KR101458013B1

KR101458013B1 - 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101458013B1
Application number: KR1020130106075A
Authority: KR
Inventors: 조영제; 채정우; 손준호
Original assignee: 경기도
Priority date: 2013-09-04
Filing date: 2013-09-04
Publication date: 2014-11-04

Abstract

본 발명은 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및/또는 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 폐기 자원의 재활용이라는 측면에서, 환경 오염원의 배출량을 감소시키는 효과를 제공할 수 있다.

Description

미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물{Composition for anti-oxidation and whitening and anti-wrinkle cosmetics comprising extract of un-ripening Pinus koraiensis Siebold et Zucc cone}

본 발명은 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및/또는 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 웰빙문화가 트렌드로 대두됨에 따라, 인체건강이나 피부건강에 대한 인식이 증대되면서 자외선, 음식, 환경 등에 의해 야기되는 피부 트러블 문제를 개선시키기 위한 목적으로 화장품과 식품, 의약품 등 다양한 분야에서 연구가 활발하게 진행되고 있다.

신체 최외각층의 배리어(barrier)로서 피부는 자외선과 유해물질 등의 외부 환경으로부터 내부기관을 보호하고 수분과 전해질의 손실을 막는 기능을 하는 기관으로서 외부환경에 항상 노출되어 있어 과도한 자외선 노출은 피부화상, 색소(melanin)침착, 주름 및 광노화 촉진, 피부염증, 심한 경우 피부암을 일으키는 요인이 되기도 한다(1).

일반적으로 멜라닌은 자외선과 같은 외부자극요인으로부터 피부를 보호하기 위해 만들어 진다. 하지만 과도한 멜라닌 합성과 축적은 기미, 주근깨와 같은 시각적으로 좋지 않은 질병을 낳게 된다. 멜라닌 생성은 tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TRP-1), TRP-2의 세 효소에 의해 조절 된다(2).

멜라닌의 생합성 기전은 출발물질인 멜라닌의 생합성 기전은 출발물질인 tyrosine이 rate-limiting enzyme인 tyrosinase에 의해 3,4-dihydroxyphenylalanin (DOPA)과 DOPA quinone으로 변형되고, DOPA chrome을 거쳐 중간체인 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid로 산화되어 eumelanin을 생성하게 된다(3).

또한, 자외선에 의해 피부의 keratinocyte가 자극을 받으면 α-melanocyte sitmulating hormone (α-MSH), adrenocorricotropic hormone (ACTH)(4)등의 신호전달물질이 melanocyte로 분비하게 된다. Melanocyte의 melanocortin type 1 receptor (MC1R) 수용체에서는 이러한 자극을 받아들여 세포내 cyclic adenosine monophosphae (cAMP) level을 증가시키며, cAMP의 증가는 protein kinase A (PKA)의 활성화를 일으키고(5), 뒤이어 cAMP response element-binding protein (CREB)의 인산화를 증가시킨다.

인산화된 CREB는 melanocyte의 특정 전사인자인 microphthalmia associated transcrpition factor (MITF)의 MITF의 발현을 일으키게 된다(6). MITF의 발현은 결국 멜라닌 생성의 주요 효소인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 promoter와의 결합이 촉진되어 멜라닌 생합성이 증가되게 된다(7).

피부에 노출되는 자외선이 증가함에 따라 여러 단백질 분해효소 중에서 기질을 분해하는 matrix metalloproteinase (MMPs)는 피부 광노화 발생에 중요한 역할을 한다. 피부 진피내 세포외 기질단백질(extracellular matrix)은 피부의 구조와 탄력성을 유지하는데 중요한 역할을 하는데, 그 중 80∼85%가 type Ⅰ procollagen으로 이루어져 있다(8).

Type Ⅰ procollagen은 전구체인 procollagen 형태로 합성이 된 후 세포 밖으로 배출되어, 아미노 말단과 카복실말단이 잘려나간 후 완성된 collagen을 만들게 된다(9). 피부 진피내 세포외 기질 단백질의 재구성에는 여러 생체 반응이 관하며, 이중 특히 MMPs가 기질 단백질들을 분해하는 중요한 역할을 하고 있으며 intestitial collagenase (MMP-1), 72kD gelatinase (MMP-2), 92kD gelatinase (MMP-9), neutrophil collagenase (MMP-8), collagenase (MMP-13) 등 26가지 이상의 MMPs가 이미 알려져 있다(10∼12).

자외선에 노출된 피부에서는 MMPs의 발현이 증가되며, 증가된 MMPs가 피부를 구성하고 있는 collagen을 분해하여 기질 단백질의 결핍을 초래하게 됨으로써 피부노화와 주름의 발생이 일어난다(13,14).

잣나무(Pinus koraiensis Siebold et Zucc)는 소나무과에 속하는 상록교목으로, 잣나무에 대한 연구를 보면, Lee 등(15)은 잣나무 목부의 성분으로는 chrysin, pinocembrin, 5-hydroxy-7-methoxyflavone, galangin, 3-hydroxy-5-methoxystilbene, pinosylvin 등의 물질이 함유된 것으로 보고하였다.

Jung(16) 은 잣나무 구과 정유 추출물의 항산화 효과 및 항균 효과에 대한 연구에서 Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans등에 대해서 모두 99.9% 이상의 항균효과를 나타난다고 보고하였다. Bae 등(17)은 잣나무 잎의 성분으로는 gallic acid, protocatechuic acid, vanillic acid, syringic acid, p-coumaric acid, scopoletin, (+)-catechin 등의 물질을 분리 동정하였고, Kim 등(18)은 잣나무 잎의 추출물에서 Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Pityrosporum ovale, Escherichia coli 등 대한 항균물질인 astragalin, juglanin을 분리 동정 하였다.

잣나무에는 영양물질 이외에 항균(19), 살충효과(20) 및 타감 작용을 하는 약리적인 성분들이 함유되어 있으며, 이러한 화학성분은 피부자극제, 소염제, 완화제 및 보향제로 이용되고 있다(21,22).

잣나무의 종자는 구과의 열매에서 수확하고, 양질의 단백질과 지방산, 아미노산, 탄수화물, 그리고 비타민을 포함하고 있으며(23,24), 수피 추출물은 항암, 항노화, 노화방지, 돌연변이 억제 등의 효능을 갖는 등 경제적인 가치가 매우 높은 수종이다(25∼27).

잣 부산물에는 여러 생리활성 물질들이 함유되어 있어서 이를 재활용한다면, 환경 오염원의 배출량을 감소시키는 효과를 얻을 수 있으며, 폐기 자원의 재활용이라는 의미에서 가치가 높을 것이고, 특히 잣나무의 구과 중 열매가 맺히지 않는 "미성숙 잣구과"는 그대로 버려져 환경 오염원으로 방치되고 있기 때문에, 효과적인 재활용 방법에 대한 연구가 절실히 요구되고 있는 실정이다.

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본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 연구를 지속적으로 수행하여, 국내에서 발생되어 수확되지 않고 방치되어 버려지는 농산 폐자원인 미성숙 잣구과(Pinus koraiensis Siebold et Zucc cone)의 추출물이 미백, 주름개선 등 피부개선 효과를 지님을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 미성숙 잣구과의 재활용 용도로서, 이의 추출물를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물, 즉 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및/또는 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물은 피부의 항산화 효과, 미백 효과 및 주름개선 효과를 지닌다.

또한, 본 발명의 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물은 폐기 자원의 재활용이라는 측면에서, 환경 오염원의 배출량을 감소시키는 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 에탄올 농도별 DPPH 소거능 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 미성숙 잣구과 추출물의 페놀성 물질의 농도에 따른 DPPH 소거능의 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 에탄올 농도별 ABTS 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 미성숙 잣구과 추출물의 페놀성 물질의 농도에 따른 ABTS의 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 에탄올 농도별 antioxidant protection factor (PF) 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 미성숙 잣구과 추출물의 페놀성 물질의 농도에 따른 antioxidant protection factor (PF)의 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 에탄올 농도별 TBRAs 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 미성숙 잣구과 추출물의 페놀성 물질의 농도에 따른 TBRAs의 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 에탄올 농도별 수렴효과를 나타낸 것이다.
도 10은 미성숙 잣구과 추출물의 페놀성 물질의 농도에 따른 수렴효과의 변화를 나타낸 것이다.
도 11은 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 에탄올 농도별 tyrosinase 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 12는 미성숙 잣구과 추출물의 페놀성 물질의 농도에 따른 tyrosinase 저해 활성의 변화를 나타낸 것이다.
도 13a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 Melanoma cell (B16F10)의 생존율을 나타낸 것이다.
도 13b는 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 Melanoma cell (B16F10)의 생존율을 나타낸 것이다.
도 14a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 Melanoma cell (B16F10)에서의 tyrosinase 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 14b는 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 Melanoma cell (B16F10)의 생존율을 나타낸 것이다.
도 15a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 Melanoma cell (B16F10)에서의 melanin 생합성 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 15b는 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 Melanoma cell (B16F10)에서의 melanin 생합성 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 16은 미성숙 잣구과 열수 추출물과 에탄올 추출물의 melanin 합성에 관여하는 tyrosinase 발현 억제 활성을 나타낸 것이다.
도 17은 미성숙 잣구과 열수 추출물과 에탄올 추출물의 Melanin 합성에 관여하는 microphthalmiaassociatedtranscription factor (MITF) 발현 억제 활성을 나타낸 것이다.
도 18은 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 에탄올 농도별 Elastase 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 19는 미성숙 잣구과 추출물의 페놀성 물질의 농도에 따른 Elastase 저해 활성의 변화를 나타낸 것이다.
도 20a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 CCD986sk fibroblst 세포에 관한 MTT 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 20b는 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 CCD986sk fibroblst 세포에 관한 MTT 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 21a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 ELISA kit를 이용한 fibroblast (CCD-986sk)에서의 procollagen type Ⅰ생합성 kit 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 21b는 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 ELISA kit를 이용한 fibroblast (CCD-986sk)에서의 procollagen type Ⅰ생합성 kit 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 22a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 Western blotting analysis를 이용한 fibroblast (CCD-986sk)에서의 procollagenase protein 발현억제 효과를 나타낸 것이다.
도 22b는 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 Western blotting analysis를 이용한 fibroblast (CCD-986sk)에서의 procollagenase protein 발현억제 효과를 나타낸 것이다.
도 23a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 섬유아 세포(CCD-986sk)의 주름관련 단백질(MMP-1) 및 mRNA 발현량을 나타낸 것이다.
도 23b는 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 섬유아 세포(CCD-986sk)의 주름관련 단백질(MMP-1) 및 mRNA 발현량을 나타낸 것이다.
도 24a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 Western blotting analysis를 이용한 fibroblast (CCD-986sk)에서의 intestitial collagenase (MMP-1)의 protein 발현억제 효과를 나타낸 것이다.
도 24b는 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 Western blotting analysis를 이용한 fibroblast (CCD-986sk)에서의 intestitial collagenase (MMP-1)의 protein 발현억제 효과를 나타낸 것이다.
도 25a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 Western blotting analysis를 이용한 fibroblast (CCD-986sk)에서의 intestitial 92kD gelatinase (MMP-9)의 protein 발현억제 효과를 나타낸 것이다.
도 25b는 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 Western blotting analysis를 이용한 fibroblast (CCD-986sk)에서의 92kD gelatinase (MMP-9)의 protein 발현억제 효과를 나타낸 것이다.
도 26a는 미성숙 잣구과 열수 추출물의 TIMP-1 활성 kit 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 26b는 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 TIMP-1 활성 kit 측정 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 "미성숙 잣구과"라 함은, 성숙된 잣구과(ripening Pinus koraiensis Siebold et Zucc cone)와 대비되는 것으로서, 잣나무의 구과(cone) 중 열매(해송자)가 맺히지 않는 것을 의미한다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 미성숙 잣구과 추출물은 상기 조성물 전체중량 대비 0.1~99.9 중량%일 수 있는데, 상기 미성숙 잣구과 추출물의 함량은 필요에 따라 적의 선택하여 변형할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 미성숙 잣구과 추출물은 열수 추출물 또는 C₁~C₄의 알코올 추출물, 바람직하게는 열수 추출물 또는 에탄올일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 열수 추출물의 경우, 미성숙 잣구과에 증류수를 중량 기준으로 5~15배 가하여, 80℃~90℃에서 1~5시간 동안 환류냉각 추출하거나, 통상의 중탕가열 방법으로 제조한 추출물을 9,000~15,000 rpm으로 5~15분간 원심분리한 후, 필터 여과지로 여과한 다음 농축하여 제조할 수 있다.

또한, 상기 알코올 추출물의 경우, 미성숙 잣구과에 중량 기준으로 5~15배 양의 C₁~C₄의 알코올, 바람직하게는 에탄올을 첨가하여 실온에서 12~36시간 동안 침지추출한 후 상등액과 침전물을 분리한 다음, 9,000~15,000 rpm으로 5~15분간 원심분리한 후, 필터 여과지로 여과한 다음 농축하여 제조할 수 있다.

본 발명의 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물에서, 상기 피부개선은 항산화, 미백 및/또는 주름개선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상, 바람직하게는 항산화, 미백 및 주름개선 모두일 수 있다.

본 발명의 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), 항산화 보호 인자(antioxidant protection factor; PF), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid(ABTS) 및 thiobarbituric acid reaction substance(TBARS)를 억제함으로써, 항산화 효과를 갖는다.

또한, 본 발명의 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물은 tyrosinase를 저해하고 B16F10세포 실험에서 tyrosine 효소 단백질과 microphthalmia-associated Transcription Factor(MITF) 단백질의 발현을 억제함으로써 멜라닌의 생성을 억제하여 미백효과를 갖는다.

또한 본 발명의 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물은 esterase 활성을 억제함으로서, 엘라스틴(elastin)분자 형태를 유지시키고, ProCOL1A2를 활성화시키며, MMP-1 및 MMP-9의 발현을 억제함으로써 주름개선 효과를 갖는다.

본 발명의 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있는데, 예를 들어 크림, 로션, 스킨, 유연화장수, 수렴화장수, 파운데이션, 에센스, 팩, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등의 제형으로 제제화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 성분을 더 포함할 수 있다.

상기 수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 상기 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

상기 유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 상기 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

상기 고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 상기 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

상기 고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

상기 스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고 당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

상기 해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있고, 또한, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 상기 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물에는 필요에 따라, 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 더 포함할 수 있다.

상기 포함될 수 있는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

상기 에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

상기 탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

상기 실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

상기 불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

상기 동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

상기 보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

상기 수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

상기 지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

상기 수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

상기 지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

상기 에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

상기 계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

상기 비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가 대두인지질 등을 들 수 있다.

상기 음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

상기 양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

상기 양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드 아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

상기 유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

상기 유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

상기 자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

상기 살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

상기 산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

상기 pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

상기 알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01-5 중량%, 보다 바람직하게는 0.01-3 중량%로 배합될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는, 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는, 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 미성숙 잣구과 열수 추출물의 제조 (1)

경기도 가평지역의 잣나무에 자생하여 형성된 잣구과 중 열매가 맺히지 않은 미성숙 잣구과만을 수거하여 수세, 건조한 후 미성숙 잣구과 전체를 40 mesh 정도로 분쇄하여 분말로 4℃에서 보관한 시료 100g에, 중량 기준으로 10배 양의 증류수를 첨가하고, 85℃에서 3시간 동안 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리시켜 환류냉각 추출물을 수득하였다.

상기에서 수득한 환류냉각 추출물을 12,000rpm으로 10분간 원심분리한 후, 와트만(Whatman) No. 1 여과지로 여과한 다음, 상기 여액을 농축하고 동결건조시켜 미성숙 잣구과의 열수 추출물을 제조하였다.

<실시예 2> 미성숙 잣구과 열수 추출물의 제조 (2)

경기도 가평지역의 잣나무에 자생하여 형성된 잣구과 중 열매가 맺히지 않은 미성숙 잣구과만을 수거하여 수세, 건조한 후 미성숙 잣구과 전체를 40 mesh 정도로 분쇄하여 분말로 4℃에서 보관한 시료 100g에, 중량 기준으로 10배 양의 증류수를 첨가하고, 75℃에서 24시간 동안 중탕가열하여 중탕가열 추출물을 수득하였다.

<실시예 3> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (1)

경기도 가평지역의 잣나무에 자생하여 형성된 잣구과 중 열매가 맺히지 않은 미성숙 잣구과만을 수거하여 수세, 건조한 후 미성숙 잣구과 전체를 40 mesh 정도로 분쇄하여 분말로 4℃에서 보관한 시료 100g에, 중량 기준으로 10배 양의 10% (v/v)에탄올을 첨가하고, 실온에서 24시간 동안 침지추출한 후, 상등액과 침전물을 분리시켜 침지추출 추출물을 수득하였다.

상기에서 수득한 침지추출 추출물을 12,000rpm으로 10분간 원심분리한 후, 와트만(Whatman) No. 1 여과지로 여과한 다음, 상기 여액을 농축하고 동결건조시켜 미성숙 잣구과의 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 4> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (2)

농도가 20%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 5> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (3)

농도가 30%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 6> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (4)

농도가 40%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 7> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (5)

농도가 50%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 8> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (6)

농도가 60%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 9> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (7)

농도가 70%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 10> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (8)

농도가 80%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 11> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (9)

농도가 90%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 12> 미성숙 잣구과 에탄올 추출물의 제조 (10)

농도가 100%(v/v)인 에탄올을 사용한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 실시하여 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실험예>

1. 실험 재료

상기 실시예 1에서 제조한 미성숙 잣구과 열수 추출물 및 상기 실시예 3 내지 실시예 12에서 제조한 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 4℃로 유지되는 냉장실에 보관하면서 본 실험의 재료로 사용하였다.

2. 실험 방법

(1). 총 폴리페놀 함량측정

총 폴리페놀 화합물은 Folin-Denis 방법으로 측정하였으며, 시료 1 mL에 95% ethanol 1 mL와 증류수 5 mL를 첨가하고 1N Folin-ciocalteu reagent 0.5 mL를 넣어 잘 섞어주고, 5분간 방치한 후, Na₂CO₃ 1 mL를 가한 후, 흡광도 725 nm에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.

(2). 잣구과 추출물의 electron donating ability 측정

전자공여능(EDA: electron donating ability)은 Blois의 방법(30)을 변형하여 측정하였다. 각 시료용액 2㎖에 0.2mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 1㎖ 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다.

전자공여능은 아래의 식에 의해 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

(3). ABTS radical cation decolorization(ABTS) 측정

ABTS radical cation decolorization의 측정은 Pellegrin 등의 방법에 의해 측정하였다. 즉, 7 mM ABTS와 140 mM K₂S₂O₈을 5 mL : 88 μL로 섞어 어두운 곳에 14~16시간 방치시킨 후, 이를 absolute ethanol과 1:88 비율로 섞어 734 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7±0.002가 되도록 조절한 ABTS solution을 사용하였다.

시료용액과 positive control로서 BHT 각각 50 μL와 ABTS solution 1 mL를 30초 동안 섞은 후 2.5분간 incubation하여 734 nm에서 흡광도를 측정하여 아래의 식에 의해 저해율(%)을 계산하였다.

(4). Antioxidant protection factor(PF) 측정

PF는 Andarwulan과 Shetty의방법으로 측정하였다. 10 mg의 β-carotene을 50 mL 의 chloroform에 녹인 용액 1 mL를 evaporator용 수기에 넣고 40℃ water bath에서 chloroform을 증류시킨 후, 20 μL linoleic acid, 184 μL Tween 40과 50 mL H₂O₂를 가하여 emulsion을 만들고, 5 mL의 emulsion에 시료용액 100 μL를 혼합하여 vortex로 잘 섞어준 뒤 50℃에서 30분간 반응시켜 냉각시킨 다음, 470 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

(5). Thiobarbituric acid reaction substance(TBARs) 측정

TBARS는 Blurge와 Aust의 방법(33)에 따라 측정하였다. 1% linoleic acid와 1% Tween 40으로 emulsion을 만들고 emulsion 0.8 mL와 시료 0.2 mL를 섞은 후 50℃ water bath에서 10시간 반응시켰다. 반응 후 반응액 1 mL에 TBA regent [100 mL stock solution(15% trichloroacetic acid(TCA), 0.375% thiobarbituric acid, 0.25 M HCl 혼합액)에 3 mL의 2% BHT/EtOH 혼합액] 2 mL를 가하고 15분간 boiling한 다음 10분간 냉각시킨 후, 15분간 1000 rpm(vision, VS-5500N)으로 원심분리하여 실온에서 10분간 방치한 후, 상등액을 532 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

TBARS값은 흡광도 수치×0.0154로 1 mL 반응혼합물에 대해서 생성된 1,1,3,3-tetraethoxy propane(TEP)의 μM으로 표시하였다.

(6). 수렴 효과 측정

Astringent 활성 측정은 Lee 등(34)의 방법에 따라 측정하였다. 피부 단백질과 유사한 혈액 단백질 (hemoglobin)을 사용하여, 원심분리관 용기에 각각의 시료용액과 헤모글로빈 용액을 1:1로 넣어서 진탕 혼합한 다음, 1,500rpm에서 3분간 원심분리 후 576nm에서 흡광도를 측정하였다.

Astringent 활성 측정은 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

(7). 미백효과 측정

(7-1). Tyrosinase 저해활성 측정

Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법(35)에 따라 측정하였다. 반응구는 0.175M sodium phosphate buffer (pH 6.8) 0.5mL에 10mM L-DOPA를 녹인 기질액 0.2mL 및 시료용액 0.1mL의 혼합액에 mushroom tyrosinase (110U/mL) 0.2mL을 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475nm에서 측정하였다.

Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

(7-2). 미성숙 잣구과 추출물의 cell line 미백 효능 검정

(7-2-1). 세포 생존율 측정

(가) 세포배양

본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin/streptomycin (100U/mL)을 첨가한 dulbeco's modified eagle‘s medium (DMEM) 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂ incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.

(나) MTT assay에 의한 세포 생존율 측정

세포 생존율 측정은 Carmichael 등의 방법(36)에 따라 측정하였다. 각 세포주[melanoma (B16F10), fibroblast (CCD-986sk), macrophage (Raw 264.7) cell]을 96 well plate에 0.6～8×10³cells/well이 되게 0.18 mL 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 0.02 mL 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다.

대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02 mL를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO:ethanol(1:1) 0.15 mL를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 550nm에서 흡광도를 측정하였다.

(7-2-2). Cellular tyrosinase 저해활성 측정

Melanoma(B16F10) 세포를 각 culture dish에 가득 배양 한 후, 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. 각 dish에 lysis buffer (67mM sodium phosphate buffer, 1% triton X-100, 0.1mM phenylmethyl sulfonyfluoride)를 100μL 첨가한 후 얼음에 방치하여 세포를 파괴시키고, 세포를 수집하여 ultra sonication 하였다.

이를 1시간 동안 방치한 후 13,200rpm에서 20분간 원심분리 하여 얻어진 상층액을 효소용액으로 사용하였다. 이를 67mM phosphate buffer(pH6.8)에 녹인 8.0mM의 L-DOPA 120uL와 시료용액 40uL를 96-well plate에 넣은 후, 67mM phosphate buffer (pH 6.8)에 녹인 효소용액 40uL을 첨가하여 37℃에서 30분간 배양한 후, 생성된 DOPA chrome의 양을 490nm에서 측정하였다.

(7-2-3). Melanoma cell(B16F10)에서의 melanin 생합성 저해율 측정

피부 멜라노마 세포로부터의 melanin 생합성 저해 측정은 Hosoi 등(38)의 방법에 따라 측정하였다. DMEM 배지로 배양된 B16F10 세포를 100mm culture dish에 1×10⁶cell/dish가 되게 분주하고 24시간 배양 후 시료를 농도별로 조제하여 2mL 첨가하고, 48시간 후에 인산완충액(pH 7.4)으로 세척하였다.

그 다음 0.25M trypsin-EDTA 용액으로 세포를 탈착한 후 수확한 세포를 1×10⁶세포 당 1mL의 5% TCA로 처리하고, 2,500rpm으로 2회 원심분리한 후 분리된 melanin을 인산완충액으로 세척한 뒤 ether:ethanol(1:3) 1mL를 가하여 2회 원심분리 한 후 ether 1mL로 세척 건조시켰다. 건조된 melanin에 1N NaOH를 1mL 가하여 80℃에서 1시간 반응시킨 후 분광 광도계 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

melanin 생합성 저해는 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

(7-2-4). Western blot을 통한 세포내 색소침착 관련 단백질의 발현 측정

MITF, tyrosinase 단백질의 발현양의 측정은 다음과 같은 방법으로 수행 하였다. 즉, B16F10을 이용하여 culture dish에 배양한 뒤 sample 처리를 한 다음 48시간 후에 PBS로 세척한 후 원심분리 하여 세포를 수집하고, RIPA buffer를 사용하여 cell lysate를 제조하였다.

세포 lysate에 함유된 단백질의 양은 Bradford 법으로 측정하였다. 단백질 15μg을 8% polyacrylamide를 함유한 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF membrane으로 electroblot 120 V에서 1시간을 실시하였다. 이어 PVDF membrane을 5% skim milk에서 1시간 방치한 뒤 primary antibody에서 4℃에서 overnight하여 준다. 다시 TBST로 세 번 세척한 뒤 secondary antibody를 상온에서 1시간 반응 시킨 뒤 TBST로 세번 세척하고 ECL kit (Amersham-Pharmacia)와 반응시켜 X-ray film에 노출 시킨다.

X-ray film에 현상되어진 밴드를 LAS 4000 이미지 분석 장치를 이용하여 정량화 하였다.

(8). 주름개선 효과

(8-1). Elastase 저해활성 측정

Elastase 저해활성 측정은 Cannell 등(40)의 방법에 따라 측정하였다. 기질로서 N-succinyl-(L-Ala)₃-p-nitroanilide를 사용하여 37℃에서 20분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 405nm에서 측정하였다.

즉, 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5mL씩 시험관에 취하고, 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase (2.5U/mL)용액 0.5mL을 가한 후 기질로 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)₃-p-nitroanilide (0.5mg/mL)을 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다.

Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

(8-2). 잣구과 추출물의 cell line 주름개선 효능 검정

(8-2-1). 세포 생존율 측정

(가). 세포배양

(나). MTT assay에 의한 세포 생존율 측정

대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02 mL를 첨가하여 4시간 배양한 후, 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO:ethanol(1:1) 0.15 mL를 가하여, 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 550nm에서 흡광도를 측정하였다.

(8-2-2). 잣추출물의 피부재생 효과

(가). ELISA kit를 이용한 주름개선 효과 측정

① Procollagen type Ⅰ생합성 kit 측정

세포를 5x10⁴ cells/well 농도로 12 well plate에 접종한 후, 각 well에 시료를 첨가하여 CO₂ 배양기에서 48시간 배양하였다. 이렇게 실험한 세포의 배양액을 모아서 실험에 사용하였다. 세포배양액내 콜라겐 생합성 정도는 procollagen type-ⅠC peptide(PIP) EIA kit를 사용하여 propeptide의 양을 측정하였다(41).

② MMP-1 & TIMP-1 활성 kit 측정

세포를 5x10⁴ cells/well 농도로 12 well plate에 접종한 후, 각 well에 시료를 첨가하여 CO₂ 배양기에서 48시간 배양하였다. 이때 MMP-1와 TIMP-1의 활성을 높이기 위하여 TNF-α를 10ng/mL의 농도로 첨가하였다.

세포의 배양액을 수거하여 MMP-1의 측정은 Amersham matrix metallproteinase-1, Human, Biotrak ELISA system(GE Healthcare)을 이용하여 측정하였다.

(나). Western blot을 통한 세포내 주름 관련 단백질의 발현 측정

Western blot을 이용하여 MMP-1, MMP-2, ProCOL1A2 단백질의 양을 측정하였다. CCD-986sk를 이용하여 culture dish에 배양한 뒤 sample 처리를 한 다음 48시간 후에 PBS로 세척한 후 원심분리 하여 세포를 수집하고, RIPA buffer를 사용하여 cell lysate를 제조하였다.

세포 lysate에 함유된 단백질의 양은 Bradford 법으로 측정하였다. 단백질 20μg을 10% polyacrylamide를 함유한 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF membrane으로 electroblot 120 V에서 1시간을 실시하였다. 이어 PVDF membrane을 5% skim milk에서 1시간 방치한 뒤 primary antibody에서 4℃에서 overnight하여 주었다.

다시 TBST로 세 번 세척한 뒤 secondary antibody를 상온에서 1시간 반응 시킨 뒤 TBST로 세 번 세척하고 ECL kit (Amersham-Pharmacia)와 반응시켜 X-ray film에 노출 시켰다.

X-ray film에 현상되어진 밴드를 LAS4000 이미지 분석장치를 이용하여 정량화 하였다(39).

3. 실험 결과

(1). 미성숙 잣(Pinus koraiensis Siebold et Zucc)구과로부터 phenol성 물질의 추출

식물에 존재하는 많은 phytochemical 중 폴리페놀 화합물이나 플라보노이드류는 여러 가지 식물에 널리 분포되어 있으며 천연 항산화제로써 작용할 수 있다는 여러 연구들이 행해져 왔다. Phenolic compounds은 식물계에 널리 분포하고 있다.

이는 식물체의 2차 대사산물로서 여러 가지 다양한 구조와 분자량을 가지고 있어 이화학적 성질 및 생리적 활성도 매우 다르게 나타난다. 특히 이들은 phenolic hydroxyl기를 가지고 있기 때문에 거대분자로 분류되는 단백질, 효소단백질 등과 결합하는 성질이 있어 항산화, 항균활성 등과 같은 여러 생리 기능을 가진다고 보고되어 있다.

경기도 지방에서 주로 재배되는 잣나무로부터 미성숙 잣구과를 수확하여 사용하여, 시료의 유효성분을 보다 효율적으로 추출할 방안을 확립하기 위하여 인체에 유해하지 않은 용매로 물과 에탄올을 선택하여 용매 종류별, 추출시간별, 용매 농도별로 용출되는 생리활성성분을 phenolic 화합물을 주 target으로 하여 함량을 측정한 결과 Table 1에서와 같이 물추출물이 3.7±0.9 mg/mL이었고, 80% ethanol 추출물에서 4.9±0.8 mg/mL의 함량을 나타내었다.

시료	페놀성 물질의 함량(mg/g)
시료	열수 추출물	80% 에탄올 추출물
미성숙 잣구과	3.7±0.9	4.9±0.8

(2). 잣구과 추출물의 항산화 활성

(2-1). 잣구과 추출물의 DPPH 소거능 측정

잣구과 물과 ethanol 추출물의 oxidative free radical 반응을 이용한 환원성 물질의 분석인 DPPH법으로 측정한 결과, 도 1에서와 같이 phenolic compound가 가장 많이 용출된 80% ethanol 추출물에서 최대의 DPPH 소거능을 나타내었으며, ethanol 추출물이 물추출물 보다 효과가 우수하였다.

Phenolic 농도에 따른 DPPH 소거능의 변화를 살펴본 결과, 도 2에서와 같이 첨가되는 phenolic의 함량이 높아질수록 농도의존적으로 DPPH 소거능도 증가하는 것을 알 수 있었고, 50 μg/mL의 저농도에서도 물추출물이 79.8%, ethanol 추출물이 90.2%의 높은 억제력을 나타내어 잣구과 추출물은 수용성물질에 대한 항산화력이 대단히 우수한 것으로 확인되었다.

또한, 대조구인 합성 항산화제인 BHA에 비해 더 우수한 산화 억제력을 나타내어 노화방지 식품 또는 화장품의 소재로 활용이 가능하리라 판단되었다.

(2-2). 잣구과 추출물의 ABTS radical cation decolorization 측정

추출물들의 상대적인 항산화 측정은 hydrogen-donating antioxidant와 chain breacking antioxidant 모두를 측정할 수 있으며, aqueous phase와 organic phase 모두에 적용이 가능할 뿐만 아니라, 표준물질의 사용으로 추출물의 상대 비교가 가능하도록 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS⁺free radical이 추출물속의 항산화 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는데, 이러한 원리를 이용하여 ABTS를 측정한 결과 도 3에서와 같이 열수 추출물의 경우 47.7%의 억제력을 나타내었고, ethanol 추출물의 경우 80% ethanol 추출물에서 43.2%로 최대 억제력 나타내어 물 추출물과 비슷한 수준의 항산화력을 나타내는 것으로 확인되었다.

첨가되는 phenolic compound의 함량에 따른 항산화력을 살펴본 경우 도 4에서와 같이 첨가되는 phenolics의 농도가 높아질수록 농도 의존적으로 ABTS 저해력이 높아지는 것을 확인할 수 있었고, 150 μg/mL phenolics 이하의 농도에서는 대조구인 BHA(72.8% 억제)에 비해 항산화력이 다소 낮으나, 200 μg/mL phenolics의 농도에서는 비슷한 수준인 것으로 확인되었다.

(2-3). 잣구과 추출물의 antioxidant protection factor (PF) 측정

β-carotene을 linoleic acid emulsion에 첨가하여 잣구과 추출물들의 지용성 물질에 대한 항산화력을 측정한 결과 도 5에서와 같이 물추출물의 0.86 PF에 비해 ethanol 추출물이 80% ethanol 추출물에서 1.08 PF로 높게 측정되었으며, 첨가되는 phenolic compound의 함량에 따른 항산화력을 살펴본 경우 도 6에서와 같이 첨가되는 phenolics의 농도가 높아질수록 농도 의존적으로 PF가 높아지는 것을 확인할 수 있었다.

50~200 μg/mL phenolics의 전 농도에서 대조구인 BHA에 비해 상대적으로 높은 PF를 나타내어 지용성 물질에 대한 항산화력이 매우 높음을 알 수 있었다.

(2-4) 잣구과 추출물의 TBARS 측정

지용성 물질에 대한 항산화력을 측정하기 위하여 잣구과 추출물의 TBARS를 측정하여 비교한 결과 도 7에서와 같이 물추출물과 80% ethanol 추출물에서 각각 61.9%와 71.1%의 억제력을 확인하였으며, 첨가되는 phenolic compound의 함량에 따른 항산화력의 경우 도 8에서와 같이 첨가되는 phenolics의 농도가 높아질수록 농도 의존적으로 PF가 높아지며, 50 μg/mL phenolics의 낮은 농도에서도 80% 이상의 높은 항산화력을 나타내었다.

대조구인 BHA와 비교하여 50~100 μg/mL phenolics의 농도에서는 상대적으로 추출물의 항산화력이 조금 낮게 나타났으나, 150~200 μg/mL phenolics의 농도에서는 대조구인 BHA와 유사한 수준의 항산화력을 나타내었다.

(3). 미성숙 잣구과 추출물의 수렴효과

수렴작용의 원리는 피부 단백질의 고분자 flavonoids와 결합하여 가교결합을 형성하여 피부가 수축되는 현상을 말한다. "수렴"이란 뜻에는 기본적으로 주름이 지고 혹은 움츠린다는 의미가 있으므로, 수렴제는 피부와 점막 혈관 등을 수축시키는 작용이 있고, 세포간극 및 림프간극을 가로막아 점액의 분비를 억제시키는 효과가 있다.

또한, 수렴제는 단백질과 결합하는 성질을 가지기 때문에, 일반적으로 헤모글로빈 단백질이 추출물과 결합하는 정도에 따라서 수렴성 효과 정도를 판단 할 수 있다. 이러한 수렴작용에는 외용 혹은 내용에 의해서 피부와 점막의 표면에 난용성의 피박을 형성하고 그 결과 구조를 보호하거나, 혹은 조직을 조밀하게 하여 세포막의 투과성을 감소시키는 효과가 있다.

잣구과 추출물의 농도를 50~200 μg/mL phenolics로 조절하여 수렴성을 측정한 결과, 도 9 및 도 10에서와 같이 잣구과 물과 ethanol 추출물에서는 함유된 phenolic compound의 함량이 낮아, 수렴효과가 20% 이하의 낮은 효과를 나타내었으나, 200 μg/mL phenolics의 농도로 첨가하였을 때 대조구인 tannic acid의 62.4%에 비하여, ethanol 추출물에서 71.5%로 상대적으로 더 높은 수렴성을 나타내어 모공 축소를 위한 화장품 소재로 활용이 가능하리라 판단되었다.

(4). 미성숙 잣구과 추출물의 미백 효과 측정 결과

(4-1). Mushroom 유래의 tyrosinase 저해 활성 확인

피부의 색조를 결정하는 주요한 인자인 melanin은 표피 기저층의 melanocyte라고 불리는 색소세포 내의 melanosome에서 생합성된다. 멜라닌을 합성하는데 있어서의 출발물질은 아미노산의 일종인 tyrosine이다.

Tyrosine은 멜라닌 세포내에서의 tyrosinase에 의해 L-3,4-dihydroxyl phenylalanine (DOPA), DOPA quinone으로 산화된다. 그 후 DOPAquinone이 DOPA chrome, 5,6-dihydroxyindole, indole-5,6-quinone이 되고, 이어서 indole-5,6- quinone으로의 중합에 의해 melanin을 생성하는 것으로 알려져 있다.

또한, tyrosinase는 피부 멜라닌 생성에 있어서 매우 중요한 역할을 하고 있으며, melanosome 내에서 tyrosine을 산화시켜 DOPA를 만드는 tyrosine hydroxylase로, DOPA를 산화시켜 DOPA quinone을 만드는 DOPA oxidase로서 작용하여 멜라닌 중합체를 합성하는데 중요한 효소로 작용한다.

사람의 피부색은 멜라닌(melanin)이나 카로틴(carotene)과 같은 색소 성분과 혈관의 분포, 각질층의 두께 등에 의해서 결정되는데, 이는 멜라닌이 피부색을 결정하는 가장 중요한 요소로 자외선을 차단하는 기능도 갖고 있지만 국소적으로 과도하게 합성되거나, 멜라닌 생성에 이상이 생기면 melasma, freckle 및 hyper-pigmentation을 유발하게 된다. 따라서 멜라닌 합성의 기질인 tyrosine을 분해하는 tyrosinase를 저해함으로서 멜라닌의 합성을 억제하여 피부의 미백효과를 볼 수 있다.

항산화 활성과 밀접한 관계가 있는 tyrosinase inhibition effect에 관해서는 최근 vitamin C, kojic acid, arbutin, hydroquinone 등의 천연 및 합성 미백제가 개발 연구되어 미백 화장품에 응용되고 있다.

본 연구에서 미성숙 잣구과 추출물의 농도를 50, 100, 150, 200 μg/mL로 조절하여 tyrosinase inhibition test한 결과, 도 11 및 도12에서와 같이 잣구과 물추출물의 경우에는 7.8%의 저해효과를, 80% ethanol 추출물에서 11.7%의 비교적 낮은 tyrosinase 저해효과를 나타내었다.

첨가된 phenolic compounds의 농도가 높아질수록 80% ethanol 추출물의 경우 미백효과가 증대하는 경향이었으나, 대조구인 kojic acid에 비하여 낮은 수준의 tyrosinase 억제효과를 나타내었으며, 물추출물의 경우 첨가되는 phenolics의 농도에 관계없이 tyrosinase 억제 효과는 낮은 수준을 나타내었다.

(4-2). Melanoma cell (B16F10)의 생존율 확인

MTT 검색법은 96 well plate를 사용하여 검사 결과를 ELISA reader를 이용하여 많은 시료를 간단하게 판독할 수 있어 세포 독성 및 세포 증식 검색법으로 널리 사용되고 있으며, 세포의 대사과정에서 미토콘드리아의 탈수소 효소 작용에 의해 노란색 수용성 MTT tetrazolium을 자주색을 띠는 비수용성의 MTT formazan으로 환원시키는 방법이다.

미성숙 잣구과 추출물에 의한 melanoma 세포의 생존율을 MTT assay에 의해B16F10세포에 1, 5, 10, 25 μg/ml의 농도로 처리한 결과, 미성숙 잣구과의 물과 알콜 추출물 25 μg/mL의 농도에서 모두 40%이상의 세포 독성율을 나타내었으며, 1, 5, 10 μg/ml에서는 90%이상의 세포 생존율을 나타내는 것을 확인하였다(도 13).

(4-3). Melanoma cell(B16F10)에서의 tyrosinase 저해 활성 확인

티로시나아제는 피부가 자외선에 노출되면 티로신에서 멜라닌 생성에 가장 중요하게 작용하는 효소로서, 티로시나아제 활성을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제 할 수 있으며, 이로 인해 기미, 주근깨, 노인성 홍반 등의 유발을 막을 수 있는 것으로 알려져 있다.

Tyrosinase는 Cu² ⁺와 결합한 효소로 동식물, 미생물 및 사람 등에 널리 분포되어 있는 polyphenol oxidase로 멜라닌 합성 과정에서 속도를 제한하는 등 멜라닌 합성의 주요한 조절적 단계를 나타내는 효소이다.

첨가된 미성숙 잣구과 추출물이 25 μg/mL의 농도에서 20% 이하의 낮은 저해율을 나타내었으며, 잣구과 물추출물과 알콜 추출물의 25 μg/mL농도에서 30%의 저해율을 나타내었다(도 14).

(4-4). Melanoma cell (B16F10)에서의 melanin 생합성 저해 확인

사람의 피부색을 결정하는 가장 중요한 요인인 멜라닌은 피부의 광노화나 일광각화증을 억제할 뿐만 아니라, 기미, 주근깨, 검버섯 등의 부분적인 과색소침착증 (hyperpigmentation)을 일으키는 역할을 하고 있다.

멜라닌은 표피 기저층 melanocyte의 수지상 돌기를 통하여 주위의 keratinocyte로 전달되고, 피부의 각질층으로 이행한다. 피부 흑화는 피부에 존재하는 melanocyte가 UV 노출 등의 외부적 환경에 대응하여 melanin의 생성을 증가하기 때문이다. 원료 및 물질의 미백효능을 확인하기 위해 melanin 생성효소인 Tyrosinase의 효소활성 억제 탐색이 주요하게 이용되어 왔으나 최근 효소활성억제와 더불어 미백원료가 melanocyte에서 tyrosinase와 관련 효소 발현을 증가시키는 환경에서 신호전달 체계를 교란시키는 기전 연구에 대한 보고가 매우 많아졌다.

B16F10세포내에서의 melanin 함량을 측정하기 위하여 미성숙 잣구과 물추출물과 알콜 추출물을 1, 5, 10 μg/mL의 농도로 처리한 결과, 도 8에서와 같이 10 μg/mL 농도에서는 40% 이하의 melanin 합성을 저해하였다(도 15).

(4-5). 미성숙 잣구과 추출물의 melanin 합성에 관여하는 tyrosinase 발현 억제 효과

미성숙 잣구과 추출물이 pro-collagen에서 우수한 효능을 나타내어 주름관련 단백질 및 mRNA 발현량을 확인하였다. Melanin 합성에 관계된 효소인 tyrosinase에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포에 농도별로 1~10μg/mL의 농도로 처리 한 후 48시간 뒤에 tyrosinase protein 발현을 western blotting으로 확인하였다.

이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 β-actin을 positive control로 사용하였다.

도 16에서 보는 바와 같이, 추출물을 처리하지 않은 B16F10군에서는 각 전사인자의 단백질 발현이 증가하였지만, 미성숙 잣구과 추출물을 처리한 B16F10군에서는 tyrosinase protein의 발현이 처리하지 않은 군보다 농도 의존적으로 감소하여 10 μg/mL의 농도에서는 알콜 추출물에서 약 60%의 발현 억제 효과를 나타내었다.

따라서, 미성숙 구과 추출물이 mushroom tyrosinase의 발현을 농도 의존적으로 감소시키는 결과를 나타냄에 따라, 미성숙 잣구과 추출물은 tyrosinase의 발현을 단계적으로 저해시킴으로서 멜라닌 생성 억제에 효과가 있음을 확인 할 수 있었다.

(4-6). Melanin 합성에 관여하는 microphthalmiaassociatedtranscription factor (MITF) 발현 억제 효과

Melanin 생합성 신호전달 체계에는 매우 다양한 신호전달물질이 관여하고 있다. Melanin은 몇 가지 세포내 신호전달 기전을 통하여 합성되며, 그 중에서 cAMP (cyclic adenosine monophosphate)/PKA (protein kinase A)경로가 melanin 합성의 주요 경로로서 UV에 피부가 노출되었을 때 melanin세포의 cAMP가 증가되고 하류 신호전달 물질인 PKA를 활성화 시키며, CREB (cAMP response element binding protein)을 거쳐 MITF (microphthalmia -associatedtranscription factor)의 발현을 증가시킨다. MITF는 melanin 합성 과정에서 중요한 전사 조절 인자로 tyrosinase의 전사를 촉진한다.

미성숙 잣구과 추출물의 미백효과 검증을 위해, melanin 합성과 관련된 MITF의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여, B16F10 mouse melanoma 세포에 농도별로 1~10μg/mL의 농도로 처리한 후, 48시간 뒤에 MITF protein 발현을 western blotting으로 확인하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 β-actin을 positive control로 사용하였다.

도 17에서와 같이 추출물을 처리하지 않은 B16F10군에서는 각 전사인자의 단백질 발현이 증가하였지만, 미성숙 잣구과 추출물을 처리한 B16F10군에서는 MITF protein의 발현이 처리하지 않은 군보다 농도 의존적으로 감소하여 10 μg/mL의 농도에서는 약 30%로 전사조절 인자인 MITF 발현을 가장 낮게 감소시켰다.

따라서 미성숙 구과 추출물이 MITF의 발현을 농도 의존적으로 감소시키는 결과를 나타냄에 따라 미성숙 잣구과 추출물은 멜라닌 생성 억제에 효과가 있음을 확인 할 수 있었다. 이는 잣구과 추출물이 미백효과 검증기전 연구에서 MITF 발현 억제를 통하여 tyrosinase의 단백질 발현이 감소되는 것으로 확인되었다.

(5). 미성숙 잣구과 추출물의 주름개선 효과 측정 결과

(5-1). Elastase 저해 활성 확인

피부는 주름 증가와 탄력감소, 색소 침착 등이 노화의 대표적인 형태로, 그 중 가장 대표적인 노화의 현상은 바로 주름이다. 인체의 중성구 과립구내에 존재하는 elastase는 진피 내 피부탄력을 유지하는데 주요한 기질 단백질인 엘라스틴을 분해하는 효소이며, elastase가 작용함에 따라 피부조직내의 elastin을 분해함으로서 피부의 탄력성이나 싱싱함을 잃게 하고, 주름과 거칠어짐을 발생하여 피부의 노화를 촉진한다. 따라서 elastase의 활성을 억제함으로서 피부노화를 지연시킬 수 있을 것이다.

Elastase는 다른 중요한 기질 단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이며, elastase 저해제는 피부 주름을 개선하는 작용을 나타내며, 현재 ursolic acid 등이 elastase 저해제로 이용되고 있다. 또한 Cannell 등은 체내의 엘라스틴을 분해하는 백혈구 과립 효소 중의 하나로 이상조직에서는 그 효소의 활성이 극히 높아 조직 파괴에 직접적인 원인이 되어 피부주름 및 탄력성 소실을 유발한다고 하였다.

따라서, elastase 저해활성을 측정함으로서 주름개선의 효과를 기대할 수 있다. Elastase는 기질인 N-succinyl- (Ala)-3-p-nitroanilide를 이용하여 nitroanilide (NA)가 분해되면서 생기는 색의 변화를 흡광도를 이용하여 측정해서 엘라스타제 활성을 확인하였다. 가장 널리 활용되고 있는 방법이나 생체 엘라스틴 대신 합성된 기질을 이용하여 활성을 측정한다는 단점이 있다.

Elastase 저해제로는ursolic acid 등이 elastase 저해제로 이용되고 있는데, ursolic acid는 물이나 오일 등의 용매에는 잘 녹지 않는 물성을 가지고 있기 때문에, 제제화하기 어려워 일반적으로 사용하기 어려운 문제점이 있다.

미성숙 잣구과 추출물의 농도를 50~200 μg/mL phenolics의 농도로 조절하여 elastase 저해활성 측정한 결과, 도 18에서와 같이 ethanol 농도별 잣구과 추출물의 elastase 저해 활성은 80% ethanol 추출물에서 가장 높게 나타났으며, 추출한 phenolis의 농도가 50 μg/mL에서 200 μg/mL로 높아짐에 따라 농도 의존적으로 elastase에 대한 저해 활성이 높아짐을 확인하였으며(도 19), 200 μg/mL phenolics의 첨가농도에서 43.3%의 높은 저해력을 확인할 수 있었다.

(5-2). Fibroblast cell (CCD-986sk)의 생존율 확인

(5-2-1). CCD986sk fibroblst 세포에 관한 MTT 측정 결과

미성숙 잣구과 추출물의 세포 생존율을 측정하기 위하여 CCD-986sk세포에 1, 5, 10, 25 μg/mL의 농도로 처리한 결과, 물 추출물의 경우 25 μg/mL의 농도에서 80%에 가까운 세포 독성을 나타내는 것을 확인하였지만, 알콜 추출물에서는 25 μg/mL의 농도에서 미비한 독성을 나타내는 것을 확인하였으며 1, 5, 10 μg/mL의 농도에서는 높은 생존율을 나타내는 것을 확인하였다 (도 20).

(5-3). ELISA kit를 이용한 fibroblast (CCD-986sk)에서의 procollagen type Ⅰ생합성 kit 측정 결과

콜라겐은 대부분 피부의 진피층에 존재하며, 피부 전체 건조중량의 약 70～80%를 차지하고 있어, 세포외 기질의 대부분을 차지하면서 피부를 지지하는 역할을 한다. 그러나 자연 노화에 따른 세포 활성의 감소와 같은 내적 요인에 의해 콜라겐의 생합성이 감소되고, 여러 가지 유해 환경에 의한 스트레스의 증가 및 태양 광선에 의한 활성 산소종의 증가와 같은 외적 요인에 의해 분해가 가속화 되어 피부 기질이 파괴되면서 주름이 생성된다.

또한, 콜라겐은 상처 치유에 있어서 중요한 역할을 담당하며, 손상된 상피에서 콜라겐의 합성을 촉진시키면서 상처를 신속하게 흉터없이 회복할 수 있다. 현재까지 밝혀진 콜라겐 합성 촉진 물질 중 가장 대표적인 것으로는 centella asiatica의 주성분들인 asiaticoside, asiatic acid, madecasic acid 등을 들 수 있다.

CCD-986sk세포내에서의 미성숙 잣구과 물과 알콜 추출물 1, 5, 10 μg/mL 농도에서의 pro-collagen의 합성을 측정한 결과, 도 21에서와 같이 10 μg/mL의 농도에서 각각의 추출물이 pro-collagen 생합성을 나타내었으며, 특히 10 μg/mL의 농도에서 약 70%의 생합성율을 나타내어 동일농도에서 대조물질인 epigallocatechin-3-O-gallate(EGCG)의 농도에서 72%의 생합성율과 비교하여 유사한 효능 확인할 수 있었다.

(5-4). Western blotting analysis를 이용한 fibroblast (CCD-986sk)에서의 procollagenase protein 발현억제 효과

피부의 주름은 콜라겐의 생합성이 감소되고, 유해 환경과 같은 여러 가지 외적 요인에 의해 collagen의 분해가 가속화 되어 피부 기질이 파괴되면서 생성된다. 또한 콜라겐의 생합성은 상처 치유에 있어서 중요한 역할을 담당하며, 손상된 상피에서 콜라겐의 합성을 촉진시켜 상처를 신속하게 회복시켜준다.

따라서, 미성숙 잣구과 추출물이 콜라겐의 생합성에 관계된 효소인 procollagenase의 효소 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 CCD-986sk 세포내에서의 procollagenase protein 발현을 western blotting으로 확인하였다. 이때, 세포의 여러 조건에서도 그 발현정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다.

도 22에서 보는 바와 같이 UV-B를 조사한 control군에서는 procollagenase의 발현정도가 normal 군에 비해 현저하게 감소하는 것이 확인되었다. 미성숙 잣구과 추출물을 처리한 CCD-986sk 세포군에서는 각 전사인자의 단백질 발현양이 첨가되는 추출물의 농도 의존적으로 증가하였으며, 10 μg/mL의 농도에서는 거의 normal군의 발현정도로 회복되는 것으로 확인되었다.

따라서, 미성숙 잣구과 추출물은 손상된 procollagenase를 활성화시킴으로 인해 콜라겐의 합성을 촉진시켜 생성된 주름의 개선 효과를 나타내며, 손상된 상피에서의 회복을 촉진시켜주는 작용을 수행하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

(5-5). 섬유아 세포(CCD-986sk)의 주름관련 단백질(MMP-1) 및 mRNA 발현량 확인

피부 세포의 결합 조직을 구성하는 성분 중 collagen은 피부 건조 중량의 90%정도를 차지하는 주요 구성 단백질이다. 따라서 collagen의 분해는 결합 조직의 탄력 저하와 주름 생성 등에 직접적인 영향을 미친다. 또한 노화와 관련된 인자인 MAPK에 가장 많은 영향을 받은 인자는 c-fos이며 이는 p38의 영향을 받는다.

이러한 요인들이 활성화되면 MMPs의 발현을 강력히 조절한다. 체내에서 생성되는 수종의 MMPs가운데 MMP-1은 collagen에 특이적으로 작용하는 protease로서 MMP-1 활성을 억제하면 collagen의 분해를 감소시키며, 피부 조직의 탄력을 유지하고 주름 생성을 예방할 수 있는 것으로 알려져 있다.

CCD-986sk 세포 내에서의 MMP-1의 활성을 측정한 결과, 미성숙 잣구과 물과 알콜 추출물 모두 농도 의존적으로 저해율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다 (도 23).

(5-6). Western blotting analysis를 이용한 fibroblast (CCD-986sk)에서의 intestitial collagenase (MMP-1)과 92kD gelatinase (MMP-9)의 protein 발현억제 효과

피부 진피내 세포외 기질 단백질(extracellular matrix)의 재구성에는 여러 생체 반응이 관하며, 이들 기질단백질 들이 피부의 구조와 탄력성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 이중 특히 MMPs가 기질 단백질들을 분해하는 중요한 역할을 하고 있으며, intestitial collagenase (MMP-1), 72kD gelatinase (MMP-2), 92kD gelatinase (MMP-9), neutrophil collagenase (MMP-8), collagenase (MMP-13) 등 26가지 이상의 MMPs가 이미 알려져 있다.

과다한 자외선에 노출된 피부에서는 MMPs의 발현이 증가되며, 증가된 MMPs가 피부를 구성하고 있는 교원질을 분해하여 기질 단백질의 결핍을 초래하게 됨으로써, 피부노화와 더불어 주름이 발생하게 된다.

피부 결합 조직 중 90%를 차지하는 collagen에 특이적으로 작용하는 protease로서 MMP-1 활성을 억제하면 collagen의 분해를 감소시키며 피부 조직의 탄력을 유지하고 주름 생성을 예방할 수 있다. 또한 MMPs 효소 중 72kD gelatinase (MMP-2)와 같은 계열로 92kD gelatinase인 MMP-9도 진피층의 세포간 material로 존재하는 gelatin의 분해를 초래하는 gelatinase의 활성을 유도하는 효소로 역시 주름의 발생에 관여하는 중요한 인자이다.

그러므로 MMP-1과 더불어 MMP-9의 활성을 억제하면 collagen의 분해를 감소시키며 피부 조직의 탄력을 유지하고 주름 생성을 예방할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 미성숙 잣구과 추출물이 MMP-1과 MMP-9 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 CCD-986sk 세포내에서의 MMP-1과 MMP-9 protein 발현을 western blotting으로 확인 하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 β-actin을 positive control로 사용하였다.

도 24에서 보는 바와 같이, UV-B를 조사한 control군에서는 MMP-1의 발현정도가 normal 군에 비해 현저하게 증가되어 있는 것이 확인되었다. 미성숙 잣구과 추출물을 처리한 CCD-986sk 세포군에서는 각 전사인자의 단백질 발현양이 첨가되는 추출물의 농도 의존적으로 감소하였으며, 10 μg/mL의 농도에서는 현재 시중에서 이용되고 있는 EGCG보다 억제율이 더 우수한 것을 확인 할 수 있었다.

따라서, 미성숙 잣구과 추출물은 MMP-1 단백질의 발현을 억제하여 결과적으로 collagenase의 억제를 유도함으로서 주름의 개선 효과를 나타내며, 손상된 상피에서의 회복을 촉진시켜주는 작용을 수행하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

MMP-9의 경우 역시 control군에서 protein의 발현정도가 normal 군에 비해 현저하게 증가되어 있는 것이 확인되었으며, 미성숙 잣구과 추출물을 처리한 CCD-986sk 세포군에서는 도 25에서와 같이 각 전사인자의 단백질 발현양이 첨가되는 추출물의 농도 의존적으로 감소하였으며, 10 μg/mL의 농도에서는 물추출물에서 현재 시중에서 이용되고 있는 EGCG와 유사한 억제율을 나타내었고, 알콜 추출물의 경우 대조구인 EGCG 보다 더 우수한 억제력을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 미성숙 잣구과 추출물은 MMP-9 단백질의 발현을 억제하여 결과적으로 주름의 개선 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

(5-7). TIMP-1 활성 kit 측정 결과

MMP 활성화는 α2-macroglobulin과 RECK등과 같은 비 특이적 저해제뿐만 아니라 tissue inhibitors of metallo-proteinase에 의해 특이적으로 저해될 수 있다(Visse, Nagase, 2005). TIMPs는 화학량론에서 1:1로 특이적 결합하는 특이적 저해제이다. TIMP-1은 조직내에서 MMP-1의 중요한 저해제로 연관이 있다.

TIMP-1의 활성을 측정하고자 CCD-986sk 세포에 UV-B를 조사한 후 추출물을 1, 5, 10 μg/mL의 농도별로 처리 후 48시간동안 배양하였다. 세포의 배양액을 취하여 TIMP-1의 활성을 측정한 결과, 미성숙 잣구과 알콜 추출물의 경우, 10 μg/mL의 농도에 82%의 높은 발현율을 확인하였다(도 26).

<제제예 1> 에센스

상기 실시예 1에서 제조한 미성숙 잣구과 열수 추출물을 함유하는 에센스의 제제예는 하기 표 2의 조성과 같이 제조하였다.

성분	함량(중량%)
미성숙 잣구과 열수 추출물	5.0
글리세린	7.0
1,3-부틸렌글리콜	2.0
폴리에틸렌글리콜	2.0
카보머	1.0
소듐하이루로네이트	0.1
글리신	3.0
폴리아크릴아마이드	2.0
하이드록시에틸셀룰로오즈	0.2
에탄올	3.0
폴리옥시에틸렌파마자유	1.0
항산화제	0.3
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
향료	0.05
정제수	잔량
합계	100

<제제예 2> 크림

상기 실시예 10에서 제조한 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 함유하는 크림의 제제예는 하기 표 3의 조성과 같이 제조하였다.

성분	함량(중량%)
미성숙 잣구과 에탄올 추출물	10.0
글리세린	3.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
하이드로지네이티드 레시틴	1.0
옥틸도데카놀	3.0
트리옥타노인	2.01
스테아린산	1.5
스테아릴알코올	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	3.0
폴리옥시에틸렌파마자유	2.0
항산화제	0.3
디메치콘	3.0
잔탄검	0.2
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
향료	0.05
정제수	잔량
합계	100

<제제예 3> 팩

상기 실시예 1에서 제조한 미성숙 잣구과 열수 추출물을 함유하는 팩의 제제예는 하기 표 4의 조성과 같이 제조하였다.

성분	함량(중량%)
미성숙 잣구과 열수 추출물	8.0
글리세린	7.0
1,3-부틸렌글리콜	30
스쿠알렌	3.0
디메치콘	3.0
소듐하이루로네이트	0.1
글리신	2.0
폴리아크릴아마이드	5.0
항산화제	0.3
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
향료	0.05
정제수	잔량
합계	100

<제제예 4> 영양 화장수

상기 실시예 10에서 제조한 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 함유하는 영양 화장수의 제제예는 하기 표 5의 조성과 같이 제조하였다.

성분	함량(중량%)
미성숙 잣구과 에탄올 추출물	7.0
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	2.0
폴리에틸렌글리콜	2.0
카보머	1.0
소듐하이루로네이트	0.1
글리신	3.0
폴리아크릴아마이드	2.0
하이드록시에틸셀룰로오즈	0.2
에탄올	3.0
폴리옥시에틸렌파마자유	1.0
항산화제	0.3
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
향료	0.05
정제수	잔량
합계	100

<제제예 5> 수렴 화장수

상기 실시예 10에서 제조한 미성숙 잣구과 에탄올 추출물을 함유하는 수렴 화장수의 제제예는 하기 표 6의 조성과 같이 제조하였다.

성분	함량(중량%)
미성숙 잣구과 에탄올 추출물	3.5
글리세린	2.0
1,3-부틸렌글리콜	2.0
알란토인	2.0
D,L-판테놀	0.2
EDTA	0.1
벤조페논	0.04
소듐히아루로네이트	3.0
에탄올	15.0
폴리솔베이트 20	0.3
구연산	0.05
향료	0.1
정제수	잔량
합계	100

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예, 실험예 및 적용예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명의 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물은 피부의 항산화 효과, 미백 효과 및 주름개선 효과를 지니기 때문에, 화장료 산업분야에 유용하게 적용될 수 있다.

Claims

열매가 정상적으로 맺히지 않는 미성숙 잣구과 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물로서, 상기 피부개선이 항산화, 미백 및 주름개선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 미성숙 잣구과 추출물은 상기 조성물 전체중량 대비 0.1~99.9 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 미성숙 잣구과 추출물은 열수 추출물 또는 C₁~C₄의 알코올 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제3항에 있어서, 상기 알코올이 에탄올인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 피부개선이 항산화, 미백 및 주름개선인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 크림, 로션, 스킨, 유연화장수, 수렴화장수, 파운데이션, 에센스, 팩, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트 및 미용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.