KR20220079414A - 캘러스 대사 산물이 다량 함유된 캘러스 용해물 및 그 제조 방법 - Google Patents
캘러스 대사 산물이 다량 함유된 캘러스 용해물 및 그 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 캘러스 대사 산물의 소실 없이 캘러스 대사 산물을 함유하는 캘러스 용해물 및 그 제조 방법, 상기 캘러스 용해물을 천연 고분자 소재로 피복하여 캡슐화한 캘러스 용해물 함유 캡슐 및 그 제조 방법, 상기 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐을 유효 성분으로 포함하는 피부 외용제 및 화장료 조성물 등에 관한 것이다.
본 발명에 따른 캘러스 용해물은 캘러스 대사 산물이 소실되지 않고 다량 함유되어 있어 캘러스 대사 산물을 피부에 직접적으로 빠르게 침투 및 흡수시킬 수 있으며, 그에 따라 캘러스 대사 산물에 의한 피부의 다양한 증상 및 질환을 예방 및 개선할 수 있다.
본 발명에 따른 캘러스 용해물은 캘러스 대사 산물이 소실되지 않고 다량 함유되어 있어 캘러스 대사 산물을 피부에 직접적으로 빠르게 침투 및 흡수시킬 수 있으며, 그에 따라 캘러스 대사 산물에 의한 피부의 다양한 증상 및 질환을 예방 및 개선할 수 있다.
Description
본 발명은 캘러스 대사 산물이 다량 함유된 캘러스 용해물, 상기 캘러스 용해물을 제조하는 방법 및 상기 캘러스 용해물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
캘러스는 일반적으로, 식물의 분화되지 않은 부정형의 유세포 덩어리를 의미한다. 이러한 캘러스는 식물 생장 조절 물질 등의 처리를 통해 전체 식물로 분화될 수 있는 전형성능을 가지므로 식물 줄기 세포로도 불리고 있다. 최근에는 식물체 훼손 없이 조직 배양 기술을 통해 캘러스 세포를 대량 배양하여 다양한 식물 유래의 대사 산물을 생산할 수 있으므로 캘러스 배양은 산업적으로 큰 이용 가치를 가진다.
캘러스는 식물 유래의 세포이므로 인체 내에서 분해되지 않는 셀룰로오스, 펙틴, 리그닌 등으로 형성된 세포벽으로 감싸져 있다. 이러한 이유로 캘러스 자체를 피부에 도포하더라도 인체 피부는 셀루로오스 분해효소가 없어 세포벽을 분해하기 어렵고 캘러스는 마이크로 사이즈라 손으로 눌러 바르는 정도의 물리력으로는 세포벽의 분해가 어려워 캘러스 내 대사 산물을 피부로 흡수할 수 없다. 즉, 캘러스 자체만으로 캘러스 내의 대사 산물을 유용 성분으로서 인체 피부에 직접 이용할 수는 없다.
이에 캘러스 내의 대사 산물을 유용 성분으로 인체에 이용하기 위한 다양한 방법이 시도되었다. 하나의 방법으로, 특정 성분에 대한 용해성이 높은 유기 용매를 이용하여 캘러스로부터 유용 성분을 추출 및 분리 정제하는 방법이다. 그러나 상기 방법은 유용 성분을 고효율로 추출하는 것이 용이하지 않으며, 일정 정도의 유용 성분 함량을 달성하기 위해 분획 및 농축을 반복하는 과정에서 피부에 적합하지 않은 유기 용매가 다량으로 사용되는 문제점이 있다. 또한, 유기 용매를 사용하지 않는 초임계 추출 등과 같은 방법이 사용되어 왔다. 그러나, 초임계 추출 방식의 경우 고가의 설비를 필요로 하거나, 공정 가동에 에너지 소모가 높아 산업적으로 이점이 있는 수준의 경제성을 달성하기 어렵다.
더욱이 상기 종래의 추출법은 식물의 모든 영양성분을 모두 이용치 못하고 일부 유용 성분만을 고집적화하는 방법이므로 고집적화되지 않은 유용 성분 이외의 성분은 소실 또는 폐기되어 캘러스 내의 대사 산물을 충분히 이용하지 못하고, 비용 대비 얻어지는 이익이 크지 않다.
종래 캘러스 관련된 등록 또는 공개 특허들(한국 등록특허 제10-1791641호, 한국 등록특허 제10-0931768호, 한국 공개특허 제10-2020-0011239호 등)도 모두 캘러스를 용매 추출하거나 초임계 추출하여 캘러스 내 유용 성분을 인체 피부에 적용하여 왔는바, 상기와 같은 문제는 여전히 해결해야 할 문제로 남아 있다.
이에 본 발명자들은 캘러스 내 대사 산물을 유용 성분으로 인체에 이용하기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 캘러스를 특정 압력에서 기계적 균질 파쇄할 경우 캘러스 내 대사 산물의 소실 없이 캘러스 내 대사 산물을 유용 성분으로 인체에 적용할 수 있을 뿐만 아니라 인체 피부의 침투력 및 흡수력이 현저하게 향상되어 인체 피부에 대한 다양한 효과를 현저히 상승할 수 있음을 밝혀내고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 캘러스를 특정 압력에서 기계적 균질 파쇄하는 캘러스의 기계적 균질 파쇄 단계;를 포함하는 캘러스 대사 산물의 소실 없이 캘러스 대사 산물을 함유하는 캘러스 용해물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 방법에 의하여 제조된 캘러스 용해물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 캘러스 용해물의 보존력 및 안정성을 향상시키기 위한 상기 캘러스 용해물의 캡슐화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 캡슐화된 캘러스 용해물 함유 캡슐을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐을 포함하는 캘러스 대사 산물의 피부 침투력 및 피부 흡수력이 향상된 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부 보습 증진, 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 또는 피부 톤 개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부 보습 증진, 피부 주름 예방 또는 개선 화장료 조성물, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 또는 피부 톤 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 피부외용제 또는 화장료 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부의 보습 증진, 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 또는 피부 톤 개선을 하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 캘러스를 특정 압력에서 기계적 균질 파쇄하는 캘러스 기계적 균질 파쇄 단계;를 포함하는 캘러스 대사 산물의 소실 없이 캘러스 대사 산물을 함유한 캘러스 용해물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어 “캘러스”는 식물의 분화되지 않은 부정형의 유세포 덩어리로서, 식물 조직에서 분리된 캘러스, 식물 절편체의 탈분화 과정을 유도하여 수득된 캘러스, 또는 상기 캘러스를 배양하여 증식한 캘러스일 수 있다.
상기 식물은 목본 식물이나 초본 식물 모두를 말한다. 이의 예로는, 사과나무, 배나무, 감나무, 포도나무, 은행나무 등의 유실수, 소나무, 잣나무, 잎갈나무 등의 침엽수, 개나리, 목련, 벚나무 등의 활엽수, 코스모스, 채송화, 콩 등의 1년생 초본나무, 보리, 밀, 냉이, 애기장대 등의 2년생 초본나무, 민들레, 도라지, 쑥 등의 다년생 초본나무 등이 있다.
하나의 구체적 예로서, 식물의 가지를 살균한 후 캘러스 유도용 배지에 치상한 후 캘러스를 유도하고 그 유도된 캘러스를 계대배양하여 다량의 캘러스를 제조할 수 있다.
상기 캘러스 유도용 배지는 당해 분야에 알려진 기본 배지 등을 사용할 수 있으며, 예를 들어 MS 배지, SH 배지, N6 배지, B5 배지 등을 사용할 수 있다. 상기 캘러스 유도용 배지는 고체 배지로서 상기 기본 배지에 한천이나 겔라이트(gelite) 등을 추가할 수 있다. 또한, 상기 캘러스 유도용 배지는 당(sugar), 무기염류, 비타민, 아미노산, 생장조절물질 등을 필요에 따라 더 포함할 수 있다. 상기 생장조절물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면 AA(indole acetic acid), NAA(naphthalene acetic acid), 제아틴(Zeatin), BA(6-Benzylaminopurine), 키네틴(kinetin) 등이 있다. 상기 생장조절물질은 1종 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 캘러스 유도는 당해 분야에서 알려진 온도 조건, 예를 들어 20 내지 30℃ 및 유도 기간, 예를 들어 5주 내지 10주 동안 수행할 수 있다.
상기 캘러스 계대배양은 당해 분야에서 잘 알려진 캘러스 성장 배양용 배지에서 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 공기 부양형 생물반응기 내의 액체 배지에서 이루어질 수 있다. 상기 액체 배지는 MS 배지, SH 배지 등이 있으며, 이에 당(sugar), 무기염류, 비타민, 아미노산, 생장조절물질 등을 필요에 따라 더 포함할 수 있다.
상기 캘러스 계대배양은 당해 분야에서 알려진 온도 조건, 예를 들어 20 내지 30℃및 계대 배양 주기, 예를 들어 2주 내지 6주일 수 있다.
따라서, 본 발명의 캘러스 대사 산물을 함유하는 캘러스 용해물 제조 방법은 캘러스를 고압 상태에서 기계적 균질 파쇄하는 캘러스 기계적 균질 파쇄 단계 이전에 캘러스를 수집하는 단계를 추가할 수 있다.
상기 캘러스를 수집하는 단계는 상술한 바와 같이, 식물 조직에서 캘러스를 분리하고 수집하는 단계 및/또는 식물 절편체의 탈분화 과정을 유도하여 생성된 캘러스를 수집하는 단계를 포함한다.
또한, 상기 캘러스를 수집하는 단계는 식물 조직에서 캘러스를 분리하고 수집된 캘러스 또는 식물 절편체의 탈분화 과정을 유도하여 생성된 캘러스를 배양하여 증식한 캘러스를 수집하는 단계일 수 있다.
상기 캘러스 배양은 상술한 바와 같이 당해 분야에서 잘 알려진 캘러스 성장 배양용 배지, 특히 공기 부양형 생물반응기 내의 액체 배지에서 이루어질 수 있다. 상기 액체 배지는 MS 배지, SH 배지 등이 있으며, 이에 당(sugar), 무기염류, 비타민, 아미노산, 생장조절물질 등을 필요에 따라 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 캘러스는 캘러스에서 분화된 체세포배(somatic embryo)도 포함하는 것으로, 본 명세서에서 달리 규정하지 않는 한 상기 캘러스는 캘러스에서 분화된 체세포배를 포함한다.
본 발명의 캘러스 대사 산물의 소실 없이 캘러스 대사 산물을 함유한 캘러스 용해물을 제조하는 방법은 캘러스를 고압 상태에서 기계적 균질 파쇄하는 단계를 포함한다.
상기 “기계적 균질 파쇄”는 볼밀(ball mill 또는 bead mill)형, 회전자/고정자(rotor/stator)형, 또는 블레이드(blade)형의 호모게나이저로 목적하는 물질을 기계 장치에 의해 파쇄 및 균질하는 것을 말한다.
상기 기계적 균질 파쇄는 고압 상태, 즉 200 내지 2,000 bar의 압력 조건, 보다 바람직하게는 300 bar 내지 1800 bar의 압력 조건, 보다 더 바람직하게는 500 bar 내지 1500 bar의 압력 조건에서 이루어진다. 상기 압력 범위가 200 bar 미만인 경우, 캘러스 내의 대사 산물이 세포벽 밖으로 노출되는 효율이 낮아 캘러스 대사 산물에 의한 효과를 기대할 수 없다. 상기 압력 범위가 2,000 bar를 초과하는 경우, 캘러스 내의 대사 산물, 특히 유용 성분이 과도한 압력에 의해 성상 변이 또는 파괴되어 캘러스 대사 산물에 의한 효과를 기대할 수 없으며 변색 및 변취가 발생하여 하기에서 기술하는 조성물로 사용하기 적합하지 않다.
또한 상기 기계적 균질 파쇄는 고압 상태에서 1회당 15분 내지 30분, 바람직하게는 18 내지 22분, 보다 바람직하게는 19분 내지 21분, 가장 바람직하게는 20분 동안 수행한다. 또한 상기 기계적 균질 파쇄는 2회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 4회, 보다 바람직하게는 3회 수행한다. 상기 수행 회수 및 1회당 수행 시간이 상기 범위 미만인 경우 캘러스 대사 산물의 용출 및 분산을 방지하고 있는 세포벽이 충분히 파괴되지 않아 캘러스 대사 산물의 용출 및 분산이 미미하며, 상기 수행 회수 및 1회당 수행 시간이 상기 범위 초과인 경우 상기 범위 내에서 충분히 세포벽이 파괴되었기 때문에 세포벽의 파괴가 더 이루어지지 않아 비효율적이다.
이와 같이 고압 상태에서 캘러스의 기계적 균질 파쇄는 기계적 전단력 및 공동현상(cavitation) 등에 의하여 캘러스의 대사 산물의 용출을 방지하고 있는 세포벽 구성 성분(셀룰로오스, 펙틴, 및 리그닌 또는 큐틴 등)의 결합력을 약화 및 파괴함으로써 캘러스의 대사 산물의 용출 및 분산을 용이하게 할 뿐만 아니라 파괴된 세포벽 구성 성분의 잔존물과 함께 자연적으로 캘러스 용해물로서 존재하게 된다. 또한, 상기 세포벽의 파괴는 기계적 균질 파쇄에 의하여 세포벽 일부분이 아닌 세포벽의 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상 파괴되므로 캘러스의 대사 산물의 용출 및 분산이 빠른 시간 내에 이루어지고 파괴된 세포벽 구성 성분의 잔존물과 함께 자연적으로 캘러스 용해물로서 존재하게 된다.
상기 “캘러스 대사 산물”은 캘러스의 소기관에 의하여 생산된 인체 피부에 유용한 성분이 함유된 물질을 말한다. 상기 인체 피부에 유용한 성분은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 피부 보습을 증진하는 성분, 피부 주름을 예방 또는 개선하는 성분, 피부 탄력을 증진하는 성분, 피부 미백을 증진하는 성분, 피부 톤을 개선하는 성분 등을 포함한다.
상기 “캘러스 대사 산물의 소실”은 본 발명의 방법에 따른 캘러스 용해물에 함유된 특정의 기준 물질의 함량이 본 발명의 방법과 다른 방법, 예들 들어 본 발명의 방법과 동일하되 압력이 100 bar에서 캘러스를 기계적 균질 파쇄한 경우 또는 본 발명의 방법과 다른 캘러스의 열수 추출물 등에 함유된 특정의 기준 물질의 함량에 비하여 1.3배 이하, 바람직하게는 1.25배 이하, 보다 바람직하게는 1.2배 이하로 함유된 경우를 말한다. 따라서, 상기 “캘러스 대사 산물의 소실 없이”는 본 발명의 방법에 따른 캘러스 용해물에 함유된 특정의 기준 물질의 함량이 본 발명의 방법과 다른 방법, 예들 들어 본 발명의 방법과 동일하되 압력이 100 bar에서 캘러스를 기계적 균질 파쇄한 경우 또는 본 발명의 방법과 다른 캘러스의 열수 추출물 등에 함유된 특정의 기준 물질의 함량에 비하여 1.2배 이상, 바람직하게는 1.25배 이상, 보다 바람직하게는 1.3배 이상으로 함유된 경우를 말한다. 상기 특정의 기준 물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 플라보노이드, 테르페노이드 등을 들 수 있다.
상기 “캘러스 용해물”은 상술한 방법에 의하여 캘러스 대사 산물 및 세포벽이 파괴된 캘러스(바람직하게는 캘러스 소기관)가 분산 또는 용해된 상태로 존재하는 것을 말한다. 본 발명에서 상기 캘러스 용해물은 상술한 방법에 의하여 제조되는 것에 특징이 있으므로, 편의상 캘러스 고압 균질 파쇄물로 칭할 수 있다.
한편, 본 발명의 캘러스 대사 산물이 함유된 캘러스 용해물 제조 방법은 상기 캘러스를 고압 상태에서 기계적 균질 파쇄하는 단계 이후에 캘러스 용해물 중 인체 피부에 유효하지 않은 성분, 예를 들어 핵, 미토콘드리아, 액포 등의 세포 소기관 등을 제거하는 단계를 필요에 따라 추가로 포함할 수 있다.
상기 캘러스 용해물로부터 유효하지 않은 성분의 제거는 목적하는 성분의 제거에 따라 적합한 방법을 선택할 수 있으나, 예를 들면 여과, 원심분리, 효소 처리, 컬럼 크로마토그래피 등의 방법에 의하여 달성할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 제조된 캘러스 용해물을 제공한다.
본 발명의 캘러스 용해물은 캘러스를 고압 상태에서 기계적 균질 파쇄하여 제조된 것을 특징으로 한다. 특히, 본 발명의 캘러스 용해물은 캘러스의 세포벽을 이루는 구성 성분의 결합을 기계적 전단력 및 공동현상으로 세포벽의 다양한 부분을 절단하여 캘러스 대사 산물의 소실 없이 용이하게 용출된 물질이다.
상기 “캘러스 대사 산물의 소실”은 본 발명의 방법에 따른 캘러스 용해물에 함유된 특정의 기준 물질의 함량이 본 발명의 방법과 다른 방법, 예들 들어 본 발명의 방법과 동일하되 압력이 100 bar에서 캘러스를 기계적 균질 파쇄한 경우 또는 본 발명의 방법과 다른 캘러스의 열수 추출물 등에 함유된 특정의 기준 물질의 함량에 비하여 1.3배 이하, 바람직하게는 1.25배 이하, 보다 바람직하게는 1.2배 이하로 함유된 경우를 말한다. 따라서, 상기 “캘러스 대사 산물의 소실 없이”는 본 발명의 방법에 따른 캘러스 용해물에 함유된 특정의 기준 물질의 함량이 본 발명의 방법과 다른 방법, 예들 들어 본 발명의 방법과 동일하되 압력이 100 bar에서 캘러스를 기계적 균질 파쇄한 경우 또는 본 발명의 방법과 다른 캘러스의 열수 추출물 등에 함유된 특정의 기준 물질의 함량에 비하여 1.2배 이상, 바람직하게는 1.25배 이상, 보다 바람직하게는 1.3배 이상으로 함유된 경우를 말한다. 상기 특정의 기준 물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 플라보노이드, 테르페노이드 등을 들 수 있다.
보다 구체적으로, 종래 캘러스 추출물은 특정 용매에 대하여 용해되는 유용 성분만을 추출하므로 특정 용매에 용해되지 않는 유용 성분은 이용할 수 없는 문제가 있어 왔다. 또한, 종래 캘러스 초임계 추출은 세포벽의 파괴가 미흡할 수 있어 캘러스 대사 산물의 용출이 용이하지 않거나 캘러스 대사 산물의 용출을 용이하게 하기 위하여 세포벽을 파괴하는데 많은 에너지가 요구되고 고가의 장비가 필요한 문제가 있어 왔다. 또한, 종래 캘러스 초음파 파쇄로는 식물 세포를 사람의 피부에 흡수 가능할 정도의 크기로 만들기는 매우 어려우며, 제조가 가능하더라도 처리 시간이 매우 오래 걸리고 상업적으로 이용이 가능한 양을 처리하기에는 한계가 있다.
이와 달리, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 캘러스 용해물은 상술한 종래 캘러스 이용 기술에 비하여 다음과 같은 장점이 있다.
(1) 본 발명에 따라 제조된 캘러스 용해물은 적은 에너지로 짧은 시간에 캘러스 세포벽의 다양한 부분을 파괴하여 캘러스 대사 산물의 용출을 용이하게 한다.
하나의 구체적 예로, 본 발명에 따른 캘러스 용해물은 플로보노이드 및 테르페노이드 함량에 있어서 종래의 방법(예를 들어 캘러스의 열수 추출물) 및 압력 조건을 달리한 캘러스 용해물에 비하여 현저히 높은 함량을 나타내고 있다.
(2) 본 발명에 따라 제조된 캘러스 용해물은 캘러스 세포벽의 파괴로 인해 캘러스 대사 산물이 파괴된 세포벽 구성 성분과 함께 자연적으로 분산 또는 용해된 상태로 존재하므로 캘러스 대사 산물 내 인체 피부에 대한 유용 성분을 모두 이용할 수 있는 장점이 있다.
하나의 구체적 예로, 본 발명에 따른 캘러스 용해물은 종래의 방법(예를 들어 캘러스의 열수 추출물) 및 압력 조건을 달리한 캘러스 용해물에 비하여 피부 보습력, 피부 주름 예방 및 개선, 피부 미백, 피부 탄력 예방 및 개선, 및 피부 톤 개선 효과가 현저히 우수하다.
(3) 본 발명에 따라 제조된 캘러스 용해물은 캘러스 세포벽의 파괴로 인하여 캘러스 대사 산물이 분산 또는 용해된 상태로 존재하므로 인체 피부에 대한 침투력 및 피부 흡수력이 우수하다.
하나의 구체적 예로, 본 발명에 따른 캘러스 용해물은 종래의 방법(예를 들어 캘러스의 열수 추출물) 및 압력 조건을 달리한 캘러스 용해물에 비하여 피부 침투량이 2.04배 내지 8배로 현저히 우수하다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상술한 캘러스 용해물을 천연 고분자 소재로 피복하여 캡슐화한 캘러스 용해물 함유 캡슐을 제공한다.
본 발명의 상기 캡슐에 함유되는 캘러스 용해물은 상술한 바와 같다.
본 발명의 상기 캡슐에서, 상기 천연 고분자 소재는 식물, 광물, 또는 미생물로부터 유래된 물질로, 상온에서는 고체이지만, 피부에 적용 시 체온, 마찰열, 또는 압력에 의해 녹는 열 연화성 물질인 것이 바람직하다. 상기 천연 고분자 소재는 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 한천, 펙틴, 알긴산, 알긴산염, 카라기난, 커드란, 전분, 젤란검, 글루코만난, 로커스트검, 구아검, 타라검, 아라비아검, 잔탄검, 히알루론산, 카라야검, 트래가칸트검(trangacanth gum), 라치검(larch gum), 덱스트란, 셀룰로오스 및 이들의 혼합물 중 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 캡슐화는, 상기 캘러스 용해물을 에멀젼화하고 액상의 천연 고분자 소재에 분산시킨 것을 특징으로 한다.
상기 에멀젼화는 상기 캘러스 용해물을 가용화 제형, 또는 유중수형(W/O), 수중유형(O/W), 수중유중수형(W/O/W) 또는 유중수중유형(O/W/O) 등의 에멀젼 제형으로 제조하는 것일 수 있다.
상기 에멀젼화는 계면활성제 또는 유화제가 사용될 수 있는데, 이들 계면활성제 또는 유화제는 이온성 또는 비이온성일 수 있다. 이의 예로는 폴록사머 또는 플루로닉, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리소르베이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 폴리에톡시화 피마자유 및 수소화 피마자유 등이 있다. 여기서, 상기 계면활성제 또는 유화제는 상기 갤러스 용해물 100 중량부를 기준으로 5 내지 30 중량부, 바람직하게는 5 내지 20 중량부로 사용할 수 있다.
상기 천연 고분자 소재는 열 연화성 물질이므로, 50℃이상, 바람직하게는 50 내지 90℃보다 바람직하게는 60 내지 90℃보다 더 바람직하게는 70 내지 90℃가장 바람직하게는 80 내지 90℃에서 가열하여 액상화할 수 있다.
본 발명의 캡슐은, 상기 천연 고분자 소재와 상기 캘러스 용해물의 중량비가 1: 0.001 내지 1: 10, 구체적으로 1: 0.005 내지 1: 10 보다 구체적으로 1: 0.05 내지 1: 10 일 수 있다. 상기 범위 내에서 상기 캡슐은 유효 성분인 캘러스 용해물의 보존력 및 안정성을 향상시키고, 저장 환경에서는 유효 성분인 캘러스 용해물의 보존력을 높이면서도, 피부에 적용시에는 피부에 도포되기에 유리한 특성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 상기 캡슐은, 평균 입자 크기가 0.1 mm 내지 30 mm, 구체적으로 0.5 mm 내지 10 mm 보다 구체적으로 1 mm 내지 10 mm 일 수 있다. 상기 범위 내에서 캡슐에 함유된 캘러스 용해물에 대한 보존력 및 안정성이 더욱 우수할 수 있다.
본 발명의 상기 캡슐은 피부에 적용 시 잘 녹아 도포될 수 있도록 녹는점이 30 내지 50℃바람직하게는 35 내지 45℃사이, 보다 바람직하게는 캡슐의 안정성을 고려하여 녹는점이 36℃이상이며, 캡슐의 상용성 및 발림성을 고려하면 녹는점이 45℃이하인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 캘러스 용해물 함유 캡슐은 유효 성분인 캘러스 용해물에 대한 보존력 및 안정성이 더욱 우수하고, 저장 환경에서는 유효 성분인 캘러스 용해물의 보존력을 높이면서도, 피부에 적용시에는 피부에 도포되기에 유리한 특성을 가진다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상술한 캘러스 용해물을 제조하는 단계 이후 상기 제조된 캘러스 용해물을 천연 고분자 소재로 피복하여 캡슐화하는 단계를 포함하는 캘러스 용해물 함유 캡슐 제조 방법을 제공한다.
상기 캘러스 용해물은 상술한 바와 같으므로 이하에서는 설명을 생략한다.
상기 캘러스 용해물을 제조하는 단계는 상술한 바와 같이, 캘러스를 200 내지 2,000 bar의 압력에서 기계적 균질 파쇄하는 캘러스의 기계적 균질 파쇄 단계; 또는 캘러스의 기계적 균질 파쇄 단계, 및 상기 캘러스 기계적 균질 파쇄물 중 인체 피부에 유효하지 않은 성분을 제거하는 단계; 또는 캘러스를 수집하는 단계, 상기 수집된 캘러스의 기계적 균질 파쇄 단계 및 상기 캘러스 기계적 균질 파쇄물 중 인체 피부에 유효하지 않은 성분을 제거하는 단계;를 말한다. 이러한 캘러스 용해물을 제조하는 단계는 상기에서 설명하였으므로 상기 내용을 참조한다.
상기 제조된 캘러스 용해물을 천연 고분자 소재로 피복하여 캡슐화하는 단계는 상기 캘러스 용해물을 에멀젼화하고 액상의 천연 고분자 소재에 분산시켜 캡슐화하는 단계이다.
상기 에멀젼화는 상기 캘러스 용해물을 가용화 제형 또는 유중수형(W/O), 수중유형(O/W), 수중유중수형(W/O/W) 또는 유중수중유형(O/W/O) 등의 에멀젼 제형으로 제조하는 것일 수 있다.
상기 에멀젼화는 계면활성제 또는 유화제가 사용될 수 있는데, 이들 계면활성제 또는 유화제는 이온성 또는 비이온성일 수 있다. 이의 예로는 폴록사머 또는 플루로닉, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리소르베이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 폴리에톡시화 피마자유 및 수소화 피마자유 등이 있다. 여기서, 상기 계면활성제 또는 유화제는 상기 갤러스 용해물 100 중량부를 기준으로 5 내지 30 중량부, 바람직하게는 5 내지 20 중량부로 사용할 수 있다.
상기 천연 고분자 소재는 식물, 광물, 또는 미생물로부터 유래된 물질로, 상온에서는 고체이지만, 피부에 적용 시 체온, 마찰열, 또는 압력에 의해 녹는 열 연화성 물질인 것이 바람직하다. 상기 천연 고분자 소재는 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 한천, 펙틴, 알긴산, 알긴산염, 카라기난, 커드란, 전분, 젤란검, 글루코만난, 로커스트검, 구아검, 타라검, 아라비아검, 잔탄검, 히알루론산, 카라야검, 트래가칸트검(trangacanth gum), 라치검(larch gum), 덱스트란, 셀룰로오스 및 이들의 혼합물 중 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 액상의 천연 고분자 소재는 상술한 특징으로 갖는 천연 고분자 소재를 50℃이상, 바람직하게는 50 내지 90℃보다 바람직하게는 60 내지 90℃보다 더 바람직하게는 70 내지 90℃가장 바람직하게는 80 내지 90℃에서 가열하여 액상화할 수 있다.
상기 천연 고분자 소재와 상기 캘러스 용해물은 그 중량비가 1: 0.001 내지 1: 10, 구체적으로 1: 0.005 내지 1: 10 보다 구체적으로 1: 0.05 내지 1: 10 일 수 있다. 상기 범위 내에서 상기 캡슐은 유효 성분인 캘러스 용해물의 보존력 및 안정성을 향상시키고, 저장 환경에서는 유효 성분인 캘러스 용해물의 보존력을 높이면서도, 피부에 적용시에는 피부에 도포되기에 유리한 특성을 나타낼 수 있다.
상기 캡슐화하는 단계는 캡슐의 안정성을 향상시키기 위해, 상기 캘러스 용해물의 에멀젼을 액상의 천연 고분자 소재에 분산시킨 이후, 외부 온도를 20℃이하, 구체적으로 -10℃내지 15℃보다 구체적으로 구체적으로 0℃내지 10℃로 조절하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때, 온도 조절 방식은 제한되지 않으나, 예를 들면, 반응기 외부에 실리콘오일, 미네랄오일, 파라핀오일, 액체질소, 액체산소, 액체공기 등과 같은 동결 냉매를 포함하는 장치를 구비하여, 온도를 조절하는 것일 수 있다. 이러한 경우, 캡슐을 형성하는 천연 고분자 소재와 캡슐 내의 캘러스 용해물의 중량비 조절이 용이하면서도, 형상성이 우수한 캘러스 용해물 함유 캡슐을 제조할 수 있다.
상기 제조된 캡슐은, 평균 입자 크기가 0.1 mm 내지 30 mm, 구체적으로 0.5 mm 내지 10 mm, 보다 구체적으로 1 mm 내지 10 mm 일 수 있다. 상기 범위 내에서 캡슐에 함유된 캘러스 용해물에 대한 보존력 및 안정성이 더욱 우수할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상술한 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐을 포함하는 캘러스 대사 산물의 피부 침투력 및 피부 흡수력이 향상된 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 함유되는 캘러스 용해물 및 캘러스 용해물 함유 캡슐은 상술한 바와 같다.
본 발명의 상기 캘러스 대사 산물의 피부 침투력 및 피부 흡수력이 향상된 조성물은 유효 성분으로 캘러스 용해물 또는 캘러스 함유 캡슐을 전체 조성물의 중량%을 기준으로 0.01 내지 100 중량%, 바람직하게는 1 내지 90 중량%, 보다 바람직하게는 5 내지 80 중량%로 함유할 수 있다.
하나의 구체적 실시에서, 유효 성분인 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐에 포함된 캘러스 용해물이 상술한 바와 같이 캘러스 대사 산물의 소실 없이 용이하게 용출 또는 분산된 물질이므로 인공 피부의 침투력 실험에서 종래의 캘러스 열수 추출물 등에 비하여 인공 피부에 대한 침투량이 2.04 배 내지 8 배로 현저하게 향상되었다.
따라서, 본 발명의 조성물은 캘러스 대사 산물이 용출 또는 분산되어 있는 캘러스 용해물을 피부에 많은 양을 빠르게 침투시킬 수 있고, 피부 흡수력을 증가시킬 수 있으며, 그에 따라 캘러스 용해물에 용출 및 분산된 캘러스 대사 산물의 피부에 대한 작용으로 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만 피부의 보습, 피부의 미백, 피부의 주름, 피부의 탄력, 및 피부의 톤을 효과적으로 개선할 수 있다.
하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 상기 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐을 포함하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명의 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐은 상술한 바와 같다.
본 발명의 피부 외용제 조성물은 유효 성분으로서 캘러스 대사 산물의 피부 침투력 및 피부 흡수력이 향상된 조성물을 단독으로 포함할 수 있으며, 필요에 따라 상기 캘러스 대사 산물의 피부 침투력 및 피부 흡수력이 향상된 조성물과 함께 부형제를 포함할 수 있다.
상기 부형제는 외용제로 사용가능한 부형제라면, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 부형제는 정제수, 에탄올 등을 포함하는 친수성 용매; 호호바 오일 등을 포함하는 식물성 오일; 스쿠알란 등을 포함하는 동물성 오일; 유동 파라핀 등을 포함하는 활제; 세틸 아릴 알코올 등을 포함하는 지방산 알코올; 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 글리세린, 토코페릴 아세테이트, 폴리글리세릴-3 메틸 글루코스 디스테아레이트 등을 포함하는 피부 컨디셔닝제; 트리 에탄올 아민, 글리세릴 스테아레이트 등을 포함하는 계면활성제; 카르복시 비닐 폴리머 등을 포함하는 증점제; 유화제; 방부제; 향료 등일 수 있다.
본 발명의 피부 외용제 조성물은 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐을 0.1 중량% 내지 80 중량%, 구체적으로 1 중량% 내지 50 중량%, 보다 구체적으로 10 중량% 내지 50 중량%로 포함할 수 있다. 상기 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐의 함량이 0.1 중량% 미만인 경우 상기 캘러스 용해물에 의한 효과가 미미하고, 80 중량% 초과인 경우 함량에 비하여 효과의 증가가 미미하다.
상기 외용제 조성물은 캘러스 용해물에 함유된 캘러스 대사 산물에 의하여 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 피부 보습 증진, 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 또는 피부 톤 개선에 매우 효과적이다.
다른 하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 상기 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐을 포함하는 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐은 상술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미한다. 예를 들어, 약사법에 따른 의약외품은 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람/동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
구체적으로, 상기 의약외품은 피부 외용제 및 개인위생용품을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 또는 연고제일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 상기 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐을 0.1 중량% 내지 80 중량%, 구체적으로 1 중량% 내지 50 중량%, 보다 구체적으로 10 중량% 내지 50 중량%로 포함할 수 있다. 상기 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐의 함량이 0.1 중량% 미만인 경우 상기 캘러스 용해물에 의한 효과가 미미하고, 80 중량% 초과인 경우 함량에 비하여 효과의 증가가 미미하다.
상기 의약외품 조성물은 캘러스 용해물에 함유된 캘러스 대사 산물에 의하여 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 피부 보습 증진, 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 또는 피부 톤 개선에 매우 효과적이다.
또 다른 하나의 구체적 양태로, 본 발명은 상기 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물은캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐 외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림 등의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐을 0.1 중량% 내지 80 중량%, 구체적으로 1 중량% 내지 50 중량%, 보다 구체적으로 10 중량% 내지 50 중량%로 포함할 수 있다. 상기 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐의 함량이 0.1 중량% 미만인 경우 상기 캘러스 용해물에 의한 효과가 미미하고, 80 중량% 초과인 경우 함량에 비하여 효과의 증가가 미미하다.
상기 화장료 조성물은 캘러스 용해물에 함유된 캘러스 대사 산물에 의하여 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 피부 보습 증진, 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 또는 피부 톤 개선에 매우 효과적이다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부의 보습 증진, 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 또는 피부 톤 개선을 하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 용어 “예방”은 상기 질환 또는 증상를 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 증상에 걸리기 쉬운 경향이 있는 개체에서 상기 질환 또는 증상의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 발명에서, 용어 “개선” 또는 “치료”는 개체에서 (a) 질환 또는 증상의 억제, 또는 (b) 질환 또는 증상의 경감을 의미한다.
본 발명에서, 용어 “개체”는 본 발명의 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐을 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여에 의하여 상기 목적을 달성할 수 있는 인간을 포함한 포유동물, 예를 들어, 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 래트, 마우스, 침팬지 등을 의미한다.
본 발명에서, 용어 “투여”는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여, 바람직하게는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 대상, 예를 들어, 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐의 일일 투여량은 성인 기준으로 1.0 ㎖ 내지 3.0 ㎖이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 5회 도포하여 투여할 수 있다.
상기 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐을 유효성분으로 포함하는 조성물은 전체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1 중량% 내지 80 중량%, 구체적으로 1 중량% 내지 50 중량%, 보다 구체적으로 10 중량% 내지 50 중량%로 포함할 수 있다. 상기 캘러스 용해물 또는 캘러스 용해물 함유 캡슐의 함량이 0.1 중량% 미만인 경우 상기 캘러스 용해물에 의한 효과가 미미하고, 80 중량% 초과인 경우 함량에 비하여 효과의 증가가 미미하다.
본 발명에 따른 캘러스 용해물 제조 방법은 종래의 캘러스 추출물 등과 비교하여 인체에 유해한 용매를 사용하지 않고도 캘러스 대사 산물이 소실되지 않고 다량 함유되도록 제조하는 방법으로, 상기 방법에 제조된 캘러스 용해물은 캘러스 대사 산물이 캘러스로부터 용출 및 분산되어 있어 상기 캘러스 대사 산물을 피부에 직접적으로 빠르게 침투 및 흡수시킬 수 있다. 또한 상기 캘러스 용해물 함유 캡슐도 상기 캘러스 대사 산물을 피부에 직접적으로 빠르게 침투 및 흡수시킬 수 있을 뿐만 아니라 유효 성분인 캘러스 용해물에 대한 보존력 및 안정성을 향상시키고, 저장 환경에서는 유효 성분인 캘러스 용해물의 보존력을 높이면서도, 피부에 적용시에는 피부에 도포되기에 유리한 특성을 제공할 수 있다. 또한, 상기 캘러스 용해물 또는 캘러스 함유 캡슐을 포함하는 조성물은 캘러스 대사 산물이 용출 및 분산되어 있어 캘러스 대사 산물에 의한 피부 보습능, 피부 주름 예방능, 피부 주름 개선능, 피부 미백능, 피부 탄력 향상능 및 피부 톤 개선능이 우수하여, 피부 외용제, 피부 의약외품, 및 화장료로서 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
제조예 1
사과 나무의 당년생 가지(학명: Malus pumila, 품종명: 부사, 채집 부위: 가지의 형성층을 포함한 부분, 생육개월: 1~6개월)를 35v/v% 과산화수소에 10분, 이어서 70v/v% 에탄올에 1분 동안 침지시킨 후, 2v/v% 차아염소산나트륨(Sodium hypochlorite) 용액에 30분 동안 진탕하여 살균하였다.
그 다음 살균한 사과 나무 가지를 멸균수로 5회 이상 세척한 후, 1cm 내외의 작은 절편으로 절단하였다. 상기 절편체를 수크로오스(Sucrose) 30 g/L, 겔라이트(Gelite) 4.0 g/L, 생장조절물질인 NAA 1 ppm, MS 파우더 4.4 g/L 및 잔부의 정제수를 포함하는 기본 배지에 치상한 후 25℃의 배양실에서 8주간 배양하여 캘러스(callus)를 유도하였다.
유도된 캘러스는 5주 간격으로 계대 배양하여 증식 및 순화하였다. 상기와 같이 유도된 캘러스는 공기 부양형 생물반응기 내에 접종하여 25℃의 배양실에서 6주간 암상태로 현탁 배양 후 수확하였다. 이때, 배양 배지는 상기 기본 배지에서 겔라이트(Gelite)를 제외하고, 동량의 MS 배지(medium)으로 대체하여 제조한 배지를 이용하였으며 25℃의 배양실에서 6주간 암상태로 현탁 배양하였다.
제조예 2
상기 제조예 1에서 사과 나무의 당년생 가지 대신에 구기자 나무의 당년생 가지(학명: Lycium chinense, 채집 부위: 가지의 형성층을 포함한 부분, 생육개월: 1~6개월)를 사용하는 것을 제외하고는 제조예 1과 동일하게 수행하였다.
제조예 3
상기 제조예 1에서 사과 나무의 당년생 가지 대신에 포도 나무의 당년생 가지(학명: Vitis vinifera L., 품종명: 캠벨, 채집 부위: 가지의 형성층을 포함한 부분, 생육개월: 1~6개월)를 사용하는 것을 제외하고는 제조예 1과 동일하게 수행하였다.
실시예 1
제조예 1에서 제조한 사과 캘러스를 500ml 채취하여, 고압 호모게나이저(제품명: Scientz-150, 제조사: Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd)를 이용해 200bar에서 1회당 20분씩 총 3회 처리하여 캘러스를 파쇄하였다. 이와 같이 제조된 사과 캘러스 고압 균질 파쇄물은 75℃에서 30분 동안 처리하여 저온 살균 및 효소의 불활성화 후처리를 수행한 후 이용하였다.
실시예 2
고압 호모게나이저의 압력을 500bar로 변경한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로, 사과 캘러스 고압 균질 파쇄물을 제조하였다.
실시예 3
고압 호모게나이저의 압력을 1,000bar로 변경한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로, 사과 캘러스 고압 균질 파쇄물을 제조하였다.
실시예 4
고압 호모게나이저의 압력을 2,000bar로 변경한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로, 사과 캘러스 고압 균질 파쇄물을 제조하였다.
실시예 5
제조예 2에서 제조한 구기자 캘러스 배양물을 500ml 채취하여, 고압 호모게나이저(제품명: Scientz-150, 제조사: Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd)를 이용해 200bar에서 1회당 20분씩 총 3회 처리하여 캘러스를 파쇄하였다. 이와 같이 제조된 식물 캘러스 고압 균질 파쇄물은 75℃에서 30분 동안 처리하여 저온 살균 및 효소의 불활성화 후처리를 수행한 후 이용하였다.
실시예 6
고압 호모게나이저의 압력을 500bar로 변경한 것을 제외하고, 실시예 5와 동일한 방법으로, 구기자 캘러스 고압 균질 파쇄물을 제조하였다.
실시예 7
고압 호모게나이저의 압력을 1,000bar로 변경한 것을 제외하고, 실시예 5와 동일한 방법으로, 구기자 캘러스 고압 균질 파쇄물을 제조하였다.
실시예 8
고압 호모게나이저의 압력을 2,000bar로 변경한 것을 제외하고, 실시예 5와 동일한 방법으로, 구기자 캘러스 고압 균질 파쇄물을 제조하였다.
실시예 9
제조예 3에서 제조한 포도 캘러스 배양물을 500ml 채취하여, 고압 호모게나이저(제품명: Scientz-150, 제조사: Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd)를 이용해 200bar에서 1회당 20분씩 총 3회 처리하여 캘러스를 파쇄하였다. 이와 같이 제조된 구기자 캘러스 고압 균질 파쇄물은 75℃에서 30분 동안 처리하여 저온 살균 및 효소의 불활성화 후처리를 수행한 후 이용하였다.
실시예 10
고압 호모게나이저의 압력을 500bar로 변경한 것을 제외하고, 실시예 9와 동일한 방법으로, 포도 캘러스 고압 균질 파쇄물을 제조하였다.
실시예 11
고압 호모게나이저의 압력을 1,000bar로 변경한 것을 제외하고, 실시예 9와 동일한 방법으로, 포도 캘러스 고압 균질 파쇄물을 제조하였다.
실시예 12
고압 호모게나이저의 압력을 2,000bar로 변경한 것을 제외하고, 실시예 9와 동일한 방법으로, 포도 캘러스 고압 균질 파쇄물을 제조하였다.
비교예 1
제조예 1에서 제조한 사과 캘러스 배양물을 500ml 채취하여, 배양액을 제거하고, 1L의 멸균수에 침지하여 80℃에서 60분간 열수 추출하였다. 그 후 수득한 추출액을 여과지(Advantes, No.2)로 여과하여 식물 캘러스 열수 추출물을 제조하였다.
비교예 2
제조예 2에서 제조한 구기자 캘러스 배양물을 500ml 채취하여, 배양액을 제거하고, 1L의 멸균수에 침지하여 80℃에서 60분간 열수 추출하였다. 그 후 수득한 추출액을 여과지(Advantes, No.2)로 여과하여 구기자 캘러스 열수 추출물을 제조하였다.
비교예 3
제조예 3에서 제조한 포도 캘러스 배양물을 500ml 채취하여, 배양액을 제거하고, 1L의 멸균수에 침지하여 80℃에서 60분간 열수 추출하였다. 그 후 수득한 추출액을 여과지(Advantes, No.2)로 여과하여 포도 캘러스 열수 추출물을 제조하였다.
비교예 4
고압 호모게나이저의 압력을 100bar로 변경한 것을 제외하고, 실시예 9와 동일한 방법으로, 포도 캘러스 고압 균질 파쇄물을 제조하였다.
비교예 5
고압 호모게나이저의 압력을 2,100bar로 변경한 것을 제외하고, 실시예 9와 동일한 방법으로, 포도 캘러스 고압 균질 파쇄물을 제조하였다.
실시예 13
상기 실시예 12에서 제조한 포도 캘러스 고압 균질 파쇄물 30 중량%, 정제수 65 중량% 및 유화제 5 중량%를 혼합한 후, 60℃~ 70℃에서 에멀젼화하여 수중유형(O/W) 에멀젼을 제조하였다.
상기 에멀젼 20 ml을 천연 고분자 소재인 한천 2 중량%가 80℃~ 90℃에서 정제수 98 중량% 중에 가온 용해된 용액 80 ml 중에 투입한 후, 온도를 유지하면서 2 시간 동안 분산시켜, 캡슐화하였다. 제조된 캡슐은 평균 입자 크기가 약 5 mm 였다.
실시예 14
반응기에 하기 표 1에 표시된 조성의 성분들을 투입한 후, 70℃로 가열하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 반응기의 온도를 45℃로 냉각시키고, 상기 실시예 13에서 제조한 포도 캘러스 함유 캡슐을 첨가하고 분산시킨 다음 30℃로 냉각하여, 영양 크림 제형의 화장료를 제조하였다.
비교예 6
반응기에 하기 표 1에 표시된 조성의 성분들을 투입한 후, 70℃로 가열하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 반응기의 온도를 45℃로 냉각시키고, 상기 비교예 3에서 제조한 포도 캘러스 추출물을 첨가하고 분산시킨 다음 30℃로 냉각하여, 영양 크림 제형의 화장료를 제조하였다.
비교예 7
반응기에 하기 표 1에 표시된 조성의 성분들을 투입한 후, 70℃로 가열하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 반응기의 온도를 45℃로 냉각시키고, 분산시킨 다음 30℃로 냉각하여, 영양 크림 제형의 화장료를 제조하였다.
| (단위: 중량%) | 실시예 14 | 비교예 6 | 비교예 7 |
| 실시예 12의 포도 캘러스 파쇄물 | 15 | - | - |
| 비교예 3의 포도 캘러스 추출물 | - | 15 | - |
| 호호바오일 | 5 | 5 | 5 |
| 유동 파라핀 | 7 | 7 | 7 |
| 세틸아릴 알코올 | 2 | 2 | 2 |
| 폴리 글리세릴-3 메칠 글루코스 디스테아레이트 | 2 | 2 | 2 |
| 글리세릴 스테아레이트 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 스쿠알란 | 3 | 3 | 3 |
| 프로필렌글리콜 | 4 | 4 | 4 |
| 글리세린 | 5 | 5 | 5 |
| 트리에탄올 아민 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
| 카르복시 비닐폴리머 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
| 토코페릴 아세티이트 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 방부제, 향 | - | 0.1 | - |
| 정제수 | 65.7 | 55.6 | 70.7 |
| 합계 | 100 | 100 | 100 |
실험예 1: 피부 침투 효과성 평가
인공 피부(DE, Dermal Equivalent)를 이용하여 상기 실시예 1 내지 12 및 비교예 1 내지 5의 시료에 대한 피부 침투 효과를 측정하였다.
상기 인공 피부는 사람 정상섬유 아세포(Human normal fibroblast)를 콜라겐 및 DMEM(Dulbecco's Modification of Eagle's Medium)을 함유하는 배지에 5% 농도의 CO2 배양기에서 37℃로 24시간 동안 배양한 후, 표면 위에 표피각질형성세포를 EGF(Epidermal Growth Factor)와 BPE(Bovine Pituitary Extract)가 함유된 K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium) 배지에서 7일간 배양하는 방식으로 다층의 표피와 진피 구조를 형성하여 제조한 것이다.
실시예 1 내지 12 및 비교예 1 내지 5에서 준비된 각각의 시료를 동일한 배양 조건에서 제조된 상기 인공 피부의 맨 위층에 도포하고, 4 시간 배양 후 침투된 시료의 양을 HPLC로 분석하였다. 시험결과는 하기 표 2에 나타내었다. 상기 HPLC 분석 시의 침투량의 기준으로 사용한 물질은 Chlorogenic acid, Rutin, Resveratrol 등이다.
| 구분 | 인공 피부에 대한 침투량 (ug/ml) | |
| 실시예 1 | 사과 캘러스 파쇄물 (200bar) | 13.2 |
| 실시예 2 | 사과 캘러스 파쇄물 (500bar) | 19.4 |
| 실시예 3 | 사과 캘러스 파쇄물 (1000bar) | 33.7 |
| 실시예 4 | 사과 캘러스 파쇄물 (2000bar) | 38.4 |
| 실시예 5 | 구기자 캘러스 파쇄물 (200bar) | 12.7 |
| 실시예 6 | 구기자 캘러스 파쇄물 (500bar) | 19.4 |
| 실시예 7 | 구기자 캘러스 파쇄물 (1000bar) | 32.5 |
| 실시예 8 | 구기자 캘러스 파쇄물 (2000bar) | 37.2 |
| 실시예 9 | 포도 캘러스 파쇄물 (200bar) | 10.4 |
| 실시예 10 | 포도 캘러스 파쇄물 (500bar) | 19.5 |
| 실시예 11 | 포도 캘러스 파쇄물 (1000bar) | 32.8 |
| 실시예 12 | 포도 캘러스 파쇄물 (2000bar) | 37.8 |
| 비교예 1 | 사과 캘러스 추출물 | 4.8 |
| 비교예 2 | 구기자 캘러스 추출물 | 5.3 |
| 비교예 3 | 포도 캘러스 추출물 | 5.1 |
| 비교예 4 | 포도 캘러스 파쇄물 (100bar) | 8.4 |
| 비교예 5 | 포도 캘러스 파쇄물 (2100bar) | 40.0 |
상기 표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 12와 같이 각각 사과 캘러스, 구기자 캘러스, 포도 캘러스를 200 bar 내지 2000bar에서 고압 호모게나이저로 파쇄한 식물 캘러스 균질 파쇄물을 포함하는 경우, 동일한 식물 캘러스의 열수 추출물을 사용한 비교예 1 내지 3에 비해 인공 피부에 대한 침투량이 2.04 배(10.4/5.1) 내지 8 배(38.4/4.8)로 현저하게 향상됨을 알 수 있다.
또한, 균질 파쇄 시 압력이 200 bar 미만인 비교예 4의 경우 시료의 침투량이 본 발명의 실시예들에 미치지 못하였으며, 세포벽이 파쇄돼지 않은 상태를 포함하는 잔여물이 다량으로 발생하였다. 균질 파쇄 시 압력이 2000 bar 초과인 비교예 5의 경우 시료의 침투량은 충분히 우수하였으나, 시료에 변색 및 변취의 성상 변이가 발생하여, 외용제용 조성물로 적용하기 적합하지 않았다.
실험예 2: 피부 보습 효과성 평가
연령이 20대 내지 50대인 남성과 여성, 총 30명의 대상자를 모집하여 피부 보습능 평가를 수행하였다.
각 대상자들은 실시예 1 내지 13 및 비교예 1 내지 5에서 제조된 시료를 각각 10 g씩 2.5cm × 2.5cm 넓이의 복부 부위 피부 표면에 도포하고, 24 시간 경과 후 경피수분손실량(transepidermal water loss, TEWL)을 TEWA 증발계(Tewameter TM210, Germany)를 사용하여 측정하였다. 상기 TEWA 증발계는 일정하게 설정된 측정 시간 동안의 측정 결과를 자동으로 평균값으로 산출하여 제공한다.
상기 경피수분손실량은 공기의 이동이 없고 직사광선이 없는 실내온도는 22℃상대 습도는 40%로 유지되는 항온 항습실에서 측정하였다. 또한, 각 실시예 및 비교예 시료에 대해 총 30명의 대상자들에 대한 측정값을 평균하여, 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| 구분 | 경피수분손실률 (단위:g/m2/h) | |
| 실시예 1 | 사과 캘러스 파쇄물 (200bar) | 15.2 |
| 실시예 2 | 사과 캘러스 파쇄물 (500bar) | 13.7 |
| 실시예 3 | 사과 캘러스 파쇄물 (1000bar) | 11.1 |
| 실시예 4 | 사과 캘러스 파쇄물 (2000bar) | 10.4 |
| 실시예 5 | 구기자 캘러스 파쇄물 (200bar) | 16.3 |
| 실시예 6 | 구기자 캘러스 파쇄물 (500bar) | 14.1 |
| 실시예 7 | 구기자 캘러스 파쇄물 (1000bar) | 11.5 |
| 실시예 8 | 구기자 캘러스 파쇄물 (2000bar) | 10.1 |
| 실시예 9 | 포도 캘러스 파쇄물 (200bar) | 14.3 |
| 실시예 10 | 포도 캘러스 파쇄물 (500bar) | 12.1 |
| 실시예 11 | 포도 캘러스 파쇄물 (1000bar) | 11.2 |
| 실시예 12 | 포도 캘러스 파쇄물 (2000bar) | 10.5 |
| 실시예 13 | 포도 캘러스 파쇄물 (2000bar)의 캡슐 제형 | 9.2 |
| 비교예 1 | 사과 캘러스 추출물 | 28.4 |
| 비교예 2 | 구기자 캘러스 추출물 | 25.4 |
| 비교예 3 | 포도 캘러스 추출물 | 26.7 |
| 비교예 4 | 포도 캘러스 파쇄물 (100bar) | 20.3 |
| 비교예 5 | 포도 캘러스 파쇄물 (2100bar) | 19.7 |
상기 표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 12와 같이 각각 사과 캘러스, 구기자 캘러스, 포도 캘러스를 200 bar 내지 2000 bar에서 고압 호모게나이저로 파쇄한 식물 캘러스 균질 파쇄물을 포함하는 경우, 동일한 식물 캘러스의 열수 추출물을 사용한 비교예 1 내지 3 및 파쇄 압력이 본 발명의 범위를 벗어나는 비교예 4 및 5에 비해 피부 보습능이 현저하게 우수함을 확인하였다.
특히, 포도 캘러스 파쇄물을 한천으로 피복한 캡슐 제형인 실시예 13의 경우, 시료의 도포 시 외피가 함께 도포되면서 복합적인 작용에 의해 더욱 우수한 경피수분손실량을 구현하였다.
실험예 3: 피부 주름 예방능 평가
콜라겐을 분해하는 효소인 콜라게네이즈의 활성 정도를 측정하기 위해 항체를 이용하였다.
사람의 정상 섬유아세포(Human normal fibroblast, (주)태평양)를 DMEM 배지가 들어 있는 6-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고(2×105세포/웰), 5% 농도의 CO2 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 농도별로 시료를 처리한 다음 24시간 동안 다시 배양하였다. 24시간 후, 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다.
콜라게네이즈 활성을 유도하는 물질로 알려진 종양괴사인자 알파(Tumor necrosis factor, TNF-alpha, Sigma, USA)를 10 ng/mL 의 함량으로 상기 섬유아세포가 배양된 6-웰 마이크로 플레이트에 처리한 후, 타입 I 콜라게네이즈 어세이 키트(Amersham Biosciences, RPN2629)를 이용하였으며, ELISA 판독기(Bio-Tek ELx808™Series Ultra Microplate Reader, 영국)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 증류수를 사용하였고, 측정된 흡광도를 하기 식 1에 대입하여 콜라게네이즈 활성 억제율을 산출하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
<식 1>
콜라게네이즈 저해율(%) = 100 - {[(A1-B1)-(C1-D1)]/(A1-B1)} × 100
A1: 대조군의 흡광도
B1: 대조군의 블랭크 흡광도
C1: 실험군의 흡광도
D1: 실험군의 블랭크 흡광도
| 구분 | 콜라게네이즈 억제율(%) | |
| 실시예 1 | 사과 캘러스 파쇄물 (200bar) | 30.2 |
| 실시예 2 | 사과 캘러스 파쇄물 (500bar) | 32.7 |
| 실시예 3 | 사과 캘러스 파쇄물 (1000bar) | 45.2 |
| 실시예 4 | 사과 캘러스 파쇄물 (2000bar) | 47.7 |
| 실시예 5 | 구기자 캘러스 파쇄물 (200bar) | 33.5 |
| 실시예 6 | 구기자 캘러스 파쇄물 (500bar) | 37.4 |
| 실시예 7 | 구기자 캘러스 파쇄물 (1000bar) | 44.2 |
| 실시예 8 | 구기자 캘러스 파쇄물 (2000bar) | 47.8 |
| 실시예 9 | 포도 캘러스 파쇄물 (200bar) | 33.4 |
| 실시예 10 | 포도 캘러스 파쇄물 (500bar) | 39.6 |
| 실시예 11 | 포도 캘러스 파쇄물 (1000bar) | 40.6 |
| 실시예 12 | 포도 캘러스 파쇄물 (2000bar) | 43.8 |
| 실시예 13 | 포도 캘러스 파쇄물 (2000bar)의 캡슐 제형 | 51.4 |
| 비교예 1 | 사과 캘러스 추출물 | 14.8 |
| 비교예 2 | 구기자 캘러스 추출물 | 15.4 |
| 비교예 3 | 포도 캘러스 추출물 | 14.5 |
| 비교예 4 | 포도 캘러스 파쇄물 (100bar) | 21.8 |
| 비교예 5 | 포도 캘러스 파쇄물 (2100bar) | 29.4 |
상기 표 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 12와 같이 각각 사과 캘러스, 구기자 캘러스, 포도 캘러스를 200 bar 내지 2000 bar에서 고압 호모게나이저로 파쇄한 식물 캘러스 균질 파쇄물을 포함하는 경우, 동일한 식물 캘러스의 열수 추출물을 사용한 비교예 1 내지 3 및 파쇄 압력이 본 발명의 범위를 벗어나는 비교예 4 및 5에 비해 피부 주름 예방능이 현저하게 우수함을 확인하였다.
특히, 포도 캘러스 파쇄물을 한천으로 피복한 캡슐 제형인 실시예 13의 경우, 시료의 도포 시 외피가 함께 도포되면서 복합적인 작용에 의해 더욱 우수한 콜라게네이즈 억제능을 구현하였다.
실험예 4: 티로시네이즈 억제능 평가
본 실험은 뮤라인 멜라노마(murine melanoma)(B-16 F1) 세포(한국세포주은행)를 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum)(FBS)이 함유된 DMEM 배지로 6-웰 플레이트에 웰 당 1 × 105개로 접종하고 5% CO2 및 37℃에서 세포가 웰 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 이어 배지를 제거하고 시료를 적당 농도로 희석된 배지에 교체한 다음 5% CO2 및 37℃에서 3일 동안 배양하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고, 이를 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 헤마토사이토미터(hematocytometer, Tiefe Depth Profondeur 0.100mm, Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, 독일)를 이용하여 세포수를 측정하고 5,000 내지 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거하여 펠릿을 얻었다. 이 세포 펠릿을 용해 완충액(lysis buffer)을 이용하여 분쇄시키고 12,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 수집하였다.
이를 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Bio-Tek ELx8081U, 미합중국)로 492 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 일정수당 티로시네이즈 활성을 구하였다. 상기 흡광도를 하기 식 2에 대입하여 티로시네이즈 활성 억제율을 산출하고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
실험군의 블랭크(blank)는 티로시네이즈 용액을 제외한 반응물, 즉 티로신, 캘러스 파쇄물 및 추출물, 및 인산나트륨 완충용액으로 된 반응물이며, 대조군의 블랭크는 실험군의 블랭크에서 캘러스 파쇄물 및 추출물 대신에 메탄올을 첨가한 것으로 하였다.
<식 2>
티로시네이즈 저해율(%) = 100 - {[(A2-B2)-(C2-D2)]/(A2-B2)} × 100
A2: 대조군의 흡광도
B2: 대조군의 블랭크 흡광도
C2: 실험군의 흡광도
D2: 실험군의 블랭크 흡광도
| 구분 | 티로시네이즈 활성 저해효과(%) | |
| 실시예 1 | 사과 캘러스 파쇄물 (200bar) | 24.4 |
| 실시예 2 | 사과 캘러스 파쇄물 (500bar) | 27.1 |
| 실시예 3 | 사과 캘러스 파쇄물 (1000bar) | 30.4 |
| 실시예 4 | 사과 캘러스 파쇄물 (2000bar) | 33.5 |
| 실시예 5 | 구기자 캘러스 파쇄물 (200bar) | 26.7 |
| 실시예 6 | 구기자 캘러스 파쇄물 (500bar) | 27.4 |
| 실시예 7 | 구기자 캘러스 파쇄물 (1000bar) | 28.6 |
| 실시예 8 | 구기자 캘러스 파쇄물 (2000bar) | 32.4 |
| 실시예 9 | 포도 캘러스 파쇄물 (200bar) | 25.4 |
| 실시예 10 | 포도 캘러스 파쇄물 (500bar) | 29.7 |
| 실시예 11 | 포도 캘러스 파쇄물 (1000bar) | 30.1 |
| 실시예 12 | 포도 캘러스 파쇄물 (2000bar) | 33.4 |
| 실시예 13 | 포도 캘러스 파쇄물 (2000bar)의 캡슐 제형 | 31.7 |
| 비교예 1 | 사과 캘러스 추출물 | 12.6 |
| 비교예 2 | 구기자 캘러스 추출물 | 9.7 |
| 비교예 3 | 포도 캘러스 추출물 | 12.1 |
| 비교예 4 | 포도 캘러스 파쇄물 (100bar) | 22.3 |
| 비교예 5 | 포도 캘러스 파쇄물 (2100bar) | 25.9 |
상기 표 5를 통해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 12와 같이 각각 사과 캘러스, 구기자 캘러스, 포도 캘러스를 200 bar 내지 2000 bar에서 고압 호모게나이저로 파쇄한 식물 캘러스 균질 파쇄물은 동일한 식물 캘러스의 열수 추출물을 사용한 비교예 1 내지 3 및 균질 파쇄 시 압력이 200bar 미만인 비교예 4에 비해 티로시네이즈 억제능이 현저하게 우수함을 확인하였다. 또한, 균질 파쇄 시 압력이 2000 bar 초과인 비교예 5의 경우 시료의 티로시네이즈 억제능은 충분하였으나, 시료에 변색 및 변취의 성상 변이가 발생하여, 외용제 및 화장료 조성물로 적용하기 적합하지 않았다.
이외 포도 캘러스 파쇄물을 한천으로 피복한 캡슐 제형인 실시예 13의 경우에도 우수한 티로시네이즈 억제능을 나타내었다.
실험예 5: 피부 미백능 평가
실시예 14 및 비교예 6 내지 7의 방법으로 제조한 영양크림을 기미, 주근깨 또는 색소침착증을 갖고 있는 건강한 성인남녀 100명을 대상으로 피부색의 변화를 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(△L)를 측정하였다.
기미, 주근깨 또는 색소침착증을 갖고 있는 건강한 성인남녀 100명을 무작위로 20명씩 3 그룹(A, B, C)으로 나눈 후, A그룹을 대상으로는 실시예 14를, B그룹을 대상으로는 비교예 6을, C그룹을 대상으로는 비교예 7을 각각 1일 2회씩 12주간 도포한 후 피부 밝기 변화를 측정하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.
| 피검자 | 실시예 14 (A그룹) |
비교예 6 (B그룹) |
비교예 7 (C그룹) |
| 1 | 6.2 | 5.7 | 4.4 |
| 2 | 5.4 | 4.9 | 3.4 |
| 3 | 5.6 | 4.8 | 3.0 |
| 4 | 6.6 | 4.5 | 2.4 |
| 5 | 5.7 | 4.1 | 3.6 |
| 6 | 6.6 | 5.7 | 2.4 |
| 7 | 6.3 | 5.9 | 4.1 |
| 8 | 5.1 | 5.2 | 3.3 |
| 9 | 6.8 | 4.7 | 3.4 |
| 10 | 6.1 | 4.2 | 3.8 |
| 11 | 4.9 | 3.8 | 2.6 |
| 12 | 6.2 | 5.4 | 4.5 |
| 13 | 6.3 | 6.2 | 4.2 |
| 14 | 5.6 | 4.1 | 3.4 |
| 15 | 5.8 | 5.0 | 3.7 |
| 16 | 6.3 | 5.3 | 2.2 |
| 17 | 6.7 | 5.4 | 2.5 |
| 18 | 6.9 | 5.2 | 3.5 |
| 19 | 6.5 | 4.9 | 2.9 |
| 20 | 6.1 | 5.1 | 2.7 |
| 평균 | 6.1 | 5.0 | 3.3 |
상기 표 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 14와 같이 포도 캘러스를 200 bar 내지 2000 bar에서 고압 호모게나이저로 파쇄한 식물 캘러스 균질 파쇄물을 포함하여 제조한 영양 크림의 경우, Vehicle만 처리된 대조군(비교예 7)에 비해서 현저한 미백 개선능을 보이며 특히 포도 식물 캘러스의 열수 추출물을 사용한 비교예 6에 비해서도 피부 미백능이 유의하게 우수함을 확인하였다.
실험예 6: 항산화능 평가
자유라디칼인 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)에 대한 소거능을 측정하여, 항산화능을 평가하였다. DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 색을 띄는 라디칼로, 이를 이용해 시료의 라디칼 제거 능력을 직접 확인할 수 있다.
실시예 1 내지 13 및 비교예 1 내지 5에 따른 시료 50
l와 100 
M DPPH 1㎖ (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)용액을 혼합시킨 후 30분간 20℃(상온)에서 반응 및 항온유지(incubation)하였다. 남아있는 DPPH의 양을 517nm의 흡광도 측정을 통해 파악하였다.
반응이 끝나면 하기 식 3에 의해 시료의 자유라디칼소거능(free radical scavenging activity, %)을 산출하고, 결과를 표 7에 표시하였다. 이때, 양성대조군으로는 아스코르브산(ascorvic acid) 400㎍/ml을 사용하였다. 또한, 블랭크는 정제수를 사용하였다.
<식 3>
라디칼 소거능 (%) = {1-(시료첨가구의 흡광도 /무첨가구의 흡광도) × 100 }
| 구분 | 자유 라디칼 소거능 (%) | |
| 실시예 1 | 사과캘러스파쇄물(200bar) | 80.2 |
| 실시예 2 | 사과캘러스파쇄물(500bar) | 83.6 |
| 실시예 3 | 사과캘러스파쇄물(1000bar) | 88.5 |
| 실시예 4 | 사과캘러스파쇄물(2000bar) | 90.3 |
| 실시예 5 | 구기자캘러스파쇄물(200bar) | 77.2 |
| 실시예 6 | 구기자캘러스파쇄물(500bar) | 80.9 |
| 실시예 7 | 구기자캘러스파쇄물(1000bar) | 84.3 |
| 실시예 8 | 구기자캘러스파쇄물(2000bar) | 89.6 |
| 실시예 9 | 포도캘러스파쇄물(200bar) | 82.6 |
| 실시예 10 | 포도캘러스파쇄물(500bar) | 85.3 |
| 실시예 11 | 포도캘러스파쇄물(1000bar) | 87.3 |
| 실시예 12 | 포도캘러스파쇄물(2000bar) | 90.1 |
| 실시예 13 | 포도캘러스파쇄물(2000bar)의 캡슐 제형 | 88.8 |
| 비교예 1 | 사과 캘러스 추출물 | 50.4 |
| 비교예 2 | 구기자 캘러스 추출물 | 38.1 |
| 비교예 3 | 포도 캘러스 추출물 | 40.4 |
| 비교예 4 | 포도캘러스파쇄물(100bar) | 37.5 |
| 비교예 5 | 포도캘러스파쇄물(2100bar) | 61.2 |
| 대조군 | 아스코르브산(ascorbic acid) 400ug/ml | 80.7 |
| 블랭크 | 증류수 | 0 |
상기 표 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 12와 같이 각각 사과 캘러스, 구기자 캘러스, 포도 캘러스를 200 bar 내지 2000 bar에서 고압 호모게나이저로 파쇄한 식물 캘러스 균질 파쇄물을 포함하는 경우 및 캡슐 제형인 실시예 13의 경우, 동일한 식물 캘러스의 열수 추출물을 사용한 비교예 1 내지 3 및 파쇄 압력이 본 발명의 범위를 벗어나는 비교예 4 및 5에 비해 항산화능 현저하게 우수함을 확인하였다.
특히, 본 발명의 실시예 1 내지 13의 시료는 모두 양성대조군인 아스코르브산과 비교하여도 현저하게 우수한 라디칼소거능을 나타내었다.
실험예 7: 플라보노이드 함량 평가
실시예 1 내지 13 및 비교예 1 내지 5의 시료를 각각 10 ml로 준비한 후, 0.2㎛ 시린지 필터(syringe filter)로 여과하여 검체를 준비하였다. 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(Gutfinger R. 1981)을 응용하였다. 각 시료의 1 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 증류수로 10배 희석한 희석액 2 mL에 0.2 mL Folin-Ciocalteu's phenol reagent를 가하여 혼합한 후 실온에서 3분간 방치한 후 2 M Na2CO3 2 mL을 넣고 1시간 반응시킨 후 상등액을 microplate reader로 725 nm에서 측정하였으며 갈산(gallic acid)을 이용하여 작성한 표준 곡선으로부터 함량을 구하였다. 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
실험예 8: 테르페노이드 함량 평가
실시예 1 내지 13 및 비교예 1 내지 5의 시료를 각각 10 ml로 준비한 후, 0.2㎛ 시린지 필터(syringe filter)로 여과하여 검체를 준비하였다. 각각의 시료를 -20℃에서 48시간 동안 동결건조한 후, 동결건조물을 석유 에테르 (60 ~ 80 "C)로 추출하였다. 추출물을 여과, 농축 후 벤젠 에틸 아세테이트 (99 : 1)를 용매로 사용하여 실리카 겔 C상에서 TLC로 농축물의 분취량을 분석 하였다. 시료는 유리 칼럼 (2m × 5mm OD)을 사용하여 가스 크로마토 그래피 (Shimadzu GC-7A, Kyoto, Japan)로 분석하였다. 아르테미시닌(artemisinin)을 사용하여 표준 곡선을 통해 정량화 하였으며 총 테르페노이드 함량은 HPLC에서 메탄올 - 물 (80:20)을 용리액 (0.8 mL/min)으로 사용하여 측정하였다. 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
| 플라보노이드 함량 (mg/L) | 테르페노이드 함량 (mg/L) | |
| 실시예 1 | 178.55 | 42.15 |
| 실시예 2 | 223.44 | 45.48 |
| 실시예 3 | 267.89 | 52.22 |
| 실시예 4 | 303.21 | 56.31 |
| 실시예 5 | 163.63 | 38.66 |
| 실시예 6 | 186.59 | 42.11 |
| 실시예 7 | 200.06 | 57.67 |
| 실시예 8 | 254.64 | 73.32 |
| 실시예 9 | 201.66 | 33.54 |
| 실시예 10 | 264.38 | 54.22 |
| 실시예 11 | 297.69 | 66.45 |
| 실시예 12 | 321.28 | 78.83 |
| 실시예 13 | 110.06 | 31.22 |
| 비교예 1 | 83.32 | 10.23 |
| 비교예 2 | 61.55 | 11.25 |
| 비교예 3 | 88.54 | 12.82 |
| 비교예 4 | 91.32 | 22.33 |
| 비교예 5 | 93.27 | 27.13 |
상기 표 8을 통해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 13은 모두 비교예 1 내지 5에 비하여 플라보노이드 및 테르페노이드와 같은 피부 유효 성분의 함량이 현저하게 우수하였다.
실험예 9: 제형 안정성 평가
실시예 12와 13 및 비교예 3 시료의 빛에 대한 안정성을 하기와 같은 방법으로 평가하였다. 각 시료를 하나당 30 ml씩 분취하여 4개 준비한 후, 차광 및 투광 용기에 담아 조도 1000±200 lux, 온도 25±2℃(상온)로 유지되는 항온기에 보관하여 2주 간격으로 고속 액체 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. 고속 액체 크로마토그래피에 의한 레스베라트롤(resveratrol) 분석을 위하여 각 시료 0.1g을 취하여 10 mL의 100% 순도의 메탄올에 용해시킨 후 초음파 분쇄기로 10초씩 3번 분쇄 추출하고 12시간 동안 추출하여 원심분리와 0.2 ㎛의 유기용매용 나이론 필터를 통과시켜 검체액을 제조하였다.
검액 및 표준액 각 10 
L씩을 가지고 아래 조작조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 레스베라트롤의 피크면적 AT(test area: 검체 시료의 피크 그래프 면적) 및 AS(AS: standard area: 표준 시료의 피크 그래프 면적)를 측정하였다.
<식 4>
레스베라트롤(C14H12NO3)의 양(mg)=레스베라트롤 표준품의 양(mg) × AT/AS
[조작 조건]
검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 305 nm)
칼럼 : 안지름 4.6 ㎜, 길이 15 ㎝인 스테인레스관에 약 5 
m의 액체 크로마토그래프용 옥타데실실릴화한 실리카겔이 충전된 칼럼 또는 이와 동등한 칼럼
칼럼온도: 실온
이동상: 0.1% TFA water : 아세토니트릴 = 70 : 30
유량: 1.0 mL/min
| 레스베라트롤 잔존량 (% of remaining) | ||||
| Light | 시간 | 비교예 3 | 실시예 12 | 실시예 13 |
| 빛차광/노출 | 0주 | 100 | 100 | 100 |
| 빛 차광 | 2주 | 84 | 91 | 100 |
| 빛 차광 | 4주 | 69 | 85 | 98 |
| 빛 노출 | 2주 | 55 | 77 | 93 |
| 빛 노출 | 4주 | 22 | 55 | 76 |
상기 표 9를 통해 알 수 있는 바와 같이, 실시예 12에서 제조된 포도 캘러스 파쇄물에서의 레스베라트롤 잔존량이 비교예 3의 포도 캘러스 열수추출물의 레스베라트롤 잔존량보다 높게 유지됨을 관찰할 수 있었다. 또한 실시예 13과 같이 식물 캘러스 파쇄물을 한천으로 피복한 캡슐 제형에 적용했을 때 레즈베라트롤 안정성이 현저하게 개선됨을 확인하였다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
Claims (18)
- 캘러스를 200 내지 2,000 bar의 압력에서 기계적 균질 파쇄하는 캘러스의 기계적 균질 파쇄 단계를 포함하는 캘러스 대사 산물의 소실 없이 캘러스 대사 산물을 함유하는 캘러스 용해물 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 캘러스의 기계적 균질 파쇄 단계 이전에 하기 단계 중의 어느 하나 이상으로 이루어진 캘러스를 수집하는 단계를 추가로 포함하는 캘러스 용해물 제조 방법.
(a) 식물 조직에서 캘러스를 분리하고 수집하는 단계;
(b) 식물 절편체의 탈분화 과정을 유도하여 생성된 캘러스를 수집하는 단계; 및
(c) 상기 (a) 또는 (b) 단계의 수집된 캘러스를 배양하여 증식한 캘러스를 수집하는 단계. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 캘러스의 기계적 균질 파쇄 단계 이후에 캘러스 기계적 균질 파쇄물 중 인체 피부에 유용하지 않은 성분을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 캘러스 용해물 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 캘러스 대사 산물의 소실은 캘러스 용해물에 함유된 특정의 기준 물질의 함량이 제1항의 방법과 다른 방법으로 제조한 경우와 비교하여 1.3배 이하인 것을 특징으로 하는 캘러스 용해물 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 캘러스 대사 산물은 캘러스의 소기관에 의하여 생산된 인체 피부에 유용한 성분이 함유된 물질인 것을 특징으로 하는 캘러스 용해물 제조 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 인체 피부에 유용한 성분에 의하여 피부 보습 증진, 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 탄력 증진, 피부 미백 증진, 및 피부 톤 개선으로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상을 나타내는 것을 특징으로 하는 캘러스 용해물 제조 방법.
- 캘러스를 200 내지 2,000 bar의 압력에서 기계적 균질 파쇄하는 캘러스의 기계적 균질 파쇄로 제조되어 캘러스 대사 산물의 소실 없이 캘러스 대사 산물을 함유하는 캘러스 용해물.
- 제7항에 있어서, 상기 캘러스 대사 산물의 소실은 캘러스 용해물에 함유된 특정의 기준 물질의 함량이 제1항의 방법과 다른 방법으로 제조한 경우와 비교하여 1.3배 이하인 것을 특징으로 하는 캘러스 용해물.
- 제7항에 있어서, 상기 캘러스 대사 산물은 캘러스의 소기관에 의하여 생산된 인체 피부에 유용한 성분이 함유된 물질인 것을 특징으로 하는 캘러스 용해물.
- 제9항에 있어서, 상기 인체 피부에 유용한 성분에 의하여 피부 보습 증진, 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 탄력 증진, 피부 미백 증진, 및 피부 톤 개선으로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상을 나타내는 것을 특징으로 하는 캘러스 용해물.
- 제7항의 캘러스 용해물을 천연 고분자 소재로 피복하여 캡슐화한 캘러스 용해물 함유 캡슐.
- 제11항에 있어서, 상기 천연 고분자 소재와 상기 캘러스 용해물의 중량비가 1: 0.001 내지 1: 10인 것을 특징으로 하는 캘러스 용해물 함유 캡슐.
- 제11항에 있어서, 상기 천연 고분자 소재는 한천, 펙틴, 알긴산, 알긴산염, 카라기난, 커드란, 전분, 젤란검, 글루코만난, 로커스트검, 구아검, 타라검, 아라비아검, 잔탄검, 히알루론산, 카라야검, 트래거캔스검, 라치검, 덱스트란, 셀룰로오스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 캘러스 용해물 함유 캡슐.
- 제7항의 캘러스 용해물을 천연 고분자 소재로 피복하여 캡슐화하는 단계를 포함하는 캘러스 용해물 함유 캡슐의 제조 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 천연 고분자 소재는 한천, 펙틴, 알긴산, 알긴산염, 카라기난, 커드란, 전분, 젤란검, 글루코만난, 로커스트검, 구아검, 타라검, 아라비아검, 잔탄검, 히알루론산, 카라야검, 트래거캔스검, 라치검, 덱스트란, 셀룰로오스 및 이들의 혼합물 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 캘러스 함유 캡슐의 제조 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 캡슐화하는 단계는 천연 고분자 소재와 상기 캘러스 용해물의 중량비가 1: 0.001 내지 1: 10인 것을 특징으로 하는 캘러스 용해물 함유 캡슐의 제조 방법.
- 제7항의 캘러스 용해물 또는 제11항의 캘러스 용해물 함유 캡슐을 포함하는 피부 보습 증진, 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 또는 피부 톤 개선용 피부 외용제 조성물.
- 제7항의 캘러스 용해물 또는 제11항의 캘러스 용해물 함유 캡슐을 포함하는 피부 보습 증진, 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 또는 피부 톤 개선용 화장료 조성물.
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