16.88%, 27,68%, 56,74%의 nitric oxide radical 소거능을 나타내어 가능성을 확인할 수 있었다.

2-6. Hydrogen peroxides 소거능 측정

상기 실시예 시료의 Hydrogen peroxides 소거능 측정법에 의한 항산화 효능을 시험하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

Hydrogen peroxide 저해활성은 Hydrogen peroxides assay(Jayaprakasha et al., 2004)에 의해 측정하였다. 농도별 시료용액 1ml와 phosphate-buffer saline(PBS at pH 7.4)에 녹인 40mM hydrogen peroxide solution 2ml를 37℃에서 10분 간 반응시킨 후 반응액 중에 저해된 hydrogen peroxide의 양을 230nm에서 흡광도를 측정하였다.

6. Hydrogen peroxides 소거능 측정

Hydrogen peroxide는 산소의 환원대사물질로서 미토콘드리아나 peroxisome 등의 정상세포로부터 형성 되거나 다양한 외부 요소에 의해 형성되는데, DNA 및 단백질 손상을 유발하거나 생체막 구성 성분인 불포화 지방산을 공격하여 과산화 지질을 생성함으로써 생체기능저하 또는 노화 및 성인병을 유발하는 것으로 알려져 있다.

도 17은 낙엽송추출물의 hydrogen peroxide의 소거활성 결과로서 농도 의존적인 저해 활성을 나타내었으며, PAC 10ug/ml의 농도에서 71.0%의 높은 hydrogen peroxides 소거능을 확인 할 수 있었다.

실험예 3. 주름 개선 효능 실험

3-1. 엘라스타제(Elastase) 저해활성 측정

실시예에서 얻은 시료들의 엘라스타제 (Elastase) 저해활성을 시험하기 위하여 카넬 (Cannell) 등을 응용하여 하기와 같이 실험하였다[Cannell RJP, Kellan SJ, Owsianks AM and Walker JM. (1988) Results of a large scale screen of microalgae for the production of protease inhibitors. Planta Media. 54(1), 10-14].

Elastase는 단백질인 엘라스틴을 분해하는 효소로 다른 중요한 기질 단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다. 피부의 진피조직 속에는 collagen과 피부의 탄력성에 관련된 elastin이 그물망 구조를 형성하고 있는데, elastin이 elastase에 의해 분해되어 피부의 그물망 구조 결합이 끊어짐으로, elastase가 주름생성의 주원인 효소로 알려져 있다. 그리고 체내의 elastin을 분해하는 백혈구 과립 효소 중의 하나로 이상조직에서는 효소의 활성이 극히 높아 조직 파괴에 직접적인 원인이 되어 피부의 주름 및 탄력성 소실을 유발한다.

추출물을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5ml씩 시험관에 취하고, 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase (2.5U/ml)용액 0.5ml을 가한 후 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 기질 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide (0.5 mg/ml)을 첨가하여 20분간 반응시켜 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 405nm에서 측정한다. Elastase 저해 활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타낸다.

이러한 주름 생성과 관련된 elastase 저해 능을 측정한 결과 Fig. 32=도 18)과 같이 나타내었다. TAX와 PAC 각각 1,000ug/ml에서 18.40%, 19.44%의 elastase 저해활성을 나타내었다.

3-2. 콜라게나제 저해활성 측정

실시예에서 얻은 시료들의 콜라게나제(collagenase) 저해활성을 시험하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(WE and Heindrich HG. (1963) Zur quantitativen bestimmung der collagenase. Hoppe-Seyler's. Physiol. Chem. 333:149-151.)

콜라겐은 대부분 피부의 진피층에 존재하며, 피부 전체 건조중량의 약 70~80%를 차지하고 있어, 세포외 기질의 대부분을 차지하면서 피부를 지지하는 역할을 한다. 그러나 자연 노화에 따른 세포 활성의 감소와 같은 내적 요인에 의해 콜라겐의 생합성이 감소되고, 여러 가지 유해 환경에 의한 스트레스의 증가 및 태양 광선에 의한 활성 산소종의 증가와 같은 외적 요인에 의해 분해가 가속화되어 피부 기질이 파괴되면서 주름이 생성된다. 이러한 collagen은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있어 발효밤송이 추출물의 collagenase 저해 활성을 하기와 같이 측정하였다.

반응구는 0.1M tris-HCl buffer(pH 7.5)에 4mM CaCl₂를 첨가하여, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl -Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (0.3mg/ml)를 녹인 기질액 0.25ml 및 시료용액 0.1ml의 혼합액에 collagenase (0.2mg/ml) 0.15ml를 첨가하여 실온에서 20분간 정치한 후 6% citric acid 0.5ml을 넣어 반응을 정지 시킨 후, ethyl acetate 1.5ml을 첨가하여 320nm에서 흡광도를 측정한다. 콜라게나제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

낙엽송추출물 collagenase 저해활성을 측정한 결과 Fig. 33=도 19)와 같이 TAX, PAC 모두 500ug/ml의 농도에서 48.4% 이상의 collagenase 저해활성능을 나타내었으며, 1,000ug/ml의 농도에서 대조군인 EGCG와 비교시 우수한 elastase 저해활성을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 항균 효과 검증실험

상기 실시예에서 수득한 시료들의 항균효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 측정하였다.

4-1. 균 배양

전 배양 및 실험을 위한 액체배지는 Escherichia coli 및 Staphylococcus epidermidis의 액체배지로서 nutrient broth (NB)를 사용하며, 고체배지는 nutrient agar (NA)를 사용한다. Staphylococcus aureus의 액체배지로서 tryptic soy broth (TSB)를 사용하며, 고체배지는 tryptic soy agar (TSA)를 사용하며 BOD incubator에서 37℃로 배양한다. Propionibacterium acnes는 GAM 액체배지와 고체배지를 사용하여 혐기성 상태인 anaerobic system envelopes (BD BBL., USA)에서 배양한다.

4-2. 생육 저해환 (Clear zone) 측정

항균력 측정은 paper disc법으로 측정한다. 평판배지에 배양된 각 균주를 1 백금이량 취해서 액체배지 10ml에서 18~24시간 배양한 후, 이를 다시 액체배지 10ml에 0.1ml 접종하여 3~6시간 본 배양한다. 평판배지에 멸균 면봉으로 균주를 균일하게 도말한 후 멸균된 8mm의 filter paper disc를 고체 평판배지에 올려놓는다. 시료를 농도별로 filter paper disc에 흡수시켜 37℃에서 18~24시간 배양하여 disc주위의 clear zone (mm)의 직경을 측정한다.

4- 3.결과

낙엽송추출물의 항균력 효과를 검토하기 위하여 Escherichia coli , Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus aureus , Propionibacterium acnes 4균주에 대한 clear zone 형성을 관찰한 결과 표 1 및 도 20과 같이 나타내었다. E coli 균주에 대해서는 TAX, PAC 모두 항균활성은 없는 것으로 나타났다. 하지만 S epidermidis , S aureus , P acnes의 경우 1mg/disc에서 TAX는 각각 20, 14, 8mm, PAC는 15, 17, 12의 항균효과를 나타났다. 이는 대표적인 항생물질에 비해 낮은 항균활성이지만, 일반적 천연물 항균활성에 비해 높은 항균활성을 나타내어 항균소재로서의 가능성을 확인하였다.

실험예 5. MTT assay에 의한 세포 생존능력 측정

세포 생존률 측정은 Carmichael 등의 방법[3]에 따라 측정하였다(Carmichael, J., W. G. DeGraff, A. F. Gazdar, J. D. Minna, and J. B. Mitchell. 1987. Evaluation of a tetrazolium based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosen- sitivity testing. Cancer Res. 47, 936-942.).

5-1. 세포 배양

RAW 264.7 세포의 배양은 10% fetal bovine serum (FBS)을 첨가한 Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMEM) 배지를 사용하며, 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 계대 배양한다.

5-2. Cell viability

세포생존율 측정을 위한 지수기의 적정 세포수 측정은 96well plate에 3×10⁵cells/well이 되게 분주한 후 24시간 동안 배양 후 5ul의 샘플을 처치한 12시간 동안 37℃, 5% CO₂ 상에서 배양한다. 5mg/mL의 농도로 제조한 MTT 용액 50ul를 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 상에서 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO:EtOH (1:1/v:v)용액 250ul를 가하여 30분 동안 반응 뒤 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정한다.

5-3. 실험 과정

Melanoma (B16F10)을 96 well plate에 0.6~0.8×10³cells/well이 되게 0.18ml 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 0.02ml 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5mg/ml 농도로 제조한 MTT 용액 0.02ml를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO:EtOH (1:1) 0.15ml를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 하기 수학식 2과 같이 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

[수학식 2]

세포 생존율을 확인하기 위한 MTT 검색법은 96 well plate를 사용하였으며, 검사결과를 ELISA reader(multiwell microplate reader)를 이용하여 많은 시료를 간단하게 판독할 수 있어 세포독성 및 세포증식 검색법으로서 널리 사용되고 있는 방법 중의 한 방법이다. 암세포의 경우 대사 과정에서 미토콘드리아의 탈수소 효소 작용에 의해 노란색 수용성 MTT tetrazolium을 자주색을 띠는 비수용성의 MTT formazan으로 환원시킨다. MTT formazan의 흡광도는 550nm 근처 파장에서 최대가 되며, 이는 대사적으로 왕성한 세포의 농도를 반영하는 것이다.

본 실험 결과, 낙엽송추출물에 의한 macrophage 세포의 독성을 MTT assay에 의해 확인한 결과 도 21와 같이 나타내었다. 즉 낙엽송추출물에 대한 세포적용 실험에서 세포독성 또는 변성으로 인한 cell population의 저하에 기인하는 결과인지 적용실험 대한 활성 또는 저해 능에 대한 정확한 결과 값 인지를 확인하기 위한 과정으로 세포독성을 확인한 결과, TAX, PAC 모두 1,000ug/ml 에서 80%이상의 다소 높은 세포독성을 확인할 수 있었다. 결과로 낙엽송추출물의 대식세포(RAW 264.7 cell) 항염증 관련 실험 농도 500ug/ml 을 넘지 않도록 범위를 제한함으로 세포독성이나 변성에 의한 결과 값을 배재하였다.

실험예 6. 항염 효과 검증실험

상기 실시예에서 수득한 시료들의 항염효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 측정하였다.

6-1. Nitric oxide 저해활성 측정

NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess reagent를 이용하여 측정하였다. HaCaT 세포를 DMEM배지를 이용하여 5×10⁴cells/ml로 조절한 후 12well plate에 접종하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 전 배양하였다. 세포에 5μg/ml의 LPS를 처리하고 1시간 뒤에 5, 10, 25, 50μg/ml의 시료들을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후 Griess 시약과 반응 시킨 후 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하여 NO 생성율을 백분율로 표시하였다.

NO 생성에 대한 낙엽송추출물의 효능을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂-의 형태로 측정 하였다. LPS를 처리하지 않은 Control군에서는 80% 미만의 NO가 생성 되었고, LPS를 처리한 TAX와 PAC를 첨가한 후 NO생성량을 비교 확인 한 결과, TAX를 첨가했을 때 NO생성이 제일 억제됨을 확인 할 수 있었다. TAX의 경우 농도 의존적으로 LPS로 유도된 Raw cell의 NO production을 감소시키는 결과를 나타내어 NO생성이 억제됨을 확인 하였다.[도 22]

NO는 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관 확장 등의 다양한 생리기능을 가지고 있다. NO 자체는 반감기가 6～10초 정도로 매우 짧으며, 이러한 NO를 형성하는 nitric oxide synthase(NOS)는 물리 화학적 성상에 따라 type Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ 등 3종류의 동종 효소로 나누어진다.

Type Ⅰ(neuronal NOS, nNOS)과 type Ⅲ(endothelial NOS, eNOS)는 세포 속에 계속적으로 존재하기 때문에 구성 NOS(constitutive NOS)로 분류하고, 일부 세포에서 LPS, cytokines 및 박테리아 독소 같은 특수한 자극제들에 노출되는 경우에만 발현되는 type Ⅱ는 유도형 NOS(iNOS)로 나누어진다.100) 이러한 NOS들은 L-arginine을 L-citrulline으로 전환시키면서 NO를 형성하고, NOS중 iNOS에 의한 NO 생성이 절대적으로 많으며, 이는 병리적으로 중요한 작용을 한다. 즉 LPS로 유도되어진 RAW 264.7 cell에서 iNOS의 protein level의 감소에 의한 항염증 효과를 기대할 수 있다.

6- 2. Western blot을 통한 iNOS , COX2 단백질 발현 확인

100mm tissue culture dish에 cell seeding 후 cell의 confluence가 80%때에 DMEM 배지를 무혈청 배지인 EMEM 배지로 교환한 후 일정 시간동안 cell을 안정화 시키고 추출물과 LPS(1μ를 처리하여 24시간동안 배양한다. 그 후 상등액은 제거한 후 PBS로 2회 세척한 후에 scrapper로 cell을 수확한 후에 lysis buffer를 넣어서 세포를 용출시킨다. 수확된 protein은 BSA(bovine serum albumin)으로 작성한 standard curve에 OD값을 대입시켜서 protein량을 보정한다. 그 후 SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 electrophoresis한 후에 gel를 떼어내어서 transfer buffer에 10~15분 정도 담근 후 transfer buffer에 스펀지 2장을 깔고 그 위에 filter paper 1장 올려놓는다. 3mm paper와 nitrocellulose filter도 buffer에 살짝 담근다. 양쪽 스펀지와 2mm paper 사이에 nitrocellulose paper 그리고 gel를 잘 밀착시킨 후에 전극을 꽂아서 transfer시킨다. 190mA에서 1시간 이상 transfer한 후에 ponceau S에 2분 정도 담근 후에 band를 확인한다. PBS로 2회 씻은 후 꺼내서 blocking buffer로 overnight시켜 background는 제거시킨다. 2번 씻은 후에 1 : 1,000으로 1차 antibody를 붙인 후 2차 antibody를 1 : 1,000으로 희석하여 반응시킨다. 2차 antibody를 붙인 후, PBST로 수차례 세척한 후에 ECL kit(Amersham Pharmacia, England)를 사용하여 film에 옮긴 후, iNOS, COX-2 단백질 발현량을 확인한다.

낙엽송추출물의 iNOS 단백질의 저해 효과를 확인하기 위해 RAW 264.7 cell에 LPS(10㎍/mL)을 처리하고 1시간 뒤, 찔레나무뿌리 추출물을 농도별로 처리 한 후 western blotting으로 확인하였다. 낙엽송추출물을 농도별로 처리 한 부분에서는 LPS에 의해 증가된 iNOS, COX2 protein 발현을 감소 시켰다. 특히 TAX처리군 500ppm에서 우수한 iNOS, COX2 protein 발현을 감소 효과를 확인 할 수 있었다.(도 23)

이하, 본 발명의 제형예로서 크림, 맛사지크림, 로션, 스킨로션, 에센스, 팩, 클렌징폼의 제형을 예시하고 있으나, 본 발명의 화장품 조성물을 포함하는 제형은 이에 한정되는 것은 아니다.

제형예 1. 크림조성물 : 유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

번호	원료명	중량 %
1	세토스테아릴 알코올	1.0
2	자기유화형 모노스테아린산 글리세린	1.0
3	친유형 모노스테아린산 글리세린	2.5
4	마이크로 스탈린 납	2.0
5	파라옥시안식향산메틸	0.2
6	파라옥시안식향산프로필	0.1
7	밀납	2.0
8	모노스테아린산 폴리에틸렌글리콜	2.0
9	모노스테아린산 소르비탄	1.0
10	트리 (카프릴, 카프린산) 글리세린	5.0
11	액상 리놀린	5.0
12	미리스틴산 옥틸도데실	8.0
13	스쿠알란	8.0
14	농글리세린	5.0
15	1,3-부틸렌글리콜	5.0
16	알란토인	0.1
17	TAX 추출물	10.0
18	향료	미량
19	황색4호	미량
20	정제수	잔량

제형예 2. 맛사지크림 조성물 : 유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 용해 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

번호	원료명	중량 %
1	세토스테아릴 알코올	2.0
2	친유형 모노스테아린산 글리세린	2.5
3	자기유화형 모노스테아린산 글리세린	1.5
4	파라옥시안식향산메틸	0.2
5	파라옥시안식향산프로필	0.1
6	바셀린	3.5
7	모노스테아린산 폴리에틸렌글리콜	3.5
8	세스퀴올레인산 소르비탄	1.8
9	유동 파라핀	35.0
10	트리 (카프릴, 카프린산) 글리세린	3.0
11	옥틸도데칸올	5.0
12	스쿠알렌	2.0
13	농글리세린	5.0
14	PAC-1 추출물	5.0
15	히아루로닉애씨드추출물	1.0
16	향료	미량
17	정제수	잔량

제형예 3. 로션 조성물 : 유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합 유화한 후 실온으로 냉각한다.

번호	원료명	중량 %
1	세토스테아릴 알코올	2.0
2	스테아린산	1.0
3	친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0
4	자기유화형 모노스테아린산 글리세린	2.0
5	바셀린	1.0
6	모노스테아린산 폴리에틸렌글리콜	1.5
7	세스퀴올레인산 소르비탄	1.0
8	유동 파라핀	5.0
9	스쿠알렌	5.0
10	파라옥시안식향산프로필	0.2
11	파라옥시안식향산메틸	0.2
12	농글리세린	5.0
13	TAX추출물	15.0
14	트리에탄올아민	0.5
15	카르복시비닐폴리머	0.2
16	향료	미량
17	정제수	잔량

제형예 4. 스킨로션 조성물 : 수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

번호	원료명	중량 %
1	글리세린	2.0
2	1,3-부틸렌글리콜	2.0
3	구연산	0.01
4	에탄올	15.0
5	폴리옥시에틸렌경화피마자유	1.0
6	PAC-1 추출물	25.0
7	향료	미량
8	위치하젤추출물	1.0
9	정제수	잔량

제형예 5. 에센스 조성물 : 수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

번호	원료명	중량 %
1	농글리세린	15.0
2	1,3-부틸렌글리콜	5.0
3	알란토인	0.1
4	에탄올	7.0
5	파라옥시안식향산메틸	0.15
6	트리에탄올아민	0.15
7	폴리옥시에틸렌경화피마자유	1.0
8	초산토코페롤	0.5
9	카르복시비닐폴리머	0.15
10	TAX 추출물	30.0
11	향료	미량
12	정제수	잔량

제형예 6. 팩 조성물 : 수상과 에탄올상을 각각 분산 용해하여 혼합시킨 후 실온으로 냉각한다.

번호	원료명	중량 %
1	폴리비닐알코올	15.0
2	카르복시메틸셀룰로이스나트륨	0.3
3	농글리세린	3.0
4	알란토인	0.1
5	에틸렌디아민테트라초산디나트륨	0.01
6	폴리에틸렌글리콜	1.0
7	에탄올	6.0
8	파라옥시안식향산메틸	0.15
9	타라옥시안식향산프로필	0.05
10	디엘판테놀	0.1
11	폴리옥시에틸렌(12)노닐페닐에테르	0.5
12	PAC-1 추출물	45.0
13	향료	미량
14	정제수	잔량

제형예 7. 클렌징폼 조성물 : 수상과 오일상을 각각 분산 용해하여 혼합 검화한 후 실온으로 냉각한다.

번호	원료명	중량 %
1	스테아린산	6.5
2	미리스틴산	28.0
3	자기유화형 모노스테아린산 글리세린	3.0
4	프로필렌 글리콜	5.0
5	농글리세린	10.0
6	수산화나트륨	7.0
7	에틸렌디아민테트라초산나트륨	0.1
8	태반 추출물	0.5
9	TAX 추출물	15.0
10	향료	미량
11	정제수	잔량

Claims (13)

1. (a) 음건한 일본 잎갈나무 (Larix kaempferi, japanese larch) 목재 중 목부에서 변재를 제거한 심재 목부를 대패밥으로 가공한 것 및 수피를 곱게 분쇄하여 분말원료를 제공하는 제 1단계; 제 1단계의 분말원료 중량의 1 내지 50배 부피(v/w)의 20 내지 70% 물 및 에탄올 혼합용매를 섞은 다음에 40 내지 120℃에서 1시간 내지 24시간 동안 환류냉각추출법을 2 내지 10회 반복 수행하여 조추출물을 얻는 제 2단계; 2 단계의 조추출물을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 건조 조추출물을 얻는 제 3단계; 제 3단계의 건조 조추출물 중량의 7 내지 20 배 부피(v/w)의 에탄올을 넣고 가용화하고 원심 분리한 뒤, 상등액과 침전물을 분리하고, 동일한 방법으로 3회 반복한 뒤, 상등액을 감압 농축하여 프로안토시아니딘(Proanthocyanidin)을 함유하는 일본 잎갈나무 수피 분획물을 얻는 제 4단계; 상기 일본 잎갈나무 수피 분획물을 건조 및 분쇄하여 일본 잎갈나무 수피 분획물 건조물을 얻는 제 5단계 공정으로 구성되는, 6 내지 10%(w/w) 프로안토시아니딘 (Proanthocyanidin)을 함유하는 일본 잎갈나무 수피 분획물을 제조하는 정제방법:
   또는 (b) 음건한 일본 잎갈나무 (Larix kaempferi, japanese larch) 목재 중 목부에서 변재를 제거한 심재 목부를 대패밥으로 가공한 것 및 수피를 곱게 분쇄하여 분말원료를 제공하는 제 1단계; 제 1단계의 분말원료 중량의 3 내지 30배 부피(v/w)의 20 내지 70% 물 및 에탄올 혼합용매를 섞은 다음에 60 내지 90℃에서 1시간 내지 6시간동안 환류냉각추출법을 2 내지 10회 반복 수행하여 조추출물을 얻는 제 2단계; 2 단계의 조추출물을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 건조 조추출물을 얻는 제 3단계; 제 3단계의 건조 조추출물 중량의 1 내지 3 배 부피(v/w)의 물을 넣고 가용화하고 분획 추출하여 일본 잎갈나무 심재 추출물을 얻는 제 4단계; 상기 일본 잎갈나무 심재 추출물을 건조 및 분쇄하여 일본 잎갈나무 심재 추출물 건조물을 얻는 제 5단계 공정으로 구성되는, 1 내지 4%(w/w) 탁시폴린을 함유하는 일본 잎갈나무 심재 추출물을 제조하는 정제방법.
   
   
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