KR20210009178A

KR20210009178A - 천마추출물을 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR20210009178A
Application number: KR1020190085867A
Authority: KR
Inventors: 김지형; 이소영; 진무현
Original assignee: 주식회사 엘지생활건강
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2021-01-26
Also published as: KR102261149B1

Abstract

본 발명은 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물, 식품조성물, 의약외품 조성물 및 헤어 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 천마꽃 또는 천마꽃대로 이루어진 조성물을 사용하여 항산화, 미백, 항염, 보습, 향균, 모발성장 촉진 또는 탈모방지, 주름개선 또는 피부 노화 방지 효과를 제공하는 것에 관한 것이다.

Description

천마추출물을 포함하는 조성물{Compositions containing Gastrodia extracts}

본 발명은 천마 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 천마꽃 또는 천마꽃대를 유효성분으로 포함하는 조성물의 항산화, 미백, 항염, 보습, 향균, 모발성장 촉진 또는 탈모방지 또는 주름개선 또는 피부 노화 방지용 조성물에 관한 것이다.

피부의 노화는 시간 의존성 자연노화에 따른 내인성 노화(intrinsic aging)와 외부적 요인에 의한 외인성 노화(extrinsic aging)로 구분할 수 있다. 바람, 온도, 공해, 자외선 등에 의한 외인성 노화 중 자외선에 의한 노화를 광노화라고 한다. 지속적인 자외선 노출은 피부의 활성산소종의 증가를 유도하여 광노화가 진행된다. 피부에 도달한 자외선은 표피에 활성산소를 과하게 생성시키고 이에 의해 멜라닌 세포의 불규칙한 멜라닌생성으로 인한 색소 침착을 관찰할 수 있다.

또한, 각질형성세포의 배열을 불규칙적으로 변화시켜 피부보습을 저하시킨다. 활성산소의 자극을 받은 각질형성세포는 염증성 사이토카인을 분비하여 진피의 섬유아세포를 자극시켜, NF-κB경로와 AP(activator protein)-1의 DNA 결합(binding)을 촉진시킨다. 상기 AP-1의 DNA 결합 촉진에 의해 금속단백질분해효소(Metalloprotease, MMPs)의 발현을 증가시킨다. 반면에, 1형 프로콜라겐의 합성을 감소시켜 결과 적으로 콜라겐 생합성 저해 및 분해 촉진을 유발시켜 피부주름을 형성하며 탄력 감소를 일으킨다. 이러한 생화학적인 기전에 근거하여 광노화 피부에서는 자외선 조사에 의한 활성산소가 가장 중요한 원인으로 여겨지고 있다.

또한, 탈모는 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태를 말하며, 일반적으로 두피의 성모(굵고 검은 머리털)가 빠지는 것을 의미한다. 성모는 색깔이 없고 굵기가 가는 연모와는 달리 빠질 경우 미용상 문제를 일으킬 수 있다. 서양인에 비해 모발 밀도가 낮은 우리나라 사람의 경우 5만～7만개 정도의 머리카락이 있으며 하루에 약 50～70개까지의 머리카락이 빠지는 것은 정상적인 현상이다. 따라서 자고 나서나 머리를 감을 때 빠지는 머리카락의 수가 100개가 넘으면 병적인 원인에 의한 것일 가능성이 높다. 최근에 이러한 탈모 질환이 급작스럽게 증가하고 있는데, 이는 환경적 변화가 탈모의 원인으로 매우 크게 작용하고 있음을 방증하는 것으로, 서구화된 식습관이나 스트레스, 과로, 환경오염 등의 다양한 원인이 머리카락이 제대로 자라지 못하도록 방해하고 있기 때문이다.

따라서, 항산화용, 미백용, 항염용, 보습용, 항균용, 모발성장 촉진 또는 탈모방지용, 또는 주름 개선 또는 피부 노화 방지용으로 사용될 수 있는 소재의 발굴이 중요시 된다.

천마(Gastrodiae rhizoma)는 한국, 중국 등에서 전통적으로 사용된 약재로, 뽕나무버섯과 편리 공생하는 난초과 식물에 속하는 식물 천마(Gastrodiae elara BLUME)의 구근인데, 두통, 마비, 경련, 신경성 질환 등의 치료에 사용되어 왔다. 천마에는 다양한 화합물, 예를 들면 가스트로딘(gastrodin, ρ-hydroxymethyl phenyl-β-Dglucopyranoside), 4-하이드록시벤질 알코올(4-hydroxybenzyl alcohol), 4-하이드록시벤질 알데하이드(4-hydroxybenzyl aldehyde), 바닐린(vanillin), 바닐릴 알코올(vanillyl alcohol)을 포함하고 있다. 본 발명은 여러용도의 소재를 발굴하기 위해 천마를 분석하고 접근하였다.

대한민국 등록특허 10-1952695

본 발명의 하나의 목적은 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 헤어 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

구체적으로, 상기 천마 추출물은 항산화, 미백, 항염, 보습, 향균, 모발성장 촉진 또는 탈모방지, 또는 주름개선 또는 피부 노화 방지 효과를 제공할 수 있다.

본 발명에서 용어, "천마(Gastrodia elata Blume, GEB)"는 한국, 중국 등에서 전통적으로 사용된 약재로, 뽕나무버섯과 편리 공생하는 난초과 식물에 속하는 식물이고, 난초과에 속하는 다년생 초본 식물로 뿌리가 없고 엽록소를 거의 함유하고 있지 않아 기생하는 곰팡이(Armillaria Mellea)로부터 영양을 공급받아 생장하는 특성을 지닌 약용식물을 의미한다.

구체적으로, 상기 천마는 천마꽃 및 천마꽃대로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있고, 이에 제한되지 않는다.

상기 추출물은 공지된 방법으로 추출될 수 있는데, 구체적으로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 추출물은 전체 조성물 대비 0.0001 중량% 내지 80중량%의 함량으로 포함될 수 있며, 구체적으로는 추출물이 전체조성물 대비 0.0001중량% 미만일 경우 효과가 기대에 미치지 못할 수 있고, 80중량% 초과할 경우 피부자극 및 피부 독성이 문제될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 항산화용, 미백용, 항염용, 보습용, 항균용, 모발성장 촉진 또는 탈모방지용, 또는 주름 개선 또는 피부 노화 방지용인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 "항산화"는 산화의 억제를 의미하며, 세포의 노화 과정과 그에 대한 예방법을 설명할 때 많이 등장하는 개념이다. 즉, 세포의 노화가 세포의 산화를 의미하기 때문에 사람의 호흡을 통해 체내로 들어온 산호는 인체에 필요한 에너지를 만드는 등 이로운 작용도 하지만, 이 과정에서 몸에 좋지 않은 여분의 산소인 활성산소가 생성된다. 활성산소는 체내의 정상 세포를 공격하여 노화나 각종 질병의 원인으로 작용한다. 따라서 이 활성산소를 제거하는 것이 세포의 산화(노호)를 막는 방법이며, 이러한 세포의 산화를 억제하는 것을 의미한다.

상기 "미백"은 피부를 하얗게 하는 것을 말하며, 멜라닌의 생성을 억제, 멜라닌이 멜라노사이트에서 각질형성 세포로 넘어가는 단계를 억제, 멜라닌이 있는 피부 세포를 파괴하고 새로운 세포가 자라나도록 돕는 역할을 하여 피부를 하얗고 깨끗하게 만들어주는 효과를 의미한다.

상기 "항염"은 염증을 예방하는 효과로 염증을 없애는 성질을 가지고 있거나 염증 과정에 관하여 이를 억제하는 것을 의미한다.

상기 "보습"은 피부에 수분을 더하고 유지시켜주는 것을 의미한다.

상기 "항균"은 세균의 발육과 번식을 억제 파괴하는 것을 의미한다.

상기 "모발성장 촉진 또는 탈모방지"는 생리적으로 털이 빠지는 일을 탈모라고 하며, 생장기와 퇴행기를 지나 휴지기에 들어간 털은 색소가 엷어지고 윤기가 없으며 모근이 가늘어지게 되어 빠지게 되는데 이를 억제 및 방지하고 모두유 세포의 활성을 조절하여 모발 주기에 영향을 미쳐 모낭 줄기세포의 증식 또는 분화에 작용시켜 모발의 성장을 촉진시키는 것을 의미한다.

상기 "주름 개선 또는 피부 노화 방지"는 주로 진피 속의 탄력섬유, 결합직섬유, 근육섬유의 퇴화 등 노화에 의해 피부 탄력이 떨어지고 피부가 접히는 현상을 주름이라고 하며, 이를 방지 하기 위해 콜라겐 합성 촉진 등을 통해 주름개선 및 피부노화를 방지하는 것을 의미한다.

상기 조성물은 자유라디칼 저해, 콜라겐 합성 촉진, 엘라스타제 활성 저해, 모유두세포 증식, 멜라닌 생성 저해, 염증생성 저해, HAS2 활성, HAS3 활성, AQP3활성 또는 비듬균 향균 효과를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "자유라디칼"은 1개의 쌍 안 지은 전자를 갖는 원자 혹은 분자. 수소원자, 염소원자 등은 단원자의 유리기인데, 보통 자유 라디칼이라 불리는 것은 무기 혹은 유기 화합물 분자에서 프로톤 1개가 탈리하여 잔기에 쌍 안 이룬 전자 1개가 있는 것을 말한다. 활성산소들은 화학적인 반응성이 뛰어나며 이들에 의해 유도되는 자유 라디칼은 생체 내의 각종 반응에 영향을 미치고 노화 등을 야기한다. 생물체는 자유 라디칼들에 의해 일어나는 유해성에 항상 노출되어 있으며, 세포의 연령증가에 따라 유해성이 점진적으로 축적되어 다양한 질병들을 일으킨다. 따라서, 자유라디칼 저해는 항산화 효과에 중요한 역할을 한다.

구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 조성물이 양성 대조군(비타민C) 대비 우수한 자유라디칼 저해를 확인하여, 항산화 효과를 가진 것을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "콜라겐"은 흔히 교원질이라고도 불리는 콜라겐(collagen)은 대부분의 동물, 특히 포유동물에서 많이 발견되는 섬유 단백질로, 피부와 연골 등 체내의 모든 결합조직의 대부분을 차지한다. 콜라겐은 폴리펩타이드 세 분자가 서로 삼중나선으로 꼬인 밧줄과 같은 형태를 이루고 있는 것을 말한다. 콜라겐섬유는 피부의 구조와 피부 탄력성을 유지에 중요하며 콜라겐의 양이 부족해지거나 손상되면 피부 상태의 이상이 초래되고 주름이 발생한다.

구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 조성물이 농도의존적으로 콜라겐 합성을 촉진하였고, 일반적으로 콜라겐 합성을 유도하는 것으로 잘 알려진 TGF-Βfmf 적용한 경우와 비교하여도 본 발명의 조성물이 콜라겐 합성을 촉진하는 효과를 가진 것을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "엘라스타제"는 이자에서 분비되어 특별히 엘라스틴(elastin)을 분해하는 단백질 용해성 효소. 엘라스틴의 펩티이드 결합과 중성 아미노산에 의해 형성되는 다른 펩티드 결합을 가수분해하는 효소를 말한다. 엘라스타제는 단백질을 분해하므로 피부의 주름을 유발할 수 있어 엘라스타제 활성 저해는 피부 재생 및 주름개선에 중요한 역할을 한다.

구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 조성물이 양성 대조군 보다 효과는 적으나, 엘라스타제 활성 저해가 뛰어남을 확인하였고, 본 발명의 조성물은 우수한 엘라스타제 활성 저해효과를 발휘하였다. 따라서, 천마꽃 또는 천마꽃대를 유효성분으로 포함한 조성물은 피부재생, 주름개선 또는 피부노화 방지를 위한 용도로 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "모유두세포"는 모낭의 기저부에 존재하는 세포로, 모낭을 구성하는 세포들에게 산소와 영양을 공급하여 모발의 성장과 모낭 주기 조절을 담당하는 것을 말한다. 따라서 모유두세포의 증식이 촉진되면 모발이 건강해지고 모발 성장이 촉진되며 탈모를 막을 수 있다. 모발의 성장은 모유두(dermal papilla)를 둘러싸고 있는 상피세포(epithelial cell)가 분열하여 모간(hair shaft)을 만들면서 진행되기 때문에 모유두세포는 상피세포의 분열을 조절하는 중요한 역할을 한다. 또한 남성형 탈모증에서 남성호르몬이 모낭에 작용하는 부위 역시 모유두로서 모유두세포는 발모에 있어 매우 중요한 역할을 하고 있다.

구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 조성물이 종래의 알려진 모유두세포 증식 대조군 대비 우수한 모유두세포의 증식을 확인할 수 있었고, 이는 모발성장을 촉진할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "멜라닌"은 자연계에서 흔히 발견되는 색소 중 하나로써 흑갈색 또는 검은색을 띤다. 이 색소는 음전하와 높은 분자량을 가지고 있으며 화학적으로 비활성 상태이고 무정형의 형태와 불용성의 성질을 띠는 것을 말한다. 피부흑화(melanogenesis)는 피부 세포내에 있는 멜라닌 색소생성세포 (melanocyte)에서 자외선 등의 자극에 대한 방어 기작으로 멜라닌 생성활동이 증가되고 이로 말미암아 만들어진 다량의 멜라닌이 각질형성세포(keratinocyte)로 전이되어 피부표피층(epdermis)에 축척된 결과이다. 비록 멜라닌이 피부보호작용을 하나 피부의 과색소침착은 기미, 주근깨, 피부염증 후의 피부흑화, 노인성 색소반점 등을 일으키며 이로 인해 당사자에게 미용상의 불편뿐만 아니라 정신적으로 부정적인 영향을 미쳐 사회활동에 불편을 초래하여 멜라닌 총량의 감소는 미백효과 중요한 역할을 한다.

구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 조성물이 양성대조군 알부틴에 비해 저농도에서도 뛰어난 멜라닌 총량 감소 효과를 나타내어 미백용도로 사용할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "염증"은 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 조직 변질, 순환장애와 삼출(渗出), 조직 증식의 세 가지를 병발하는 복잡한 병변(病變)을 일컫는다. 중이염(中耳炎) 등과 같이 끝자가 염(炎)으로 되어 있는 것 외에, 전염성 질환(결핵·매독·이질·디프테리아 등) 등에서 볼 수 있는 병변의 총칭이다. 대부분의 병이 이것에 속한다. 여러가지 원인 중 세균에 의한 것이 가장 많다.

구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 조성물이 대표적인 항염 의약물질인 양성대조군 (L-NMMA)대비 활성이 약간 낮으나 천연물질로써 우수한 활성을 나타내어, 항염효과를 확인할 수 있었다.

본 발명에서 용어, "HAS2, HAS3"는 히알루론산 합성효소 hyaluronan synthase-2 (HAS-2), hyaluronan synthase-3 (HAS-3)를 말하며, 히알루론산 (Hyaluronan, HA)는 피부와 세포외 기질의 주요 구성성분으로 영양 성분과 이온의 이동을 촉진하고 세포외기질의 주요 성분으로 수분을 보유하는 것으로 잘 알려져 있다. 또한, 세포간 간격 유지, 세포의 분열과 분화, 이동, 면역 조절 등에 관여하는 것으로 포유류의 체내에 존재하는 HA의 50%이상이 피부 특히 표피의 세포간 간격과 진피의 결체 조직에 분포한다고 보고되었고, 이러한 HA는 주로 표피 각질 형성세포와 진피 섬유아세포에 의해 합성되는 것으로 알려져 있다. 인체 피부에서 HA의 양은 노화와 함께 감소되는 것으로 보고되었는데, 피부 탄력 저하 및 수분 함유량 감소의 직접적인 원인 중 하나로 여겨지고 있다. 피부 세포 배양 상태에서 HA의 합성은 여러 종류의 성장인자 등에 의해 증가된다고 보고되어 있다. HA의 합성은 세포막의 안쪽 표면에서 Hyaluronan synthases(HAS)에 의해 진행되며, 합성되는 동안 세포막을 뚫고 나와 세포외기질에 축적되는 것으로 알려졌다. 이러한 HAS의 유전자는 염기서열의 유사성이 높은 Hyaluronan synthase-1(HAS1), Hyaluronan synthase-2(HAS2), Hyaluronoan synthase-3(HAS3)의 세가지 형태가 보고되어 있다.

구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 조성물이 HAS2 및 HAS3의 mRNA의 발현이 증가시켰고 이는 히알루론산의 생성 증가로 이어져 보습, 주름개선, 탄력증진 등에 효과를 확인하였다.

본 발명에서 용어, "AQP3"는 아쿠아포린-3(AQP3)을 말하며, 아쿠아포린(Aquaporin)은 세포막에서 물 분자를 능동적으로 세포내로 이동시키는 수송단백질(transporter)로서 세포막에 존재한다 아쿠아포린-3(AQP3) 단백질은 물 분자와 글리세롤(glycerol)을 선택적으로 통과시키는 아쿠아글리세로포린(aquaglyceroporin) 단백질 일종으로서, 피부의 보습(hydration)과 상처 치료에 중요하게 작용한다고 알려져 있다.

구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 조성물이 AQP3의 mRNA의 발현이 증가시켰고 이는 피부 각질층으로의 수분 유입과 표피층의 글리세롤 농도를 유지시켜주어 피부 보습을 유지, 주름개선, 탄력증진 등에 효과를 확인하였다.

본 발명에서 용어, "비듬"은 두피에서 쌀겨 모양으로 표피 탈락이 발생하여 각질이 눈에 띄게 나타나는 현상을 말하며, "비듬균"은 피부의 정상 세균 중의 하나인 피티로스포룸 오발레(Pityrosporum ovale)를 말하며, 이 곰팡이의 과다증식으로 비듬이 발생하여 비듬 원인균이라 한다.

구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 조성물이 세균, 진균뿐만 아니라 비듬균 성장을 억제하는 효과를 나타내어 향균에 의한 구겅건강 및 두피 의 항비듬효과를 확인하였다.

상기 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가지는 것일 수 있고, 이에 제한되지 않는다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는, 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공일 수 있다.

용어, 천마 및 추출물은 상기에서 설명한 바와 같다.

구체적으로, 상기 천마는 천마꽃 및 천마꽃대로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 식품 조성물은 항산화용, 미백용, 항염용, 보습용, 항균용, 모발성장 촉진 또는 탈모방지용, 또는 주름 개선 또는 피부 노화 방지용인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 "식품 조성물"은 식용 가능한 조성물로 영양성분을 함유하는 물질이며, 산제, 정제, 캡슐제 등 다양한 제제로 제공 가능한 것을 의미한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 의약외품 조성물일 수 있다.

용어, 천마 및 추출물은 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 의약외품 조성물은 항산화용, 미백용, 항염용, 보습용, 항균용, 모발성장 촉진 또는 탈모방지용, 또는 주름 개선 또는 피부 노화 방지용인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 "의약외품"은 질병을 치료하거나 예방하기 위해 쓰는 의약품 보다는 인체에 대한 작용이 경미한 물품에 대해 보건복지부가 따로 정한 분류 기준에 의한 약품을 의미한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 헤어 조성물일 수 있다.

용어, 천마 및 추출물은 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 헤어 조성물은 항산화용, 항염용, 보습용, 항균용, 모발성장 촉진 또는 탈모방지용인 것일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.

상기 "헤어 조성물"은 두피나 모발에 쓰이는 조성물을 말하고, 비듬이나 탈모 등의 치료 목적으로 사용 할 수 있으며 헤어 엠플, 헤어샴푸, 헤어 토닉 등의 제형으로 제조되는 것을 의미한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 천마를 유효성분으로 함유한, 화장료 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물 및 헤어조성물은 콜라겐 합성 촉진, 엘라스타제 활성 저해, 모유두세포 증식, 멜라닌 생성 저해, 염증생성 저해, HAS2 활성, HAS3 활성, AQP3활성 또는 비듬균 향균 효과를 제공하여 항산화용, 미백용, 항염용, 보습용, 항균용, 모발성장 촉진 또는 탈모방지용, 또는 주름 개선 또는 피부 노화 방지용도를 제공하는 것을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명의 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 항산화용, 미백용, 항염용, 보습용, 항균용, 모발성장 촉진 또는 탈모방지용, 또는 주름 개선 또는 피부 노화 방지용도를 제공하기 위한, 화장료 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물, 또는 헤어 조성물로서 사용할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 천마를 유효성분으로 포함한 화장료 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물 및 헤어 조성물은 항산화, 미백, 항염, 보습, 향균, 모발성장 촉진 또는 탈모방지, 주름개선 또는 피부 노화 방지 효과를 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 천마꽃 추출물의 제조

천마꽃을 건조하여 세절한 후 건조중량 100g을 플라스크에 넣고 추출용매(20%EtOH) 2000g으로 상온 25℃에서 1주일간 추출하였다. 추출물을 0.2㎛의 기공크기를 가진 필터로 여과/농축한 후 물(Distilled water)에 농축물: 물 1:10으로 용해하여 천마꽃 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 천마꽃대 추출물의 제조

상기 실시예 1에서 천마꽃 대신 천마꽃대를 사용하는 방법 이외에 같은 방법으로 천마꽃대 추출물을 제조하였다.

실시예 3: 천마덩이 뿌리추출물의 제조

상기 실시예 1에서 천마꽃 대신 천마덩이 뿌리를 사용하는 방법 이외에 같은 방법으로 천마덩이 뿌리 추출물을 제조하였다.

실험예 1: 항산화 효과

추출물에 대한 자유라디칼 소거능을 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(DPPH) 방법으로 측정하였다(Blois, Nature 181, 1190, 1958). DPPH는 비교적 안정한 자유라디칼로서 라디칼 상태로 존재 시 517㎚에서 최대 흡광을 보이며 라디칼이 소거되면 흡광성을 잃는다. DPPH는 시그마(Sigma)사의 것을 사용하였으며, 0.15 mM의 농도로 메틸 알코올에 녹여 사용하였다.

먼저, 추출물 또는 양성 대조군인 비타민 C를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 100μl씩 넣었다. 여기에 DPPH 용액을 100μl씩 첨가한 다음 상온에서 30분간 방치하고 마이크로플레이트 리더(BioTek EL-340)를 이용하여 517㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 시료를 처리한 것의 흡광도가 대조군의 흡광도의 절반이 될 때의 추출물의 농도를 IC₅₀으로 표시한 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 본 실험은 3회 반복하였다.

항산화 효과 결과

시료	IC₅₀(%w/v)
대조군	0.0025
양성대조군 (비타민 C)	0.0005
천마꽃추출물	0.0012
천마꽃대추출물	0.0011
천마덩이뿌리추출물	0.0019

그 결과, 상기 표 1에서 나타난 바와 같이, IC₅₀값의 수치가 대조군 대비 천마덩이뿌리 추출물, 천마꽃 추출물 및 천마꽃대 추출물이 모두 더 낮아 항산화 효과가 우수한 것을 확인할 수 있으며, 특히, 천마꽃과 천마꽃대 추출물에서 천마덩이 뿌리 추출물 대비 그 효과가 우수하여 부위에서도 천마꽃과 천마꽃대 추출물의 항산화 효과가 현저히 우수함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 천마 추출물을 포함하는 조성물을 항산화 용도로 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.

실험예 2: 멜라닌 생성저해 효과

멜라닌 생성 저해를 통한 미백 효과를 확인하기 위하여, Lotan R. 외(Cancer Res. 40:3345-3350, 1980)에 기재된 방법에 따라 쥐의 멜라노마 세포(B-16 mouse melanoma cell)의 배양액에, 추출물을 첨가하여 멜라닌 총량을 측정하였다. 실험 시, 먼저 쥐의 멜라노마 세포에 대하여 독성을 평가하여 독성이 없는 농도에서 미백평가를 수행하였다. 음성 대조군으로는 DMSO를, 양성 대조군으로는 알부틴(albutin)을 사용하였다.

구체적으로, 시료를 최종 농도가 100 ppm이 되도록 배지에 첨가하고, 알부틴은 100 ppm이 되도록 배지에 첨가한 후 멜라노마 세포를 3일간 배양하였다. 이후, 세포들을 트립신(trypsin) 처리하여 배양용기로부터 떼어내 원심분리한 후, 멜라닌을 추출하였다. 떼어낸 세포는 수산화나트륨 용액(1N 농도) 1 ml를 가하여 10분간 끓여 멜라닌을 녹이고 분광 광도계를 이용하여, 400 nm에서 흡광도를 측정하여 생성된 멜라닌의 양을 측정하였다.

상기 멜라닌 양은 단위 세포수당(1×106 cell)의 흡광도로 나타내는 방법으로 측정하였으며, 대조군에 대한 상대적인 멜라닌 총량을 저해율(%)로 계산하고 결과를 하기 표 2에 나타내었으며, 실험은 각각 3회씩 수행하여 평균값으로 나타내었다.

멜라닌 생성 저해 효과 결과

시료	멜라닌생성량 (abs)	저해율(%)
대조군 (DMSO, 10ppm)	0.33	-
양성대조군 (알부틴, 100ppm)	0.228	30.91
천마꽃 추출물 (10ppm)	0.239	27.58
천마꽃 추출물 (1ppm)	0.261	20.91
천마꽃대 추출물 (10ppm)	0.241	26.97
천마꽃대 추출물 (1ppm)	0.257	22.12
천마덩이뿌리 추출물(10ppm)	0.248	24.85

그 결과, 상기 표 2에서 나타난 바와 같이, 멜라닌 생성량이 대조군 대비 천마덩이뿌리 추출물, 천마꽃 추출물 및 천마꽃대 추출물이 모두 더 낮아 멜라닌 총량 감소효과가 우수한 것을 확인할 수 있으며, 특히, 천마꽃과 천마꽃대 추출물이 천마덩이뿌리 추출물 대비 그 효과가 우수하여 부위에서도 천마꽃과 천마꽃대 추출물의 멜라닌 생성 저해율 및 멜라닌 총량 감소효과가 현저히 우수함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 천마 추출물을 포함하는 조성물은 미백용도로 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.

실험예 3: 항염 효과

항염증 효과 및 피부트러블 개선 효과를 확인하기 위하여, RAW264.7 세포주 (ATCC number: CRL-2278)를 이용한 GRIESS 법으로 nitric oxide(NO) 생성 억제력 실험을 실시하였다.

구체적으로, 생쥐의 대식세포인 RAW264.7 세포를 수차례 계대 배양하고, 웰 하나에 3×105 개씩 들어가도록 24-웰 프레이트에 넣은 후, 24 시간 동안 배양하였다. 이어서, 최종농도 10ppm의 농도로 시료를 함유한 세포 배지로 교체하였다. 이때, NO-생성 억제물질인 L-NMMA(L-NG-Monomethylarginine)을 양성 대조군으로 함께 처리하여 30분 동안 배양하였고, 자극원으로 LPS(Lipopolysaccharide)를 1 ㎍씩 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 상층액을 100㎕씩 취해 96-웰 프레이트에 옮기고, GRIESS 용액을 100㎕씩 가해 상온에서 10분간 반응시키고, 540nm에서의 흡광도를 측정함으로써 NO 억제 효과를 판단하고, NO 생성 저해율(%)은 하기 수학식 2를 이용하여 계산하여 하기 표 3에 나타내었으며, 실험은 각각 3회씩 수행하여 평균값으로 나타내었다.

항염 효과 결과

시료	NO 생성 저해율(%)
대조군 (DMSO, 10ppm)	-
L-NMMA (양성 대조군, 10ppm)	36.76
천마꽃 추출물 (1ppm)	16.30
천마꽃 추출물 (10ppm)	20.37
천마꽃 추출물 (100ppm)	32.51
천마꽃대 추출물 (1ppm)	19.49
천마꽃대 추출물 (10ppm)	27.62
천마꽃대 추출물 (100ppm)	37.90
천마덩이뿌리 추출물 (1ppm)	17.29
천마덩이뿌리 추출물 (10ppm)	19.37

그 결과, 상기 표 3에서 나타난 바와 같이, NO생성 저해율은 항염효과가 우수한 항염 의약물질 양성대조군 (L-NMMA)과 같이 천마덩이뿌리 추출물, 천마꽃 추출물 및 천마꽃대 추출물도 항염 효과가 우수한 것을 확인할 수 있으며, 특히, 천마꽃과 천마꽃대 추출물에서 천마덩이뿌리 추출물 대비 그 효과가 우수하여 부위에서도 천마꽃과 천마꽃대 추출물의 항염효과가 현저히 우수함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 천마 추출물을 포함하는 조성물을 항염용도로 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.

실험예 4: 콜라겐 합성 촉진 효과

시료를 인간 유래 섬유아세포의 배양액에 첨가하여 세포수준에서 제1형 콜라겐 합성 촉진 효과를 확인하였다. 합성된 콜라겐의 측정은 PICP EIA kit(Procollagen Type I C-Peptide Enzyme Immuno Assay KIT)를 이용하여 정량하였다. 콜라겐 합성량을 측정하기 위해 시료를 최종 농도가 100ppm이 되도록 섬유아세포의 배양배지(DMEM 배지)에 첨가하여 48 시간 배양한 후 배양액을 취하여 PICP EIA 키트로 각 농도에서 제1형 콜라겐 합성 정도를 분광광도계를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.

효과의 비교를 위하여 시료를 처리하지 않은 섬유아세포의 배양배지를 음성대조군으로 TGF-β 10ng/ml를 양성대조군으로하여 첨가한 시료에 대하여 동일한 방법으로 콜라겐 합성 정도를 측정하였다. 콜라겐 생성 증가율은 음성 대조군에 대한 상대적인 콜라겐 생성량의 비율로 계산하고 결과를 하기 표 4에 나타내었으며, 실험은 3회씩 수행하여 평균값으로 나타내었다.

콜라겐 합성 촉진 효과 결과

시료	증가율(%)
음성대조군	-
양성대조군 (TGF-β 10ng/ml)	20.3
천마꽃 추출물 (10ppm)	7.7
천마꽃 추출물 (100ppm)	11.3
천마꽃대 추출물 (10ppm)	8.3
천마꽃대 추출물 (100ppm)	12.1
천마덩이뿌리 추출물 (10ppm)	7.2
천마덩이뿌리 추출물 (100ppm)	9.8

그 결과, 상기 표 4에서 나타난 바와 같이, 콜라겐 증가율은 일반적으로 콜라겐 합성을 유도하는 것으로 잘알려진 양성대조군(TGF-β)과 같이 천마덩이뿌리 추출물, 천마꽃 추출물 및 천마꽃대 추출물도 콜라겐 합성을 증가시키는 것을 확인할 수 있으며, 특히, 천마꽃과 천마꽃대 추출물이 천마덩이뿌리 추출물 대비 콜라겐 합성을 촉진 효과가 우수하여 부위에서도 천마꽃과 천마꽃대 추출물의 콜라겐 합성 효과가 현저히 우수함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 천마 추출물을 포함하는 조성물을 주름 및 탄력개선 용도로 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.

실험예 5: 엘라스타제활성 저해 효과

엘라스틴(Elastin)을 분해하는 효소인 엘라스테이즈(Elastase)의 활성 저해 효과를 다음과 같이 확인하였다.

엘라스테이즈(Elastase)는 사람의 백혈구 세포로부터 유래한 엘라스테이즈를 사용하였고, 엘라스테이즈의 기질로 합성 기질인 MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA를 사용하였다. 완충용액은 100mM의 Tris(pH 7.5) 용액을 사용하였다. 엘라스테이즈는 완충용액을 이용하여 최종적으로 0.2 mU을 사용하였다. 또한 엘라스테이즈의 합성 기질은 DMSO를 이용하여 100mM 용액을 만든 후 최종 농도가 0.5mM이 되도록 완충용액을 이용하여 희석하였다. 이 때, 양성 대조군은 엘라스테이즈 저해 물질로 알려진 쿼세틴(Quercetin)을 10ppm 농도로 넣은 것으로 설정하였다. 엘라스테이즈 저해 후보는 최종농도가 10ppm이 되도록 첨가하였다. 반응은 96-웰 플레이트에서 진행하였으며, 상온에서 20분간 반응시켰다. 분광 광도계를 이용하여 1분 간격으로 405 nm에서 흡광도를 측정하여, 시간 대비 흡광도의 기울기를 구하여 효소의 활성도로 정하였다. 엘라 스테이즈 저해율은 다음과 같이 계산하였다.

[수학식]

엘라스타제 저해율은 상기 수학식을 이용해 계산하여 하기 표 5에 나타내었으며, 실험은 각각 3회씩 수행하여 평균값으로 나타내었다.

엘라스타제 활성 저해 효과 결과

시료	효소 활성도	저해율(%)
양성대조군 (Quercetin, 10ppm)	3.5	66.35
대조군 (DMSO, 20ppm)	10.4	-
천마꽃 추출물 (10ppm)	7.1	31.73
천마꽃 추출물 (20ppm)	4.2	59.62
천마꽃대 추출물 (10ppm)	5.9	43.27
천마꽃대 추출물 (20ppm)	3.7	64.42
천마덩이뿌리 추출물 (10ppm)	7.6	26.92
천마덩이뿌리 추출물 (20ppm)	4.8	53.85

그 결과, 상기 표 5에서 나타난 바와 같이, 효소 활성도는 대조군 대비 천마덩이뿌리 추출물, 천마꽃 추출물 및 천마꽃대 추출물이 모두 더 낮아 엘라스타제활성 저해 효과가 우수한 것을 확인할 수 있으며, 특히, 천마꽃과 천마꽃대 추출물이 천마덩이뿌리 추출물 대비 그 효과가 우수하여 부위에서도 천마꽃과 천마꽃대 추출물의 엘라스타제 활성 저해가 현저히 우수함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 천마추출물을 포함하는 조성물은 피부재생, 주름개선을 위한 용도로 사용할 수 있음을 확인하였다.

실험예 6: 세포 증식 효과

세포 증식 효과는 다음과 같은 방법으로 실험하였다. 사람의 섬유아세포(human fibroblast cell)를 96웰 플레이트(96 well plate, Corning사)에 접종하여 배양한 다음, 실시예 1 내지 실시예 2로 제조된 농축물을 1% 농도로 희석하여 2일간 적용하고, MTT 시험 방법을 수행하여 세포증식을 평가하였다. 보다 구체적으로, 인간 섬유아세포를 24well plate에 5Х103 cells/well씩 동일하게 hemocytometer를 이용하여 계수한 후 분주하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 40% 내지 50%만큼 배양되면, 시료를 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 더 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA) 용액 (2.5 mg/ml)을 50 ul 첨가하고 3시간 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 200ul의 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well 당 200ul씩 처리하여 교반한 후, 100 ul씩을 96 well로 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA)로 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 무혈청 배지를 사용하였으며, 비교군으로는 혈청(serum) 1%를 부가하여 사용하였다. 실험은 각각 3회씩 반복하였고, 그 결과를 하기 표 6에 나타낸다.

세포증식 효과 결과

시료의 종류	2일 후 세포증식율(%)
대조군(무혈청 배지)	100
비교군(serum 1%)	176
천마꽃추출물(1%)	129
천마꽃대추출물(1%)	137
천마덩이뿌리추출물(1%)	98

그 결과, 상기 표 6에서 나타난 바와 같이, 세포증식율은 대조군 대비 천마덩이뿌리 추출물, 천마꽃 추출물 및 천마꽃대 추출물이 비슷하거나 더 높았으며, 특히, 천마꽃과 천마꽃대 추출물이 천마덩이뿌리 추출물 대비 그 효과가 우수하여 부위에서도 천마꽃과 천마꽃대 추출물의 세포재생에 효과가 현저히 우수함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 천마 추출물을 포함하는 조성물은 세포재생용으로 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.

실험예 7: 인간 각질형성세포에서의 HAS2, HAS3 및 AQP3 발현 증가 시험

인간 각질형성세포(HaCaT)를 6-well cell culture plate에 각 2x10⁵씩 분주하여 10% 우혈청(fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지에서 24시간 배양하였다. 배양된 세포에 10% 우혈청과 칼슘(Ca²⁺)이 포함되지 않은 DMEM 배지로 교체한 후, 천마꽃 추출물을 배지에 희석하여 24시간 처리하였다. 24시간 경과 후 세포를 회수하여 냉각된 인산완충용액(PBS)으로 세척하고, RNeasy mini kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. RNA를 cDNA Synthesis Kit (PhileKorea, Korea) 이용하여 역전사반응을 수행하였다. 합성된 cDNA는 정량 후 물로 희석하여 모든 반응에 동일량을 사용하였다. TaqMan® Universal Master Mix II와 TaqMan® Gene Expression Assays (Thermo Fisher, USA) HAS2, HAS3 및 AQP3 프라이머를 사용하였다. StepOnePlus® Real-time PCR System (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 실시간 중합 효소 연쇄 반응(quantitative real time PCR)을 수행하였다. 실험 결과는 하우스키핑 유전자(housekeeping gene) Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 기준으로 ΔΔCt 방법으로 계산하여 나타내었다. 각 시료의 HAS2, HAS3 및 AQP3 유전자의 발현 정도는 추출물을 첨가하지 않은 음성 대조군의 mRNA 발현량을 약 1.0으로 기준하여 수치화하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 양성 대조군으로 EGF Recombinant Human Protein (Life Technologies, USA) 10 ng/ml 를 사용하였다.

인간 각질형성세포에서의 HAS2, HAS3 및 AQP3 발현 증가 시험

시료	HAS2의 mRNA 증가양	HAS3의 mRNA 증가양	AQP3의 mRNA 증가양
무첨가(대조군)	1	1	1
EGF 10ng/ml	17.13	5.30	1.04
천마꽃추출물 0.1%	2.47	4.19	1.81
천마꽃추출물 0.25%	7.17	6.69	4.90
천마꽃대추출물 0.1%	2.62	4.32	2.11
천마꽃대추출물 0.25%	7.97	6.42	4.72
천마덩이뿌리추출물 0.1%	1.96	4.01	1.51
천마덩이뿌리추출물 0.25%	5.72	5.78	1.69

그 결과, 상기 표 7에서 나타난 바와 같이, HAS2, HAS3 및 AQP3 발현이 대조군 대비 천마덩이뿌리 추출물, 천마꽃 추출물 및 천마꽃대 추출물이 모두 더 높아 히알루론산 합성을 발현키는 효과가 우수한 것을 확인할 수 있으며, 특히, 천마꽃과 천마꽃대 추출물의 발현이 천마덩이뿌리 추출물 대비 우수하여 부위에서도 천마꽃과 천마꽃대 추출물의 히알루론산 합성 촉진 효과가 현저히 우수함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 천마 추출물을 포함하는 조성물은 피부 보습, 주름 개선 및 탄력 증진 등의 용도로 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 8: 크림 도포 전 후의 피부 수분량 변화 시험

하기 표 8의 조성으로 A 내지 D를 크림 제형으로 제조하였다(단위: 중량%).

천마꽃추출물을 2% 넣어 in vivo 테스트를 진행하였다. 평가대상은 30세 여성 20명을 선정하여 A 내지 D를 크림을 나누어 주고 왼쪽 및 오른쪽 뺨에 각각 A 내지 D를 크림을 사용하게 한 후 2주 후에 피부 수분함유량을 측정하였다. 구체적으로 상기 피험자 20명을 대상으로 안면을 비누로 씻은 후, 항온항습 조건(온도 20±2℃, 상대습도 40±2%)에서 피부를 적응시켰다. 코네오미터(Corneometer, CM825)를 이용하여, 피부 표면 전기용량을 3회 반복 측정하였다. 그 평균 결과를 아래 표 9에 표시하였다.

크림 조성 성분

성분	A	B	C	D
천마꽃추출물	0	2	0	0
천마꽃대추출물	0	0	2	0
천마덩이뿌리추출물	0	0	0	2
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량
글리세린	8.0	8.0	8.0	8.0
부틸렌글리콜	4.0	4.0	4.0	4.0
히알루론산 추출물	5.0	5.0	5.0	5.0
베타글루칸	7.0	7.0	7.0	7.0
카보머	0.15	0.15	0.15	0.15
카프릴릭/ 카프릭 트리글리세라이드	8.0	8.0	8.0	8.0
스쿠알란	5.0	5.0	5.0	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5	1.5	1.5	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4	0.4	0.4	0.4
세테아릴 알코올	2.0	2.0	2.0	2.0
방부제	적량	적량	적량	적량
색소	적량	적량	적량	적량
트리에탄올아민	0.15	0.15	0.15	0.15

크림 도포 전 후의 피부 수분량 변화 결과

	2주 후 수분함유량 변화율(%)
A	10
B	27
C	25
D	20

그 결과, 상기 표 8 내지 표 9에서 나타난 바와 같이, 수분함유량 변화율은 A(천마 추출물이 포함되지 않은 대조군)대비 천마덩이뿌리 추출물, 천마꽃 추출물 및 천마꽃대 추출물이 모두 더 증가하여 보습효과가 우수한 것을 확인할 수 있으며, 특히, 천마꽃 또는 천마꽃대 추출물을 포함한 B 내지 C는 천마덩이뿌리 추출물을 포함한 D 보다 수분함유량을 증가시켜 보습효과가 현저히 우수함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 천마 추출물을 포함하는 조성물은 보습용도로 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.

실험예 9: 항미생물 효과(항비듬균 효능)

실험 방법 및 검사 균주 [최소성장억제농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 측정법] 세균-MHB2, 진균-PDB 배지를 적용하여 serial dilution 법으로 실험 수행 하였다. 각 well에 106 수준의 균을 접종하고, 일반세균 3종, 진균 2종, 피티로스포룸 오발레를 접종하여 배양한 다음, 시료농도별 균체의 성장정도를 관찰하여 균성장을 억제하는 최소농도를 판정하였다.

항미생물 효과 실험 결과

	최소저해농도 (%)
	E. coli 대장균	S. aureus 화농균	P. aeruginosa 녹농균	A. niger 흑곰팡이	C. albicans 효모
아연피리치온	0.002	0.001	0.002	0.02	0.02
천마꽃추출물	0.1	0.1	0.1	0.5	0.5
천마꽃대추출물	0.5	0.5	0.5	2	1
천마덩이뿌리추출물	-	-	-	-	10

그 결과, 상기 표 10에서 나타난 바와 같이, 비듬원인균인 피티로스포름 오발레(Pityrosporum ovale)를 대상으로 우수한 항미생물 효과를 보이는 아연피리치온(양성 대조군)과 같이 천마덩이뿌리 추출물, 천마꽃 추출물 및 천마꽃대 추출물이 항미생물 효과를 보이는 것을 확인할 수 있으며, 특히, 천마꽃과 천마꽃대 추출물이 천마덩이뿌리 추출물 대비 0.5 내지 1%의 적은양으로도 항미생물 효과 및 향균 효능이 우수하여 부위에서도 천마꽃과 천마꽃대 추출물의 향균 효능이 현저히 우수함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 천마 추출물을 포함하는 조성물을 향균효과용도로 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.

실험예 10: 세포독성

본 실시예에서 혼합추출물의 세포독성 평가를 위해 Follicle Dermal Papilla(Promocell, 독일)의 세포분열 변화를 Cell Counting Kit-8(Dojindo Lab, 미국)을 사용하여 측정하였다.

먼저, 균일한 수의 세포를 96 well plate에 깔아준 뒤 안정화 시킨 후 하기 추출물들을 10, 20 ug/ml이 되도록 처리한 후 48시간 동안 추가배양 하였다. 이후 CCK-8을 처리하여 2시간 뒤 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 무처리 대비 추출물을 처리한 세포의 상대적인 세포 생존율을 아래와 같이 분석, 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

세포독성 실험 결과

시료	생존율(%)
무처리	100
BIO 1uM	103
천마꽃추출물 (10ug/ml)	97
천마꽃추출물 (20ug/ml)	101
천마꽃대추출물 (10ug/ml)	97
천마꽃대추출물 (20ug/ml)	102
천마덩이뿌리추출물 (10ug/ml)	94
천마덩이뿌리추출물 (20ug/ml)	104

상기 표 11에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 천마꽃, 천마꽃대, 및 천마덩이뿌리 추출물은 모두 무처리 시료 대비 세포수가 크게 변하지 않는 것을 확인하여 세포독성이 없는 것을 확인하였다.

실험예 11: 추출물의 Wnt/β-catenin signal pathway 활성 효과 조사

추출물들이 Wnt/β-catenin signal pathway 활성화에 미치는 영향을 조사하기 위해 TOPflash reporter(Millipore, 미국)를 이용하였다. 인간 모유두세포를 24 웰 플레이트에 2 x 105/웰로 접종하고 24시간 동안 배양한 다음 추출물들을 10, 20 ug/ml이 되도록 처리한 후 15시간 동안 추가 배양하여 듀얼 루시퍼레이즈 어세이 키트(Promega, 미국)를 사용하여 파이어플라이 루시퍼레이즈 (firefly luciferase)활성을 측정하였다.

루시퍼레이즈 활성을 정확하게 측정하기 위하여 각각의 시료에 대하여 3회 실시하였으며 대조군에 대한 상대적인 활성을 증가율(%)로 계산하고 하기 표 12에 나타내었다. 대조군은 무처리군이다. 양성대조군으로는 6-bromoindirubin-3'-oxime (BIO)를 사용했으며 Wnt 신호전달 체계에서 GSK-3를 억제하는 것으로 알려져 있는 물질이다.

추출물의 Wnt/β-catenin signal pathway 활성 효과 결과

시료	증가율(%)
대조군 (무처리)	100
BIO 1uM	152
천마꽃추출물 (10ug/ml)	143
천마꽃추출물 (20ug/ml)	182
천마꽃대추출물 (10ug/ml)	135
천마꽃대추출물 (20ug/ml)	175
천마덩이뿌리추출물 (10ug/ml)	114
천마덩이뿌리추출물 (20ug/ml)	132

그 결과, 상기 표 12에서 나타난 바와 같이, Wnt/β-catenin signal pathway 활성은 대조군 대비 천마덩이뿌리 추출물, 천마꽃 추출물 및 천마꽃대 추출물이 모두 더 높아 우수한 것을 확인할 수 있으며, 특히, 천마꽃과 천마꽃대 추출물에서 천마 덩이 뿌리 추출물 대비 그 효과가 우수하여 부위에서도 천마꽃과 천마꽃대 추출물의 Wnt/β-catenin signal pathway 활성효과가 현저히 우수함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 천마 추출물을 포함하는 조성물을 탈모 방지 및 모발성장 촉진 용도로 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 12: 모유두세포 증식효과

실험에 하기 1) 내지 3)의 배지를 사용하였고,

1) DMEM (10% FBS, 1% P/S)

2) depletion media: 5% charcoal stripped FBS containing phenol-red free DMEM media

3) SF(serum free) media - DMEM (1% P/S)

Day0 내지 Day5 동안 하기에 나타낸 각기 다른 실험을 진행하여 모유두세포 증식 효과를 확인하였다.

Day 0 : 오전 10시, seeding (5,000 cell/well)

Day 1 : 오전 10시, depletion media change 후, 24h 배양

Day 2 : 오전 10시, 시료처리전 CCK-8 측정 (초기값 평균: 0.586) 및 시료처리

(추출물의 경우 100ppm 농도로 처리)

Day 5 : 오전 10시, CCK-8 측정. (Control값 평균이 0.556으로 세포가 죽지 않고 수가 초기값을 유지하는 것으로 판단됨)

모유두세포 증식효과 실험 결과

시료	Average(ratio)	stdev
Control(DMEM)	1.00	0.03
SF(serum free)	0.68	0.04
천마꽃추출물 100ppm	1.34	0.07
천마꽃대추출물 100ppm	1.49	0.05
천마덩이뿌리추출물 100ppm	0.76	0.05

상기 표 13에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 천마덩이뿌리, 천마꽃 또는 천마꽃대 추출물은 Control(대조군) 대비 모유두세포가 증식되는 것을 확인할 수 있었다. 본 발명의 천마 추출물을 포함하는 조성물은 탈모 방지 용도로 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.

실시예 1 내지 실시예 3 및 실험예 1 내지 실험예 12를 종합하면, 본 발명의 천마꽃 또는 천마꽃대 추출물은 자유라디칼 저해, 콜라겐 합성 촉진, 엘라스타제 활성 저해, 모유두세포 증식, 멜라닌 생성 저해, 염증생성 저해, HAS2 활성, HAS3 활성, AQP3활성 또는 비듬균 향균 효과를 제공하므로 항산화용, 미백용, 항염용, 보습용, 항균용, 모발성장 촉진 또는 탈모방지용, 또는 주름 개선 또는 피부 노화 방지용도로 화장료 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물 및 헤어조성물로 제공할 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 천마는 천마꽃 및 천마꽃대로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출한 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 항산화용, 미백용, 항염용, 보습용, 항균용, 모발성장 촉진 또는 탈모방지용, 또는 주름 개선 또는 피부 노화 방지용인 것인, 화장료 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 자유라디칼 저해, 콜라겐 합성 촉진, 엘라스타제 활성 저해, 모유두세포 증식, 멜라닌 생성 저해, 염증생성 저해, HAS2 활성, HAS3 활성, AQP3활성 또는 비듬균 향균 효과를 가지는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가지는 것인, 화장료 조성물.
천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
제7항에 있어서,
상기 천마는 천마꽃 및 천마꽃대로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 식품 조성물.
제7항에 있어서,
상기 식품 조성물은 항산화용, 미백용, 항염용, 보습용, 항균용, 모발성장 촉진 또는 탈모방지용, 또는 주름 개선 또는 피부 노화 방지용인 것인, 식품 조성물.
천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 의약외품 조성물.
제10항에 있어서,
상기 의약외품 조성물은 항산화용, 미백용, 항염용, 보습용, 항균용, 모발성장 촉진 또는 탈모방지용, 또는 주름 개선 또는 피부 노화 방지용인 것인, 의약외품 조성물.
천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 헤어 조성물.
제12항에 있어서,
상기 헤어 조성물은 항산화용, 항염용, 보습용, 항균용, 모발성장 촉진 또는 탈모방지용인 것인, 헤어 조성물.