KR102473093B1

KR102473093B1 - 햄프씨드오일, 식물캘러스배양여과물 및 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102473093B1
Application number: KR1020200086599A
Authority: KR
Inventors: 백미정; 박현우; 이광식; 이건국
Original assignee: 주식회사 코리아나화장품
Priority date: 2020-07-14
Filing date: 2020-07-14
Publication date: 2022-12-02
Also published as: KR20220008484A

Abstract

본 발명은 햄프씨드오일, 식물캘러스배양여과물 및 펩타이드의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부상태개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화장료 조성물은 햄프씨드오일, 식물캘러스배양여과물 및 펩타이드의 혼합물을 포함하여, 우수한 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 피부 보습 개선, 피부결 개선 효과를 제공한다.

Description

햄프씨드오일, 식물캘러스배양여과물 및 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR IMPROVING SKIN CONDITION COMPRISING HEMP SEED OIL, PLANT CALLUS CULTURE FILTRATE AND PEPTIDES AS ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 햄프씨드오일(삼씨오일, Cannabis Sativa (Hemp) Seed Oil), 식물캘러스배양여과물 및 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부상태개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 우리 몸의 중요한 기관들을 보호하는 보호막 역할을 할 뿐만 아니라 수분 증발을 조절하고 외부 감염으로부터 몸을 보호하는 역할을 한다. 하지만, 아무리 외부로부터의 바이러스 침투를 막아내는 피부일지라도 과도한 자외선, 오염된 환경 등 외부로부터 받는 스트레스는 피부 자극을 유발하게 되고, 결국에는 피부 노화로 이어지게 된다.

피부는 노화가 진행되기 전에는 피부 세포의 생리활성이 활발하여 진피(dermis)에 있는 섬유아세포(fibroblast)에서는 피부의 탄력 및 주름 형성 억제에 중요한 콜라겐 (collagen)의 합성과 신진대사가 왕성하다. 또한, 피부수분 유지에 필수적인 히아루론산(hyaluronic acid)을 포함한 당단백질류인 GAGs(Glucosaminoglycans) 합성도 활발하여 피부에 탄력성, 부드러움, 유연성 및 보습성을 부여한다. 또한 표피(epidermis)에서는 기저세포(basal layer cell)의증식이 활발하고, 피부세포간의 결합을 강화시키는 라미닌, 인테그린, 데스모좀과 같 은 결합단백질(adhesion protein)의 생성이 균형적으로 이루어져 피부 세포조직을 강화시켜 건강한 피부를 유지해 준다.

그러나, 현대인의 피부는 외부의 각종 유해 환경 및 스트레스에 노출되어 다양한 손상을 받고 있고, 나이가 들면서 피부의 생리활성이 저하되고 손상된 피부의 회복속도가 느려지면서 피부는 탄력저하, 건조, 주름 형성, 칙칙함, 피부결이 거칠어지는 등의 다양한 피부노화 현상을 맞게 된다. 따라서, 화장료의 가장 큰 목표는 이런 노화 및 피부 고민의 증세를 개선하는데 있고, 이를 위한 다양한 화장료가 개발되고 있다. 근래의 주된 노화증세 개선 물질로는 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase)와 카탈레이즈(catalase) 등과 같이 프리 라디칼(free radical) 소거능이 있는 효소, 비타민E, 베타-카로틴(β-carotene), L-아스코르빈산(L-ascorbic acid) 및 글루타티온(glutathione) 등의 항산화제, 그리고 비타민 A와 알파하이드록시산(α-hydroxy acid)와 같은 섬유아세포(fibroblast) 내의 콜라겐 합성을 증진시켜서 주름을 완화시키는 것들이 있다. 위와 같은 활성산소 소거 기능의 물질들은 화장료나 의약품에 배합되어 주름 및 기타 피부 고민 및 피부 질환을 예방하기 위하여 이용되어 왔으나, 이들은 가격이 고가일 뿐만 아니라 배합 시 화학적 안정성이 좋지 못하여 실질적인 효과를 기대하기가 어려운 점이 있었다. 이러한 이유로 보다 안전하면서 효과가 높은 물질을 개발하는 것이 의약품이나 식품 분야뿐만 아니라 화장품 산업분야에서도 중요한 과제로 대두되어 많은 연구가 진행되고 있다.

한국공개특허 제2020-0053815호에서는 펩타이드와 천연복합추출물을 함유하여 피부주름 및 탄력개선 효과를 갖는 화장료 조성물을 개시한다. 또한, 한국등록특허 제10-1365262호에서는 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물을 함유하여, 피부 미백 또는 피부 주름 개선 효과를 갖는 화장료 조성물을 개시하고 있다.

본 발명은 피부 보호 작용을 하는 조성물, 즉 피부 탄력과 주름 개선과 함께, 보습 효과를 발휘하여 피부상태 개선 작용을 완벽하게 수행할 수 있는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

상기한 과제는 햄프씨드오일, 식물캘러스배양여과물 및 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부상태 개선용 화장료 조성물에 의해 달성된다.

바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 피부주름개선 효과, 피부탄력개선 효과, 피부보습 효과 또는 피부결개선 효과를 갖는다.

또한 바람직하게는, 상기 식물캘러스배양여과물은 록샘파이어 캘러스배양여과물 또는 에델바이스 캘러스배양여과물, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 펩타이드는 아세틸헥사펩타이드-8, 팔미토일펜타펩타이드-4, 팔미토일올리고펩타이드 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는다.

본 발명은 햄프씨드오일, 캘러스배양여과물 및 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부상태개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함된 햄프씨드오일(삼씨오일 : Cannabis Sativa Seed Oil, Cannabis Sativa (Hemp) Seed Oil), 식물캘러스배양여과물, 펩타이드 혼합물은 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 피부 보습,및 피부결 개선 효과가 우수하다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명은 햄프씨드오일(삼씨오일: Cannabis Sativa Seed Oil, Cannabis Sativa (Hemp) Seed Oil), 식물캘러스배양여과물 및 펩타이드 혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부상태개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 '피부상태개선'은 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 피부 보습 개선, 피부결 개선이 복합적으로 작용하여 달성이 되는 작용을 의미한다. 바람직하게는, 피부상태 개선은 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 피부 보습 개선 및 피부결 개선으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효과를 의미한다.

햄프씨드오일은 대마종자로부터 저온 압착(Cold Pressing)으로 얻어진 오일로써 필수 지방산, 비타민 A, D, E, 미네랄, 오메가 3, 오메가 6을 포함하고 있으며, 생선 오일을 제외하고 유일하게 오메가 3와 오메가 6를 공급하는 오일이다. 어떤 다른 식물성 오일보다 많은 필수 지방산을 함유하며 완벽한 3:1 의 오메가 6: 오메가3의 비율을 가지며, 천연 항산화제 비타민 E와 콜레스테롤의 흡수를 막는 스테롤이 함유되어 있다. 또한, 햄프씨드 오일은 알파리놀레산(Alpha-Linolenic Acid;ALA)과 감마리놀레산이 풍부하며, 보습과 피부연화에 훌륭한 역할을 할 뿐만 아니라, 인, 칼륨, 마그네슘, 황, 칼슘과 철, 아연 등의 미네랄도 풍부하게 함유하고 있다. 이러한 햄프씨드 오일은 콜레스테롤 농도를 낮추고, 혈관염증을 치료하며, 피를 맑게 하여 고혈압과 심장질환 및 발작을 감소시키기도 한다. 특히, 피부에 사용할 경우 보습, 피부노화방지 및 피부재생효과가 탁월하며, 아토피 피부에 사용시 가려움증을 해소할 수 있다. 상기와 같은 효능을 포함하여 보습, 항균, 항염 효과를 극대화 할 수 있다. 본 발명에서 햄프씨드 오일은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.1~5 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명에서 식물캘러스배양여과물은 록샘파이어 또는 에델바이스의 식물캘러스배양여과물일 수 있다.

록샘파이어(rock samphire, Chrithmum maritimum)는 바닷물에 영향을 받는 소금기가 많은 곳에서 자라는 식물로 염분농도가 높은 환경에 적응된 염생식물로써 해안, 자갈사이, 절벽의 갈라진 틈, 바위 등에서 발견되며, 서아시아 연안의 흑해 해변에 있는 카나이라 제도와 섬 연안에서 서생 한다. 청정 해협가의 바위틈에서 서식하는 특수한 염생 식물로 높은 염도, 자외선, 온도와 바람 등에 대한 저항성이 강한 것으로 알려져 있다. 그 효능으로는 경피 수분증발 억제, 주름 개선, 피부탄력 개선에 효과가 있다.

에델바이스(edelweiss, Gnaphali㎛ leontopodi㎛)는 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과의 여러해살이풀인 고산식물로서 높이 10-20cm이며, 전체적으로 흰 면모가 덮여 있다. 잎은 뿌리에서 비교적 많이 나오고 줄기에 약간 있으며 선형(線形)이다. 줄기 끝에 포가 모여 달려서 사방으로 퍼지고 중앙에 약간의 두상화(頭狀花)가 달린다. 에델바이스는 건조한 곳에서 잘 자라고, 유럽, 시베리아, 히말라야, 중국, 한국, 일본 및 사할린 등에 분포하지만 극지에는 없다. 미용학적으로 루테올린과 루테올린-7-글루코사이드와 같은 플라보노이드가 많아 피부 진정 효과와 항산화 작용이 있으며, 자외선을 흡수하여 피부에 자외선이 도달하는 것을 방어하는 효과가 있다.

본 발명에서 식물캘러스배양여과물은 상기 록셈파이어와 에델바이스의 꽃잎, 줄기, 잎, 씨방, 태좌, 종자, 또는 종자의 발아된 유모에서 절취된 조직을 유도시킨 캘러스일 수 있다. 바람직하게는 상기 식물캘러스배양여과물은 록샘파이어 캘러스배양여과물과 에델바이스 캘러스배양여과물의 혼합물일 수 있다.

본 발명에서 식물캘러스배양여과물은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.01~5 중량%로 포함될 수 있다. 또한 바람직하게는, 식물캘러스배양여과물은 록샘파이어 캘러스배양여과물과 에델바이스 캘러스배양여과물의 혼합물로서, 록샘파이어 캘러스배양여과물과 에델바이스 캘러스배양여과물이 1:10 내지 1:30의 중량비로 혼합될 수 있고, 보다 바람직하게는 1:20의 중량비로 혼합될 수 있다.

상기 펩타이드는 팔미토일올리고펩타이드, 팔미토일펜타펩타이드-4, 카프트리펩타이드-1, 아세틸헥사타이드-8, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

팔미토일올리고펩타이드는 생체 유사 단백질로서 상대적으로 다른 펩타이드보다 분자량이 작아 표피층 침투가 용이하고 나아가, 친유기인 팔미토일(Palmitoyl)을 포함하고 있어 피부의 표피층 침투가 더 용이하다. 또한, 팔미토일올리고펩타이드의 구조는 Palmitoyl - Glycyl - Histidyl - Lysine (Pal - Gly - is - Lys)으로서, 친수기인 아미노산기에 의해 진피층 침투가 용이하여 진피층에 존재하는 섬유아세포에 효과적으로 작용할 수 있다. 따라서 매우 낮은 농도에서도 콜라겐 합성과 진피층 세포외기질의 주 성분으로 피부의 보습에 중요한 역할을 하는 GAGs (Glycosaminoglycans)의 합성을 매우 효과적으로 증진시킨다. 본 발명에서 목적하는 효과를 얻기 위하여 상기 팔미토일올리고펩타이드는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 10^-6~ 10^-2 중량%, 바람직하게는 10^-5~ 10^-3 중량%의 양으로 함유하는 것이 좋다.

합성 팔미토일펜타펩타이드는 피부결합조직과 주름형성 및 보습과 관련하여 중요한 콜라겐 Type I의 카르복실기 말단단편(Fragment)으로써, 콜라겐을 생합성하는 세포인 섬유아세포의 세포배양에서 콜라겐 Type I과 Type III 및 세포와 세포의 접착과 관련하여 세포간 정보전달이 원활하게 되도록 도와주는 파이브로넥틴(Fibronectin)과 성장인자인 β-TGF의 합성을 촉진하였다. 합성 팔미토일펜타펩타이드의 구조는 Palmitoyl-Lysyl-Threonyl- Threonyl-Lysyl-Serine(Pal-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser)으로 Palmitoyl기(친유기)에 의해 피부의 표피층 침투가 용이하고 친수기인 아미노산기에 의해 진피층 침투가 용이하여 진피층에 존재하는 섬유아세포에 효과적으로 작용할 수 있다. 따라서 매우 낮은 농도(10^-9 ∼ 10^-12 M)에서도 콜라겐 합성과 진피층 세포외기질의 주 성분으로 피부의 보습에 중요한 역할을 하는 GAGs(Glycosaminoglycans)의 합성을 매우 효과적으로 증진시킨다.

카퍼트리펩타이드-1은 Loren Pickart 박사가 1973년 인체 내 혈장 알부민에서 분리한 트리펩타이드-1의 카퍼 복합체 성분으로, 구리이온과 3개의 아미노산(Gly-His-Lys) 복합체이다. 카퍼트리펩타이드-1은 신장, 콜라겐, 타액 및 소변에서도 발견이 되며, 포유동물에서 모낭과 모발성장 촉진, 상처치유, 피부재건, 상처회복, 간 보호 및 위벽궤양 방지에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

아세틸헥사펩타이드-8(Acetyl Hexapeptide: Acetyl Glutamyl-Glutamyl-Methyonyl-Glutaminyl-Arginyl-Arginylamide-8)는 보톡스 주사제와 동일한 기작으로 작용하여 피부의 주름을 감소시켜 준다. 일반적으로, 근육은 신경의 말단에 연결되어 있고 신경과 신경은 시냅스(Synapse)라는 접합부로 연결되어 신경전달 물질을 방출한다. 스네어 콤플렉스(SNARE(SNAP Receptor) Complex)는 VAMP, Syntaxin 및 SNAP-25라는 단백질에 의해 형성된 3중 복합체이다. 이 복합체는 신경전달물질로 채워진 베지클(Vesicle)의 신경세포외배출(Neuronal Exocytosis)을 조절하는 중 요한 막단백질(Membrane Protein)이다(A.Ferrer Montiel et al, The Journal of Biological Chemistry, 272:2634-2638(1997)). 아세틸헥사펩타이드는 SNAP-25과 구조적으로 유사한 물질로 SNAP 25와 경쟁적으로 작용하여 스네어콤플렉스의 구조를 변형시킨다. 그러면 이 콤플렉스는 신경전달물질을 효과적으로 방출하지 못하므로 근육운동이 약해지게 되어 근육운동에 의한 얼굴의 주름생성을 억제해주는 역할을 한다.

본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 펩타이드는 팔미토일올리고펩타이드, 팔미토일펜타펩타이드-4, 카프트리펩타이드-1 및 아세틸헥사타이드-8의 혼합물이고, 팔미토일올리고펩타이드, 팔미토일펜타펩타이드-4, 카프트리펩타이드-1 및 아세틸헥사타이드-8는 100~10:10~4:5~1:1의 중량비로 혼합될 수 있고, 보다 바람직하게는 40:4:2:1의 중량비로 혼합될 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에 따르면, 본 발명의 화장료 조성물은 햄프씨드오일, 식물캘러스배양여과물 및 펩타이드의 혼합물을 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.001 내지 30.0 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 10.0 중량% 함유하는 것을 특징으로 한다. 햄프씨드오일, 식물캘러스배양여과물 및 펩타이드의 혼합물의 함량이 0.001 중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 나타나지 않으며, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 피부개선 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

햄프씨드오일, 식물캘러스배양여과물 및 펩타이드의 혼합물을 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은 우수한 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 피부 보습 개선, 피부결 개선 효과를 갖는다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트리칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글라이콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글라이콜, 1,3-부틸렌글라이콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글라이콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글라이콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 다이메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일 비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.

제조예 1 - 록샘파이어캘러스배양여과물

식물 조직으로부터 탈분화된 록샘파이어 세포의 시험관내 배양 조건은 아래와 같다.

1 .일차 유합 조직(callus)의 획득

선택된 구역, 줄기, 잎 등에서 조직 절편(최소 3 ㎝)은 한 쌍의 가위를 이용하여 절단한다. 본 조작 단계에서, 모든 작업은 무균 대기 하에 무균 작업대(laminar flow hood)에서 수행된다. 식물 재료를 멸균하기 위하여, 조직은 에탄올에 30초간 담그고 용제를 제거하며, 이후 이들 조직은 3 x 100 ㎖의 무균 H2O로 씻어내고 몇 방울의 Tween 20이 첨가된 아염소산나트륨(sodium hydrochlorite)에 15분간 담그고 3 x 100 ㎖의 무균 H2O로 씻어낸다.

조직 배양을 위하여, 이들 조직 단편은 무균 페트리 접시(125 ㎜)에 집어넣고 절단하며(2 내지 3 ㎜) 아염소산나트륨으로 표백된 부분을 조심스럽게 제거한다. 이렇게 수득된 외식체는 가늘게 절개하여 아가 영양 배지에 도말하고 반쯤 묻는다. 상기 영양 배지(고형 배양 배지)의 조성은 아래 표 1과 같다.

다량원소	㎎/ℓ
KNO3	2500
(NH₄)₂SO₄	134
CaCl₂, 2H₂O	150
NaH₂PO₄, 2H₂O	300
MgSO₄, 7H₂O	250
미량원소	㎎/ℓ
MnSO₄, H₂O	16.9
ZnSO₄, 7H₂O	8.6
H3BO3	6.2
Kl	0.83
Na₂MoO₄, 2H₂O	0.25
CuSO₄, 5H₂O	0.025
FeSO4, 7H2O	27.8
비타민	㎎/ℓ
미오-이노시톨	100
니코틴산	1
칼슘-D(+)-판토테네이트	1
(+)-비오틴	0.01
피리독살 클로하이드레이트	1
티아민 디클로라이드	1
유기 화합물	g/ℓ
사카로오스	30
식물호르몬	㎎/ℓ
나프탈렌 아세트산	1.5
2,4-디클로로페녹시아세트산	0.5
키네틴	0.5
겔화제	g/ℓ
아가	9

2. 유합 조직 재식(replanting)

본 조작 단계에서, 모든 작업은 무균 대기하에 무균 작업대에서 수행된다. 유합 조직 수준에서 압설자(spatula)로 2 내지 3개의 세포 클러스터(1 내지 2 ㎝)를 채취한다. 이들 클러스터는 새로운 배지에 도말하고 분산시킨다.

3. 액체 배지에서 유합 조직 세포의 확장

- 유지 종자(maintenance seed)

이들 유합 조직 세포는 고형 아가-없는 배지와 동일한 액체 배지로 이전한다(표 1). 이들은 교반(110 rpm/min)하에 25℃ 연속 백광(3500 lux, 형광 튜브 “일광”), 250 ㎖ Erlenmeyer 플라스크에서 Erlenmeyer 플라스크당 50 ㎖의 비율로 성장 시킨다. 이들은 매 10-11일마다 1:4(즉, 100 ㎖/400 ㎖)로 희석한다.

- 건식 재료(dry material)의 생산

이들 세포는 교반(110 rpm/min)하에 25℃연속 백광(3500 lux, 형광 튜브 “일광”), 5 ℓ의 Erlenmeyer 플라스크에서 유지 종자의 1:4 희석액으로부터 Erlenmeyer 플라스크당 2ℓ배양의 비율로 12-13일간 성장시킨다. 2,4-디클로로페녹시아세트산은 완전히 대사되고 최종 산물에서 발견되지 않는다.

4. 탈분화된 록샘파이어 세포의 동결건조물의 제조

현탁액에서 액체 세포 배양액은 원심분리하여 세포를 펠리트(pellet)로 만든다. 이들 세포는 150-200 ㎛의 체에 통과시키고 냉동시키며, 이후 플레이트 동결건조기(plate lyophiliser)에서 동결건조시킨다.

제조예 2 - 에델바이스캘러스배양여과물

에델바이스(꽃잎)으로부터 캘러스를 유도하기 위하여, 꽃잎을 70%(v/v) 에탄올에 30초간 침지시키고, 2%(v/v) 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 5분 진탕하여 살균 후, 멸균수로 세척하여 표면을 소독하였다. 소독된 에델바이스 꽃잎은 날카로운 칼로 잘라서 IAA(indole-3-acetic acid) 0.5 ㎎/L, 제아틴(Zeatin) 0.2 ㎎/L의 생장조절물질과 수크로오스(Sucrose) 30 g/L, 겔라이트(Gelite) 2.0 g/L를 함유한 MS 기본배지에 접종한 후 23~27℃의 배양실에서 8주간 배양하여 캘러스를 유도하였다. 유도된 캘러스는 4주 간격으로 계대 배양하여 증식하였다.

무균적으로 계대 배양을 통하여 채취된 에델바이스캘러스는 이후, 생물반응기를 이용하여 agar를 제외한 동일한 조성의 액체 배지에서 온도 25 ℃, 습도 70 %, 공기공급량 0.1 vvm으로 일정하게 조절하며 14일 간격으로 배양 및 증식하여 대량생산하였다.

상기 생물반응기에서 대량생산된 에델바이스캘러스를 고주파 파형 발생장치를 연결하여 100 또는 400kHz로 하여 하루동안 15분 간격으로 4번 처리하고 이를 일주일 또는 이주일간 반복하였다. 상기 배지에서 일주일간 배양하며 고주파 처리된 상기 샘플은 회수한 후 60℃에서 2일 내지 5일 동안 진공 건조하였다.

건조된 캘러스 배양물 분말 10 g을 용기에 담고, 1 L의 정제수를 넣고 열수 추출하였다. 열수추출은 8~48시간 정도, 80∼100 ℃로 가열하여 진행하였다. 추출 후, mesh로 여과하여 고형분을 제거하였다.

실시예 및 비교예

실시예 및 비교예에서 햄프씨드오일(삼씨오일)(제조사: Northstar Lipids Ltd.), 록샘파이어캘러스배양여과물(제조사: BIOTECH MARINE), 에델바이스캘러스배양추출물(제조사:(주)지에프씨), 카퍼트라이펩타이드-1 (제조사: (주)인코스), 아세틸헥사펩타이드-8(제조사: LIPOTEC), 팔미토일펜타펩타이드-4 (제조사: SEDERMA), 팔미토일올리고펩타이드(제조사: SEDERMA)를 사용하였다.

아래 표 2의 조성으로 실시예 및 비교예의 로션 제형의 화장료를 제조하였다.

성분(중량%)	실시예1	비교예1	비교예2	비교예3	비교예4	비교예5	비교예6	비교예7
팔미토일올리고펩타이드	0.01	-	-	-	0.01	-	0.01	0.01
팔미토일펜타펩타이드-4	0.001	-	-	-	0.001	-	0.001	0.001
카퍼트라이펩타이드-1	0.0005	-	-	-	0.0005	-	0.0005	0.0005
삼씨오일	1	-	1	-		1		1
아세틸헥사펩타이드-8	0.00025	-	-	-	0.00025	-	0.00025	0.00025
에델바이스캘러스배양추출물	0.02	-	-	0.02	-	0.02	0.02	-
록샘파이어캘러스배양여과물	0.001	-	-	0.001	-	0.001	0.001	-
글리세린	9.269	9.269	9.269	9.269	9.269	9.269	9.269	9.269
카프릴릭/카프릭트라이글리세라이드	8	8	8	8	8	8	8	8
1,2-헥산다이올	2.0255	2.0255	2.0255	2.0255	2.0255	2.0255	2.0255	2.0255
폴리글리세릴-3메틸글루코오스다이스테아레이트	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
아데노신	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04
알지닌	0.16	0.16	0.16	0.16	0.16	0.16	0.16	0.16
글리세릴폴리메타크릴레이트	0.79	0.79	0.79	0.79	0.79	0.79	0.79	0.79
세테아릴알코올	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
부틸렌글라이콜	0.23	0.23	0.23	0.23	0.23	0.23	0.23	0.23
프로필렌글라이콜	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
카보머	0.17	0.17	0.17	0.17	0.17	0.17	0.17	0.17
잔탄검	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
폴리솔베이트20	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
카프릴릴글라이콜	0.0025	0.0025	0.0025	0.0025	0.0025	0.0025	0.0025	0.0025
다이소듐이디티에이	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
방부제, 향	미량	미량	미량	미량	미량		미량	미량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량
합계	100	100	100	100	100	100	100	100

실험예 1. 피부 탄력 개선의 임상 효과

상기 본 발명의 햄프씨드오일, 식물캘러스배양여과물 및 펩타이드 혼합물을 함유하는 화장료에 대한 피부탄력 개선 임상효과를 측정하였다. 30세 이상의 여성 20명을 대상으로 실시예 1과 비교예 1 내지 7을 상기 표 1과 같이 제형화한 후 눈가를 중심으로 왼쪽에는 실시예 1을, 오른쪽에는 비교예 1 내지 7 중 하나를 12주간 도포한 후, 피부탄력측정기(Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., 독일국)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다. 시험 결과는 표 3에 Cutometer SEM 575의 △R8 값으로 기재하였는데, 이는 피부 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.

시험 대상	피부탄력효과(△R8)
실시예 1	0.42
비교예 1	0.29
비교예 2	0.30
비교예 3	0.31
비교예 4	0.35
비교예 5	0.30
비교예 6	0.32
비교예 7	0.35

표 3의 결과에서 알 수 있듯이, 햄프씨드오일, 식물캘러스배양여과물 및 펩타이드 혼합물을 함유한 실시예 1의 피부탄력은 비교예 1에 비해 44.8% 증가했다. 이와 같은 결과를 고려할 때, 피부의 탄력이 증가된 것으로 볼 수 있다.

시험예 2: 피부 보습 개선 효과

상기 본 발명의 햄프씨드오일, 식물캘러스배양여과물, 펩타이드 혼합물을 함유하는 화장료에 대한 보습효과를 측정하였다. 25℃, 상대습도 45%, 30세 이상의 여성 40명을 대상으로 실시예 1과 비교예 1 내지 7을 각각 상기 표 2에 따라 제형화하여 팔의 상박에 하루에 3회 6주간 도포하였다. 이어, TEWAMETER TM210 (C+K electronic GmbH. 독일국)를 이용하여 경피수분손실량 즉, TEWL (Transepidermal Water Loss) 값을 시간 변화에 따른 TEWL 값 변화량 △TEWL로 측정하고, CORNEOMETER CM 820 PC (C+K electronic GmbH. 독일)를 이용하여 표피 수분량에 따른 전기전도도의 변화로 0에서 150까지 피부의 수분량을 수치화하여 보습효과를 측정하였다. 시험결과는 하기 표 4에 나타나 있다.

구분	△TEWL (g/hm²)	Corneometer Value
실시예 1	5.1	120
비교예 1	2.7	105
비교예 2	4.3	110
비교예 3	3.9	108
비교예 4	3.0	107
비교예 5	4.0	110
비교예 6	3.9	110
비교예 7	4.5	112

시험 결과, 실시예1의 △TEWL 값은 5.1 g/hm² 로 비교예1에 비해 경피 수분 손실량이 6주 후 매우 효과적으로 개선 되었음을 알 수 있다. 아울러 피부의 수분량을 측정한 Corneometer value에서도 실시예 1이 비교예 1에 비해 14.2% 증가하여 피부가 촉촉해짐을 알 수 있다.

실험예 3: 주름 개선 효과 평가

본 발명에 따른 햄프씨드오일, 식물캘러스배양여과물, 펩타이드 혼합물을 함유하는 화장료의 주름 개선 효과를 실시예 1과 비교예 1 내지 7을 사용해 테스트를 통하여 평가하였다. 240명의 30~40세 여성을 무작위로 8개군으로 나누어 실시예 1과 비교예 1 내지 7을 매일 아침, 저녁 2회씩 세안 후 크림 적당량을 눈가를 중심으로 2개월간 연속적으로 바르게 하였다. 각 피검자의 주름 개선 효과를 육안 관찰을 통하여 평가하였다. 실험 결과는 하기의 표 5에 나타낸 바와 같다.

구분	주름개선효과 우수	주름개선효과 약간	주름개선 효과 없음
실시예 1	15	12	3
비교예 1	4	7	19
비교예 2	5	7	18
비교예 3	8	10	12
비교예 4	12	14	4
비교예 5	9	12	9
비교예 6	13	13	4
비교예 7	11	9	10

표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 햄프씨드오일, 식물캘러스배양여과물, 펩타이드 혼합물이 함유된 실시예 1은 비교예1 비하여 주름개선 효과가 있음을 알 수 있으며, 본 발명의 화장료를 피부에 도포한 부분의 피검자들에서 피부 자극을 관찰할 수 없었다.

실험예 4: 자극에 의해 손상된 피부결 개선 효과 평가

본 발명에 따른 햄프씨드오일, 식물캘러스배양여과물 및 펩타이드의 혼합물을 함유하는 화장료의 피부결 개선 효과를 실시예 1과 비교예 1 내지 7을 사용하는 테스트를 통하여 평가하였다. 대상자는 20 ~ 40대 성인 20명으로 하였다. 시험부위는 전박 부위로, 연구 대상자는 시험 부위를 폼클렌징으로 세정하고 항온항습실 (22±2 ℃, 50±5% RH) 에서 20분 간 안정을 취했다. 시험 부위에 가로 x 세로 1.5x1.5 cm의 크기로 구획을 정한 후, 피부결을 측정하기 위하여 Visioscan VC98 로 R5(Arithmetic Roughness Average) 값을 측정하였다. SLS 1.0% 수용액을 Finn chamber에 적용하여 이를 시험부위에 16 시간 적용한 후 Finn c hamber를 제거하고 미온수로 시험 부위를 세정한 후 4 시간 경과 후 Visioscan VC98으로 R5 값을 측정하였다. 그 후 시험 제품을 오전, 오후 1 일 2 회 시험부위에 적용하였고 1, 2, 3주 후 측정하였다. 그 결과는 표 6 및 7에 나타내었다.

R5 측정	무도포	실시예 1	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4	비교예 5	비교예 6	비교예7
Before	7.29	7.48	7.19	7.14	7.22	7.28	7.15	7.17	7.11
SLS처리후 (0D)	8.43	8.76	8.33	8.62	8.5	8.41	8.45	8.47	8.52
7D	8.71	9.05	9.05	8.86	8.68	8.55	8.7	8.8	8.72
15D	9.1	8.33	9	8.14	8.92	8.46	8.89	8.52	8.61
21D	7.76	7.76	7.67	7.99	7.85	7.82	7.9	7.84	7.78

R5값의 감소는 피부의 평균 거칠기가 감소하고 그에 따라 피부결이 개선된 것을 의미한다. 시험 제품 도포 21일에, R5 값은 모두 도포 전에 대비하여 유의하게 감소하였다.

R5 측정	무도포	실시예 1	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4	비교예 5	비교예 6	비교예7
7D개선율 (%)	-3.32	-3.31	-8.64	-2.78	-2.12	-1.66	-2.96	-3.90	-2.35
15D개선율 (%)	-7.95	4.91	-8.04	5.57	-4.94	-0.59	-5.21	-0.59	-1.06
21D개선율 (%)	7.95	11.42	7.92	7.31	7.65	7.02	6.51	7.44	8.69

제품 도포 후 R5 값을 측정하여 피부결 개선효과를 확인한 결과를, 본 발명의 햄프씨드오일, 식물캘러스배양여과물, 펩타이드 혼합물이 함유된 실시예 1이 비교예 1내지 7과 무도포보다 우수함을 알 수 있었다. 이로써 피부결 개선의 효과를 확인할 수 있었다.

Claims

햄프씨드오일, 식물캘러스배양여과물 및 펩타이드를 유효성분으로 함유하고,
상기 식물캘러스배양여과물은 록샘파이어 캘러스배양여과물과 에델바이스 캘러스배양여과물이 1:10 내지 1:30의 중량비로 혼합된 혼합물이고,
상기 펩타이드는 팔미토일올리고펩타이드, 팔미토일펜타펩타이드-4, 카프트리펩타이드-1 및 아세틸헥사타이드-8가 100~10:10~4:5~1:1의 중량비로 혼합된 혼합물인 것을 특징으로 하는, 피부상태 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 주름개선 효과, 피부 탄력개선 효과, 피부 보습 효과 또는 피부결개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 것인 피부상태 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는, 피부상태 개선용 화장료 조성물.
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