KR102315646B1 - 잣나무 추출물을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 잣송이 지표성분인 α-pinene 또는 이를 함유하는 잣나무 추출물의 콜라게나제 억제 활성을 통한 피부재생, 주름개선 등의 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것이다.

Description

잣나무 추출물을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물{Skin improvement composition including Korean pine extract}

본 발명은 잣나무 추출물을 유효성분으로 함유한 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 잣나무 추출물이 각질 형성 세포 증식효과, 콜라게나제 증가, 부신피질호르몬인 디하이드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone : DHEA)의 생합성을 촉진함으로써 피부 문제 개선, 피부 주름 개선, 피부재생, 민감성 피부인 아토피 피부 개선, 욕창 개선, 화상으로 인한 피부손상 개선, 피부 노화 저해, 손상 피부에 대한 창상치료를 통한 피부 개선 효과가 뛰어난 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체의 약 16%를 차지하고 있으며, 외부환경과 직접적으로 접해 있어 온도, 습도 및 자외선 등과 같은 외부 유해인자들로부터 인체를 보호하는 중요한 역할을 하고 있다. 그러나 나이가 들어감에 따라 각종 오염물질, 강한 자외선, 스트레스 및 영양결핍 등으로 인해 피부 세포들이 손상을 입게 되고, 세포 증식이 원활하게 되지 않아 피부에 주름, 탄력 손실 및 각질화 등이 발생한다.

피부는 외부 요인(온도, 습도, 건조)에 의한 피부 생리활성 저하 또는 유해활성산소, 자유 라디칼에 의한 체내의 산화 작용에 의하여 과산화 지질이 생성되어 피부를 구성하는 단백질들의 변형을 유발한다고 보고되어 있다.

피부에서 활성산소가 세포막을 공격하여 산화시키게 되고, 산화된 지질에 의해 세포막이 손상되어 정상적인 피부 세포의 기능을 상실하게 된다. 또한, 피부의 효소적, 비효소적 항산화 방어 체계의 균형이 유지되지 못해 피부가 지속적인 산화상태에서 회복 되지 못해 피부는 거칠고 윤기가 없어진다.

외부의 자극으로부터 가장 먼저 반응을 하는 피부는 크게 표피, 진피, 피하지방의 3부분으로 구분할 수 있다. 각질층, 투명층, 과립층, 유극층, 기저층을 포함하는 표피와 유두층, 망상층으로 이루어진 진피층과 지방세포로 이루어진 피하지방이 있다. 가장 표면층인 표피는 외부의 자극으로부터 신체를 보호하는 역할을 하며, 각질형성세포는 표피 세포의 대부분을 구성하는 성분으로 각질을 형성하고 여러 cytokines를 생산하여 다양한 염증 반응과 면역 반응에 관여한다. 따라서 각질형성세포의 증식을 자극하에 따라 표피 재생 효과도 있는 것으로 밝혀졌다.

피부의 대부분을 차지하는 진피는 표피와의 상호작용에 의해 피부의 재생을 도우며, 진피의 75% 이상을 차지하고 있는 탄력섬유인 collagen의 감소는 피부의 주름 및 탄력감소로 인해 나타나는 피부노화와 밀접한 관련이 있다.

피부의 진피 조직에 존재하는 fibroblast는 피부의 유연성, 탄력성, 장력을 유지하는 역할을 하며 피부뿐만 아니라 각종 장기에 존재하여 외부 공격으로 파괴된 조직을 복원하는 역할을 주로 한다. 상처 치유는 진피 섬유아세포와 표피 각질 세포의 분화, 이동, 증식과 같은 여러 가지 세포의 특징과 관련된 복합적인 생리학적 반응이다.

정상적인 상처 치유 과정에서는 상처부위의 염증 세포에서 분비되는 매개체들의 신호에 의해 대식세포들이 상처 주위로 이동하고, cytokine 등을 분비하면 상처 부위에서 섬유아세포 등의 이동과 증식이 진행되면서 상처부위의 진피층이 기질을 형성하고 상처가 치유된다. 그러나 상처 치유과정에서 fibroblast의 과도한 증식으로 콜라겐이 과잉 생산되는 경우 비대흉터, 켈로이드, 피부섬유종, 피부경화증 등과 같은 질환이 나타난다.

비대 흉터나 켈로이드와 같은 질환은 질병으로서의 문제뿐만 아니라 피부에 대한 관심이 높은 현대인들의 피부 미용적인 측면에 있어서도 높은 관심을 나타내는 부분이다.

노화란 세월이 지나감에 따라 신체의 구조와 기능이 점진적으로 저하되고 질병과 사망에 대한 감수성이 급격히 증가하면서 쇠약해지는 과정으로 신체에 생리적 변화가 발생하여 신체 전반적으로 현저한 퇴화현상이 나타나게 되는 것을 말한다. 이중에서 우리가 가장 쉽게 느낄 수 있는 것이 피부 노화로 이는 당뇨병, 심장병, 동맥경과, 치매, 암 등에 못지않게 중요한 것으로 인식이 되고 있으며, 개인차가 있지만 피부노화는 대개 20대 초반을 전후해서 시작되어 나이가 많아지면서 증가하는 것으로 나타난다.

피부 노화는 유전적, 환경적 등의 다양한 요인에 의해 영향을 받는데 크게 두 종류로 나눌 수 있다. 하나는 내인성 노화(intrinaic againg)로 이는 자연노화로써 유전정보에 따라 시간이 지나면서 일어나는 노화현상이며, 다른 하나는 외인성 노화(extrinasic aging)로 광노화(photoaging)라고도 하며, 외부환경 요인, 그 중에서도 햇빛에 존재하는 자외선에 의해 일어나는 노화 현상을 말한다. 내인성 노화는 햇빛에 노출되지 않은 피부에서 주로 관찰이 되고, 잔주름과 피부탄력감소를 그 특징으로 하며, 광노화의 경우 햇빛에 노출이 많이 되는 부위에서 나타나며, 깊은 주름, 피부결의 거침, 색소침착, 피부톤 및 피부탄력이 감소하는 것을 특징으로 한다.

노화현상을 연구하는 학자들은 21세기를 '호르몬의 시대'라고 이야기 한다. 호르몬의 적절한 활용을 통해 노화를 방지할 수 있는 길이 열릴 것으로 전망하고 있다. 실제로 노화현상을 예방하거나 되돌리는데 호르몬을 이용하기 위한 연구 노력이 현재 전 세계적으로 진행되고 있으며 이미 상당한 성과를 거두고 있으나 호르몬이 노화를 일으키는 유일한 요인은 아니며 유전과 환경적 요인들이 노화에 깊은 영향을 미친다는 사실을 인정하고 있다.

dehydroepiandrosterone (DHEA)는 잘 알려진 peroxisome prolifertor-activated receptor(PPAR)활성효과를 가진 hormone이며, 이 PPAR는 사람의 피부노화 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 사료되는 catalase의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다.

여성들은 40대 이후부터 에스트로겐의 분비 감소로 인해 피부의 주름이 증가하고 피부 건조가 증가하게 되며, 전체적인 호르몬의 감소로 신체 기관의 노화와 신진대사의 감소로 인해 노화가 촉진되는데, 노화와 관련된 호르몬 중에서 최근 가장 많은 관심을 받고 있는 부신피질에서 합성되는 부신피질호르몬으로 알려진 DHEA이기 때문이다. DHEA는 콜레스테롤(cholesterol)이 프레그네로논(pregnelonon)으로 변환된 후 생성되는 호르몬이며, 성호르몬인 테스토스테론(testosterone), 에스트로젠(estrogen)의 전구물질이 된다. DHEA는 디하이드로에피안드로세 때 인체에서 최대분비가 되며, 그 후 지속적으로 감소하는 것으로 알려져 있기 때문에 DHEA의 생합성이 원활히 이루어진다면 피부노화의 진행을 억제할 수 있게 된다.

다른 한편으로 염증성 질환에 해당되는 여드름은 안드로겐, 피부각질 생성, 피지와 세균의 상호작용으로 발생할 수 있고 예를 들어 프로피오니박테리훔 아그네스(propionibacterium acnes)의 지방분해 효소의 분비에 기인하는 것으로 알려져 있다.

여드름의 발병의 유전적, 환경적 요인 외에 체내 호르몬 분비의 변화로 인한 활발한 피지생성, 모낭 피지선의 비정상적인 각질화로 인한 모공의 폐쇄, 여드름균의 활성화 및 여드름균에 의해 유발되는 피부 염증반응의 네 가지 주요 원인과 이들 간의 상호작용에 의한다.

따라서 피지 생성을 억제하는 항안드로겐제, 항염제로 작용하는 비스테로이드 소염제, 항균효과가 있는 레조시놀, 유황 및 벤조일 퍼옥사이드와 항생효과가 있는 테트라사이클린, 에리스로마이신, 클린다마이신 및 머크로라이드 등에 의한 여드름균 활성 억제 방법과 레티노익산 등의 비타민A 유도체를 이용한 치료법 등이 여드름 치료방법으로 이용되고 있다.

그러나 이러한 기존의 여드름 치료 방법은 효능이나 피부 안전성 측면에 있어서 여러 가지 문제점이 있어 왔다. 호르몬제의 사용은 표피의 생장억제나 호르몬 남용 등의 역효과를 유발할 수 있다고 보고된 바 있고, 레티노익산과 벤조일 퍼옥사이드 등은 기형아 출산, 피부 자극, 접촉성 피부염 발병 등의 우려가 있으며, 클린다마이신 등의 항생물질은 내성균의 출현, 알러지 반응, 광과민 반응 등의 부작용을 나타내는 것으로 보고되고 있다.

한편, 여드름 치료는 단기간에 이루어지는 것이 아니라 꾸준하고 지속적인 치료가 요구되는 것이어서 상기 문제점을 지닌 여드름 치료 방법은 단기간의 사용이나 한정된 범위 내의 사용만 가능할 뿐이었다.

이에 대해, 최근에는 식물을 비롯한 천연자원으로부터 상기 부작용들을 줄이고 지속적으로 사용할 수 있으며 인체에 무해하면서도 강력한 항여드름균 효과를 갖는 유효성분들을 탐색하는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 국내에서는 상황버섯, 녹차 및 황금, 버드나무, 삼백초, 감초 및 어성초 추출물을 여드름 치료에 관련된 기능성 화장품 및 비누의 원료로 사용하고 있고, 천연물 유래의 화학물질을 이용한 항여드름균 효능의 화장품 원료개발도 진행되고 있다, 그러나 그 효과가 기존의 여드름 치료 물질에 비해 매우 약하거나, 여드름 치료에 관련된 유효물질의 대량 생산이 어려운 문제점이 있다.

특히 천연물은 다양한 성분이 복합적으로 구성되어 있어서 유효활성물질의 분리, 정제방법이 목적하는 활성물질의 물리화학적 성질에 따라 다르고, 또 여러가지 서로 다른 원리에 근거한 분리, 정제 방법 중에서도 적절한 방법을 효과적으로 조합하여 사용하여야 하므로 천연물로부터 항여드름균 활성을 지니는 물질을 추출분리하는 데에는 많은 어려움이 있다.

최근에 식물성 정유로 알려진 Phytoncide(PT)의 생리활성이 연구되면서 잣나무의 부산물에 함유된 PT의 항균, 방충, 소취 등 다양한 기능이 연구되었다. 또한 휘발성 성분으로 수십종에서 200여 종에 달하는 Phenolics, terpenoid, alkaloid, acetogenin, steroid 등의 화합물로 구성되어 있다.

하지만 PT가 다양한 생리활성을 갖고 있음에도 불구하고 많이 활용되지 못한 가장 큰 문제점은 오일성분으로 휘발성이 강하며 빠른 발향에 있다. 이러한 점을 극복하여 식품, 의약품, 화장품 등과 같은 산업에 응용하기 위해 poly(caprolactone)와 PVA등의 고분자를 활용하여 PT를 캡슐화하는 연구들이 많이 진행되고 있다.

PT의 뛰어난 항균성능은 의식주에 다양하게 활용되고 있다. 아토피 치료 패치, 구강용 세제, 건축자재, 식품포장재 등에 활용되어 천연항균제로 알려져 있으며 기능성이 추가된 제품으로 포장되어 비싼 값에 판매되고 있다.

기존의 의약외품용 혹은 미용전용 하이드로젤은 합성 보존료인 sodium azide, methyl paraben 등의 첨가로 피부의 문제점을 야기시켜 염증, 민감성 피부, 짓무름 등을 유발시키는 보고가 있다. 이런 점을 보완하여 천연 보존료 연구가 활발히 이루어지고 있으며 천연 보존료로 알려진 활금 추출물, 목단피 추출물, 자몽 종자씨 추출물 등이 사용되고 있으나 값이 비싸서 응용분야에 한계를 가지고 있다.

상처받은 조직의 재구성시 여러 가지 반응들이 관여하는데 예를 들어 피부재생에는 각질세포의 이동, 증식, 분화, 손상세포의 탈락, 외피조직의 생산이 관여되어 있다. 상처치유의 과정은 각종 세포와 인자가 관여하여 매우 복잡한데 먼저 상처부위에 혈소판이 응집하고 형질전환 증식인자. 혈소판유래 증식인자. 상피세포 증식인자 등의 여러가지 세포증식인자가 유리됨에 따라 혈관내피, 탐식세포, 섬유아세포, 상피세포 등에 자극을 주어 세포 증식을 촉진함과 동시에 이들 세포 자신도 자기 분비적으로 섬유아세포증식, 형질전환증식인자. 인터류킨 등의 물질을 생산, 방출하면서 상처치유 기전이 진행된다.

Signal tranceducers and activators of transcription(STAT)는 각질세포에서 P 130 cas의 타이로신 인산화가 세포접착을 조절하여 하층세포에 성장인자 독립세포이동에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져있다(S.Sano et al. J.Dermato. Sci. 2008. 50.1-14). 상처는 주변 세포, 혈액 유래 세포 및 감각 뉴우런으로부터 분비되는 성장인자, 사이토카인, 신경호르몬, 및 세포 외 기질로 이루어지는 특이한 미세환경을 만든다. 상처 미세환경의 일부 인자들은 충분히 장기간 지속하여 말초혈액으로 확산된 후, 골수의 줄기세포에 영향을 미쳐 골수 세포의 말초혈액으로 이동, 상처 부위로의 공급, 및 상처 치유에 참여하는 것으로 알려져 있다.

STAT-3는 원래 인터페론 의존 유전자의 발현에 관여하는 DNA 바인딩 단백질로 발견되었다. STAT은 세포외부의 신호 전달 리간드인 성장인자 리셉터, 사이토카인 리셉터, 타이로신 카이네이스의 활성화로 유도되는 여러 가지 리셉터들에 의하여 유도되어지는 것으로 알려졌다. 여기에는 Janus Kinases 2(JAK2), 타이로신 카이네이스 리셉터, ABL이나 SRC리셉터들이 STAT-3 인산화에 관여하는 것으로 알려졌다. 수용체의 세포질 도메인에 결합한 STAT-3는 JAK2, 타이로신 카이네이스 리셉터, ABL이나 SRC리셉터에 의해 인산화가 된 후 수용체에서 떨어져 나온다. 활성화된 STAT-3들은 세포질 내에 서로서로 결합하여 호모 또는 헤테로다이머를 이룬 후 핵 내로 들어가 목적 유전자의 인식 서열에 결합하여 전사를 증가시킨다(Levy, D.E., 등, Nat Rev Mol Cell Biol, 2002, 3,651-62, Darnell, J.E., J.r., Science, 1997, 277, 1630-1635).

본 발명에 따른 잣나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물은 알레르기성, 염증성 또는 자극성 반응들 또는 장벽의 병리학적 병태들 또는 장애들의 예방 및 또는 치료, 또는 피부, 화상과 외부의 상처로 인해 손상된 피부의 항상성을 목적으로 한다.

또한, 기존 여드름, 창상 등의 피부 문제 치료방법과 관련된 부작용을 최소화하고, 지속적 사용이 가능하면서도 안전성이 우수한 방법으로 피부 문제를 예방 및 또는 치료하기 위한 새로운 용도를 제공함을 목적으로 한다.

또한, 잣송이 추출물의 지표성분인 α-pinene 또는 이를 함유하는 잣나무 추출물의 콜라게나제 억제 활성을 통한 피부재생, 주름개선용, 화장료 조성물 및 피부 상태 개선용 조성물을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명은 잣나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물을 제공한다.

상기 잣나무 추출물은 잣나무의 성숙 또는 미성숙 구과 추출물인 것을 특징으로 한다.

상기 피부 상태는 여드름, 장미증 또는 혈관확장증, 건선, 혈관성 장애, 기저귀 발진, 아토피 피부염, 습진, 접촉성 피부염, 자극성 피부염, 알레르기성 피부염, 피지성 피부염(유아 지방관), 민감성 피부, 반응성 피부, 건조한 피부(건조증), 탈수된 피부, 발적을 가진 피부, 홍반, 노화 또는 광-노화된 피부, 광민감성 피부, 색소침착된 피부(기미, 염증 후 색소침착), 탈색된 피부(백반증), 연조직염을 가진 피부, 늘어진 피부, 피부 균열, 곤충 물림, 햇볕 화상, 광선으로 인한 염증, 화학적 제제·물리적 제제(이, 좀진드기, 버짐증, 진드기, 피부사상균들)· 방사선학적 제제에 의한 자극을 갖는 피부 또는 선천적 면역 결함(항미생물성 펩타이드들)·후천적 면역 결함(세포성, 체액성, 사이토카인 등)에 의한 자극을 가지는 피부인 것을 특징으로 한다.

상기 조성물은 α-pinene 또는 α-pinene을 함유하는 잣나이 추출물이 콜라게나제를 억제하는 것을 특징으로 한다.

상기 잣나무 추출물은 PVA/PET 하이드로젤 형태인 것을 특징으로 한다.

상기 잣나무 추출물은 STAT-3활성을 억제하고, 손상된 각질 세포 HaCaT세포의 생장속도를 활성화하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 잣나무 추출물을 포함하는 피부상태 개선용 조성물은 피부 문제 개선, 피부 주름 개선, 피부재생, 민감성 피부인 아토피 피부 개선, 욕창 개선, 화상으로 인한 피부손상 개선, 피부 노화 저해, 손상 피부에 대한 창상치료를 통한 피부 개선에 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 섬유아세포에서 잣나무 추출물 처리시 세포증식율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 잣나무 추출물의 콜라게네이즈 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 잣나무 추출물에 의한 각질형성세포의 증식 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 잣나무 추출물에 의한 섬유아세포주의 증식 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 잣나무 추출물과 대조군을 이용한 시간에 따른 여드름군 억제 효능을 시험한 그래프이다.
도 6은 잣나무 추출물을 STAT-3 저해 활성을 나타내는 그래프이다.
도 7은 잣나무 부산물로부터 잣나무 추출물을 제조하는 공정도이다.
도 8은 잣나무 추출물이 첨가된 창상피복제의 항균성 평가 그래프이다.
도 9는 잣나무 추출물 함유 하이드로젤의 농도별 용출액의 세포독성을 평가한 그래프이다.
도 10은 창상유발 후 0 내지 20일까지 상처 면적 변화를 5일 간격으로 촬영한 사진이다.
도 11은 창상치유율 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12는 SD rat 피부의 H&E 염색 후 대조군과 실험군의 조직을 나타낸 것이다.

이하에서는 본 발명에 따른 실시예 및 도면을 바탕으로 보다 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명은 잣나무 추추물을 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 잣나무는 잣나무는 전국의 표고 100~1,900m 사이의 산지에 자라는 상록침엽교목으로서, 한국이 원산지이고 일본, 중국, 시베리아 등지에도 분포한다. 내한성이 좋아서 산악지방의 고산지대에 많이 분포하고 여러 가지 환경 적응성이 좋아 전국 어디서나 잘 자란다. 또한, 잣나무의 목재는 대단히 아름다우며 재질이 가볍고 향기가 있다. 아울러 가공이 용이하여 다양한 용도에서 애용되고 있으며, 잣은 생식이나 잣죽, 착유 및 그 밖의 각종 요리에 이용된다.

본 발명에서 잣나무는 쉽게 입수 할 수 있는 잣을 털고 남은 잣나무 미성숙 구과, 성숙 구과, 잣나무 잎, 줄기, 가지 등을 의미하며, 어느 한가지에 국한 되지 않고 이용하여 잣나무 추출물을 얻고, 이를 이용하여 피부상태 개선용 조성물을 얻을 수 있다. 특히 본 발명의 잣나무 추출물은 잣나무 구과(미성숙 구과 및/또는 성숙 구과)를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 사용되는 잣나무 추출물은 지표성분인α-pinene이 다량 함유되어 있고, 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 α-pinene 또는 α-pinene 을 함유하는 잣나무 추출물을 통해 콜라게나제 억제 활성을 나타내는 특징을 가진다.

본원발명의 잣나무 추출물은 도 7 과 같은 공정을 거쳐 제조할 수 있다. 잣나무 부산물을 그늘진 곳에서 건조하여 수분함유량이 20%의 상태로 입자는 2~4cm 크기로 조정 후 1kg을 5L 용량의 둥근 플라스크에 장입하고, 별도의 스팀 발생 장치를 두어 증류 온도는 100±3로 유지하면서 스팀을 발생시켜 시료의 하단부에 직접 통과하도록 하였고, 추출시간은 10min으로부터 10min간격으로 일정 시간 동안 증류 시켰다. 증류로 얻어진 용액은 비중 차에 의하여 오일과 수상이 분리되는데 상등액은 잣나무 오일이며, 하등액은 수용성 잣나무 추출물 성분을 함유하는 수상의 수용성 Hydrosol(이하 '잣물'명명)이다.

또한, 본원발명은 잣나무 추출물을 포함하는 PVA/PET 하이드로젤 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 우선 PVA와 PET을 5:5 비율로 100ml 증류수에 넣고 호모게나이저(12500rpm)로 10분간 혼합시킨 후, 오토클레이브(121, 20분)를 이용하여 용해시킨다. 용해된 PVA:PET 조성에서 기포를 제거하기 위해 매스실린더레 넣어 기포를 제거하고, 기포가 빠진 PVA:PET 용액에 잣나무 추출물을 첨가하지 않은 대조군과 잣나무 추출물을 첨가한 실험군으로 각각의 petridish에 15g씩 넣고 -80에서 4시간 방치한 후, 상온에서 8시간 동안 해동시키는 과정, 즉 냉동과 해동을 총 3회 반복 진행하여 PVA:PET 하이드로젤을 제조한다.

본 발명에 따른 잣나무 추출물은 STAT-3활성을 억제하고, 손상된 각질 세포 HaCaT세포의 생장속도를 활성화하는 능력이 매우 뛰어남을 확인하여 창상 치료 또는 피부 재생 또는 피부 손상 회복 등 다양한 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 잣나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물은 다음의 반응들, 장애들 또는 병리학적 병태들의 예방 및 또는 치료에 사용 할 수 있다. 여드름, 장미증 또는 혈관확장증, 건선, 혈관성 장애들, 기저귀 발진, 아토피 피부염, 습진, 접촉성 피부염, 자극성 피부염, 알레르기성 피부염, 피지성 피부염(유아 지방관), 건선, 민감성 피부, 반응성 피부, 건조한 피부(건조증), 탈수된 피부, 발적을 가진 피부, 피부 홍반, 노화 또는 광-노화된 피부, 광민감성 피부, 색소침착된 피부(기미, 염증 후 색소침착), 탈색된 피부(백반증), 연조직염을 가진 피부, 늘어진 피부, 선 자국들, 피부 균열, 곤충 물림, 햇볕 화상들, 모든 종류의 광선들로 인한 염증들, 화학적 제제들, 물리적 제제들(이, 좀진드기, 버짐증, 진드기, 피부사상균들), 방사선학적 제제들에 의한 또는 선천적 면역 결함들(항미생물성 펩타이드들) 또는 후천적 면역 결함들(세포성, 체액성, 사이토카인 등)에 의한 자극들을 가지는 피부 등에 적용할 수 있다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따른 피부상태 개선용 조성물은 잣나무 추출물을 유효성분으로 함유하며 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함게 기초화장품 조성물(화장수, 밀크로션, 스킨로션, 크림, 에센스, 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 보디오일), 색조 화장품 조성물(화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업베이스), 두발 제품 조성물(샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어젤), 연고 등의 외용제, 비누 등의 세정제, 또는 의약부외품에 사용되는 창상피복제 또는 건강식품 등의 형태로 제조될 수 있다.

상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성 개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성고분자 물질 등을 포함할 수 있다. 예를 들면 본 발명의 화장료 조성물로 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 상기 잣나무 추출물을 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형(O/W)의 크림베이스에 잣나무 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등과 물성 개선을 목적으로 한 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 경피투여, 도포에 의한 국부 투여 등의 방식이 가능하다.

이하, 본 발명의 잣나무 추출물을 포함하는 피부 개선 조성물에 관하여 실시예를 들어 설명한다.

<실시예>

잣나무 (부산물)추출물의 제조

도 7 과 같은 공정을 거쳐 잣나무 추출물, 보다 구체적으로는 잣나무 부산물 추출물을 제조한다. 잣나무 부산물을 그늘진 곳에서 건조하여 수분함유량이 20%의 상태로 입자는 2~4cm 크기로 조정 후 1kg을 5L 용량의 둥근 플라스크에 장입한다. 별도의 스팀 발생 장치를 두어 증류 온도는 100±3로 유지하면서 스팀을 발생시켜 시료의 하단부에 직접 통과하도록 하였고, 추출시간은 10min으로부터 10min간격으로 일정 시간 동안 증류 시킨다. 증류로 얻어진 용액은 비중 차에 의하여 오일상과 수상이 분리되는데 상등액은 오일상인 잣나무 오일이며, 하등액은 수용성 잣나무 추출물 성분을 함유하는 수상의 수용성 Hydrosol(이하 '잣물'명명)이다.

PVA/PET 하이드로젤의 제조

PVA와 PET을 5:5 비율로 100ml 증류수에 넣고 호모게나이저(12500rpm)로 10분간 혼합시킨 후, 오토클레이브(121, 20분)를 이용하여 용해시킨다. 용해된 PVA:PET 조성에서 기포를 제거하기 위해 매스실린더레 넣어 기포를 제거한다. 기포가 빠진 PVA:PET 용액에 잣나무 추출물을 첨가하지 않은 대조군과 잣나무 추출물을 첨가한 실험군으로 각각의 petridish에 15g씩 넣고 -80에서 4시간 방치한 후, 상온에서 8시간 동안 해동, 즉 냉동과 해동을 반복시키는 과정을 총 3회 반복진행하여 PVA:PET 하이드로젤을 제조한다.

<실험예>

실험예 1 - 잣나무 추출물의 콜라겐 생성 효과 실험

콜라겐 생성 효과는 크리스탈 바이올렛방법을 이용하여 확인하였으며, 이는 단백질 합성 능력을 알아보는 실험으로 크리스탈 바이올렛 염색액은 단백질과 결합하는 시약으로, 이러한 측정을 활용하여 콜라겐 합성 능력을 측정하였다

섬유아세포를 96웰 플레이트 (96-well plate)의 각 쉴에 0.5X10^2 세포를 분무하여 10% 우태아 혈청이 함유된 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 우태아 혈청이 없는 배지로 바꾼 다음, 잣나무 추출물을 0.001, 0.01, 0.1%로 세포에 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 48시간이 지나면, 배양액을 제거하여 PBS로 1회 세척한 다음, 37에서 30분간 건조하였다. 그 후 크리스탈 바이올렛 시약을 가하여 실온에서 5분간 염색을 하고 염색액을 증류수로 잘 세척한 후 결합된 염색약을 0.2M 인산과 에탄올을 첨가하여 녹인 다음, 5분 후 ELISA Reader로 500nm에서 흡광도를 측정한 결과 잣나무 추출물은 콜라겐 합성 촉진 효과가 있고, 특히 농도 의존적으로 효과가 증가하였다. 이는 표 1에 나타내었다.

시료	콜라겐 생성
대조군	100.0
0.001%	112.7
0.01%	127.4
0.1%	173.5

실험예 2 - 잣나무 추출물의 세포증식율 확인 실험 섬유아세포에서 잣나무 추출물의 처리가 세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 이용한 세포 생존율을 측정하여 도 1에 나타내었다. 그 결과 잣나무 추출물은 피부 섬유아세포에 대한 세포독성이 없는 것으로 확인되었다.

실험예 3 - 콜라게네이즈 효소 억제 활성 실험

항산화 활성이 가장 우수한 잣나무 추출물의 콜라게네이즈 효소 활성 측정은 NIH-3T3 cells line을 이용하여 세포 배양액으로부터 human MMP-8 im-munoassay kit를 사용하여 잣나무 추출물의 콜라게네이즈 억제 효과를 측정한 결과를 도 2에 나타내었다. 그 결과 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였으며, 도 2를 통해 잣나무 추출물이 콜라겐 추출물에 활성을 감소시켜 분해도 증가되는 형성을 억제하는 효과가 있는 것을 확인하였다

항산화 효과 및 콜라게네이즈 억제 효과와 관련해 볼 때 잣나무 추출물은 free redical 생성 억제뿐만 아니라, 콜라게네이즈의 발현을 억제하므로 콜라겐 생성 촉진 효과에 영향을 주는 것이 확인되었다.

실험예 4 - 잣나무 추출물에 의한 각질형성세포 증식 유도 실험

0.1% Transcutol-CG에 가용화시킨 잣나무 추출물을 각질형성세포주인 HaCaT 세포에 적용하여 proliferation을 확인한 결과를 도 3에 나타내었다. 그 결과 0.1μg/ml 까지는 185.44±7.69%를 보여 농도 의존적으로 증식이 촉진되는 것을 확인하였다

실험예 5 - 잣나무 추출물에 의한 섬유아세포주 CCD-986sk 세포 증식 유도 실험

0.1% Transcutol-CG에 가용화시킨 잣나무 추출물을 섬유아세포주인 CCD-986sk세포에 적용하여 proliferation을 확인한 결과를 도 4에 나타내었다. 그 결과 0.1μg/ml의 농도에서는 87.92±3.02%으로 나타난 것을 제외한 나머지 농도에서 농도 의존적으로 증식 억제하는 것을 확인하였다.

실험예 6 - 6가지 균주에 대한 효능

6가지 균주에 대한 효능 시험을 경화를 나타낸 것으로 잣나무 추출물을 가지고 항균 시험 결과와 대조 예에 의한 항균 시험 결과를 표 2에 나타내었다.

대조를 위하여 잣나무 추출물을 일반적인 세균인 아스페르기루스 니게르Aspergillus niger), 대장균(E.coli), 칸디다 알비칸(Candida albican), 포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 녹농균(Psedomonas auruginosa)에 대한 항균 시험을 하였다. 동일한 세균에 대하여 항균 시험을 한 결과 모든 세균에서 큰 효능을 보여주었다.

시험항목		시험 결과			시험방법
		초기농도(CFU/40p)	24시간 후 농도 (CFU/40p)	세균감소율 (%)
아스페르기루스 니게르 항균시험	blank	144	2821	-	의뢰자 제시
	잣나무 추출물	144	1	99.8
대장균 항균시험	blank	400	2472	-
	잣나무 추출물	400	1	99.8
칸디다균 항균시험	blank	401	2831	-
	잣나무 추출물	401	1	99.8
포도상구균 항균시험	blank	417	2740	-
	잣나무 추출물	417	1	99.8
녹농균 항균시험	blank	410	2833	-
	잣나무 추출물	410	1	99.8

실험예 7 - 시간에 따른 여드름 균 억제 효능 실험 잣나무 추출물을 이용해 시간에 따른 여드름균 억제 효능을 시험하고 도 5로에 나타내었다.

도 5에서 위쪽 곡선은 대조군의 시간에 따른 억제 효능 그리고 아래쪽 곡선은 잣나무 추출물에 따른 억제 효능을 각각 나타낸 것이다. 잣나무 추출물의 경우 시간에 경과에 상관없이 효능을 유지한다는 것을 알 수 있다.

실험예 8 - STAT-3 저해 활성 실험

잣나무 추출물의 STAT-3 저해 활성을 확인하기 위해, HepG2 세포에 p-STAT3-TA-Luc를 형질 감염시키고, 잣나무 추출물을 형질 감염 시킨 세포에 처리한 결과를 도 6에 나타내었다. 그 결과 잣나무 추출물에 의해 IL-6 유도 루시퍼라제를 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다.

실험예 9 - 잣나무 추출물이 첨가된 창상피복제 항균성 평가

잣나무 추출물이 함유된 PVA:PET 하이드로젤의 항균성을 측정하기 위하여 UV light하에서 5분 건조시킨 하이드로젤을 10mm 두께로 고정하여 항균실험에 이용하였다, 시험균주는 시험균주는 staphylococcus aureus와 staphylococcus epidermidis을 사용하였다. 먼저 균주를 nutrient broth(Difco Co.,USA)에 접종하여 37 oC에서 24시간 동안 배양한 후, 배양된 균을 1 mL 취하여 액체 배지 99 mL에 혼합한 후, 멸균된 하이드로젤을 10 g씩 첨가시킨 후 shaking incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 대조군에는 순수 균주만 배양한 그룹과 실험군으로 Phy가 함유되지 않은 벽물질로만 구성된 하이드로젤군과 Phy 나노미립구가 혼합된 하이드로젤, 그리고 미립구가 첨가되지 않은 하이드로젤만 첨가한 그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. 일정시간을 정해두고 배양액을 얻어 UVspectrophotometer기기를 이용하여 700 nm 파장에서 탁도를 측정하였다.

액체배지의 optical density(OD)값은 대조군으로 아무것도 첨가하지 않은 균만 접종한 그룹, PVA:PET 조성 젤 첨가 그룹, 잣나무 추출물을 캡슐화하기 위해 벽물질로 사용된 CH/MD소재가 첨가된 PVA:PET 조설 젤 그룹, 잣나무 추출물 캡슐이 첨가된 PVA:PET 조성 젤 그룹으로 각각 배양 후 저해 값을 비교한 그래프를 도 8에 나타내었다.

그 결과 각각의 균주 그룹에서 잣나무 추출물이 첨가된 군에서 균의 성장을 억제시키는 것을 관찰할 수 있었다. 벽물질 조성이 첨가된 젤 그룹에서도 CH의 자체적 항균력으로 균 저해능을 관찰할 수 있었으나, 시간이 지남에 따라 균 저해능이 높아지는 것은 잣나무 추출물의 방출에 의한 현상임을 짐작할 수 있었다. 또한 PVA:PET 조성 젤만 처리한 그룹에서는 대조군보다 높은 OD값을 나타낸 것은 PVA:PET 조성이 균주 성장에 도움이 되는 영양분이 되어 투과도 값이 높아지는 것을 관찰할 수 있었다.

실험예 10 - PVA/PET 하이드로젤의 세포독성 실험

MTT assy를 이용하여 관찰한 잣나무 추출물 함유 하이드로젤의 농도별 용출액의 세포독성 평가는 모든 농도에서 95%이상으로 독성이 없는 것을 관찰하였다. 농도에 따라 도 9에 나타내었다. 실험결과 각 농도별로 처리한 후 세포가 95% 이상의 생존율을 보여 본 발명에서 이용된 젤은 세포독성이 없는 생체 소재로 활용이 가능하며, 다양한 생체재료로의 응용도 예측할 수 있다.

실험예 11 - 잣나무 추출물 창상에 대한 육안적, 조직학적 평가

도 10은 창상유발일에서 창상유발 후 20일 경과시점까지 창상유발균(control, PVE:PET hydrogel, PHY-VE:PET hydrogel)에서 선택한 동일 개체의 창상부분을 5일 간격으로 촬영하여 상처면적 변화를 나타낸 것이다. 창상유발 당일에서부터 창상유발 후 20일 경과시점까지 창상유발군의 대조군(control group)은 멸균거즈를 처리한 군으로 10일까지 염증과 삼출액에 형성되는 것을 관찰할 수 있었다. 점차 20일이 경과된 시점에서는 피딱지가 형성되어 있는 표피를 관찰할 수 있었다. 하지만, PVA:PET 하이드로젤을 처리한 그룹에서는 15일 경과시점에서부터 표피화와 수축이 더 빨라진 것을 관찰할 수 있었다. 창상치유율의 변화는 도 11과 같이 측정되었다. 창상치유율은 창상 유발 후 5일 대조군은 23.97±1.57, 잣나무 추출물 함유 젤군은 22.56±2.23, 잣나무 추출물이 함유되지 않은 군에서는 24.48±1.88, 10일 째 대조군은 51.11±1.189, 잣나무 추출물 함유 젤군은 67.10±4.20, 잣나무 추출물이 함유되지 않은 군에서는 53.67±2.38, 15일째 대조군은 60.83±8.18, 잣나무 추출물 함유 젤군은 94.42±2.24, 잣나무 추출물이 함유되지 않은 군에서는 70.21±2.34, 20일째 대조군은 90.9±2.35, 잣나무 추출물 함유 젤군은 96.511±0.9, 잣나무 추출물이 함유되지 않은 군에서는 93.18±4.36로 측정되었다.

도 12는 SD rat 피부의 H&E 염색 후 대조군과 실험군의 조직을 관찰한 결과를 나타낸다. 대조군의 조직에서는 혈전생설과 적형구가 삼출되는 것을 관찰할 수 있었다. 잣나무 추출물이 첨가된 하이드로젤과 첨가되지 않은 하이드로젤을 처치한 조직에서는 잣나무 추출물이 함유된 군에서 염증 침윤 세포도 감소하고 조직이 치밀하게 형성된 것을 확연히 관찰할 수 있었다. 잣나무 추출물이 함유된 하이드로젤 처치군으로 일차적으로 scar에 습윤 및 항균 상태가 유지되고, monoterpene 계열의 화합물인 α-pinene(27%), L-liminene(26%) 성분은 섬유아세포의 증식 및 교원질의 형성을 돕고 염증침윤세포를 저해하여 창상부위의 재생에 효과적인 것을 관찰할 수 있었다. 상처유발 후 상처 초기의 관리와 처치는 상피층에 표피가 형성되면서 scar에 많은 영향을 주는 것을 관찰할 수 있었으며, 잣나무 부산물에서 얻어지는 잣나무 추출물은 상처치유를 개선할 수 있는 식물성 정유로 사용 가능성을 확인하였다.

Claims (2)

1. 잣나무 구과에서 잣을 털고 남은 잣나무 구과 추출물을 유효성분으로 포함하고, PVA/PET 하이드로겔 형태를 가지는 조성물로서, 상기 잣나무 구과 추출물은 잣을 털고 남은 건조된 잣나무 구과를 스팀으로 증류하여 얻은 추출물인 것을 특징으로 하는 여드름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서, 잣나무 구과 추출물은 스팀으로 증류하여 얻은 추출물 중에서 유상을 제거한 수용성 추출물인 것을 특징으로 하는 여드름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.

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