KR101190201B1 - 소나무 뿌리 추출물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소나무 뿌리 추출물 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 소나무 뿌리 추출물 제조방법 및 이를 통해 제조된 추출물 0.01 ~ 30.0중량%를 함유하며 항산화 효과, 항균력 효과, 주름방지 효과, 미백 효과, 피부 자극완화 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

소나무 뿌리 추출물, 초고압 추출, 항산화 효과, 항균력 효과, 주름방지 효과, 미백 효과, 피부 자극완화 효과, 기능성 소재, 화장료 조성물

Description

소나무 뿌리 추출물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing extract of pinus root}

본 발명은 소나무 뿌리 추출물 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 소나무 뿌리 추출물 제조방법 및 이를 통해 제조된 추출물 0.01 ~ 30.0중량%를 함유하며 항산화 효과, 항균력 효과, 주름방지 효과, 미백 효과, 피부 자극완화 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리?화학적인 변화가 일어나며 그 원인에 따라 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분된다. 즉, 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 프리라디칼이 활성화되어 상태가 심화 될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망이 파괴되고, 세포 및 조직이 손상되어 성인병 및 노화가 촉진된다. 좀 더 구체적으로 설명하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부세포 및 조직이 파괴되어 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 심한 과다 염증반응과 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 더 심 해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다. 그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 프리라디칼이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 프리라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상된 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다.

노화에는 프리라디칼뿐만 아니라 기질 금속 단백질 분해효소(matrix metalloproteinase;MMP)라는 효소가 관여하는데 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 MMP의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조사에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로 세포내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

이제까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다. 이에 본 발명자들은 세포내 자연노화와 광노화에 의해 그 발현이 유도되는 MMP 발현양 및 활성을 조절하고자 하였다.

다음으로, 색소 침착에 의한 피부 변화이다. 피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 멜라노이드, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비 정도이다. 멜라닌은 자외선을 흡수 또는 산란시켜 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는데 큰 역할을 하는데, 특별한 최대흡수파장이 없으며 전 영역의 빛을 흡수 한다. 또한 활성산소종을 제거하는 기능이 탁월하나, 때로는 멜라닌 자체가 활성산소를 발생시키기도 하며, 멜라닌 구조 내의 카테콜이나 퀴논에 의하여 다른 물질을 환원시키거나 산화시키고, 멜라닌 자체가 자유라디칼의 성질을 나타내기도 한다. 멜라닌이 과잉생산됨으로써 기미, 주근깨 등을 형성하고, 피부노화를 촉진하며, 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 멜라닌 과잉생산을 예방하는 연구개발이 활발히 진행되고 있다.

이미 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 일부 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료로 이용되고 있으나 상기 물질들은 합성물질이라는 단점과 화장품 제형 중에서의 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 수준에서의 효능?효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자는 좀 더 우수한 화장품 원료를 개발하고자 연구하던 중 소나무 뿌리 추출물이 생물학적 효능을 나타낼 수 있는 활성성분의 양을 증가시키는것을 발견하고 이를 화장료 조성물에 적용하였다.

본 발명은 소나무 뿌리 추출물에 대해 화장료 조성물의 원료로서의 효능을 확인하고, 그 사용 방법을 개발하고, 이 원료를 사용함으로써 우수한 기능성을 갖는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 소나무 뿌리 추출물의 효능을 증대시키기 위한 추출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 소나무 뿌리 추출물에 대하여 화장료 조성물로의 응용 가능성을 연구한 결과, 항산화 효과, 항균력 효과, 주름방지 효과, 미백 효과, 피부 자극완화 효과를 측정한 결과, 그 효과가 우수하여 화장료로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

소나무는 겉씨식물 구과목 소나무과의 상록침엽교목으로 주로 한국, 중국, 북동부, 우수리, 일본등지에 분포한다. 나무 줄기가 붉어서 '적송(赤松)'이라고 부르기도 하고, 주로 내륙 지방에서 자란다 '육송(陸松)'이라고 부르기도 하며, 여인의 자태처럼 부드러운 느낌을 준다고 '여송(女松)'이라 부르기도 한다. 늘푸른 바늘잎나무로 키는 20~35m에 이른다. 나무껍질은 거북등처럼 세로로 넓게 갈라지며 줄기 밑은 회갈색이며 윗부분이 적갈색을 띤다. 바늘잎은 8~9cm 길이로 두 개가 한 묶음이 되어 가지에 촘촘히 붙는다. 암수한그루로 5월 중순에 햇가지에서 꽃이 핀 다. 암꽃은 달걀 모양의 자주색으로 새로 자란 가지 끝에 1~3개가 달리며 수꽃은 그 아래 가지 밑 부분에 풀색에 가까운 흰색을 띠며 여러 개가 촘촘히 모여 달린다. 암수 꽃 피는 시기가 약 10일 정도 차이가 나 자가 수정을 막는다. 솔방울 열매는 꽃이 핀 이듬해 9월에 여무는데 길이 4.5cm, 지름 3cm이며 솔방울 조각은 70~100개쯤 된다. 익으면 조각조각 벌어지면서 날개 달린 씨가 나온다.

소나무는 전체가 좋은 약이다. 소나무잎, 소나무 속껍질, 솔방울, 솔씨, 송진은 말할 것도 없고 소나무 뿌리, 소나무 꽃, 소나무 마디, 뿌리에 생기는 복령, 소나무 아래 나는 송이버섯, 소나무 가지에 늘어져 기생하는 송라(松蘿), 심지어는 소나무 숯까지 중요한 약재로 쓴다. 소나무잎은 싱싱한 것을 따서 쓰는데, 통증과 피를 멎게 하고, 송진은 고약이나 반창고를 만드는데 쓰는데 염증을 빨리 곪게 하고 고름을 빨아낸다. 송화 가루는 기운을 돋우고 피를 멎게 하고 소나무를 베어내고 7~8년이 지난 뒤에 뿌리에서 외생근균이 자라 버섯이 생기는데 이것을 '복령'이라 하며, 입맛을 돋우고 구역질을 없애 주어 중요한 약재로 썼다. 그 밖에도 소나무 씨앗, 속껍질, 봄에 나는 새순도 약으로 썼다.

소나무 뿌리는 근육과 뼈를 튼튼하게 하고 어혈을 없애며 몸 안의 나쁜 것을 없애고 새살을 돋아나게 하는 데 매우 좋은 약재이다. 산후풍과 관절염, 신경통, 요통, 골수염, 골수암에 매우 훌륭한 약이 된다.

본 발명은 소나무 뿌리 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다. 소나무 뿌리는 통상 열수 또는 에탄올, 에칠아세테이트, 핵산, 디에틸에테르의 가용성 유기용매를 용매로 이용하여 추출한다. 초고압을 이용하여 추출하는 것도 가능하며 초고압 추출시 항산화 효과, 항균력 효과, 주름방지 효과, 미백 효과, 자극완화 효과가 열수 또는 에탄올, 에칠아세테이트, 핵산 디에틸에테르의 가용성 유기용매를 이용한 추출물보다 증가한다.

초고압 추출이란 물리적으로 100MPa(1,000atm)를 상회하는 압력을 가하여 추출하는 기술을 말하며, 바다 속 10,000m의 압력 하에 물질을 추출하는 것과 같은 효과를 가지는 추출방법이다. 기존의 열수추출, 초음파추출, 환류추출 등의 추출방법은 추출수율이 낮고 에너지 소비가 많으며, 열로 인한 유용성분의 파괴 및 단백질 변성, 성분의 손실, 열에 대한 불안정성, 색상변화 등의 단점이 있는 반면, 초고압 추출은 추출수율이 높고, 유용성분의 파괴가 적으며, 색상변화, 불쾌취가 적다는 등의 장점을 갖는 유용한 추출방법이다.

본 발명은 소나무 뿌리 시료에 용매를 첨가하는 공정;

초고압 기계의 챔버내에 시료가 함유된 용매를 넣고, 100MPa 이상의 초고압을 가하여 추출하는 가압 공정;

상기 추출물을 시료로부터 분리하는 정제 공정;

상기 정제된 추출물을 동결건조 또는 농축하는 공정;을 포함하는 소나무 뿌리 추출물 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 건조된 소나무 뿌리 시료에 첨가하는 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 클로로포름, 에 틸아세테이트, 디클로로메탄, 헥산, 페트로레움에테르 및 디에틸에테르로 이루어진그룹 중 선택된 1종 이상이다.

또한, 본 발명은 상기 시료를 준비하는 공정 이후 글라스 비드(glass bead), 실리카비드(silica bead) 또는 해사(sea sand)와 같은 조추출물질을 첨가하는 공정을 부가한다.

또한, 본 발명은 소나무 뿌리 추출물의 함량이 화장료 조성물 전체에 대해서0.0001~30.0%중량인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물을 제공한다. 상기 추출물의 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 거의 없으며, 30.0중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.

또한, 본 발명은 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 연고, 에센스, 샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어무스, 립스틱, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 소나무 뿌리 추출을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 소나무 뿌리 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 항산화 효과, 항균력 효과, 주름방지 효과, 미백 효과, 피부 자극을 완화시켜 주는 효과를 나타내었다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1

건조된 소나무 뿌리 시료 60g을 진공백에 담아 물 540g을 첨가한 후 글라스 비드(glass bead, GHM-30, B&K Media, Korea) 6g을 첨가하였다. 조추출물질 첨가 후 진공기(IS-100, Namwoong, Korea)를 이용하여 진공처리하였다. 그 후 초고압장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., Japan)를 이용하여 100MPa(1,000 bar), 25℃, 물(완충용매)을 조건으로 1시간 동안 2중 액상 초고압 처리하였다. 초고압 처리가 완료된 후 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000rpm, 15℃ 조건으로 20분간 원심분리하여 소나무 뿌리 시료 및 조추출물질인 글라스비드와 추출물을 분리하였다. 이렇게 분리된 추출물을 0.8㎛ 또는 0.45㎛ 필터로 여과를 수행하여 여과액을 수득하였고, 이 여과액을 -21℃ 조건에서 동결 전처리 후 동결건조기(Bondiro, Ilshin, Korea)를 이용하여 -80℃, 48시간 동안 동결건조를 실시하여 소나무 뿌리 추출물을 얻었다.

실시예 2

건조된 소나무 뿌리 시료 60g을 진공백에 담아 물 540g을 첨가한 후 진공 기(IS-100, Namwoong, Korea)를 이용하여 진공처리하였다. 그 후 초고압장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., Japan)를 이용하여 100MPa(1,000 bar), 25℃, 물(완충용매) 조건으로 1시간 동안 2중 액상 초고압 처리하였다. 초고압 처리가 완료된 후 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000rpm, 15℃ 조건으로 20분간 원심분리하여 소나무 뿌리 시료와 추출물을 분리하였다. 이렇게 분리된 추출물을 0.8㎛ 또는 0.45㎛ 필터로 여과를 수행하여 여과액을 수득하였고, 이 여과액을 -21℃ 조건에서 동결 전처리 후 동결건조기(Bondiro, Ilshin, Korea)를 이용하여 -80℃, 48시간 동안 동결건조를 실시하여 소나무 뿌리 추출물을 얻었다.

실시예 3

건조된 소나무 뿌리 시료 60g을 진공백에 담아 70% 에탄올 수용액 540g을 첨가한 후 침지 된 시료에 글라스 비드(glass bead, GHM-30, B&K Media, Korea) 6g을 첨가하였다. 조추출물질 첨가 후 진공기(IS-100, Namwoong, Korea)를 이용하여 진공처리 하였다. 그 후 초고압장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., Japan)를 이용하여 100MPa(1,000 bar), 25℃, 물(완충용매) 조건으로 1시간 동안 2중 액상 초고압 처리하였다. 초고압 처리가 완료된 후 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000rpm, 15℃ 조건으로 20분간 원심분리하여 소나무 뿌리 시료 및 조추출물질과 추출물을 분리하였다. 이렇게 분리된 추출물을 0.8㎛ 또는 0.45㎛ 필터로 여과를 수행하여 여과액을 수득하였고, 이 여과액을 농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 60℃, 30hPa, 2시간 동안 농축을 실시, 이 농축 물을 -21℃ 조건에서 동결 전처리 후 동결건조기(Bondiro, Ilshin, Korea)를 이용하여 -80℃, 48시간 동안 동결건조를 실시하여 소나무 뿌리 추출물을 얻었다.

실시예 4

건조된 소나무 뿌리 시료 60g을 진공백에 담아 70% 에탄올 수용액 540g을 첨가한 후 진공기(IS-100, Namwoong, Korea)를 이용하여 진공처리 하였다. 그 후 초고압장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., Japan)를 이용하여 100MPa(1,000 bar), 25℃, 물(완충용매) 조건으로 1시간 동안 2중 액상 초고압 처리하였다. 초고압 처리가 완료된 후 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000rpm, 15℃ 조건으로 20분간 원심분리하여 소나무 뿌리 시료와 추출물을 분리하였다. 이렇게 분리된 추출물을 0.8㎛ 또는 0.45㎛ 필터로 여과를 수행하여 여과액을 수득하였고, 이 여과액을 농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 60℃, 30hPa, 2시간 동안 농축을 실시, 이 농축물을 -21℃ 조건에서 동결 전처리 후 동결건조기(Bondiro, Ilshin, Korea)를 이용하여 -80℃, 48시간 동안 동결건조를 실시하여 소나무 뿌리 추출물을 얻었다.

비교예 1

건조된 소나무 뿌리 시료 60g을 비이커에 담아 물 540g을 첨가한 후 수조(HB-205WP, Hanbaek, Korea)를 이용하여 80℃ 조건으로 1시간 동안 열수처리하였다. 열수처리가 완료된 후 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000rpm, 15℃ 조건으로 20분간 원심분리 하여 소나무 뿌리 시료와 추출물을 분리하였다. 이렇게 분리된 추출물을 0.8㎛ 또는 0.45㎛ 필터로 여과를 수행하여 여과액을 수득하였고, 이 여과액을 -21℃ 조건에서 동결 전처리 후 동결건조기(Bondiro, Ilshin, Korea)를 이용하여 -80℃, 48시간 동안 동결건조를 실시하여 소나무 뿌리 추출물을 얻었다.

비교예 2

건조된 소나무 뿌리 시료 60g을 비이커에 담아 물 540g을 첨가한 후 초음파 장치(5510R-DTH, BARANSON, USA)를 이용하여 20kHz, 750W, 25℃ 조건으로 1시간 동안 초음파처리 하였다. 초음파 처리가 완료된 후 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000rpm, 15℃ 조건으로 20분간 원심분리 하여 소나무 뿌리 시료와 추출물을 분리하였다. 이렇게 분리된 추출물을 0.8㎛ 또는 0.45㎛ 필터로 여과를 수행하여 여과액을 수득하였고, 이 여과액을 -21℃ 조건에서 동결 전처리 후 동결건조기(Bondiro, Ilshin, Korea)를 이용하여 -80℃, 48시간 동안 동결건조를 실시하여 소나무 뿌리 추출물을 얻었다.

비교예 3

건조된 소나무 뿌리 시료 60g을 둥근 플라스크에 담아 70% 에탄올 수용액 540g을 첨가한 후 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃ 조건으로 1시간 동안 열수(환류)처리 하였다. 열수(환류)처리가 완료된 후 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000rpm, 15℃ 조건으로 20분간 원심분리하여 소나무 뿌리 시료와 추출물을 분리하였다. 이렇게 분리된 추출물을 0.8㎛ 또는 0.45㎛ 필터로 여과를 수행하여 여과액을 수득하였고, 이 여과액을 농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 60℃, 30hPa, 2시간 동안 농축을 실시, 이 농축물을 -21℃ 조건에서 동결 전처리 후 동결건조기(Bondiro, Ilshin, Korea)를 이용하여 -80℃, 48시간 동안 동결건조를 실시하여 소나무 뿌리 추출물을 얻었다.

비교예 4

건조된 소나무 뿌리 시료 60g을 비이커에 담아 물 540g을 첨가한 후 초음파장치(5510R-DTH, BARANSON, USA)를 이용하여 20kHz, 750W, 25℃ 조건으로 1시간 동안 초음파처리 하였다. 초음파 처리가 완료된 후 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000rpm, 15℃ 조건으로 20분간 원심분리 하여 소나무 뿌리 시료와 추출물을 분리하였다. 이렇게 분리된 추출물을 0.8㎛ 또는 0.45㎛ 필터로 여과를 수행하여 여과액을 수득하였고, 이 여과액을 농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 60℃, 30hPa, 2시간 동안 농축을 실시, 이 농축물을 -21℃ 조건에서 동결 전처리 후 동결건조기(Bondiro, Ilshin, Korea)를 이용하여 -80℃, 48시간 동안 동결건조를 실시하여 소나무 뿌리 추출물을 얻었다.

실험예 1: 추출수율 비교

본 발명의 추출방법에 따른 소나무 뿌리 추출물의 수율을 확인하기 위하여 건조된 소나무 뿌리 시료 투입량 대비 추출물 수득량을 통해 실시예 1~4, 비교예 1~4의 추출물 수율을 비교하여 표 1에 나타내었다.

추출방법	수율(%)
	물 용매		70% 에탄올 수용액 용매
초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	10.66	실시예3	15.76
초고압 추출	실시예2	8.17	실시예4	13.22
열수(환류) 추출	비교예1	2.69	비교예3	5.07
초음파 추출	비교예2	1.34	비교예4	4.84

상기 표 1에서 나타난 바와 같이, 열수(환류) 추출, 초음파 추출을 실시한 비교예 1~4 보다 초고압 추출을 실시한 실시예 1~4 수율이 두 가지 용매 조건에서 모두 3배 이상 높은 수율을 나타내었으며, 추출시 글라스 비드(glass bead), 실리카 비드(silica bead) 또는 해사(sea sand)와 같은 조추출물질을 첨가하였을때 수율이 높아지는 것을 알 수 있다.

실험예 2: 성분 확인 및 함량 실험

본 발명에 의한 소나무 뿌리 추출물의 주요성분 중 항산화 효과와 관련된 페놀성 물질, 플라보노이드에 대한 총 페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 확인하기 위해 아래와 같이 실험을 수행하였다.

총 페놀 함량 측정

추출물 1㎖에 증류수 10㎖을 첨가한 후, 2㎖의 Folin-Ciocalteu phenol reagent(Sigma)를 첨가하여 혼합한 다음, 실온에서 5분간 반응시켰다. 이 반응물에 20% 소듐 카보네이트 2㎖를 첨가하여 혼합한 다음, 상온에서 1시간 시킨 후 마이크로플레이트 판독기(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 680㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 지표물질은 갈릭산(gallic acid, Sigma, USA)을 사용하였으며, 지표 물질의 농도별 검정곡선을 만들어 각 시료의 흡광도 값을 대입하여 표 2에 나타내었다.

총 플라보노이드 함량 측정

추출물 1.5㎖에 동량의 메탄올에 용해된 2% AlCl₃6H₂O을 혼합한 다음 상온에서 10분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 367㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질은 카테킨(catechin, Sigma, USA)을 사용하였으며, 지표 물질의 농도별 검정곡선을 만들어 각 시료의 흡광도 값을 대입하여 표 2에 나타내었다.

추출용매	추출방법	시료	총 페놀함량 (gallic acid equivalents)(/ of extract)	총 플라보노이드 함량 (catechin equivalents)(/ of extract)
물	초고압추출(조추출물질첨가)	실시예1	216	147
	초고압추출	실시예2	205	116
	열수(환류) 추출	비교예1	139	56
	초음파 추출	비교예2	117	49
70% 에탄올 수용액	초고압추출(조추출물질첨가)	실시예3	397	205
	초고압추출	실시예4	370	189
	열수(환류) 추출	비교예3	154	72
	초음파 추출	비교예4	134	58

상기 표 2의 결과 열수(환류) 추출, 초음파 추출을 한 비교예 1~4 보다 초고압 추출을 한 실시예 1~4의 폴리페놀, 플라보노이드 함량이 두 가시 용매 조건에서 월등히 높은 것을 알 수 있다.

실험예 3: 항산화 효과 측정

본 발명의 상기 소나무 뿌리 추출물에 대한 피부 노화개선 효과 검정시험으로 항산화 효과를 확인하기 위하여 자유라디칼소거시험과 활성산소소거시험을 실시하였다.

자유라디칼 소거시험

안정한 DPPH의 흡광도가 540㎚에서 최대 흡광도를 나타내는 것을 이용, 자유라디칼인 DPPH가 시료에 의해 소거되어 보라색에서 투명한 색이 될수록 즉, 자유라디칼 소거율이 증가될수록 상기 540㎚파장에서 흡광도가 줄어들게 됨을 응용하여 아래와 같은 시험방법에 의해 진행하였다.

먼저 0.1㎜ DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical, Sigma)용액 1㎖에 상기의 실시예 1~4, 비교예 1~4 시료를 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 1㎖를 혼합하고, 37℃에서 15분간 방치한 후 마이크로플레이트 판독기(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 540㎚파장에서 흡광도를 측정하였다.

상기 자유라디칼 소거시험에서 대조군은 DPPH 1㎖과 메탄올 1㎖을 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 메탄올 1㎖과 시료 1㎖을 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.

수학식 1을 이용하여 자유라디칼 소거율을 계산하여 하기 표 3에 나타내었다. 표 3에서 SC₅₀은 자유라디칼을 50% 소거하기 위해 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 항산화 활성이 높음을 나타낸다.

자유라디칼 소거율(%) = 100 - ((시료의 흡광도/대조군의 흡광도)×100)

활성산소 소거시험

잔틴/잔틴산화효소(xanthine/xanthine oxidase, Sigma)의 효소반응에 의한 활성산소 발생을 이용하여 활성산소에 의한 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium, NBT)의 산화를 이용한 흡광도 변화를 측정함으로써 활성 산소의 소거 능을 알 수 있다.

탄산나트륨(Na₂CO₃) 2.4㎖, 잔틴(xanthine,Sigma) 0.1㎖, EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid) 0.1㎖, BSA(bovine serum albumin, Sigma) 0.1㎖, NBT 0.1㎖ 및 시료 0.1㎖을 넣고 볼텍스 믹서(Type 37600 Mixer, Mini mix, USA)를 이용하여 혼합한 후 25℃에서 10분간 방치한 후 잔틴 산화효소(xanthine oxidase) 0.1㎖을 넣고 25℃ 20분간 반응시킨 후, 6㎜ 구리(CuCl_{2 )}를 넣어 반응을 정지시키고, 마이크로플레이트 판독기(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 540㎚파장에서 흡광도를 측정하였다.

상기 활성산소 소거활성시험에서의 대조군은 시료용액 대신 3차 증류수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 잔틴 산화효소(xanthine oxidase) 용액 대신 3차 증류수를 넣어 추출 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.

수학식 2를 이용하여 활성산소 소거율을 수치로 계산하여 표 3에 나타내었다. 표 3에서, IC₅₀은 활성산소를 50% 소거하기 위해 소요되는 시료 농도이며, 값이 작을수록 항산화 활성이 강함을 의미한다.

활성산소 소거율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100)

추출용매	추출방법	시료	자유라디칼소거율SC50(mg/㎖)	활성산소소거율 IC50(mg/㎖)
물	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	0.24	0.19
	초고압 추출	실시예2	0.29	0.24
	열수(환류) 추출	비교예1	0.64	0.59
	초음파 추출	비교예2	0.77	0.67
70% 에탄올 수용액	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예3	0.13	0.09
	초고압 추출	실시예4	0.18	0.11
	열수(환류) 추출	비교예3	0.54	0.41
	초음파 추출	비교예4	0.59	0.55

상기 표 3의 결과 열수(환류) 추출, 초음파 추출 방법을 사용한 비교예 1~4 보다 초고압 추출 방법을 사용한 실시예 1~4가 두 가지 용매 조건에서 모두 월등한 항산화효과를 나타내었다.

실험예 4: 항균력 측정

본 발명의 소나무 뿌리 추출물에 대한 항균력 효과 검정시험으로 고체 배양 희석법과 페이퍼 디스크 방법에 의하여 항균시험을 실시하였다. 실험균주는 한국생명공학연구원으로부터 분양받았으며, 그람양성균으로 포도상구균(Staphylococcus aureus KCTC 6910), 그람음성균으로 녹농균(Pseudomonas aeruginosa KCTC 1637), 대장균(E. Coli KCTC 1039), 효모로는 캔디다 효모(Candida albicans KCTC 7965), 사상균으로 흑국균(Aspergillus niger KCTC 6910) 이상 총 4종의 균주를 사용하였다.

고체 배양 희석법( Agar Serial Dilution Method )

세균류는 트립틱 소이 배지를 사용하였고, 배지에 균을 접종하여 37℃ 진탕 배양기에서 24시간 동안 전배양하여 사용하였다. 효모의 배양에는 포테이토 덱스트로스 배지를 사용하였고 배지에 균을 접종하여 25℃ 진탕 배양기에서 2일간 전배양하여 사용하였다. 사상균의 배양에는 포테이토덱스트로스 한천배지를 사용하였고 배지에 균을 접종하여 25℃ 배양기에서 7일간 전배양하여 사용하였다.

좀더 구체적인 항균시험은 먼저 세균의 경우, 트립틱 소이 배지에 균을 접종하여 37℃에서 24시간 전배양하여 준비하고, 효모의 경우, 포테이토 덱스트로스 배지에 균을 접종하여 25℃에서 2일간 전배양하며, 사상균은 포테이토 덱스트로스 한천배지에 균을 접종하여 25℃ 배양기에서 7일간 전배양한 후, 도말봉을 이용, 배지 표면에 형성된 사상균의 포자를 회수하여 멸균된 식염수에 희석하여 사용하였다. 멸균된 패트리 디쉬에 시료 및 실험균종 별로 5% DMSO(Dimethylsulfoxide) 생리식염수용액에 적절한 농도로 희석한 각각의 추출물을 2㎖씩 넣고, 대조군은 5% 생리식염수 용액에 적절한 농도로 희석한 각 시료 2㎖씩 넣고, 대조군은 5% DMSO(Dimethylsulfoxide) 생리식염수용액 2㎖을 넣은 후, 각 패트리 디쉬에 멸균하고 48℃로 냉각한 트립틱소이 한천배지 및 포테이토덱스트로스 한천배지를 18㎖씩 첨가하여 교반 후 정지하여 응고시켰다.

이후 전배양시킨 각각의 시험균을 세균의 경우 최종농도 약 1 X 10⁶CFU/㎖ 의 균농도로 각각의 페트리디쉬에 도말하고, 효모의 경우 1 X 10⁵CFU/㎖, 상균의 경우 약 1 X 10⁴CFU/㎖의 균농도로 각각의 페트리디쉬에 도말한다. 각각의 페트리 디쉬는 세균은 37℃에서 24시간 배양하고 효모는 25℃에서 3일간 배양, 사상균은 25℃ 배양기에서 7일간 배양한 후 각 구획 안에 클로니 형성여부를 관찰하여 성장이 되지 않은 평판의 최소 시료 농도를 최소저해농도(MIC, Minimum inhibitory concentration)로 하며, 그 결과를 표 4에 나타내었다. 이때, 최소저해농도는 값이

작을수록 항균효과가 높음을 의미한다.

균주	추출방법	최소저해농도(MIC, ug/㎖)
		물 용매		70% 에탄올 수용액 용매
S. aureus	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	320	실시예3	160
	초고압 추출	실시예2	360	실시예4	190
	열수(환류) 추출	비교예1	510	비교예3	220
	초음파 추출	비교예2	530	비교예4	290
P. aeruginosa	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	300	실시예3	160
	초고압 추출	실시예2	310	실시예4	170
	열수(환류) 추출	비교예1	500	비교예3	200
	초음파 추출	비교예2	550	비교예4	260
E. Coli	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	210	실시예3	110
	초고압 추출	실시예2	260	실시예4	120
	열수(환류) 추출	비교예1	290	비교예3	180
	초음파 추출	비교예2	340	비교예4	210
C. albicans	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	280	실시예3	140
	초고압 추출	실시예2	290	실시예4	160
	열수(환류) 추출	비교예1	410	비교예3	400
	초음파 추출	비교예2	490	비교예4	490
A. niger	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	150	실시예3	70
	초고압 추출	실시예2	170	실시예4	80
	열수(환류) 추출	비교예1	250	비교예3	140
	초음파 추출	비교예2	280	비교예4	160

표 4에 나타난 바와 같이, 열수(환류) 추출, 초음파 추출 방법을 사용한 비교예 1~4 보다 초고압 추출 방법을 사용한 실시예 1~4가 4종의 세균, 효모, 사상균에 대하여 두 가지 용매 조건에서 모두 월등한 항균력 효과를 나타내었다.

페이퍼 디스크 방법

평판 배지에 배양된 각 균주를 1 백금이량 취해서 액체 배지 10㎖에서 24시간 배양하여 활성화시킨 후 다시 액체 배지 10㎖에 균액을 0.1㎖ 접종하여 6시간배양한 후 평판배지 1개당 균액을 약 10⁷CFU/㎖이 되게 접종하여 멸균된 도말봉으로 균일하게 도말하였다. 그 후 멸균된 페이퍼 디스크(6㎜, Satorius, Germany)를 고체 평판 배지에 올려놓은 다음 용매에 녹인 실험예, 비교예의 시료를 0.05㎖/디스크가 되도록 흡수시켜 배양하였다. 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 아에루기노사( Pseudomonas aeruginosa ), 이콜리(E. Coli)는 37℃, 진균 종류인 칸디다 알비칸스(Candida albicans ), 아스퍼길러스 나이거(Aspergillus niger )는 27℃에 각 각 24시간, 120시간 배양하여 디스크 주위 투명존의 직경을 측정하였다. 비교군으로 항균활성이 강력하다고 알려진 메틸 파라벤을 사용하였으며, 결과는 표 5에 나타내었다. 이때, 디스크 주위의 투명존은 해당 균주에 대해 증식억제 정도의 지표이며, 직경이 클수록 해당 균주에 대해 항균력 효과가 높음을 의미한다.

균주	추출방법	투명존 직경(㎜)
		물 용매		70% 에탄올 수용액 용매
S. aureus	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	13	실시예3	16
	초고압 추출	실시예2	11	실시예4	15
	열수(환류) 추출	비교예1	7	비교예3	8
	초음파 추출	비교예2	-	비교예4	7
	메틸 파라벤	11
P. aeruginosa	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	10	실시예3	16
	초고압 추출	실시예2	8	실시예4	14
	열수(환류) 추출	비교예1	-	비교예3	10
	초음파 추출	비교예2	-	비교예4	8
	메틸 파라벤	12
E. Coli	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	11	실시예3	21
	초고압 추출	실시예2	8	실시예4	19
	열수(환류) 추출	비교예1	-	비교예3	11
	초음파 추출	비교예2	-	비교예4	9
	메틸 파라벤	18
C. albicans	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	11	실시예3	14
	초고압 추출	실시예2	10	실시예4	12
	열수(환류) 추출	비교예1	9	비교예3	8
	초음파 추출	비교예2	7	비교예4	7
	메틸 파라벤	13
A. niger	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	11	실시예3	28
	초고압 추출	실시예2	9	실시예4	26
	열수(환류) 추출	비교예1	-	비교예3	18
	초음파 추출	비교예2	-	비교예4	11
	메틸 파라벤	24

- : 효과 없음

표 5에서 나타난 바와 같이, 열수(환류) 추출, 초음파 추출 방법을 사용한 비교예 1~4 보다 초고압 추출 방법을 사용한 실시예 1~4가 세균, 효모, 사상균에 대하여 두 가지 용매 조건에서 모두 더 넓은 투명존 직경을 나타내어 월등한 항균력 효과를 나타내었으며, 특히 70% 에탄올 수용액을 용매로 사용한 초고압 추출물은 강력한 항균제로 알려진 메틸파라벤보다 4종의 세균, 효모, 사상균에 대해 더 강력한 항균활성을 나타내었다.

실험예 5: 티로시나제 활성저해 시험

본 발명의 소나무 뿌리 추출물의 미백효과를 검정하기 위해 티로시나제(tyrosinase)라는 효소의 기능이 억제되는 정도를 평가하였다. 티로시나제는 생체내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 멜라닌이란 흑색의 고분자로서 생체 내에서 상기와 같은 산화에 의해 멜라닌이 형성되어 피부 상층부로 이동하게 되면 피부가 검게 변하고 기미, 주근깨를 생성하게 된다. 이러한 티로시나제의 작용을 억제하는 정도를 측정하여 미백효과를 검정하는 방법(Pomerantz S. H., J. Biochem., 24:161-168, 1966)을 응용해 판정하였다. 시험방법은 아래와 같다.

시료 0.9㎖, 0.1M 인산완충액(pH 6.8) 1.0㎖ 및 1.5㎜ L-티로신 용액 1.0㎖을 넣은 후, 37℃에서 10분간 유지시켰다. 머쉬룸 티로시나제(1,500 units/㎖) 0.1㎖를 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, UV-vis spectrophotometer(Smartspec Plus, Biorad, USA)를 사용하여 475㎚에서 흡광도를 측정하여 티로시나제에 대한 저해율을 측정하였다.

상기 티로시나제 활성저해시험을 위한 대조군은 시료액 대신 완충용액을 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 티로시나제 대신 완충용액을 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻은 경우로 설정하였다. 효과를 판단하기 위해 실험에 사용한 비교군은 여러 연구결과에서 미백효과가 뛰어나다고 알려진 알부틴 (Arbutin synthetic, Sigma)을 비교하였고, 수학식 3을 이용하여 티로시나제 저해율을 수치로 계산하여 표 6에 나타내었다. 표 6에서, IC₅₀은 티로시나제 활성을 50 % 저해하는데 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 저해율이 높음을 나타낸다.

티로시나제 저해율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100)

추출방법	티로시나제 저해율(IC50, ug/㎖)
	물 용매		70% 에탄올 수용액 용매
초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	64	실시예3	32
초고압 추출	실시예2	86	실시예4	38
열수(환류) 추출	비교예1	219	비교예3	150
초음파 추출	비교예2	301	비교예4	179
알부틴	30

표 6에 나타난 바와 같이, 열수(환류) 추출, 초음파 추출 방법을 사용한 비교예 1~4 보다 초고압 추출 방법을 사용한 실시예 1~4가 두 가지 용매 조건에서 모두 월등한 미백 효과를 나타내었으며, 특히 70% 에탄올 수용액 용매를 사용한 초고압 추출물은 강력한 미백제로 알려진 알부틴과 거의 비슷한 강력한 미백 효과를 나타내었다.

실험예 6: 엘라스테이즈 활성저해시험

본 발명의 소나무 뿌리 추출물 시료의 피부주름 억제 및 개선 효과를 검정하기 위하여 엘라스테이즈 활성저해시험(elastase inhibition activity test)을 실시하였다. 엘라스틴은 피부 진피 내 매트릭스층을 구성하는 성분으로 피부가 노화됨에 따라 엘라스틴이 분해되고 진피 내 매트릭스층이 무너지며 주름이 생기게 된다. 이러한 원리를 이용하여 엘라스틴(elastin)을 분해하는 효소인 엘라스테이즈의 활성을 측정하는 방법으로 엘라스테이즈 기질인 N-석시닐-(Ala)₃ p-니트로아닐린(N-succinyl-(Ala)₃ p-nitroaniline, Sigma)을 이용하여 p-니트로아닐린이 분해되면서 생기는 색의 변화를 405㎚의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 엘라스테이즈 활성을 측정하는 방법이다. 완충액은 pH 8.0, 0.267 M Trizma-HCl (Sigma), 기질액은 8.8㎜ N-석시닐-(Ala)₃ p-니트로아닐린, 효소액은 돼지췌장 엘라스테이즈를 10ug/㎖ (Elastase, Sigma, USA)의 농도로 사용하였다. 완충액 60㎕, 기질액 20㎕와 상기 소나무 뿌리 추출물 시료 각각을 농도별로 3차 증류수에 희석한 시료액 100㎕를 섞은 후, 효소액 20㎕를 넣어 25℃ 항온수조에서 15분간 반응시켜 p-니트로아닐린의 생성량을 마이크로플레이트 판독기(UVT-06685, Thermo max, USA)를 사용하여 파장 405㎚에서 측정하였다. 이때, 엘라스테이즈 활성도를 측정하기 위한 대조군은 시료 대신 3차 증류수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 효소액 대신 3차 증류수를 넣어 각각에 대한 색 보정값을 얻은 경우를 설정하였다. 시험에 사용한 시료는 상기 실시예, 비교예의 소나무 뿌리 추출물 그리고 엘라스테이즈 활성저해효과를 판단하기 위해 엘라스테이즈의 특이 저해제인 PMSF(phenylmethyls㎕fonyl fluoride; Sigma, USA)를 비교군으로 설정하였고, 수학식 4를 이용하여 엘라스테이즈 저해율을 수치로 계산하여 표 7에 나타내었다. 표 7에서 IC₅₀은 엘라스테이즈 활성을 50% 저해하기 위해 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 저해율이 높음을 나타낸다.

엘라스테이즈 활성저해율(%) = 100 - ((시료의 흡광도/대조군의 흡광도) x 100)

추출방법	엘라스테이즈 활성저해율(IC50, mg/㎖)
	물 용매		70% 에탄올 수용액 용매
초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	64.13	실시예3	3.14
초고압 추출	실시예2	75.81	실시예4	5.13
열수(환류) 추출	비교예1	89.67	비교예3	9.88
초음파 추출	비교예2	100 이상	비교예4	13.79
PMSF	0.07

표 7에 나타난 바와 같이, 열수(환류) 추출, 초음파 추출 방법을 사용한 비교예 1~4 보다 초고압 추출 방법을 사용한 실시예 1~4가 두 가지 용매 조건에서 모두 월등한 주름개선 효과를 나타내었다.

실험예 7: 콜라겐 합성 효과 시험

본 발명의 소나무 뿌리 추출물의 피부 주름개선 효과를 검정하기 위하여 콜라겐 합성능을 측정하였다. 콜라겐은 상기 엘라스틴과 함께 피부 내 진피 매트릭스층을 이루는 구성성분으로서 피부가 서서히 노화되어가며 진피 내 매트릭스층을 이루고 있는 구성성분들이 분해되어 감으로 주름이 생성되는데, 진피 매트릭스층의 구성성분인 콜라겐의 합성효과를 확인함으로써 피부 주름을 개선시키는 효과를 확인 할 수 있다.

사람의 정상 섬유아세포(human dermal fibroblast)를 24-웰 마이크로플레이트에 접종시키고(1 X 10⁵ 세포/웰) 37℃, 5 % 농도의 CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 각 시료들을 농도별로 첨가한 혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 콜라겐 합성량은 효소면역측정법을 이용하여 다음과 같이 수행한다.

24시간 배양한 배지를 96-웰 마이크로플레이트에 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 세척 버퍼(PBS-T; 0.05% Tween 20 in phosphate buffered saline)로 3회 세척하고 블로킹 용액(5% skin milk, Fluka)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 용액을 버리고 세척 버퍼로 3회 세척하고, 일차항체(rabbit anti-collagen type I, Sigma)를 PBS-T에 희석하여 100㎕씩 가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척한 다음, 이차 항체(anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate, Sigma)를 PBS-T에 희석하여 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척 후, 기질용액(alkaline phosphatase substrate solution, Sigma)을 100㎕씩 넣고 항온 25℃에서 발색시킨 후, 마이크로플레이트 판독기(UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.

콜라겐 합성효과를 측정하기 위한 대조군은 시료를 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도이며, 콜라겐 합성효과를 판단하기 위해 아스코르빈산을 비교군으로 설정하여 각각 3회씩 실시, 평균값을 구하였다.

수학식 5를 이용하여 콜라겐 합성효과를 수치로 계산하여 표 8에 나타내었다.

콜라겐 합성효과(%)	추출용액	추출방법	시료	농도(ug/㎖)
				0	1	10	100
	물	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	100.00	104.21	106.66	113.47
		초고압 추출	실시예2	100.00	102.13	103.70	109.80
		열수(환류) 추출	비교예1	100.00	100.10	98.64	100.81
		초음파 추출	비교예2	100.00	97.68	96.76	99.35
	70% 에탄올 수용액	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예3	100.00	107.89	117.60	129.89
		초고압 추출	실시예4	100.00	106.70	113.64	119.29
		열수(환류) 추출	비교예1	100.00	102.31	109.80	111.42
		초음파 추출	비교예2	100.00	101.55	107.14	110.84
	아스코르빈산			100.00	108.45	123.57	131.58

상기 표 8에 나타난 바와 같이, 열수(환류) 추출, 초음파 추출 방법을 사용한 비교예 1~4 보다 초고압 추출 방법을 사용한 실시예 1~4가 두 가지 용매 조건에서 모두 월등한 주름개선 효과를 나타내었다.

실험예 8: 자외선 조사 후 소나무 뿌리 추출물에 의한 MMP -1 발현억제 평가

본 발명의 소나무 뿌리 추출물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하여 MMP-1 발현억제를 검정하기 위해서 효소면역분석법(ELISA)를 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정한다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96-웰에 코팅한다. 일차항체(MMP-1(Ab-5) 단일클론항체와 MMP-2(Ab-3) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분 반응시킨다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1mg/㎖ ρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 판독기(UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 405㎚에서 흡광도를 측정한다. 이때, 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하고, MMP-1 발현 억제 평가를 하기 위해 MMP-1 발현 억제효과가 뛰어나다고 알려진 레티놀을 비교군으로 설정하여 결과를 표 9에 나타내었다.

추출용매	추출방법	시료	처리농도(%)	MMP-1 발현억제율(%)
물	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	0.1	10
	초고압 추출	실시예2	0.1	8
	열수(환류) 추출	비교예1	0.1	3
	초음파 추출	비교예2	0.1	1
70% 에탄올 수용액	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예3	0.1	36
	초고압 추출	실시예4	0.1	27
	열수(환류) 추출	비교예3	0.1	14
	초음파 추출	비교예4	0.1	8
레티놀			0.1	18

상기 표 9에 나타난 바와 같이, 열수(환류) 추출, 초음파 추출 방법을 사용한 비교예 1~4 보다 초고압 추출 방법을 사용한 실시예 1~4가 두 가지 용매 조건에서 모두 월등한 MMP-1 발현 억제효과를 나타내었고, 특히 자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 초고압 소나무 뿌리 추출물은 36% 이상의 억제율을 보였으며, 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율보다 우수한 결과를 나타내었다.

실험예 9: B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정

본 발명의 소나무 뿌리 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단하였다.

본 실험예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실험예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호 : 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6 웰 플레이트에 각 웰당 2 × 10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 trypsin-EDTA로 떼어 낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄 (Lotan : Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50㎜ 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 ㎜ PMSF) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1 N NaOH (10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로플레이트 판독기(UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 405㎚에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율 (%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 6에 의하여 계산, 표 10에 나타냈으며, 이때, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도로 낮을수록 멜라닌 생성 저해효과가 높음을 의미한다.

저해율(%) = [(A-B)/A] X 100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

추출용매	추출방법	시료	처리농도(%)	멜라닌 합성 저해율(IC50)
물	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	0.1	0.71
	초고압 추출	실시예2	0.1	0.94
	열수(환류) 추출	비교예1	0.1	2.65
	초음파 추출	비교예2	0.1	3.88
70% 에탄올 수용액	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예3	0.1	0.19
	초고압 추출	실시예4	0.1	0.21
	열수(환류) 추출	비교예3	0.1	0.89
	초음파 추출	비교예4	0.1	1.54
알부틴			0.1	0.21

상기 표 10에 나타난 바와 같이, 열수(환류) 추출, 초음파 추출 방법을 사용한 비교예 1~4 보다 초고압 추출 방법을 사용한 실시예 1~4가 두 가지 용매 조건에서 모두 월등한 멜라닌 생성 억제효과를 나타내었고, 특히 초고압 소나무 뿌리 추출물의 IC₅₀값은 0.19%로 기존의 미백제인 알부틴에 비해 우수한 효과를 나타내었다.

실험예 10: 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과

본 발명의 소나무 뿌리 추출물의 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과를 확인하기 위해 아래와 같이 실험하였다.

섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1 X 10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15 W, Sankyo Dennki, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/cm²를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10 % FBS가 첨가된 것) 1㎖을 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 소나무 뿌리 추출물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕ 배지와 MTT 용액(2.5mg/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100 ㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기(UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 565㎚ 흡광도를 측정하였다. 수학식 7에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 8에 의하여 계산하여 표 11에 나타내었다.

세포생존율(%) =〔(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 세포배양 배지만을 발색 반응한 웰의 565㎚ 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565㎚ 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565㎚ 흡광도

자외선에 의한 세포독성 완화율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

추출용매	추출방법	시료	처리농도(%)	세포독성 완화율(%)
물	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	0.1	21
	초고압 추출	실시예2	0.1	18
	열수(환류) 추출	비교예1	0.1	11
	초음파 추출추출	비교예2	0.1	9
70% 에탄올 수용액	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예3	0.1	38
	초고압 추출	실시예4	0.1	30
	열수(환류) 추출	비교예3	0.1	18
	초음파 추출	비교예4	0.1	14

상기 표 11에 나타난 바와 같이, 열수(환류) 추출, 초음파 추출 방법을 사용한 비교예 1~4 보다 초고압 추출 방법을 사용한 실시예 1~4가 두 가지 용매 조건에서 모두 월등한 세포독성 완화율을 나타내어 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

실험예 11: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

본 발명의 소나무 뿌리 추출물의 자외선조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 확인하기 위해 아래와 같이 실험하였다.

사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5 X 10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/cm²를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 소나무 뿌리 추출물을 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량하여 소나무 뿌리 추출물의 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked I㎜unosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 9에 의해 계산하였고, 그 결과를 표 12에 나타내었다.

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량

추출용매	추출방법	시료	처리농도(%)	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
물	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예1	0.1	18
	초고압 추출	실시예2	0.1	12
	열수(환류) 추출	비교예1	0.1	6
	초음파 추출추출	비교예2	0.1	3
70% 에탄올 수용액	초고압 추출(조추출물질 첨가)	실시예3	0.1	43
	초고압 추출	실시예4	0.1	41
	열수(환류) 추출	비교예3	0.1	24
	초음파 추출	비교예4	0.1	20

상기 표 12에 나타난 바와 같이, 열수(환류) 추출, 초음파 추출 방법을 사용한 비교예 1~4 보다 초고압 추출 방법을 사용한 실시예 1~4가 두 가지 용매 조건에서 모두 월등한 염증성 사이토카인 발현 억제율을 나타내어 자외선에 의한 염증 발생을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

[ 제형실시예 1 및 제형비교예 1]

상기 실시예에 따른 초고압 소나무 뿌리 추출물을 포함한 영양크림의 성분구성을 하기 표 13과 같이 구성하여 제조하였다

번호	성 분	제형 실시예 1	제형 비교예 1
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	시료 1	2.0	-
17	증류수	잔량	잔량
18	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 13의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12~17의 수성성분을 80℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1~11을 80℃로 가온하여 상기 원료 12~17의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, Japan)를 이용하여 3,000rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 18를 투입하여 5분간 교반시킨 후 실온으로 냉각하였다.

[ 제형실시예 2 및 제형비교예 2]

상기 실시예에 따른 초고압 소나무 뿌리 추출물을 포함한 영양크림의 성분구성을 14과 같이 구성하여 제조하였다.

번호	성 분	제형 실시예 2	제형 비교예 2
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	시료 2	2.0	-
17	증류수	잔량	잔량
18	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 14의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12~17의 수성성분을 80℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1~11을 80℃로 가온하여 상기 원료 12~ 17의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, Japan)를 이용하여 3,000rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 18를 투입하여 5분간 교반시킨 후 실온으로 냉각하였다.

[ 제형실시예 3 및 제형비교예 3]

상기 실시예에 따른 초고압 소나무 뿌리 추출물을 포함한 영양크림의 성분구성을 표 15와 같이 구성하여 제조하였다.

번호	성 분	제형 실시예 3	제형 비교예 3
1	시료 5	2.0	-
2	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
3	스테아린산	1.5	1.5
4	세테아릴 알콜	2.2	2.2
5	밀납	1.0	1.0
6	스쿠알란	3.0	3.0
7	경화식물유	1.0	1.0
8	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
9	광물유	5.0	5.0
10	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
11	디메치콘	1.0	1.0
12	트리옥타노인	5.0	5.0
13	베타인	3.0	3.0
14	트리에탄올아민	1.0	1.0
15	글리세린	5.0	5.0
16	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
17	증류수	잔량	잔량
18	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 15의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 13~17의 수성성분을 80℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1~11을 80℃로 가온하여 상기 원료 13~17의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, Japan)를 이용하여 3,000rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 18를 투입하여 5분간 교반시킨 후 실온으로 냉각하였다.

[ 제형실시예 4 및 제형비교예 4]

상기 실시예에 따른 초고압 소나무 뿌리 추출물을 포함한 영양크림의 성분구성을 표 16과 같이 구성하여 제조하였다.

번호	성 분	제형 실시예 4	제형 비교예 4
1	시료 6	2.0	-
2	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
3	스테아린산	1.5	1.5
4	세테아릴 알콜	2.2	2.2
5	밀납	1.0	1.0
6	스쿠알란	3.0	3.0
7	경화식물유	1.0	1.0
8	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
9	광물유	5.0	5.0
10	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
11	디메치콘	1.0	1.0
12	트리옥타노인	5.0	5.0
13	베타인	3.0	3.0
14	트리에탄올아민	1.0	1.0
15	글리세린	5.0	5.0
16	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
17	증류수	잔량	잔량
18	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 16의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 13~17의 수성성분을 80℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1~11을 80℃로 가온하여 상기 원료 13~17의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, Japan)를 이용하여 3,000rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 18을 투입하여 5분간 교반시킨 후 실온으로 냉각하였다.

실험예 12: 미백효과 측정

상기 제형 실시예 및 제형 비교예에서 제조된 영양크림의 미백효과를 측정하기 위하여 다음과 같은 방법을 통하여 측정하였다. 기미, 주근깨 및 색소 침착증을 갖고 있는 25세이상 여성 20명을 대상으로 상기 제형 실시예 및 제형 비교예의 영양크림을 12주간 사용하게 한 후 피부색의 변화를 조도색차계(CR-410, Minolta, Japan)를 이용하여 색의 밝기 변화(ΔL)를 측정하였다. 총 20명의 평균값을 통하여 계산하였으며, 밝기 변화 값이 클수록 미백효과가 높음을 의미한다. 실험 결과는 표 17과 같다.

	평균값
	제형 실시예1	제형 비교예1	제형 실시예2	제형 비교예2	제형 실시예3	제형 비교예3	제형 실시예4	제형 비교예4
피부색 밝기 변화(L)	4.32	0.29	4.13	0.39	7.97	0.58	6.88	0.23

상기 표 17의 결과와 같이 초고압 소나무 뿌리 추출물이 첨가된 제형 실시예의 영양크림은 초고압 소나무 뿌리 추출물이 첨가되지 않은 제형 비교예의 영양크림과 비교하였을 때, 미백효과가 월등히 우수함을 확인하였다.

실험예 13: 주름개선효과 측정

상기 제형 실시예 및 제형 비교예에서 제조된 영양크림의 주름개선효과를 측정하기 위하여 다음과 같은 방법을 통하여 측정하였다. 피부노화가 진행중인 30대이상 여성 40명을 대상으로 상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1의 영양크림을 12주간 양쪽 눈가주름(crow feets)부위에 사용하게 한 후 4주, 8주, 12주 간격으로 눈가 주름 주형(replica)을 영상분석법으로 Skin visiometer(SV-600, C+K, Germany)를 이용하여 주름의 깊이(㎛)를 측정하고, 그 결과를 표 18에 나타내었다.

	평균값(A.U.)
	제형 실시예1	제형 비교예1	제형 실시예2	제형 비교예2	제형 실시예3	제형 비교예3	제형 실시예4	제형 비교예4
도포 전	328 ±17	322±15	337±11	315±12	321±18	330±21	322±12	324±13
도포 12주 후	263±13	316±18	269±21	311±29	234±16	319±15	239±11	315±15
주름깊이 감소율(%)	19.8	1.9	20.2	1.3	27.1	3.3	25.8	2.8

상기 표 18의 결과와 같이 초고압 소나무 뿌리 추출물이 첨가된 제형 실시예의 영양크림은 초고압 소나무 뿌리 추출물이 첨가되지 않은 제형 비교예의 영양크림과 비교하였을 때, 주름 개선효과가 월등히 우수함을 확인하였다.

실험예 14: HPLC 분석

본 발명의 소나무 뿌리 추출물의 성분함량 비교를 위하여 HPLC(High pressure liquid chromatography)를 이용해 분석을 수행하였다. 시료는 각 용매로 적당 농도를 제조하여 0.2㎛ 필터에 여과, 전처리 후 기기에 주입하였다. 기기는 HPLC(Agilent 1200series, Agilent, USA)를 사용하여 UV 254~340㎚ 영역에서 분석하였으며, C₁₈컬럼(Zorbax XDB-C₁₈ 4.6 x 250㎜, Agilent, USA)을 사용하여 2% 아세트산 용매와 아세토니트릴 용매를 사용한 기울기 용법으로 분석하였다. 분석에 사용된 용매는 HPLC급 시약을 사용하였으며, 표준물질로는 탁시폴린(Fluka, USA), 탁시폴린-3-글루코사이드(Huisong, China)를 사용하여 성분분석을 수행하였다. 분석결과는 [도 1]과 같다.

이하, 본 발명의 제형예로서 유연 화장수(표 19), 수렴화장수(표 20), 영양 화장수(표 21), 에센스(표 22) 및 팩(표 23)을 예시하나 본 발명의 화장료 조성물의 제형은 이에 제한되는 것으로 해석해서는 안되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	5.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	3.00
3	PEG 1500	1.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	에탄올	10.00
9	옥틱도데세스-16	0.20
10	폴리솔베이트 20	0.20
11	초고압 소나무 뿌리 추출물	5.0
12	방부제, 향, 색소	미량
13	증류수	잔량

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	2.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	2.00
3	알란토인	0.10
4	DL-판테놀	0.30
5	EDTA-2Na	0.02
6	벤조페논-9	0.04
7	에탄올	15.00
8	폴리솔베이트 20	0.20
9	초고압 소나무 뿌리 추출물	3.0
10	구연산	미량
11	방부제, 향, 색소	미량
12	증류수	잔량

번호	성 분	함량(%)
1	세테아릴 알콜	1.00
2	글리세릴스테아레이트	0.50
3	폴리소르베이트 60	1.00
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.30
5	세틸옥타노에이트	6.00
6	스쿠알란	4.00
7	샤플라워오일	4.00
8	부틸렌글라이콜	4.00
9	글리세린	4.00
10	카보머	0.10
11	트리에탄올아민	0.10
12	초고압 소나무 뿌리 추출물	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	10.00
2	베타인	5.00
3	PEG 1500	2.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	히드록시에틸 셀룰로오스	0.10
9	카르복시비닐 폴리머	0.20
10	트리에탄올아민	0.18
11	옥틸도데칸올	0.30
12	옥틸도데세스-16	0.40
13	에탄올	6.00
14	초고압 소나무 뿌리 추출물	5.00
15	방부제, 향, 색소	미량
16	증류수	잔량

번호	성 분	함량(%)
1	폴리비닐 알콜	15.00
2	셀룰로오스 검	0.15
3	글리세린	3.00
4	PEG 1500	2.00
5	시이크데스트린	0.15
6	DL-판테놀	0.30
7	알란토인	0.10
8	글리시리진산 모노암모늄	0.20
9	니코틴 아미드	0.40
10	에탄올	5.00
11	PEG 40 경화피마자유	0.30
12	초고압 소나무 뿌리 추출물	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

도 1a 및 도1b는 소나무 뿌리 초고압 추출물의 HPLC 성분분석 크로마토그램에 관한 것이다.

Claims (6)

1. 소나무 뿌리 시료에 에탄올을 첨가하는 공정;

   초고압 기계의 챔버 내에 시료가 함유된 에탄올을 넣고, 100MPa 이상의 초고압을 가하여 추출하는 가압 공정;

   상기 추출물을 상기 시료로부터 분리하는 분리?정제 공정;을 포함하는 방법으로 제조되어 탁시폴린-3-글루코사이드(Taxifolin-3-glucoside) 함량이 증가된 소나무 뿌리 추출물을 0.001~30.0중량% 함유하는 항산화, 항균, 피부 주름개선, 피부 미백, 피부 자극 완화용 화장료 조성물.
2. 청구항 1에 있어서,

   상기 화장료 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 연고, 에센스, 샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어무스 및 립스틱의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 삭제
4. 청구항 1에 있어서,

   상기 시료에 에탄올을 첨가하는 공정 이후 글라스 비드(glass bead), 실리카비드(silica bead) 또는 모래(sand)와 같은 조추출물질을 첨가하는 공정;이 부가되어 제조되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 소나무 뿌리 시료에 에탄올을 첨가하는 공정;

   초고압 기계의 챔버내에 시료가 함유된 에탄올을 넣고, 100MPa 이상의 초고압을 가하여 추출하는 가압 공정;

   상기 추출물을 상기 시료로부터 분리하는 분리?정제 공정;

   상기 정제된 추출물을 동결건조 또는 농축하는 공정;을 포함하는 탁시폴린-3-글루코사이드 (Taxifoline-3-glucoside) 함량이 증가된 소나무 추출물 제조방법.
6. 청구항 5에 있어서,

   상기 시료에 에탄올을 첨가하는 공정 이후 글라스 비드(glass bead), 실리카비드(silica bead) 또는 모래(sand)와 같은 조추출물질을 첨가하는 공정을 부가하는 것을 특징으로 하는 탁시폴린-3-글루코사이드 (Taxifoline-3-glucoside) 함량이 증가된 소나무 추출물 제조방법.

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