KR101754643B1 - 리포좀에 포획된 산삼 배양근 추출물을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 리포좀에 포획된 산삼 배양근 추출물을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 항산화물질 함유량이 높은 산삼 배양근을 추출하고 리포좀으로 포획시킨 유효 성분을 포함함으로써, 자외선 등의 외부환경 스트레스에 의한 세포 손상을 방지하여 뛰어난 피부 손상 및 노화 억제 작용을 나타내는 장점이 있다.

Description

리포좀에 포획된 산삼 배양근 추출물을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법{Cosmetic composition comprising extracts of cultured wild ginseng root encapsulated in liposome and preparation method thereof}

본 발명은 리포좀에 포획된 산삼 배양근 추출물을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항산화물질 함유량이 높은 산삼 배양근을 추출하고 리포좀으로 포획시킨 유효 성분을 포함하여 뛰어난 피부손상 및 노화 억제 작용을 나타내는 피부 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

피부는 외부 환경과 직접 접해 있으면서, 물리적, 화학적 및 생물학적 자극원으로부터 인체를 보호하는 중요한 보호막 역할을 담당하므로, 다양한 외부 환경적 스트레스에 의해 세포가 손상되어 노화현상이 발생하게 된다.

사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리, 화학적인 변화가 일어난다. 그 원인으로는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 프리라디칼이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐(collagen), 히아루론산(hyaluronic acid), 엘라스틴(elastin), 프로테오글리칸(proteoglycan), 피브로넥틴(fibronectin) 등이 절단되어 심한 과다 염증반응과 피부의 탄력에 지장을 주고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

특히, 피부가 자외선에 노출되면 피부세포 손상의 주원인인 자유라디칼(free radical)과 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성된다. 이들은 DNA의 손상을 유발하고, 세포막구조를 공격하여 노화반점을 발생시키며 피부를 촉촉하고 부드러우며 유연하게 탄력을 유지시키는 교원질과 섬유질을 공격하여 노화를 촉진시키게 된다.

따라서, 피부 세포들을 자외선 등의 외부 환경으로부터 보호하고, 세포 증식능을 활성화시키며, 세포의 기능을 활성화시키기 위한 화장료 개발을 위한 연구하 활발히 진행되고 있다. 최근에는 다양한 생약 성분들에 대한 피부생리 활성을 검색하여 피부미용 효과가 우수한 물질들을 개발하여 노화 방지 등과 같은 기능성 화장품에 이용하는 사례가 급증하고 있다.

그러나, 대부분의 생약 성분들은 안정성에 문제가 있어 화장료로 적용시 저장안정성이 떨어지고, 유효성분들의 피부전달력에 한계가 있어 생약의 실질적인 효능을 기대하기 어려운 실정이다.

본 발명의 목적은 상기 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 산삼 배양근 추출물을 리포좀에 포획시킨 후 화장료에 적용함으로써, 피부 전달력을 높여 뛰어난 피부손상 및 피부노화 억제 작용을 나타내는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공함을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화장료 조성물을 제조하는 방법이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 리포좀에 포획된 산삼 배양근 추출물을 유효성분으로 포함하여 뛰어난 피부손상 및 피부노화 억제 활성을 갖는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서 이용되는 산삼은 인삼에 비해 유효성분의 함량이 많으며, 약효가 높은 것으로 알려져 있다. 배당체 성분인 사포닌(saponin)을 비롯하여, 질소함유 화합물로서 단백질, 아미노산, 핵산, 알칼로이드, 지용성분으로 지방산, 정유, 폴리아세틸렌, 페놀화합물, 파이토스테롤, 테르페노이드, 당류로서 단당류와 올리고당, 다당류, 펙틴질 그리고 비타민류와 무기질 등 매우 다양한 성분들이 함유되어 있다. 산삼의 사포닌은 약성이 온화하고 독성이 없을 뿐만 아니라 용혈작용이 거의 없고, 다른 식물에서 발견되는 사포닌과는 화학구조가 전혀 달라서 산삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 진세노사이드(Ginsenoside)라고 부른다.

본 발명에서는 산삼 배양근을 이용하는 것이 바람직한데, 이러한 산삼 배양근의 배양은 당업계에 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 식물의 일부를 모체로부터 분리하여 적당한 조건 아래에서 무균적으로 배양하여 생육시키는 것으로 조직 절편의 액체 배양, 조직 절편의 캘러스 배양, 원형질체 배양 등이 모두 가능하다. 또한, 배양된 배양근에서의 추출물의 제조는 배양근 자체를 이용하는 것이 바람직하나, 배양된 세포를 식물 또는 캘러스로 분화시켜 사용할 수도 있다. 식물 또는 캘러스로의 분화는 배양된 식물세포를 적당한 조건아래에서 분화를 유도하여 캘러스, 식물의 조직 또는 식물로 분화시키는 것으로 그 분화 조건 및 방법은 당업자에게 공지된 조건 및 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 산삼 배양근은 바람직하게는 초기재료로 자연산 산삼을 무균 상태에서 배양한 후, 산삼 뿌리 유도 과정, 유도된 산삼 뿌리의 현탁배양 과정, 소규모 생물반응기 배양 과정 및 대규모 대량 배양 과정을 거쳐 얻을 수 있다. 특히, 산삼의 항산화물질 함유량을 높이기 위해, 스테비아 추출액이 포함된 배지에서 배양시키는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 산삼 배양근의 바람직한 기관은 부정근 부위이다. 이때, 상기 배발생캘러스를 산삼 부정근으로 발달시키기 위해, 배지 내에 식물생장조절물질, 예를 들면, NAA(a-Naphtalene Acetic Acid), IAA(Indole-3-4-Acetic Acid) 등을 첨가시켜 배양시킬 수 있고, 산삼 부정근의 항산화물질 함량을 높이기 위해 배지에 스테비아 추출액을 첨가시켜 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 산삼 배양근 추출물은 특히, 진세노사이드 Rg2 성분을 높은 함량으로 포함함을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 산삼 배양근 추출물 제조는 당업계에 공지된 다양한 추출방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 유기용매 또는 물을 이용한 추출법, 초임계 추출법 등이 가능하다. 추출용매로는 물, 탄소수 1~3의 무수 또는 함수 알코올, 에틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 이들의 혼합물이 가능하며, 바람직하게는 70% 에탄올 및 1,3-부틸렌글리콜의 혼합용매이다. 추출온도는 각 재료의 유용성분의 유효활성이 제거되지 않을 정도의 온도이면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 50 내지 100℃ 정도이며, 더욱 바람직하게는 60 내지 80℃이다. 상기 추출용매는 건조된 산삼 배양근 중량 기준으로 2~40배 정도로 혼합하여 추출할 수 있으며, 에탄올 단독으로 추출하는 경우에는 20~40배, 70%에탄올 및 1,3-부틸렌글리콜의 혼합용매로 추출하는 경우에는 2~10배로 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다. 본 발명의 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 상기 산삼 배양근 추출물은 스테비아 추출액이 포함된 배지에서 배양시킨 산삼 부정근을 추출하고 리포좀에 포획시킨 후 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 상기 산삼 배양근 추출물을 리포좀에 포획시키는 과정은 인지질 및 콜레스테롤이 혼합된 지질을 건조시켜 얻은 지질막에 비드를 넣고 산삼 배양근 추출물을 첨가시켜 수화시킨 후 초음파분해시켜 작은입자크기를 갖도록 하여 이용할 수 있다.

상기 리포좀은 나노입자크기의 나노리포좀인 것이 바람직하며, 20~1000nm 크기의 리포좀일 수 있으며, 바람직하게는 50~200nm 크기일 수 있다. 또한, 상기 산삼 배양근 추출물은 리포좀 총 중량에 대하여 0.1-20중량%으로 첨가시켜 리포좀 포획시킬 수 있으며, 바람직하게는 2~10중량%이다. 첨가되는 추출물의 양이 너무 많으면 리포좀 포획 효율이 떨어지고, 너무 많으면 피부개선 효과를 기대하기 어렵다.

이러한 리포좀에 포획시켜 안정화된 산삼 배양근 추출물은 리포좀 포획과정을 거치지 않은 일반 추출물에 비해 피부손상 및 피부노화 억제 활성이 더욱 높아지게 된다.

본 발명에서 상기 리포좀에 포획된 산삼 배양근 추출물은 조성물 총 중량에 대해 0.01 내지 20 중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1~10 중량%이다. 추출물의 함량이 너무 낮으면 피부손상 및 노화 억제를 통한 피부개선효과를 기대하기 어렵고, 함량이 너무 높으면 피부가 자극될 수 있다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 유효 성분으로서 포함되는 리포좀에 포획된 산삼 배양근 추출물 외에도 화장료 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제나 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 상기 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 제조방법은 (a) 산삼 종자를 배양시켜 산삼 뿌리에서 배발생캘러스를 유도하는 단계; (b) 상기 배발생캘러스를 스테비아 추출액 함유 배지에서 배양시켜 산삼 부정근을 형성시키는 단계; (c) 상기 산삼 부정근을 추출시켜 추출물을 제조하는 단계; 및 (d) 상기 추출물을 리포좀에 포획시키는 단계;를 포함함을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 상기 리포좀에 포획된 산삼 배양근 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 피부에 영양을 공급하고, 자외선 등의 외부환경 스트레스에 의한 세포 손상 및 DNA 손상을 방지함으로써, 뛰어난 피부 손상 및 노화 억제 작용을 나타내는 장점이 있다.

도 1은 산삼 배양근 추출물의 유전 독성 감소효과 분석을 위한 MTT assay 결과이다.
도 2는 스트레스원에 대한 산삼 배양근 추출물 및 리포좀 포획된 산삼 배양근 추출물의 세포 활성 측정결과이다.
도 3은 DNA 절단 분석에 미치는 산삼 배양근 추출물 및 리포좀 포획된 산삼 배양근 추출물의 효과(DNA fragmentation assay)를 나타낸 그래프이다.
도 4 및 도 5는 RT-PCR 방법을 이용하여 산삼 배양근 추출물 및 리포좀 포획된 산삼 배양근 추출물이 p53과 GADD45의 mRNA 발현량에 미치는 효과를 분석한 그래프이다.
도 6 및 도 7은 Western blotting 방법을 이용하여 산삼 배양근 추출물 및 리포좀 포획된 산삼 배양근 추출물이 p53과 GADD45 단백질 발현에 미치는 영향을 분석한 그래프이다.
도 8은 IDB(immune dot blot) assay를 이용한 산삼 배양근 추출물 및 리포좀 포획된 산삼 배양근 추출물의 스트레스원에 의한 DNA 상해 회복의 효능 평가 결과이다.
도 9a, b는 산삼 배양근 추출물의 성분분석(HPLC) 결과이다.
도 10 산삼 배양근의 성분 중 Rg2 및 리포좀 포획된 Rg2를 세포에 처리하여 세포활성(MTT assay) 변화를 측정한 그래프이다.
도 11은 배양 세포에 자외선(200 J/m2)을 조사한 후 Rg2와 리포좀에 포획된 Rg2를 처리하여 DNA 절단 분석을 DNA fragmentation assay로 분석한 결과이다.
도 12는 배양 세포에 자외선(200 J/cm²)을 조사한 후 Rg2와 리포좀에 포획된 Rg2를 처리하여 p53과 GADD45의 발현을 RT-PCR로 분석한 결과이다.
도 13 및 도 14는 배양 세포에 자외선(200 J/m2)을 조사한 후 Rg2와 리포좀에 포획된 Rg2를 처리하여 p53과 GADD45의 단백질 발현을 Western blotting으로 분석한 결과이다.
도 15는 Rg2의 자외선에 의한 유전독성의 감소 영향 평가를 위해, DNA 회복을 확인할 수 있는 IDB (immune dot blot) assay를 이용하여 DNA 상해 회복량을 분석한 그래프이다.
도 16은 Coenzyme Q10, 산삼 배양근 추출물, 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물, Rg2, 리포좀에 포획된 Rg2에서 표피 및 진피를 포함하는 피부 잔류량을 비교한 결과이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되지는 않는다. 여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.

실시예 1. 산삼 배양근 추출물 제조

<1-1> 산삼 배양근의 최적 배양조건 확립

건강한 산삼 종자는 밝은 흰노랑색을 띠지만 보관기간이 길고 보관상태가 불량하면 검은 갈색을 띠게 된다. 검은 갈색 종자는 발아율이 저조할 뿐만 아니라 멸균한 후 배양할 경우에 오염율이 매우 높은 것으로 나타났다.

먼저, 건강한 종자를 멸균하여 종피를 제거한 후 배유내부에 있는 배축을 적출하여 절단한다. 적출된 배축 절편을 적절한 크기로 절단하여 2,4-D가 0.1-3.0 mg/L 첨가된 MS3V 한천배지에서 4주간 배양하였을 때 연노랑색의 배 발생세포가 10-20%의 절편에서 유도되었다. 배발생캘러스만을 선별하여 같은 배지에서 계대배양을 계속하면 거의 형태적으로 동일한 배발생캘러스를 얻을 수 있었다. 한편, 산삼 뿌리로부터 배발생캘러스를 얻을 수도 있었다. 통상 채취된 산삼뿌리는 건조방지를 위해 습기가 충분한 이끼류와 함께 보관한다. 이러한 보관 방법은 산삼뿌리의 표면부위가 항상 물기와 접하게 되어 여러 미생물이 번식하기 좋은 조건이 된다. 따라서 산삼 뿌리를 조직배양하기 위해 소독액으로 멸균하여도 오염률이 매우 높은 것으로 알려져 있다.

산삼 뿌리를 고농도의 소독액으로 1회 또는 수회 멸균한 후 3-5 mm 크기로 횡단면으로 절단하였다. 절단된 뿌리에서 분열능이 왕성한 형성층만을 분리ㆍ적출하였다. 적출한 형성층 을 적절한 크기로 절단하여 2,4-D가 0.1-3.0 mg/L 첨가된 MS3V 한천배지에서 4주간 배양하였을 때 연노랑색의 배발생세포가 10-20%의 절편에서 유도되었다. 배발생캘러스만을 선별하여 같은 배지에서 계대배양을 계속하면 거의 형태적으로 동일한 배발생캘러스를 얻을 수 있었다. 이렇게 산삼의 종자 또는 뿌리에서 유래된 배발생캘러스를 생장조절물질이 첨가되지 않은 MS 한천 또는 액체배지에 넣어 빛이 있는 조건에서 배양하면 배발생캘러스는 녹색의 유식물체로 발달하였다. 한편, 이들 배 발생캘러스를 식물생장조절물질인 NAA, IAA 또는 IBA가 0.5-6.0 mg/L 첨가된 1/2 또는 1/4 MS3V 한천 또는 액체배지에서 배양하면 부정근이 발달하였다. 항산화 물질 고함유한 산삼 배양근의 생산을 위해 스테비아 추출액을 배지에 첨가하여 배양기간별 산삼 배양근 생장량 조사 : 스테비아 추출물 함유량에 의한 배지 성분의 변화에 기존 산삼 배양근 생산기간을 1-2주 정도 단축하였다.

<1-2> 다양한 산삼 배양근 추출물 확보

산삼 배양근 추출에 사용되는 용매는 에탄올을 단독으로 사용할 수 있었으며, 에탄올과 1,3-부틸렌 글리콜의 혼합물, 또는 에탄올과 프로필렌 글리콜의 혼합물을 사용기도 하였다. 에탄올을 단독으로 사용하는 경우, 사용되는 에탄올의 양은 건조된 산삼 부정근 중량의 10 내지 40배 정도의 양을 사용하였으며, 에탄올 농도는 약 70~95% 정도가 적합하였다. 또한, 에탄올과 1,3-부틸렌 글리콜의 혼합물, 또는 에탄올과 프로필렌 글리콜의 혼합물을 사용하는 경우, 70% 농도의 에탄올과 산삼 부정근 중량의 약 2 내지 10배의 1,3-부틸렌 글리콜 또는 프로필렌글리콜을 사용하는 것이 적합하였다.

<1-3> 산삼 배양근 추출물의 유전 독성 감소효과 분석

상기 산삼 배양근 추출물의 세포활성(MTT assay) 측정을 통해 유전독성 감소효과를 분석하였다. 구체적으로, 산삼 배양근 추출물이 배양세포인 HaCaT (Human skin keratinocyte cell)에 각각 추출 용매에 따른 산삼 배양근 추출물을 24시간과 48시간 동안 처리하여 살아있는 세포내 미토콘드리아의 reductase에 의해 formazan의 형성으로 세포 활성률을 분석한 결과 산삼 배양근 추출물 자체만 처리하였을 경우는 추출물을 처리하지 않은 대조군과 별다른 세포 활성률의 변화를 보이지 않았음을 관찰하였다.

산삼 배양근 추출물의 경우 모든 농도에서 세포 독성이 나타나지 않았다(도 1). 이상의 결과에서 산삼 배양근 추출물은 스트레스원에 대한 세포 활성 및 DNA 상해 회복 효능을 평가하는데 이용할 수 있음을 확인하였다.

추출 용매를 다르게 선택하여 세포 활성을 비교한 결과, 열수 및 클로르포름 을 이용한 산삼 배양근 추출물의 경우에는 약 5% 정도 세포 활성이 감소했지만 에탄올 추출물의 경우에는 증가하는 경향을 나타냈다. 또한 에탄올 50%에서보다 95%로 추출한 산삼 배양근의 경우 세포 활성이 더 높게 나타났다. 이하, 시험예에서는 에탄올 95%로 추출한 산삼 배양근을 사용하였다.

실시예 2. 산삼 배양근 추출물의 리포좀 포획

상기 실시예 1에서 제조된 산삼 배양근 추출물(95%에탄올 용매)을 리포좀에 포획시켰다.

구체적으로 산삼 배양근 추출물의 유효성분을 리포좀에 포획하기 위하여 36mg의 지질(phospholipid : cholesterol = 15 :３)을 용매에 녹인 후 질소가스로 휘발시켜 지질막을 형성시켰다. 형성된 지질막에 bead를 지질양의 1/5이 되도록 넣고 bead에 지질이 잘 묻도록 흔들어 준 후 50 μg/ml이 되도록 산삼 배양근을, 50 μM 이 되도록 Rg2를 넣어 수화하였다. 이렇게 형성된 리포좀을 얼음에 넣고 일정 시간 sonication을 하며 single unilamella vesicle이 형성되었고, 다시 freezing과 drying을 반복하면서 large unilamella vesicles를 형성시켰다.

시험예 1. 산삼 배양근 추출물의 스트레스원에 대한 세포 영향 평가

<1-1> 스트레스원에 대한 세포 활성 측정

산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물이 자외선 B (Ultraviolet-B, UVB)에 의한 세포 활성의 감소에 방어 효과를 보임은 배양세포인 HaCaT 세포를 이용하여 스크리닝함으로써 규명하였다.

구체적으로, 배양세포에 자외선 B (200 J/m²)을 조사한 후 24시간 동안 산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물을 처리하여 세포 활성률을 분석한 결과, 산삼 배양근 추출물 자체만 처리하였을 경우는 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 약 5% 정도 증가하였다. 그러나 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물의 경우에는 농도 의존적으로 점차 증가하여 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 약 20% 정도 증가하였다. 자외선 B를 조사한 후 산삼 배양근의 추출물을 처리한 경우에는 자외선에 의한 세포 활성의 저해로부터 점차 회복되어 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 약 18% 정도 증가하였다. 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물의 경우에는 상대적인 고농도에서 약 25% 정도 증가하여 추출물 상태로 처리했을 때보다 약 7% 정도 높게 나타났다(도 2).

도 2에서 보듯이, 세포의 독성에 대한 산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물의 세포 활성에 미치는 영향을 농도와 시간 의존적으로 확인하였다. 추출물을 처리하지 않은 대조군은 시간 의존적으로 24시간 동안 약 5% 정도의 세포 증식을 증가시키는 효과를 나타냈으나 산삼 배양근 추출물을 처리한 경우에는 약 10%, 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물의 경우에는 약 17% 정도 세포 증식 효과를 나타났다.

또한, 자외선 B를 조사한 후 정상 배지, 산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한 삼 배양근 추출물을 처리한 결과, UVB에 의해 감소된 세포의 활성이 정상 배지를 처리한 경우에는 24시간 동안 약 10% 정도, 산삼 배양근 추출물의 경우에는 약 15%, 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물의 경우에는 약 20% 정도의 증식을 회복하는 효과가 나타났다. 이는 산삼 배양근 추출물이 세포 활성 뿐만 아니라 증식에도 효과가 있음을 확인할 수 있었으며, 추출물 상태보다는 리포좀에 포획한 상태로 처리할 경우 자외선으로부터 보호되는 효과가 더 크게 나타났다.

<1-2> 스트레스원에 의한 세포 독성 (Trypan blue excusion assay)

여러 산삼 배양근 추출물이 자외선 B에 의한 유전독성의 감소에 효과를 보임은 배양세포인 HaCaT 세포를 이용하여 스크리닝함으로써 규명하였다. 배양세포에 자외선 B를 조사한 후 24시간 동안 산삼 배양근 추출물을 처리하여 trypan blue 흡입율로 세포 생존률을 분석한 결과, 산삼 배양근 추출물 자체만 처리하였을 경우는 자외선을 조사하지 않은 대조군과 별다른 세포 생존률의 증가를 보이지 않으나, 자외선 조사 후 처리된 산삼 배양근 추출물은 자외선에 의한 세포 생존률의 저하를 거의 대조군 수준으로 회복할 수 있는 능력이 있음을 관찰하였다(표 1).

표 1에서 보듯이, 세포의 독성에 대한 산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물의 효능을 확인한 결과 추출물만 처리한 대조군에서는 상대적인 고농도에서도 독성을 나타나지 않았다.

자외선 B를 조사한 후 산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물을 처리한 결과 상대적으로 저농도에서는 대조군과 별 차이가 없었지만 고농도에서는 각각 약 29%, 34% 정도의 상해를 회복하는 효과가 나타났다.

<1-3> 스트레스원에 의한 비주기성 DNA 합성(UDS) 정도 평가

산삼 배양근 추출물이 자외선 B에 의한 유전독성의 감소에 기여하는 것으로 생각되어 DNA 회복을 측정할 수 있는 비주기성 DNA 합성을 수행하였다. 자외선을 처리 후 48시간 경과될 경우 자외선 상해에 대한 DNA 회복은 거의 다 진행되어 비주기성 DNA 합성으로 표현되지 않으므로 우선 산삼 배양근 추출물을 먼저 48시간 동안 처리한 후 자외선 상해를 조사하여 비주기성 DNA 합성을 분석하였다. 표3에 제시된 바와 같이 산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물 모두 자외선에 의한 비주기성 DNA 합성을 매우 효과적으로 향상시켰다.

표 2에서 보듯이, DNA 상해 회복 효능에 대해서 확인하기 위해 산삼 배양근을 다양한 농도에서 DNA 상해 회복 효능에 대해서 확인하였다. 그 결과 산삼 배양근 추출물을 처리한 경우에는 상대적인 고농도 (200 μg/ml)에서 약 66% 정도 DNA 상해 회복이 증가하는 효과를 관찰하였다. 그러나 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물을 처리한 경우에는 약 78%를 증가하는 효과로, 리포좀에 포획한 경우에는 세포활성 뿐만 아니라 상해원에 대한 회복 효과도 추출물보다는 높게 나타났다.

<1-4> 스트레스원에 의한 DNA 상해 회복 유전자 발현

(1) DNA 절단 분석에 미치는 추출물의 효과 (DNA fragmentation assay)

배양 세포에 자외선 B을 조사한 후 산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한 산삼 배양근을 처리하여 DNA 절단 분석을 DNA fragmentation assay로 분석하였다. 자외선 B를 처리한 세포에서 세포 고사에 의한 DNA fragmentation을 의미하는 DNA ladder가 유도되지는 확인하였다. 자외선을 처리하지 않고 산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물을 확인한 결과 DNA ladder가 거의 관찰되지 않았다. 그러나 자외선을 처리하고 추출물들을 처리한 결과 자외선에 의해 증가되었던 DNA ladder들이 농도 의존적으로 점차 감소하는 것이 관찰되었다(도 3).

(2) mRNA 발현에 미치는 추출물의 효과 (RT-PCR)

배양 세포에 자외선 B (200 J/m2)을 조사한 후 산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한 산삼 배양근을 처리하여 p53과 GADD45의 발현을 RT-PCR로 분석하였다. 발현 수준의 변화는 RT-PCR 산물의 양적 수준에 대한 densitometric scan 결과의 상대적 비율을 구하여 도표화하였다. 그 결과 산삼 배양근 추출물만 처리한 결과 mRNA와 단백질의 발현량은 농도의존적인 형태를 나타내지 않았다. 자외선을 조사한 후 산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물을 처리한 결과 p53과 GADD45의 mRNA 발현량은 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소하는 것을 확인하였다.

배양 세포에 자외선을 조사한 후 산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물을 처리한 결과 p53과 GADD45의 mRNA 발현량은 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소하였다. 그러나 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물을 처리한 경우가 p53과 GADD45의 mRNA 발현량이 산삼 배양근 추출물을 처리한 경우보다 더 감소한 정도가 높게 나타났다(도 4).

정상배지, 산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물을 처리하여 각 시간 별로 p53과 GADD45의 mRNA 발현량을 확인하였다. 그 결과 정상배지를 처리한 경우에는 p53과 GADD45의 발현량이 시간 의존적으로 점차 증가하다 각각 9시간, 12시간 부터 감소하였다. 산삼 배양근 추출물의 경우에는 p53의 발현량은 3시간부터 점차 감소하였으며, GADD45의 발현량은 9시간부터 점차 감소하였다. 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물의 경우에는 p53과 GADD45의 발현량이 3시간부터 점차 감소하였다.

자외선 B를 조사한 후 정상배지, 산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물을 처리하여 각 시간 별로 p53과 GADD45의 mRNA 발현량을 확인하였다. 그 결과 정상배지를 처리한 경우에는 p53과 GADD45의 발현량이 시간 의존적으로 점차 증가하다 각각 9시간, 18시간부터 점차 감소하였다. 산삼 배양근 추출물의 경우에는 p53의 발현량은 6시간부터 점차 감소하였으며, GADD45의 발현량은 12시간부터 점차 감소하였다. 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물의 경우에는 p53과 GADD45의 발현량이 각각 3시간, 9시간부터 점차 감소하는 것을 확인하였다.

자외선 B를 조사한 후 일정 시간동안 상해를 회복하고자 이에 관여하는 p53의 유전자 발현량이 증가하여 상해를 회복시키다 점차 감소하는 것으로 알 수가 있었다. 정상 배지보다 감소하는 시점이 점차 빨라지는 것으로 보아 산삼 배양근이 상해 회복을 증진시키는 것을 알 수 있었다. 산삼 배양근 추출물을 처리했을 때보다는 리포좀에 포획하여 처리했을 때 그 효과는 더욱 증가되었다. 증가되었던 p53과 GADD45의 발현량이 24시간이 경과된 후 정상 배지보다 낮게 나타난 것으로 보아 산삼 배양근 추출물이 정상 배지에 비해 상해를 회복시키는 효능이 더 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다(도 5).

(3) 단백질 발현에 미치는 추출물의 효과(Western blot)

배양 세포에 자외선(200 J/m2)을 조사한 후 산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한산삼 배양근 추출물을 처리하여 p53 과 GADD45의 단백질 발현을 Western blotting으로 분석하였다. 발현 수준의 변화는 Western blotting 산물의 양적 수준에 대한 densitometric scan 결과의 상대적 비율을 구하여 도표화하였다. 자외선을 조사한 후 추출물을 처리한 결과 p53과 GADD45의 단백질 발현량은 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 점차 감소하는 것을 확인하였다(도 6).

배양 세포에 자외선을 조사한 후 산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물을 처리한 결과 p53과 GADD45의 단백질 발현량은 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소하였다. 그러나 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물을 처리한 경우가 p53과 GADD45의 단백질 발현량이 산삼 배양근 추출물을 처리한 경우보다 더 감소한 정도가 높게 나타났다(도 6).

p53 단백질은 세포핵에 존재하는 단백질로 DNA에 결합하여 세포 주기 중 G1-S phase check point로 손상 DNA를 복구하거나, 손상 DNA를 고사 시켜 세포 증식을 억제하는 암 억제 유전자로 알려져 있는 단백질이다. 본 연구 결과를 토대로 스트레스에 대한 회복에 관여하는 유전자 p53과 GADD45의 발현량이 정상대조군에 비해 점차 감소하는 것으로 DNA 상해원으로부터 받은 자외선 B에 대한 회복 효과를 확인하였다. 그러나 산삼 배양근 추출물보다 리포좀에 포획한 산삼 배양근이 더 감소하는 것으로 보아 세포핵에 산삼 배양근 추출물이 리포좀으로 포획했을 경우가 좀 더 용이하게 전달할 수 있을 것으로 보여진다(도 7).

<1-5> 스트레스원에 의한 DNA 상해 회복의 효능 평가 (CPD)

산삼 배양근 추출물이 자외선에 의한 유전독성의 감소에 기여하는 것으로 생각되어 DNA 회복을 확인할 수 있는 IDB (immune dot blot) assay를 이용하여 DNA 상해 회복량을 확인하였다. 자외선을 처리 후 24시간 경과될 경우 자외선 상해에 대한 DNA 회복은 거의 다 진행되어 CPD (Cyclobutane Pyrimidine Dimers)의 양을 IDB assay로 분석하였다(도 8). 그림 6과 7에 제시된 바와 같이 산삼 배양근 추출물은 자외선에 대한 회복 효과를 효과적으로 향상시킴을 관찰하였다.

CPDs (Cyclobutane pyrimidine dimers)는 UV에 의해 손상된 DNA가 갖는 구조이다. 티민(Thymine) 이 연속된 서열에 UV가 가해지면 CPDs가 형성된다. 산삼 배양근 추출물을 처리했을 때 정상대조군에 비해 CPDs가 점차 감소하는 것은 산삼 배양근 추출물이 DNA 상해원 (UV)의해 손상된 DNA를 대한 회복시키는 효과를 나타낸다. 그러나 산삼 배양근 추출물보다 리포좀에 포획한 산삼 배양근이 더 감소하는 것으로 보아 산삼 배양근 추출물이 리포좀에 포획했을 경우가 세포 내에 산삼 배양근이 더 용이하게 유입되어 전달할 수 있음을 보여준다(도 8).

시험예 2. 산삼 배양근 추출물 및 Rg2 성분의 세포 영향 평가

<2-1> 산삼 배양근의 성분분석

산삼 배양근의 일반적인 성분은 아래 표 3과 4과 같이 분석되었다. 상대적으로 높은 탄수화물의 비율을 관찰할 수 있었다. 산삼 배양근의 무기질 및 중금속 함량을 분석한 결과 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 그리고 인의 비율이 높게 나타났다. 또한 납이나 수은등 해로운 중금속은 검출되지 않았다.

* 산삼 배양근의 일반적인 성분(3번 반복치) (단위 : 습물기준 %)
수 분	조 회 분	조 지 방	총 질 소	조 단백질	조 섬 유	탄수화물
11.41	6.82	1.25	3.27	20.43	7.23	52.86

* 산삼 배양근의 무기질 및 중금속 함량 분석 결과(3번 반복치) (단위 : mg/습물100 g)
칼슘	마그네슘	나트륨	칼륨	인	철	구리	아연	납	수은
516.04	218.72	22.36	416.12	224.28	13.79	0.45	7.19	ND	ND

산삼 배양근 추출물에 대한 유용성분 분석 : 산삼 배양근(위)과 재배 인삼(아래)의 HPLC 분석 비교분석 결과 산삼에서는 재배 인삼에 비해 성분의 종류가 유사하지만, Rg3 함량의 증가가 현저하였고 Rg2 함량도 다소 높이 포함되었다(도 9a, b).

<2-2> 세포활성(MTT assay) 평가

산삼 배양근의 성분 중 Rg2를 배양세포인 HaCaT (Human skin keratinocyte cell) 세포활성에 변화가 없음을 규명하였다. 배양세포에 Rg2를 24시간 동안 처리하여 살아있는 세포내 미토콘드리아의 reductase에 의해 formazan의 형성으로 세포 활성률을 분석한 결과 Rg2만 처리하였을 경우는 모든 농도에서 세포 독성이 나타나지 않았다. 이상의 결과에서 스트레스원에 대한 세포 활성 및 DNA 상해 회복 효능을 평가하였다. Rg2와 리포좀에 포획한 Rg2를 자외선 B에 의한 세포 활성의 감소에 효과를 보임은 배양세포인 HaCaT 세포를 이용하여 스크리닝함으로써 규명하였다. 배양세포에 자외선 B (200 J/m2)을 조사한 후 24시간 동안 Rg2과 리포좀에 포획한 Rg2를 처리하여 세포 활성률을 분석한 결과, 자외선에 의한 저하된 세포활성을 점차 증가시켜 Rg2를 처리하지 않은 대조군에 비해 약 20% 정도 증가하였다. 리포좀에 포획한 Rg2의 경우에는 상대적인 고농도에서 약 25% 정도 증가하여 추출물 상태로 처리했을 때보다 약 5% 정도 높게 나타났다(도 10).

<2-3> 스트레스원에 대한 세포 독성 실험 (Trypan Blue excusion)

Rg2 추출물이 자외선 B에 의한 유전독성의 감소에 효과를 보임은 배양세포인 HaCaT 세포를 이용하여 스크리닝함으로써 규명하였다. 배양세포에 자외선 B를 조사한 후 24시간 동안 Rg2을 처리하여 trypan blue 흡입율로 세포 생존률을 분석한 결과, Rg2 자체만 처리하였을 경우는 자외선을 조사하지 않은 대조군과 별다른 세포 생존률의 증가를 보이지 않으나, 자외선 조사 후 처리된 Rg2와 리포좀에 포획한 Rg2은 자외선에 의한 세포 생존률의 저하를 각각 약 35%, 40% 수준으로 회복하였다 (표 5).

세포의 독성에 대한 Rg2과 리포좀에 포획한 Rg2의 효능을 확인한 결과 추출물만 처리한 대조군에서는 상대적인 고농도에서도 독성을 나타나지 않았다.

자외선 B를 조사한 후 Rg2와 리포좀에 포획한 Rg2을 처리한 결과 상대적으로 저농도에서는 대조군과 별 차이가 없었지만 고농도에서는 각각 약 34%, 39% 정도의 상해를 회복하는 효과를 나타냈다.

<2-4> 스트레스원에 의한 비주기성 DNA 합성 (UDS)

Rg2가 자외선에 의한 유전독성의 감소에 기여하는 것으로 생각되어 DNA 회복을 측정할 수 있는 비주기성 DNA 합성을 수행하였다. 자외선을 처리 후 48시간 경과될 경우 자외선 상해에 대한 DNA 회복은 거의 다 진행되어 비주기성 DNA 합성으로 표현되지 않으므로 Rg2을 먼저 48시간 동안 처리한 후 자외선 상해를 조사하여 비주기성 DNA 합성을 분석하였다. 표4에 제시된 바와 같이 Rg2와 리포좀에 포획한 Rg2를 모두 자외선에 의한 비주기성 DNA 합성을 매우 효과적으로 향상 시켰다.

DNA 상해 회복 효능에 대해서 확인한 결과 Rg2을 처리한 경우에는 상대적인 고농도 (200 uM)에서 약 75% 정도 DNA 상해 회복이 증가시켰다. 또한 리포좀에 포획한 Rg2를 처리한 경우에는 약 81%를 증가하는 효과로 리포좀에 포획한 경우에는 세포활성 뿐만 아니라 상해원에 대한 회복 효과도 추출물보다는 높게 나타났다.

<2-5> 스트레스원에 의한 DNA 상해 회복 유전자 발현

(1) DNA 절단 분석에 미치는 추출물의 효과 (DNA fragmentation assay)

배양 세포에 자외선(200 J/m2)을 조사한 후 Rg2와 리포좀에 포획한 Rg2를 처리하여 DNA 절단 분석을 DNA fragmentation assay로 분석하였다. 자외선 B를 처리한 세포에서 세포 고사에 의한 DNA fragmentation을 의미하는 DNA ladder가 유도되는지 확인하였다. 자외선을 처리하지 않고 Rg2와 리포좀에 포획한 Rg2를 확인한 결과 DNA ladder가 거의 관찰되지 않았다. 그러나 자외선을 처리하고 Rg2를 처리한 결과 자외선에 의해 증가되었던 DNA ladder들이 농도 의존적으로 점차 감소하였다 (도 11).

(2) mRNA 발현에 미치는 추출물의 효과 (RT-PCR)

배양 세포에 자외선(200 J/cm²)을 조사한 후 Rg2와 리포좀에 포획한 Rg2를 처리하여 p53과 GADD45의 발현을 RT-PCR로 분석하였다. 발현 수준의 변화는 RT-PCR 산물의 양적 수준에 대한 densitometric scan 결과의 상대적 비율을 구하여 도표화하였다. 자외선을 조사한 후 Rg2와 리포좀에 포획한 Rg2를 처리한 결과 p53과 GADD45의 mRNA 발현량은 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소하였다(도 12).

(3) 단백질 발현에 미치는 추출물의 효과 (Western blot)

배양 세포에 자외선(200 J/m2)을 조사한 후 Rg2와 리포좀에 포획한 Rg2를 처리하여 p53과 GADD45의 단백질 발현을 Western blotting으로 분석하였다. 발현 수준의 변화는 Western blotting 산물의 양적 수준에 대한 densitometric scan 결과의 상대적 비율을 구하여 도표화하였다. 자외선을 조사한 후 추출물을 처리한 결과 p53과 GADD45의 단백질 발현량은 Rg2를 처리하지 않은 대조군에 비해 점차 감소하였다. 또한 리포좀에 포획한 Rg2를 처리한 경우가 p53과 GADD45의 단백질 발현량이 Rg2를 처리한 경우보다 더 감소한 정도가 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다(도 13).

자외선 B를 조사한 후 Rg2와 리포좀에 포획한 Rg2를 처리하여 각 시간 별로 p53과 GADD45의 단백질 발현량을 확인하였다. 그 결과 Rg2의 경우에는 p53의 발현량은 3시간부터 점차 감소하였으며, GADD45의 발현량은 9시간부터 점차 감소하였다. 리포좀에 포획한 Rg2의 경우에는 p53과 GADD45의 발현량이 각각 6시간, 9시간부터 점차 감소하였다(도 14).

UVB를 조사한 후 일정 시간동안 상해를 회복하고자 이에 관여하는 p53의 유전자 발현량이 증가하여 상해를 회복시키다 점차 감소하였다. 정상 배지보다 감소하는 시점이 점차 빨라지는 것으로 보아 Rg2가 상해 회복을 증진시키는 것을 알 수 있었다. Rg2를 처리했을 때보다는 리포좀에 포획하여 처리했을 때는 감소하는 시점에는 차이가 없었으나 발현량의 정도로 그 효과는 더욱 증가되는 것을 알 수가 있었다. 증가되었던 p53과 GADD45의 발현량이 24시간이 경과된 후 정상 배지보다 낮게 나타난 것으로 보아 Rg2가 정상 배지에 비해 상해를 회복시키는 효능이 더 높게 나타난 것을 확인하였다(도 14).

<2-6> 스트레스원에 의한 DNA 상해 회복의 효능 평가 (CPD)

Rg2가 자외선에 의한 유전독성의 감소에 기여하는 것으로 생각되어 DNA 회복을 확인할 수 있는 IDB (immune dot blot) assay를 이용하여 DNA 상해 회복량을 확인하였다. 자외선을 처리 후 24시간 경과될 경우 자외선 상해에 대한 DNA 회복은 거의 다 진행되어 CPD (Cyclobutane Pyrimidine Dimers)의 양을 IDB assay로 분석하였다(도 15). 도 13과 14에 제시된 바와 같이 Rg2는 자외선에 대한 회복 효과를 효과적으로 향상시켰다.

CPDs (Cyclobutane pyrimidine dimers)는 UV에 의해 손상된 DNA가 갖는 구조이다. 티민(Thymine) 이 연속된 서열에 UV가 가해지면 CPDs가 형성된다. Rg2를 처리했을 때 정상대조군에 비해 CPDs가 점차 감소하는 것은 Rg2가 DNA 상해원 (UV)의해 손상된 DNA를 대한 회복시키는 효과를 나타낸다. 그러나 Rg2보다 리포좀에 포획한 Rg2가 세포 내에 더 용이하게 유입되어 전달할 수 있음을 보여준다(도 15).

시험예 3. 산삼 배양근 추출물의 피부 영향 평가

<3-1> UVB 조사에 따른 피부조직의 산화

UVB에 대한 산화 민감도를 증가시키기 위해 비타민 E가 결핍된 식이를 14주간 섭취시킨 ICR mouse의 피부 조직을 1.15% KCl 용액으로 10배 희석하여 homogenizer로 균질화 시킨 뒤 800×g, 10분간 원심 분리한 상층액을 Petridish에 균일한 두께로 담아 자외선을 조사하였다. 첨가된 산삼 배양근 추출물과 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물은 5-50μg/ml, Rg2와 리포좀에 포획한 Rg2는 5-50μM이 되도록 첨가하였으며, 대조군에는 증류수를, 비교산화제는 ascorbic acid을 동일한 농도로 첨가하였다. 추출물 및 Rg2의 산화 저해율은 다음의 수학식에 맞춰 계산하였다.

자외선 B에 피부를 강하게 노출시키면 산소에 에너지가 전달되어 다양한 활성산소종이 생성되며, 이들 활성산소종은 광독성, 광노화, DNA 손상 및 피부암, 피부염을 발생시킨다. 따라서 Hydroxyl radical에 대한 산삼 배양근 추출물과 Rg2의 소거능을 조사하였다. 그 결과 산삼 배양근 추출물의 소거능은 50 μg/ml에서 41.2%를 나타냈으며, 리포좀으로 포획한 산삼 배양근 추출물의 경우 51%를 나타냈다. Rg2의 소거능은 50 μM에서 58%, 리포좀으로 포획한 Rg2의 경우에는 74%를 나타냈다(표 7). 이는 UVB와 같은 스트레스를 받았을 때 산삼 배양근과 Rg2에 의해 회복하는 효과가 있음을 알 수 있다.

<3-2> 피부 반응 실험

피부반응 실험은 산삼 배양근 추출물이 피부에 닿았을 때 나타나는 염증이나 알레르기 반응을 확인하는 실험으로 지원자의 손목에 추출물을 다양한 농도로 바르고 24시간 이상경과 시의 이상 반응을 시간 경과에 따라 육안으로 관찰하며 통증 등에 대해 설문하였다. 실험 결과 설문 및 육안 관찰에서 모든 추출물의 200 μg/ml 까지 이르는 농도에서 피부에 거부 반응이 일어나지 않았다. 다음 제시한 결과들은 시간 경과 시 아무런 장애가 일어나지 않았음을 보여주며 그 후 관찰을 지속하였을 경우에도 아무런 장애가 발생하지 않았다(표 8).

실험군 ＼농도(㎍/ml)	피 부 반 응
	0	5	25	50	100	200
증류수	-
extract	-	-	-	-	-	-
liposomal extract	-	-	-	-	-	-
Rg2	-	-	-	-	-	-
liposomal Rg2	-	-	-	-	-	-
* - : no + : slight (~49%) ++ : moderate (50~79%) +++ : heavy (80~99%)

<3-3> 피부투과도 실험

in vitro에서 마우스에 대한 피부 투과 실험은 Franz 확산 cell 형태의 수평막 cell을 이용하여 실험을 하였으며 막으로서 마우스의 피부를 적출하여 사용하였다. 마우스의 피부 적출은 고압 증기 멸균 처리한 수술 도구를 사용하였으며 에테르를 사용하여 질식사 즉시 표피를 1.5 × 1.5 cm로 피부를 적출하여 피하지방 및 혈관 등을 제거하였다. 적출한 마우스의 피부를 즉시 수평막 cell 중앙에 고정시킨 후 투과 실험을 실시하였다. 시험액은 pH7.4 PBS를 사용하였다. franze modified diffusion cell에 무모마우스 피부를 장착하고 Rg2와 리포좀에 포획한 Rg2를 바른 후 채취시간마다 medium 100μl씩을 채취하고 새로운 시험액을 동량 보충하였다. 시험액은 37℃±0.2℃를 유지하도록 하였으며 cell 내의 교반속도는 600rpm으로 고정하였다. 피부의 단위 면적당 통과한 주성분의 양을 시간에 대한 함수로 나타낸 후 다음의 식을 이용하여 투과 파라메터들을 구하였다.

J_s : 평행 상태에서의 투과 속도(㎍/cm²/hr)

A : 투과가 일어나는 피부의 면적 (cm²)

(dQ/dt)_ss : 평행 상태에서의 단위 시간당 피부를 통과하는 약물의 양(㎍/hr)

C : 제제중의 약물 농도 (㎍/mL)

K : 약물의 분배계수 (피부/기제)

h : 피부의 두께 (cm)

D : 피부를 통한 Rg2의 확산 계수 (cm²/hr)

T_L : lag time (hr)

Coenzyme Q10, 산삼 배양근 추출물, 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물, Rg2, 리포좀에 포획한 Rg2를 Franz modified diffusion cell에 장착된 무모마우스 피부에 도포한 후 시간별로 투과된 양을 측정한 결과 7시간 후에 coenzyme Q10의 경우 32.18±2.2 μg/cm²이 투과되었다. 산삼 배양근 추출물의 경우에는 10.21±2.1 μg/cm², 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물의 경우에는 11.84±1.8 μg/cm², Rg2의 경우에는 12.87±2.3 μg/cm², 리포좀에 포획한 Rg2의 경우에는 14.03±0.9 μg/cm²이 투과되었다(표 9). 위의 결과로 산삼 배양근 추출물과 Rg2가 지표물질인 coenzyme Q10보다는 투과율이 낮게 나타났으나 약 20% 정도의 투과율을 나타냈다. 또한 리포좀에 포획한 경우가 더 높은 투과율을 나타냈다.

Coenzyme Q10, 산삼 배양근 추출물, 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물, Rg2, 리포좀에 포획한 Rg2을 평행상태에서의 lag time을 비교해보면 coenzyme Q10의 경우 0.15±0.14시간, 산삼 배양근 추출물의 경우에는 0.05±0.08 시간, 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물의 경우에는 0.07±0.06, Rg2의 경우에는 0.07±0.05, 리포좀에 포획한 Rg2의 경우에는 0.09±0.12시간으로 리포좀에 포획한 경우가 더 높은 수치를 나타내었다. 위의 결과를 토대로 추출물 상태보다는 Rg2의 상태가 피부 투과량이 더 높게 나타냈으며 리포좀에 포획한 경우가 투과량이 더 높게 나타났다.

<3-4> 피부잔류량 실험

피부투과실험 직후에 피부상에 잔류되어 있는 Rg2와 리포좀에 포획한 Rg2를 제거하고 생리식염수를 사용하여 피부를 충분히 씻어낸 후 Rg2와 리포좀에 포획한 Rg2를 직접 바른 부분의 피부만 절게하고 -66℃ 냉동건조기에 보관한 다음 해동시켜 무게를 잰 뒤 Tris buffer 1 ml를 가하고, homogenizer를 사용하여 균질화시킨 후 t-buthyl ethyl ether 5ml을 가하여 원심분리 시킨 후 상층액 1ml을 취하고 50℃에서 증발 건조시킨 후 용제에 녹여 HPLC에 주입한 다음 피크 면적의 양으로써 잔류량을 산출하였다.

Coenzyme Q10, 산삼 배양근 추출물, 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물, Rg2, 리포좀에 포획한 Rg2에서 표피 및 진피를 포함하는 피부 잔류량을 비교한 결과 7시간 후에는 coenzyme Q10의 경우 8.6±0.2 μg/cm², 산삼 배양근 추출물의 경우에는 3.9±0.4 μg/cm², 리포좀에 포획한 산삼 배양근 추출물의 경우에는 4.2±0.1 μg/cm², Rg2의 경우에는 5.2±0.3 μg/cm², 리포좀에 포획한 Rg2의 경우에는 5.7±0.2 μg/cm² 추출물 상태보다는 Rg2의 상태가 피부 잔류량이 더 높게 나타났으며, 리포좀에 포획한 경우가 더 높게 나타났다(도 16).

이상 살펴본 바와 같이, 본 연구의 산삼 배양근 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 자외선에 의한 세포 손상, DNA 손상 등을 막고, 그 회복을 촉진하여 피부의 손상을 막아 줄 수 있을 뿐만 아니라, 산삼 자체가 가지는 활성으로 인해 피부의 노화를 방지하고, 영양을 공급해 줄 수 있다.

제조예 1. 산삼 배양근 이용 천연비누 제조

산삼 배양근 농축액을 이용하여 천연성분 만으로 구성된 표 10의 조성을 갖도록 하여 산삼 배양근 천연비누를 통상의 방법으로 제조하였다.

성 분	함유량 (g)
코코넛오일	260
팜오일	190
피마자오일	150
NaOH(가성소다)	120
미강유	40
해바라기씨유	40
포도씨유	40
호호바유	40
동백유	40
라벤더 E.O.	10
바질 E.O.	10
산삼농축액	10
증류수	60
전 체	1,000

제조예 2. 산삼 배양근 이용 천연에센스 제조

산삼 배양근 농축액을 이용하여 천연성분 만으로 구성된 표 11의 조성을 갖도록 하여 산삼 배양근 에센스를 통상의 방법으로 제조하였다.

성 분	함유량 (g)
증류수	75
알로에베라	20
식물성 글리세린	2
산삼 배양근 농축액	3
콜라겐	1
히아루론산	1
쟁탄검	1
비타민E	1
메틸파라벤	0.01
라벤더 에센셜오일	0.1
티트리 에센셜오일	0.1
전 체	100

제조예 3. 산삼 배양근 이용 마스크팩 제조

산삼 배양근 농축액을 이용하여 천연성분 만으로 구성된 표 12의 조성을 갖도록 하여 순면 마스크팩을 통상의 방법으로 제조하였다.

성 분	함유량 (g)
정제수	80
에탄올	1
프로필렌글리콜	3
소듐히아루로네이트	1
글리세린	5
산삼 배양근 농축액	3
히아루론산	1
쟁탄검	0.1
알부틴	1
비타민E	1
베타인	1
PVM/MA코폴리머	0.05
글리세릴폴리메타크릴네이트	1.5
콜라겐펩타이드	1
알란토인	0.15
디소듐EDTA	0.03
트리에탄올아민	0.16
프로필렌노닐페닐에틸	0.2
디엠디엠히단토인	0.15
향 료	0.003
전 체	100

제조예 4. 산삼 배양근 이용 바디워시 제조

산삼 배양근 농축액을 이용하여 천연성분 만으로 구성된 표 13의 조성을 갖도록 하여 바디워시를 통상의 방법으로 제조하였다.

성 분	함유량 (g)
코코넛오일 아미도프로필 베타인	30
코카마이드DEA	1
글리세린	6
산삼 배양근 농축액	3
코코넛오일	22
피마자오일	10
올리브오일	10
동백유	10
콜라겐	2
씀바귀추출물	2
귀리추출물	2
젤라틴	1
메틸파라벤	0.15
씨트릭에씨드	1
BHT	0.15
디소듐EDTA	0.03
향 료	0.003
전 체	100

제조예 5. 산삼 배양근 이용 샴푸 제조

산삼 배양근 농축액을 이용하여 천연성분 만으로 구성된 표 14의 조성을 갖도록 하여 샴푸를 통상의 방법으로 제조하였다.

성 분	함유량 (g)
코코넛오일 아미도프로필 베타인	30
코카마이드DEA	1
글리세린	6
산삼 배양근 농축액	3
코코넛오일	20
피마자오일	10
올리브오일	10
동백유	10
콜라겐	2
씀바귀추출물	2
귀리추출물	2
젤라틴	1
메틸파라벤	0.15
살리실릭에시드	2
씨트릭에씨드	1
BHT	0.15
디소듐EDTA	0.03
향 료	0.003
전 체	100

Claims (8)

1. 스테비아 추출액이 포함된 배지에서 산삼 부정근을 배양시키고, 상기 배양된 산삼 부정근을 추출하여 산삼 부정근 추출물을 제조하는 단계;및
   인지질 및 콜레스테롤이 혼합된 지질을 건조시켜 얻은 지질막에 비드를 넣은 후 상기 산삼 부정근 추출물을 첨가시켜 수화시킨 후 초음파분해 시켜 리포좀에 포획된 산삼 부정근 추출물을 제조하는 단계를 포함하는,
   리포좀에 포획된 산삼 부정근 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물의 제조 방법.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 리포좀에 포획된 산삼 부정근 추출물은 조성물 총 중량에 대해 0.01 내지 20 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물의 제조 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 산삼 부정근 추출물은 물, 탄소수 1~3의 무수 또는 함수 알코올, 에틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 추출용매로 추출되는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물의 제조 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 화장료의 제형은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물의 제조 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 리포좀에 포획된 산삼 부정근 추출물은 진세노사이드 Rg2 성분을 함유하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물의 제조 방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 피부손상 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물의 제조 방법.
8. (a) 산삼 종자를 배양시켜 산삼 뿌리에서 배발생캘러스를 유도하는 단계;
   (b) 상기 배발생캘러스를 스테비아 추출액 함유 배지에서 배양시켜 산삼 부정근을 형성시키는 단계;
   (c) 상기 산삼 부정근을 추출시켜 추출물을 제조하는 단계; 및
   (d) 인지질 및 콜레스테롤이 혼합된 지질을 건조시켜 얻은 지질막에 비드를 넣은 후 상기 산삼 부정근 추출물을 첨가시켜 수화시킨 후 초음파분해 시켜 상기 산삼 부정근 추출물을 리포좀에 포획시키는 단계;
   를 포함하는 리포좀에 포획된 산삼 부정근 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.

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