KR20110013812A - 함초캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타추출물을 함유하는 피부주름개선또는 피부탄력증진용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 함초(Salicornia herbacea) 캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타(Laminaria digitata) 추출물을 함유하는 피부주름개선 또는 피부탄력개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명의 화장료 조성물에 이용된 함초 캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물이 피부 주름 개선과 피부 탄력 개선, 보습력을 향상시킨다.

함초, 라미나리아 디지타타 주름개선, 탄력개선

Description

함초캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타추출물을 함유하는 피부주름개선또는 피부탄력증진용 화장료 조성물{Cosmetic composition containing Salicornia herbacea callus Extracts and Laminaria digitata Extracts for Improving Skin Wrinkle or enhancing skin Elasticity}

본 발명은 함초(Salicornia herbacea) 캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타(Laminaria digitata) 추출물을 함유하는 피부주름개선 또는 피부탄력증진용 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명에 따른 함초 캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물을 함유한 화장료 조성물이 피부 주름 개선과 피부 탄력 개선, 보습력을 향상시킨다. 더욱이, 본 발명의 화장료 조성물은 피부에 자극이 없는 안전한 물질로서, 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패취, 또는 분무제 등의 제형으로 이용될 수 있다.

인체의 가장 큰 기관으로서 전체 인체 부피의 약 16%를 차지하고 있는 피부는 외부환경과 직접 접해 있으면서, 인체 안으로 침입하려는 치명적인 많은 유해인자, 예를 들면, 온도, 습도 및 자외선 등으로부터 인체를 보호하는 중요한 보호막 역할을 담당한다. 그러나, 나이가 들어감에 따라 각종 오염물질, 강한 자외선, 스 트레스 및 영양결핍 등으로 인해 피부 세포들이 손상을 입게 되고, 세포 증식이 제대로 이루어지지 않게 되어 피부에 주름, 탄력 손실 및 각질화 등이 발생한다.

피부의 노화는 크게 내인적 노화(intrinsic aging)와 외인적 노화(extrinsic aging)로 대별된다(Cosmetics & Toiletories, 111:31-37(1996)). 내인적 노화는 나이가 듦에 따라 피부의 생리적 기능이 점차 저하되어 자연적으로 나타나는 노화 현상으로 임상학적으로 탄력이 감소하고, 피부결이 거칠어지며, 깊은 주름이 생기며 색소가 침착되는 특징이 있다(Arch Dermatol., 130:87-95(1994)). 외인적 노화는 자외선, 활성 산소종(reactive oxygen species) 및 스트레스 등의 외인적 요인에 의해 발생하는 노화 현상을 말한다. 이러한 요인들에 의해 피부의 노화가 급속히 진행되며, 그 결과 피부 표면에 거친 주름이 생성되고 탄력이 현저히 감소하게 된다.

피부의 노화 기작을 규명하기 위한 여러 연구들이 진행되어 여러 가지 피부 노화의 원인들이 밝혀졌다. 피부가 온도의 변화, 습도의 저하 또는 바람 등에 의해 건조하게 되면 외부에 대한 방어벽으로서의 피부 생리 활성이 저하되어 노화가 촉진된다. 또한, 유해 활성산소종 또는 자유 라디칼에 피부가 노출되면 체내의 산화 작용에 의해 과산화 지질이 생성되고 피부를 구성하는 여러 단백질들의 변형을 유발하게 된다. 한편 피부 진피의 대부분(피부 전체 건조 중량의 약 70-80%)을 차지하는 콜라겐과 신축성이 큰 엘라스틴 단백질은 섬유아세포에서 생성되는 주요 단백질로 피부 진피층에서 피부의 기계적 견고성, 조직의 결합력 및 탄력성 등에 관여한다(Journal of the American academy of dermatology, 21:610-613(1989)). 콜라 겐은 연령이 증가할수록, 그리고 자외선에 노출이 많이 될수록 양적 감소를 보인다. 콜라겐은 형태와 구조적 특징에 따라서 분류되는데 이들 중에서, 가장 특징이 잘 알려진 것은 타입 I, II, III 그리고 IV이다. 콜라겐 타입 I과 III는 진피층의 세포간질의 구성성분을 이루고 콜라겐 타입 IV는 DEJ (Dermal Epidermal Junction)의 주요 구성물질이 된다. DEJ는 피부의 표피층과 진피층 사이에 위치하여 두 층간의 물질 투과와 수송을 조절해주며 인접한 피부세포의 분화를 조절하며 피부의 견고성을 유지시켜준다. 피부의 주요 구조적 성분인 콜라겐과 엘라스틴은 자연적 또는 외부 자극에 의해 구조가 변성되거나 생합성량이 감소하게 되는데 이로 인해 피부 노화가 가속화된다.

이러한 피부노화를 억제시키거나 진행 속도를 완화시키기 위하여, 레티놀, 레티노이드, 비타민 C, 플라보노이드 및 토코페롤 등의 여러 가지 피부 보호 성분이 함유된 화장료 또는 피부 보호제가 개발되고 있다. 그러나 이와 같은 화장료 또는 피부 보호제는 최종적인 제형에 있어서 역가가 떨어져 그 효능이 경미하고, 피부 자극이 심한 문제점을 지니고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 천연물을 이용한 피부 보호용 화장료 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 함초 캘러스 추출물과 라미나리아 디지타타 추출물에 의한 피부 주름 개선과 피부 탄력 개선 또는 보습력을 향상시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 피부주름개선용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 피부탄력증진용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 콜라겐 합성 증진용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위하여 다음과 같은 수단을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피부주름개선용 화장료 조성물은 함초캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물을 유효성분으로 함유한다.

본 발명에 따른 피부탄력증진용 화장료 조성물은 함초캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물을 유효성분으로 함유한다.

본 발명에 따른 피부보습개선용 화장료 조성물은 함초캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물을 유효성분으로 함유한다.

상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 형성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 함초 캘러스 추출물과 라미나리아 디지타타 추출물을 함유한 화장료 조성물에 의하여 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 콜라겐 합성 증진 또는 보습력을 효과적으로 향상시킬 수 있다.

본 발명은 함초(Salicornia herbacea) 캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타(Laminaria digitata) 추출물을 함유하는 피부주름개선 또는 피부탄력증진용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명에 따른 함초 캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물을 함유한 화장료 조성물이 피부 주름 개선과 피부 탄력 개선, 보습력을 향상시킨다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 이용되는 함초(Salicornia herbacea)는 흔히 퉁퉁마디로도 불리우며, 한국(서해안·울릉도)·일본·중국·인도·우수리강·북아메리카 등지에 분포한다. 쌍떡잎식물 중심자목 명아주과의 한해살이풀로 바닷가에서 자란다. 전체에 털이 없다. 줄기는 마디가 많고 두드러지며, 1-2번 갈라지고, 가지는 대생, 다육질 이고, 비대하며, 짙은 녹색, 후에 붉은 색으로 변한다. 잎은 없다. 꽃은 녹색, 이삭화서, 가지 끝에 달린다. 마디 위에 마주 난 움푹 들어간 구멍 속에 2-3송이의 작은 꽃이 숨어 있다. 화피는 역원추형, 다육질로 통통하며, 꽃이 핀 후 자라서 열매를 둘러싼다. 수술은 1-2개, 자방은 난형, 암술대는 2개가 길게 나온다. 열매는 포과, 납작한 난형, 화피에 싸인다. 함초 염분에는 NaCl(염화나트륨) 96%와 미네랄 4%을 함유하고 있다. 그러나 일반 소금에 함유되어 있는 NaCl(염화나트륨)과 미네랄의 함량에 차이가 있으며, 특히 미네랄의 함량이 함초 염분에 더 많이 있는 것으로 알려져 있다. 이는 바닷물을 증발시켜 결정체를 얻은 후 정제하여 만든 소금과는 달리 염생 식물인 함초가 바닷물의 염분을 삼투압 방식을 통해 흡수하여 생체에 저장하고, 함초 뿌리는 불순물을 걸러내고 순수한 NaCl(염화나트륨)과 바닷물에 있는 미네랄, 효소등을 흡수하여 사람의 신진대사 및 건강을 유지하는데 일반 소금에 비교할 수 없는 탁월한 성분으로 밝혀져 있다. 결과적으로 일반 소금과 함초의 염분에서 기능적 차이는 미네랄의 함량과 일반 소금에는 존재하지 않는 바닷물의 특별한 청정 효소까지 함초가 흡수하여 신체 신진대사에 도움을 주며, 그 외 일반 소금에서 볼 수 없는 많은 생리활성 물질들이 함유되어 있으며, 그 생리활성 물질들은 고혈압, 당뇨, 심혈관 질환, 면역계 질환, 항암, 각종 염증, 천식, 기미, 주근깨 등 여러 가지 질병에 관여하는 것이다.

본 발명에서 이용되는 라미나리아 디지타타(Laminaria digitata)는 바다에서 자라는 해조류 중 하나로서 주로 영국의 아일랜드 해변과 같이 수심이 낮고 깨끗한 물에서 자생하는 갈조류이다. 라미나리아 디지타타에는 요오드, 알긴산, 엽록소, 칼슘, 라미닌, 타우린, 칼륨, 푸코이단, 각종 비타민과 미네랄 등의 영양소가 풍부하게 함유되어 있는 영양소의 보고라고 할 수 있다. 알긴산(alginic acid)은 2종의 우론산의 중합체로 중합도 80, 분자량 1500정도이다. 미역 다시마 등의 갈조류 세포막의 구성 성분으로 존재하는 다당류로서 주로 D-mannuronic acid가 β-1,4 결합으로 연결된 직선상의 분자이다. 알긴은 알긴산의 Na+, Ca2+, Mg2+ 등의 염을 말하며 이들은 Na₂CO₃ 용액으로 추출하여 얻어낸다. 알긴산은 끈적끈적한 점액성 물질로 콜레스테롤을 줄이고 유해산소를 억제하는 효과가 있다. 또한 혈압강하제 역할을 하며 인체내 흡수된 유해금속등과 결합하여 인체 밖으로 배설케 하는 작용을 갖고 있다.

본 발명에서 명명되는 알긴은 상기 알긴산을 포함하고, 본 발명에서 명명되는 하기에서 설명되는 비알긴은 라미나리아 디지타타 추출물 중에 상기 알긴을 제외한 모든 성분을 포함하는 것을 지칭하나, 바람직하게는 비알긴성분 중에 요오드, 칼슘, 철분, 마그네슘, 셀레늄, 푸코이단을 유효성분으로 함유하는 것을 지칭하는 것이 적합하다.

라미나리아 디지타타의 비알긴 성분으로 함유되는 요오드는 비알긴의 대표적인 성분으로 갑상선 호르몬인 티록신을 만드는데 원료가 되는 물질이다. 티록신은 심장과 혈관의 활동, 체온과 땀의 조절, 신진대사를 증진시키는 작용을 하므로 체력증진에 도움이 되며 그밖에 해독작용, 정장작용, 생체 방어능력 향산을 촉진시키는 역할을 한다.

또한 상기 비알긴 성분은 무기질중 칼슘과 철분을 가장 많이 함유하고 있는데, 라미나리아 디지타타에 함유된 칼슘은 비타민, 엽록소 등과 함께 존재하므로 체내에 효과적으로 흡수되어 뇌신경계 활동을 원활히 해주고, 철분은 빈혈예방에 도움을 준다.

그밖에 비알긴 성분으로 마그네슘과 셀레늄이 있는데, 마그네슘은 인체 내 자연 치유력을 높이는 역할을 하며, 셀레늄은 항암효능과 같은 강력한 항산화 효과를 갖는다.

마지막으로 비알긴 성분의 대부분을 차지하는 식물 섬유인 푸코이단이 있다. 푸코이단은 유방암의 억제효과 뿐만아니라 콜레스테롤 수치를 저하시켜 동맥경화, 심장병, 뇌졸증을 예방해주는 것으로 알려져있다.

본 발명에 의한 라미나리아 디지타타의 알긴 추출물과 비알긴 추출물은 시중에서 구입하여 사용할 수 있고 또한, 다양한 방법으로 제조할 수 있으나, 바람직하게는 다음과 같이 제조하는 것이 적합하다.

먼저 라미나리아 디지타타를 정제수에 침지시켜 염분을 제거한 후 잘 건조시켜 분쇄한다. 분쇄된 라미나리아 디지타타로부터 알긴을 추출하기 위해, 중량당 0.01~10% 바람직하게는 0.1~2.0%의 염기성 염류, 예컨대 탄산칼륨, 탄화수소나트륨, 탄산수소암모늄, 염화암모늄, 제2 인산나트륨, 제2 인산칼륨 및 탄산나트륨 바람직하게는 제2 인산칼륨을 첨가하여 30 ~ 70℃ 바람직하게는 40 ~ 50℃에서 1~30분간 가열시킨다. 반응후 분리된 알긴을 침강법 ·공기부유법 ·원심분리법 등으로 단백질·섬유질 등의 알긴 이외의 물질과 분리한 후 알긴 분해효소(alginate lyase)를 이용하여 가수분해 한 후 알코올을 사용하여 탈수, 건조시킨 후 분말의 알긴 추출물을 얻는다.

알긴 추출물을 얻은 후 알긴이 제거된 나머지 고형분을 건조 중량의 2 ~ 10 배 바람직하게는 2.5~3.5 배되는 물(정제수), 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합 용매로부터 선택된 극성용매를 사용에 추출할 수 있으며, 바람직하게는 순도 90% 이상의 에칠알콜을 첨가하여 열수 추출하는 것을 특징으로 하며, 이를 3시간이상 혼합교반한 후 여기에 라미나리아 디지타타의 6~8배의 물을 첨가하고30 ~ 70℃ 바람직하게는 55℃~65℃의 온도에서 9~11시간 분해시킨 후 찌꺼기를 분리하기 위해 여과한다. 여과된 추출물은 55℃~60℃에서 진공농축하여 비알긴 추출물을 만든다.

한편, 본 발명에서 이용되는 라미나리아 디지타타 추출물은 알긴 성분 및 비알긴 성분이 다양한 농도로 라미나리아 디지타타 추출물에 함유될 수 있다.

한편, 본 명세서에서 용어 캘러스(callus)는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포 덩어리로서 대부분 유세포로 되어있으며, 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신(auxin) 또는 사이토키닌(Cytokinin)을 함유한 배지에서 배양하거나 식물체에 상처를 내거나 또는 식물체의 상구를 옥신으로 처리하였을 때 생기는 것으로 유상조직 또는 유합조직이라고도 한다. 캘러스는 식물세포 배양, 특히 조직배양을 통하여 잎, 줄기, 뿌리, 근경, 열매, 씨앗 등 식물의 어느 부분에서도 유도될 수 있으며, 계대배양에 의해 계속해서 만들어 낼 수 있다는 특징을 가지고 있다.

캘러스의 유도는 당업계에 공지된 통상의 방법을 통하여 수행될 수 있다. 바람직하게는 식물의 조직 또는 이의 절편체를 조직배양용 배지에서 배양한다. 상기 배지로는 MS (Murashige & Skoog) 배지, WHITE 배지, B5 배지, R2 배지 등을 사용할 수 있다. 이 때 식물의 종(species), 식물체의 나이, 배양기관의 종류와 그의 숙도 등을 고려하여 배양하고자 하는 식물에 적합한 배지를 선택하는 것이 바람직하다. 또한 배지에 생장조절제를 첨가하는 것이 바람직하다. 상기 생장조절제는, 이에 제한되는 것은 아니나, IAA(3-indoleacetic acid), IAld (3-indoleacetaldehyde), IPA(3-indolepyruvic acid), IAN(3-indoleacetonitrile), IAE(ethyl ester of indoleacetic acid)와 같은 옥신(auxin) 및 그의 유도체(예: 2,4-D(2,4-dichlorphenoxy acidic acid), NAA(naphthaleneacetic acid)) 및 키네틴(kinetin), BA(benzoic acid), CPPU(N-(2-chloro-4-pyridyl)-N'-phenylurea)와 같은 사이토키닌(cytokinin) 및 그의 유도체를 포함한다. 이외에도 세포의 분화 및 증식에 작용하는 천연 추출물 등을 배지에 추가로 첨가할 수도 있다. 바람직한 캘러스 유도 및 배양방법은 다음과 같다: 먼저, 식물체의 조직 일부를 분리하여 소독한 후 탄수화물이나 아미노산과 같은 유기 성분, 질소, 인산, 칼륨과 같은 무기 양분 및 옥신과 같은 식물 호르몬을 함유한 한천 배지에서 배양한다. 얼마 후에 이 조직의 세포가 세포 분열을 하여 세포의 덩어리인 캘러스가 생기면, 배지로부터 캘러스를 분리하여 신선한 고체 배지위에 치상한다. 이후, 일정기간 간격으로 계대배양한다. 대량 생산을 위해 상기 배양된 캘러스를 아가만 제외한 동일한 조성의 액체 배지에서 배양한다.

본 발명에서 제공하는 함초 캘러스 및 라미나리아 디지타타 내 각종 유효 성분은 당업계에 공지된 다양한 추출 방법을 이용하여 수득할 수 있으며, 바람직하게는, (a)물, (b)탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c)상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름 또는 (g) 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다.

한편, 본 발명의 추출물은 상기한 추출 용매 뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 생약 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

또한, 본 발명의 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물 뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명의 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 피부주름개선 또는 피부탄력증진 효능을 갖는 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 화장수, 에센스, 크림, 팩, 젤, 로션, 연고, 패취 또는 분무제 등의 제형으로 제조될 수 있다. 상기 제형에 있어서 추출물의 함량은 조성물의 총 중량에 대하여 각각 0.01 내지 20 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%로 함유될 수 있다. 혼합물의 함량은 총 중량에 대하여 0.01 중량% 미만일 경우에는 본 발명에서 목적하는 효과를 기대하기가 힘들며, 20 중량% 이상일 경우에는 제형 안정성에 문제가 생길 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[제조예 1]함초 캘러스의 제조

함초 뿌리를 멸균처리한 후, 약 1cm 길이로 절단하였다. 0.5mg/L 농도의 2,4-D (2,4-dichlorphenoxy acidic acid)와 0.1mg/L 농도의 Kinetin이 첨가되어 있는 MS 배지(Sigma) 위에 치상하였다. 약 2주 후에 무정형의 캘러스 조직이 유도되면, 이를 별도로 분리하여 신선한 고체배지 위에 치상하고, 일정기간 간격으로 계대배양하였다. 이 후, 한천을 제외한 동일한 조성의 액체 배지에서 25℃, 35일간 배양하여 대량 생산하였다.

[제조예 2]함초 캘러스 추출물의 제조

대량 생산한 함초 캘러스 50g을 취하여 정제수 200ml에 침지시켜 50℃ 수욕조에서 10시간 동안 온탕하였다. 얻어진 추출액을 실온으로 냉각시키고 거름종이로 여과하여 여과액을 취하였다. 질소를 사용하여 여과액에서 수분을 증발시켜 농축한 다음, 이를 정제수에 녹여 추출물을 제조하였다.

[제조예 3]라미나리아 디지타타 추출물의 제조

정제수에 침지시켜 염분을 제거한 후 라미나리아 디지타타 50g을 파쇄기에 곱게 파쇄하여 1.0%의 제2 인산칼륨용액 500~1000mL을 첨가하여 40℃~ 50℃에서 30분간 교반한 후 여과하여 겔상태의 알긴을 얻는다. 알긴 분해효소(alginate lyase)를 이용하여 가수분해한 후 건조하여 알긴 추출물을 제조하였다. 이 후, 알긴을 추출한 나머지 고형분에 2.5~3.5배의 에칠알코올을 첨가하여 3시간 교반한 후 6~8배의 물을 첨가하고 55℃~65℃의 온도에서 9~11시간 분해한 후 거름종이로 여과하여 여과액을 얻었다. 질소를 사용하여 여과액에서 수분을 증발시켜 농축하여 비알긴 추출물을 제조하였다. 알긴 추출물과 비알긴 추출물을 1:1의 중량비로 정제수에 녹여 라미나리아 디지타타 추출물을 제조하였다.

[실험예 1]섬유아세포 증식효과

함초 캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물의 섬유아세포 (Fibroblast)증식효과를 알아보기 위해 인체 정상 섬유아세포(Fibroblast)를 96-웰 마이크로 플레이트(96-well microplate)의 각 웰(Well)에 1X10⁴ 세포가 되도록 접종하여 디엠이엠(DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium)배지에서 24시간 배양한다. 배양 후 상기에서 제조한 제조예 2, 3의 추출물을 최종 농도 0.5, 1, 2% 되도록 조정하여 혈청이 각각 2, 5, 10% 함유된 디엠이엠 배지로 교체한 후 24시간 더 배양하였으며, 이때 양성대조군으로 TGF-β (Transforming growth factor-β)을 10ng/ml 적용하였다. 배양 후 MTT (3-(4,5-dimethyl- thiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium: 5㎎/㎖) 용액 10㎕을 첨가하여 4시간 방치 후 반응액을 제거한다.

각 웰당 100㎕의 디메틸 설폭사이드용액을 가하여 염색된 세포를 용해시킨 후 마이크로 플레이트 리더로 570㎚ 에서의 흡광도를 측정하였다. 상기 과정을 실시하여 하기 수학식 1로부터 세포증식효과를 구해 그 결과를 표 1 에 나타내었다.

세포증식효과(%) = {(추출물처리시의 흡광도-대조군의 흡광도)/대조군의 흡광도} X 100

		함초 캘러스 추출물			라미나리아 디지타타 추출물
	TGF-β(10ng/ml)	0.5%	1%	2%	0.5%	1%	2%
2% FBS	47.4	20.6	45.9	79.8	17.6	27.6	43.9
5% FBS	26.6	15.3	29.7	56.3	10.6	19.3	35.4
10% FBS	11.8	8.9	16.8	35.1	4.1	11.5	23.6

상기 표 1에 의하면, 함초 캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물 모두 섬유아세포 증식 촉진 효과를 나타내었다. 특히, 함초 캘러스 추출물이 2% FBS 조건에서 2% 처리 시 섬유아세포의 증식율이 79.8% 증가하여, 세포증식에 열악한 환경(low FBS)에서 섬유아세포의 증식효과가 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 2]각질형성세포 증식효과

함초 캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물의 각질형성세포 (keratinocyte) 증식효과를 알아보기 위해 인체 정상 각질형성세포(keratinocyte)를 96-웰 마이크로 플레이트(96-well microplate)의 각 웰(Well)에 1X10⁴ 세포가 되도록 접종하여 디엠이엠(DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium)배지에서 24시간 배양한다. 배양후 상기에서 제조한 제조예 2, 3의 추출물을 최종 농도 0.5, 1, 2% 되도록 조정하여 혈청이 각각 2, 5, 10% 함유된 디엠이엠 배지로 교체한 후 24시간 더 배양하였으며, 이때 양성대조군로 TGF-β(Transforming growth factor-β)을 10ng/ml 적용하였다. 배양 후 MTT (3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium: 5㎎/㎖) 용액 10㎕을 첨가하여 4시간 방치 후 반응액을 제거한다. 각 웰당 100㎕의 디메틸 설폭사이드용액을 가하여 염색된 세포를 용해시킨 후 마이크로 플레이트 리더로 570㎚ 에서의 흡광도를 측정하였다.

상기 과정을 실시하여 하기 수학식 2로부터 세포증식효과를 구해 그결과를 표 2에 나타내었다.

세포증식효과(%) = {(추출물처리시의 흡광도-대조군의 흡광도)/대조군의 흡광도} X 100

		함초 캘러스 추출물			라미나리아 디지타타 추출물
	TGF-β(10ng/ml)	0.5%	1%	2%	0.5%	1%	2%
2% FBS	38.5	16.0	29.9	56.9	10.8	17.9	33.6
5% FBS	19.6	11.3	19.5	41.2	6.5	14.7	25.4
10% FBS	8.5	5.6	12.6	25.6	-1.1	9.5	13.2

상기 표2에 의하면, 함초 캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물 모두 각질형성세포 증식 촉진 효과를 나타내었다. 특히, 함초 캘러스 추출물이 2% FBS 조건에서 2% 처리 시 각질형성세포의 증식율이 56.9% 증가하여, 세포증식에 열악한 환경(low FBS)에서 각질형성세포의 증식효과가 뛰어난 것을 발견할 수 있었다.

[실험예 3]피부 내 세포성장인자 생합성 촉진 효과

함초 캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물의 피부 내 세포성장인자인 EGF (Epidermal growth factor), FGF (Fibroblast growth factor) 및 TGF-beta (Transforming growth factor)의 생합성 촉진 효과를 알아보기 위해 각각의 세포성장인자의 mRNA 발현량을 RT-PCR법으로 정량하였다. 인간 각질형성세포(Human Keratinocyte)의 일종인 HaCaT 세포를 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum)이 혼합된 DMEM (Dulbecco‘s modified eagle medium)에서 온도 37℃, 5% CO2 : 95% 대기 상태로 24시간 배양하였으며, 배양후 상기에서 제조한 제조예 2, 3의 추출물을 최종 농도 1.0%가 되도록 조정하여 함유된 디엠이엠 배지로 교체한 후 24시간 더 배양하였다. 배양액을 제거한 다음, 트리졸(Trizol) 용액에 넣고 세포를 라이시스 (lysis) 시켰다. 트리졸을 이용한 RNA 분리법에 의하여 토탈 RNA를 분리하여 260 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 10 μg의 RNA를 MMLV-RT 효소와 올리고 디티 프로머(oligo dT promer)를 이용하여 cDNA로 역전사(reverse transcription)시킨 다음, RT 반응산물을 각각 EGF, FGF, TGF-beta 프라이머를 사용하여 PCR 반응용액으로 증폭시켰다. 최종 PCR 생성물을 1.0% 아가로스젤 (agarose gel)에서 전기영동 한 뒤 사이버-그린(Cyber Green)으로 염색하여 320 nm UV 하에서 정량하였다.

상기 과정을 실시하여 피부 내 세포성장인자 생합성효과를 구해 그 결과를 표 3에 나타내었다.

	생합성 촉진 효과(%)
	함초 캘러스 추출물(1.0%)	라미나리아 디지타타 추출물(1.0%)
EGF	53.2	26.0
FGF	26.9	25.2
TGF-b	87.2	43.6

상기 표3에서 알 수 있듯이, 함초 캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물 모두 피부 내 세포성장인자의 생합성 촉진 효과를 나타내었으며, 특히, 함초 캘러스 추출물이 매우 우수한 세포성장인자 생합성 촉진 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

[실험예 4]콜라겐 합성효과

1X10⁵ 개의 신생아 피부로부터 분리된 인체 정상 섬유아세포를 6-웰 플레이트에서 24 시간 배양한 후, 제조예2, 3의 추출물 시료를 0.2 ~ 1.0% 농도로 처리하였다. 24∼48 시간 배양한 후, 섬유아세포가 새롭게 합성 분비한 콜라겐의 양을 상업적으로 입수가능한 콜라겐 키트(procollagen assay kit)를 이용하여 측정하였다. 그 콜라겐량을 세포수 또는 단백질량으로 보정하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

농도	콜라겐 합성 증가(%)
	함초 캘러스 추출물	라미나리아 디지타타 추출물
0.2%	5.2	25.3
0.5%	10.6	44.9
1.0%	16.9	79.5

상기 표 4에 의하면, 라미나리아 디지타타 추출물을 1.0% 처리 시 79.5% 콜라겐 합성증가 효과가 있음을 알 수 있었으며, 함초 캘러스 추출물도 동일 농도에서 16.9%의 합성증가 효과를 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 라미나리아 디지타타 추출물이 매우 우수한 콜라겐 합성 증진 효과가 있음을 확인할 수 있다.

실시예 및 비교예

함초 캘러스 추출물과 라미나리아 디지타타 추출물을 함유하는 화장료를 제조하고, 이와 비교하기 위하여 상기 추출물이 결여된 화장료 조성물을 하기 표 5의 조성비로 제조하였다.

구분	함량(중량%)
성분	실시예	비교예1	비교예2	비교예3
함초 캘러스 추출물	1.0	2.0	-	-
라미나리아 디지타타 추출물	1.0	-	2.0	-
부틸렌글리콜	2.0	2.0	2.0	2.0
프로필렌글리콜	6.0	6.0	6.0	6.0
카르복시비닐폴리머	0.5	0.5	0.5	0.5
밀납	2.0	2.0	2.0	2.0
바셀린	7.0	7.0	7.0	7.0
폴리솔베이트 60	2.0	2.0	2.0	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.5	2.5	2.5	2.5
스쿠알란	3.0	3.0	3.0	3.0
유동파라핀	10.0	10.0	10.0	10.0
트리에탄올아민	0.5	0.5	0.5	0.5
토코페릴아세테이트	0.1	0.1	0.1	0.1
향료, 방부제	미량	미량	미량	미량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량
합계	100	100	100	100

[실험예 5]보습력 개선 임상효과

본 발명의 함초 캘러스 추출물과 라미나리아 디지타타 추출물을 함유하는 화장료에 대한 피부 보습력 개선 임상효과를 측정하였다. 21세에서 48세의 여성 20명(평균연령 38세)을 대상으로 하였으며 피부 수분량이 65 이하인 건성피부를 가진 사람을 선별하였다. 측정하고자 하는 부위를 정하고 피부의 수분량을 도포 전과 도포 28일 후에 각각 측정한 후 상기 표 5에 따라 제형하여 4주간 도포(2회/일) 한 후, 피부 수분함량 측정 장치인 코네오미터(Corneometer Courage & Khazaka, Germany)를 이용하여 각질층 바로 아래의 표피층의 수분을 측정하였다.

	표피수분량 증가율(%)
실시예	35.6%
비교예1	11.4%
비교예2	33.1%
비교예3	4.5%

시험결과 함초 캘러스 추출물과 라미나리아 디지타타 추출물 모두를 첨가한 실시예에서 적용 28일후 표피수분량이 35.6% 증가하여 각각을 따로 첨가한 비교예1, 2보다 더 우수한 보습력 증진효과를 나타내었다.

[실험예 6]피부탄력효과

본 발명의 함초 캘러스 추출물과 라미나리아 디지타타 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피부 탄력 증진효과를 측정하였다.

온도 24-26℃, 습도 70%의 조건에서 20세 이상의 건강한 여성 40명(평균연령 37세)을 4 그룹으로 나누고, A 그룹에는 실시예를, B 그룹에는 비교예 1을, C 그룹에는 비교예 2를, D 그룹에는 비교예 3의 제형을 눈가를 중심으로 하루 2회씩 (아침 및 저녁) 12주간 도포한 후, 피부탄력 측정기(Cutometer MPA580, Conrage + Khazaka사, 독일연방국)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다. 시험결과는 cutometer MPA580의 R8(R8(12주)-R8(0주)) 값으로 기재하였는데, R8 값은 피부점탄성 (Vicoelasticity)의 성질을 나타내며, 결과는 하기 표 7에 기재되어 있다.

실험 제형	피부탄력효과
실시예	0.61
비교예1	0.39
비교예2	0.29
비교예3	0.03

표 7의 결과에서와 같이, 함초 캘러스 추출물과 라미나리아 디지타타 추출물을 함유하는 실시예의 화장료 조성물이 매우 우수한 피부탄력 증진 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

[실험예 7]외부 주름 개선 임상효과

본 발명의 함초 캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물을 함유하는 화장료에 대한 피부주름개선 임상효과를 측정하였다. 40세 이상의 여성 40명 (평균연령 44.5세)을 4그룹으로 나누어 실시예, 비교예1, 2, 3을 각각 주름이 있는 눈가를 중심으로 12주간 도포(2회/일, 0.2g/회) 한 후, 숙련자의 객관적 평가와 피검자의 주관적 평가를 다음의 7등급으로 분류하여 평가함으로써 피부주름의 개선정도 (ΔW)를 측정하였다. 결과는 하기 표 8과 표 9에 나타내었다.

또 미세주름측정기인 스킨 비지오메터(Skin Visiometer SV 600 FireWire, CK Electronic GmbH)를 이용하여 피부의 주름개선 효과를 측정하였으며, 그 결과를 표 10에 나타내었다.

*피부 주름 평가 기준

매우 심하게 악화	-3
악화	-2
약간 악화	-1
변화 없음	0
약간 개선	1
개선	2
매우개선	3

*숙련자의 객관적 평가

	평균주름 개선정도(△W)
실시예	2.6
비교예1	1.5
비교예2	1.1
비교예3	0.2

*피검자의 주관적 평가

	평균주름 개선정도(△W)
실시예	2.8
비교예1	1.8
비교예2	1.7
비교예3	0.5

구분		주름개선효과
		주름의 평균깊이(%)
실시예	T0	100.0
	T12	75.5
비교예1	T0	100.0
	T12	86.5
비교예2	T0	100.0
	T12	88.6
비교예3	T0	100.0
	T12	98.1

상기 표 8, 9, 10에서 알 수 있듯이, 함초 캘러스 추출물과 라미나리아 디지타타 추출물을 함유하는 실시예의 화장료 조성물이 매우 우수한 주름 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

[실험예 8]인체 피부 첩포시험

과거력상 피부자극에 과민반응을 보인 적이 없으며, 현재 피부병 내지 피부 알러지 증상이 없는 20 ~ 40대 여성 20명을 대상으로 실시예 및 비교 실시예의 화장료 조성물에 대한 피부자극 유발 정도를 인체 피부 첩포시험을 통하여 확인해 보았다. 우선 시험부위를 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시켰다. 준비된 시험물질을 15 ㎍씩 핀 챔버(Finn chamber, 100×10, EPITEST, 핀란드국) 내에 적하시킨 후 시험대상자의 전박(forearm) 안쪽 부위에 밀폐첩포하였다. 24시간 동안 첩포하고 첩포를 제거한 후 표시펜으로 시험부위를 표시하였다. 각각 1시간 그리고 24시간 후에 확대경 (8MC-150, DAZOR, 미합중국)을 이용하여 시험 부위를 관찰한여 홍반 및 부종 유무를 관찰하였다.

피부반응은 국제접촉피부염연구회(ICDRG: International Contact Dermatitis Research Group )의 규정에 따라 판정하였으며, 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

- 피부반응의 평가 기준 및 점수 -

기 호 점수 평가 기준

- 0 무반응

± 0.5 희미한 또는 가벼운 홍반

+ 1 경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진

++ 2 뚜렷한 홍반, 구진 및 소수포

+++ 3 심한 홍반 및 대수포, 가피형성

평균피부반응도(mean score) =

(Score X No. of response X 100 X 1/2) / (3(Maximum score) X 총피검자수)

시험물질	24시간	48시간	Mean score (n=20)
	± + ++	± + ++
실시예 비교예1 비교예2 비교예3	- - - - - - - - - - - -	- - - - - - - - - - - -	0.00 0.00 0.00 0.00

상기 표 11에서 알 수 있듯이, 함초 캘러스 추출물과 라미나리아 디지타타 추출물을 함유하는 화장료 조성물(실시예)은 피부 자극 및 부작용이 없는 매우 안전한 화장료 조성물임을 확인하였다.

앞선 실험예의 결과를 근거로 하여 본 발명의 함초 캘러스 추출물과 라미나리아 디지타타 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 조성하여 제시한다. 그러나 본 발명의 조성물을 하기의 제형예들로 한정하고자 하는 것은 아니다.

[제형예 1]유연 화장수

함초 캘러스 추출물과 라미나리아 디지타타 추출물을 함유한 유연 화장수의 제형예는 다음 표 12의 조성과 같이 제조하였다.

원료	함량(중량%)
함초 캘러스 추출물	1.00
라미나리아 디지타타 추출물	1.00
1,3-부틸렌글리콜	1.00
디소듐이디티에이	0.05
알란토인	0.10
디포타슘글리시리제이트	0.05
시트릭애씨드	0.01
소듐시트레이트	0.02
글리세레스-26	1.00
알부틴	2.00
하이드로제네이티드캐스터오일	1.00
에탄올	30.00
보존제	미량
착색제	미량
착향제	미량
정제수	잔량

[제형예 2]영양 크림

함초 캘러스 추출물과 라미나리아 디지타타 추출물을 함유한 영양크림의 제형예는 다음 표 13의 조성과 같이 제조하였다.

원료	함량(중량%)
함초 캘러스 추출물	2.0
라미나리아 디지타타 추출물	2.0
1,3-부틸렌 글리콜	7.0
글리세린	1.0
D-판테놀	0.1
마그네슘알루미늄실리케이트	0.3
PEG-40 스테아레이트	1.2
스테아릭애씨드	2.0
폴리소르베이트 60	1.5
친유형글리세릴스테아레이트	2.0
소르비탄세스퀴올리에이트	1.5
세테아릴알코올	3.0
미네랄오일	4.0
스쿠알란	3.8
카르릴릭/카프릭트리글리세라이드	2.8
식물성 오일	1.8
디메치콘	0.4
디포타슘글리시리제이트	미량
알란토인	미량
소듐 히아루로네이트	미량
토코페릴아세테이트	적량
트리에탄올아민	적량
보존제	적량
착향제	적량
정제수	잔량

Claims (5)

1. 함초캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
2. 함초캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부탄력 증진용 화장료 조성물.
3. 함초캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물을 함유하는 피부보습 개선용 화장료 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 함초캘러스 추출물 및 라미나리아 디지타타 추출물은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 각각 0.01 내지 20 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 형성되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.