MX2009000693A - Uso de un hidrolizado de proteina de arroz como principio activo pigmentador. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de un hidrolizado de proteína de arroz para pigmentar la piel y sus extensiones; de esta manera, es posible intensificar la pigmentación normal de la piel sin la luz solar; las áreas preferidas de aplicación son la repigmentación de manchas blancas de la piel, repigmentación de manchas blancas de la piel originadas por pitiriasis o debidas al uso de corticosteroides dérmicos, aceleración e intensificación del proceso de bronceado, estimulación de la fotoprotección constitutiva y mejoramiento del fototipo, prevención de la fotocarcinogénesis; ventajosamente, el hidrolizado de proteína de arroz comprende péptidos de los cuales por lo menos 50% tienen un peso molecular en la escala de entre 300 Da y 3,500 Da.

Description

USO DE UN HIDROLIZADO DE PROTEINA DE ARROZ COMO PRINCIPIO ACTIVO PIGMENTADOR MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere al uso de por lo menos un hidrolizado de proteína de arroz como un ingrediente activo pigmentador en una composición dermatológica, cosmética, o nutracéutica. La melanina es un pigmento que, en el hombre, es responsable del color de la piel, el cabello y los ojos. La melanina es producida por los melanocitos, células encontradas en la epidermis, partiendo del aminoácido tirosina. La tirosinasa transforma la tirosina en DOPA y después en DOPA-quinona. Después varias enzimas actúan para formar la melanina. En los melanocitos, la melanina se encuentra en los organelos intracelulares (melanosomas). Estos melanosomas son transferidos por los melanocitos por medio de estructuras de tipo brazo (dendritas) hacia los queratinocitos cercanos. Los melanosomas proveen una función protectora con respecto a la radiación UV colocándose encima del núcleo de los queratinocitos, de manera muy semejante a una sombrilla. Los melanocitos se localizan en la unión dermo-epidérmica y se acomodan entre los queratinocitos de la capa basal. Un melanocito protege 36 queratinocitos; ésta es la denominada unidad de melanina. En el hombre, la melanina es responsable de la pigmentación constitutiva y el bronceado. Por medio del bronceado, protege al ADN de las células de la piel de los rayos ultravioleta (UV) del sol (UVA y UVB). Durante una exposición prolongada al sol, el cuerpo se broncea debido a que fabrica más melanina, protegiéndolo así más de la radiación ultravioleta. La melanina absorbe la radiación ultravioleta liberando la energía recibida en forma de calor. La definición de los fototipos humanos íntegra el concepto de color inicial de la piel y la capacidad de broncearse y enrojecerse en el sol. De esta manera, existe el interés en cambiar de un fototipo dado a un fototipo más alto para dar mayor fotoprotección, por medio de una proporción más alta de pigmentación. Debido a la sobreexposición al sol, una predisposición genética, o una enfermedad de la piel, pueden aparecer manchas blancas desagradables, consistentes con una pérdida de la pigmentación de la piel. La afección de la piel más común de este tipo es el vitíligo. También pueden aparecer manchas blancas en la piel (principalmente en los pacientes bronceados) en el caso de tiña versicolor, una afección debida a la proliferación excesiva de un hongo que pertenece al género de levaduras Malassezia. En la actualidad, se sabe como tratar estas levaduras. Sin embargo, el tratamiento detiene la infección pero persisten las manchas blancas, normalmente hasta la siguiente exposición al sol. Similarmente, puede aparecer hipocromia después de cicatrización postraumática o quemaduras, concurrentemente con marcas de estiramiento, o después del tratamiento de dermatosis escamosa. Para acelerar la desaparición de estas manchas blancas se puede contemplar un tratamiento que fomente la pigmentación. El cabello blanco (canas) aparece cuando los bulbos de cabello dejan de producir melanina. El mecanismo de esta detención de producción sigue siendo poco entendida. Por otra parte, se sabe que el mecanismo es hereditario y está relacionado con la edad. En la actualidad la gente desea tener una piel bronceada pero limitando o eliminando la exposición a la radiación UV (natural o artificial), y al mismo tiempo proteger a la piel del envejecimiento prematuro y de otros efectos secundarios de la radiación UV. Los presentes inventores han descubierto, de manera sorprendente e inesperada, que hidrolizados de proteína de arroz (denominados también péptidos de arroz) tienen la propiedad de estimular la pigmentación cutánea. La aplicación de la composición activa permite una mayor pigmentación constitutiva y un bronceado más rápido y más intenso durante una exposición más corta. Consecuentemente, se retarda la aparición de factores de envejecimiento cutáneo y otros efectos indeseables debidos a la radiación UV. Además, el paciente alcanza un fototipo más alto que disminuye el riesgo de fotocarcinogénesis cutánea. De esta manera, el primer objetivo de la invención es el uso de un hidrolizado de proteína de arroz para producir una composición pigmentadora, cosmética, dermatológica o nutracéutica, para el hombre y los animales.

Esta composición estimula la pigmentación cutánea (que puede ser constitutiva o adquirida) y por lo tanto se puede usar como un acelerador de bronceado. La composición se puede usar en cabinas de bronceado ya sea con una finalidad puramente estética (bronceado), o con una finalidad dermatológica (reforzar el fototipo de pacientes con piel sensible a la luz o al sol). De esta manera, de acuerdo con modalidades ventajosas de la invención, la composición de la invención aumenta e intensifica la pigmentación normal de la piel sin la luz solar. También acelera e intensifica el bronceado. También puede estimular la fotoprotección constitutiva y refuerza el fototipo. También puede prevenir el fotoenvejecimiento. Finalmente, también puede prevenir la fotocarcinogénesis cutánea. Dentro del alcance de la presente invención, "fotoprotección constitutiva" significa el fototipo, esto es, la capacidad innata de protegerse del sol por medio de la sensibilidad hasta enrojecimiento por radiación UV, la pigmentación adquirida genéticamente sin el sol (complexión normal de la piel), y bronceado posterior a la exposición (complexión de la piel después de exposición a la luz solar). La invención también tiene como objetivo un método de tratamiento cosmético para estimular la pigmentación constitutiva o adquirida, caracterizado porque se aplica por vía tópica una composición que comprende por lo menos un hidrolizado de proteína de arroz. Este método de tratamiento cosmético acelera notablemente el bronceado y el color natural de la piel sin la luz solar, o permite broncearse con poca o ninguna luz solar. Esta composición también se puede usar para tratar manchas de despigmentación (blancas) sobre la piel, por ejemplo de vitíligo o hipopigmentación iatrogénica (corticosteroides dérmicos). La composición también se puede usar para repigmentar la piel de pacientes con pitiriasis, en particular tiña versicolor. También puede permitir a los pacientes que sufren de xerodermia pigmentosa tener una estimulación de la pigmentación cutánea sin el sol. Esta composición puede estimular la fotoprotección constitutiva y reforzar el fototipo. De esta manera, la invención también tiene como objetivo el uso de un hidrolizado de proteína de arroz para producir una composición o un medicamento para tratar y prevenir manchas de despigmentación (repigmentar manchas blancas cutáneas). Las manchas de despigmentación se pueden deber o ser consecuencia de una afección o una sensibilización elegida del grupo comprendido de vitíligo, pitiriasis (tiña versicolor), el uso de corticosteroides dérmicos, cicatrización, o exposición intensa al sol. Las manchas de despigmentación se pueden deber a fotoenvejecimiento significativo. La invención también tiene como objetivo el uso de un hidrolizado de proteína de arroz para producir un tratamiento capilar para impedir y tratar las canas.

Finalmente, la invención tiene como objetivo el uso de un hidrolizado de proteína de arroz para producir una composición o medicamento para prevenir la fotocarcinogénesis cutánea. Dentro del alcance de la presente invención, la expresión "hidrolizados de proteína de arroz" y "péptidos de arroz" indican ambos el producto resultante de la hidrólisis enzimática de proteínas de arroz. Los péptidos de arroz ya se conocen de la técnica anterior; ya se han descrito procedimientos para obtener estos péptidos (EP 575452, WO 02/102347). Están disponibles comercialmente hidrolizados de proteína de arroz de SILAB, bajo la marca Nutriskin. Estos hidrolizados comprenden péptidos de peso molecular bajo (menos de 1 ,400 Dalton). Se pueden obtener como se describe en la solicitud internacional WO 02/102347. Un método para preparar un hidrolizado de proteína de arroz comprende, por ejemplo, lo siguientes pasos: - solubilizar proteínas de arroz en agua para obtener una suspensión, - hidrolizar esta suspensión en presencia de una o más proteasas, - filtrar convenientemente en una membrana para eliminar los compuestos insolubles, enzima residual y péptidos de peso molecular alto (mayor de 10,000 Dalton); y - opcionalmente realizar una filtración en estéril del concentrado previamente obtenido. Las proteínas de arroz usadas se pueden obtener moliendo granos de arroz (por ejemplo Oriza sativa). También están disponibles comercialmente concentrados de proteína de arroz (vendidos por ejemplo por Remy Industries). Ventajosamente, el método para preparar el hidrolizado de proteína de arroz no incluye un paso de fermentación o germinación. Además, el arroz usado en la composición de la invención, o utilizado en el procedimiento anterior, pertenece preferiblemente al género Oriza, muy de preferencia es la especie Oriza sativa L Ventajosamente, el hidrolizado de arroz usado en la composición de la invención, y que se obtiene en el método de preparación anterior, resulta de una fracción de arroz libre del salvado de arroz. El hidrolizado de proteína de arroz usado en el método de la invención puede comprender péptidos que tienen un peso molecular medio que varía de menos de 300 Dalton a más de 10,000 Dalton, de preferencia un peso molecular medio de entre 300 Dalton y 3,500 Dalton. En particular, se usará preferiblemente un hidrolizado de proteína de arroz que comprende péptidos que tienen un peso molecular menor o igual que 10,000 Dalton, de preferencia un peso molecular menor o igual que 3,500 Dalton. De acuerdo con una modalidad particular de la invención, por lo menos 75% en peso, ventajosamente por lo menos 80% en peso, muy ventajosamente por lo menos 85% en peso de los péptidos, tienen un peso molecular entre 300 Da y 3,500 Da. En particular, por lo menos 50% en peso de los péptidos, ventajosamente por lo menos 55% en número de los péptidos, tienen un peso molecular entre 300 Da y 1200 Da. La concentración de péptidos de arroz en la composición de la invención (cosmética, dermatológica o nutracéutica) es ventajosamente de entre aproximadamente 0.1 % y aproximadamente 20% en peso, más ventajosamente entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 10% en peso, muy ventajosamente entre aproximadamente 4% y aproximadamente 6% en peso, con respecto al peso total de la composición. La composición de la invención puede contener otros ingredientes activos que pigmentan o colorean la piel (además de la protección UV), produciendo un efecto complementario o sinérgico. Notablemente, se pueden citar los siguientes ejemplos de agentes pigmentadotes o colorantes: - agentes que colorean la piel, tales como dihidroxiacetona y melaninas; - agentes que estimulan el proceso natural de pigmentación, tales como soralenos (8-metoxisoraleno, 5-metoxisoraleno, 4, 5', 8-trimetilsoraleno, o extractos vegetales de Psoralea corylifolia y Ammi majus), carotenoides (licopeno, cantaxantina), agentes que estimulan la ruta de AMP cíclico (1 - análogos de cAMP tales como 8-bromo-cAMP o dibutiril-cAMP, 2-forskolina, 3- isobutil-metil-xantina o teofilina), activadores de proteína cinasa C (diacilgliceroles, en particular oleoilacetilglicerol), dioles alifáticos o cíclicos (1 ,2-propanodiol, 5-norbornano-2,2-d¡metanol, norbornano-2,2-dimetanol), dioles bicíclicos de monoterpeno, derivados de tirosina (L-tirosina, L-DOPA), sulfóxido de dimetilo, agentes lisosomotrópicos, dinucleótidos de timidina, fragmentos de ADN, análogos de la hormona estimuladora de melanocito, 3-isobutil-1 -metilxantina, donadores de óxido nítrico (David A. Brown, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 63 (2001 ) 148-161 ); - extractos vegetales, en particular algas, que exhiben actividad promelanogénica: Laminaria digitata (thalitan de CODIF). La tirosinasa es una enzima implicada en la melanogénesis. De esta manera, los péptidos de arroz de la invención se pueden combinar con ingredientes activos capaces de: activar factores que inducen la síntesis de tirosinasa; promover la actividad enzimática de tirosinasa; promover la glicosilación de tirosinasa (permitir su absorción por los melanosomas); aumentar la actividad general de los melanocitos; promover la transferencia de tirosinasa en los premelanosomas; transportar precursores de melanina; - restringir la actividad celular, preservando así los queratinocitos cargados con melanina. Los péptidos de arroz también se pueden combinar con oxidantes o antioxidantes produciendo un efecto complementario o sinérgico.

Como ejemplos de antioxidantes se pueden citar los siguientes: vitamina C, vitamina E, polifenoles (particularmente los extraídos del té verde, uva o pino), derivados de azufre. Los péptidos de arroz también se pueden asociar con agentes que protegen a las células del daño causado por la luz solar, aparte de los antioxidantes, que actúan sobre las células quemadas por el sol, p53, proteínas de choque de calor, apoptosis, tisis de membrana, liberación de citosina, o mediadores celulares. De acuerdo con otro aspecto de la invención, las composiciones de la invención también contienen por lo menos un filtro UVB o UVA, o bloqueador solar, tal como las pantallas o filtros minerales u orgánicos conocidos para los expertos en la materia, que adaptarán sus elecciones y concentraciones de acuerdo con el grado requerido de protección. Más aún, las composiciones de la invención pueden contener exfoliantes o agentes hidratantes, tales como alfa-hidroxiácidos y ácido salicílico, y derivados de los mismos por ejemplo en forma de éster. Las composiciones de la invención también pueden contener agentes antiinflamatorios o calmantes, agentes que desensibilizan la piel, tales como AINEs (agentes antiinflamatorios no esteroideos), corticosterides dérmicos, agonistas de PPAR (receptor activado por proliferador de peroxisoma), derivados de regaliz, bisabolol, ¡soflavonas (por ejemplo de soya), glicosilada o no, palmitoiletanolamida, materiales insaponificables que contienen fitosteroles y vitamina E, inhibidores de ciclooxigenasa (COX) o lipooxidasa (LOX), agua de fuentes termales, agua marina, o agua reconstituida de oligoelementos exógenos. Finalmente, las composiciones de la invención también pueden contener agentes contra el envejecimiento tales como retinol, vitaminas B3, C y A, licopeno, carotenos, carotenoides, alfa-hidroxiácidos (AHAs), beta-hidroxiácidos (BHAs), libres, esterificadas o unidas covalentemente, proteínas de la matriz extracelular (glucosamina, sulfato de condroitina), colágeno, elastina y sus activadores, derivados furánicos de aguacate, fitosteroles, ácidos grasos insaturados y poliinsaturados, isoflavonas de planta (soya, trébol), lactobacilos y otros prebióticos y probióticos. Dentro del alcance del tratamiento o prevención de las canas, la composición puede comprender también activadores del crecimiento de cabello (minoxidil, aminexil, etc.) o ingredientes activos que inhiben o retardan la pérdida del cabello. Las composiciones también pueden comprender agentes de penetración y colorantes del cabello, agentes formadores de película y fijadores, y tratamientos capilares del cabello. La composición de la invención se puede administrar por vía tópica u oral. Dentro del alcance de la aplicación tópica, la composición de la invención comprende un vehículo dermatológico o cosmético aceptable, esto es, un vehículo compatible con la piel. Ventajosamente, se puede proveer en todas las formas galénicas usadas normalmente para aplicación tópica, en particular en forma de una solución acuosa, hidroalcohólica u oleosa, una emulsión de aceite en agua, agua en aceite, o múltiple, un gel acuoso u oleoso, un producto anhidro líquido, pasta o sólido, una dispersión de aceite en una fase acuosa usando esferoides (nanoesferas, nanocápsulas, vesículas de lípido), un dispositivo transdérmico, o en cualquier otra forma para aplicación tópica. Esta composición puede ser más o menos fluida y puede tener la apariencia de una crema blanca o coloreada, pomada, leche, loción, suero, pasta, espuma, o gel. Opcionalmente se puede aplicar a la piel en forma de aerosol. También se puede proveer en forma sólida, por ejemplo en forma de barra. También se puede aplicar por medio de un parche. Dentro del alcance de la administración oral, la composición se puede proveer en forma de una cápsula, cápsula dura de gelatina, tableta, gránulo, preparado para atomización, o solución oral. Cuando la composición se provee en forma de una cápsula blanda o una cápsula dura de gelatina, la envoltura de dichas cápsulas blandas o dichas cápsulas duras de gelatina puede contener particularmente gelatina animal, tal como gelatina de pescado, glicerina, o un material de origen vegetal como un derivado de almidón o celulosa, o una proteína vegetal. Cuando la composición se provee en forma de una cápsula dura de gelatina, tableta o gránulo, los ingredientes activos se pueden fijar en un vehículo de polvo tal como sílice, celulosa y maltodextrina. La composición de la invención también puede contener los aditivos típicos usados en el campo de los cosméticos, tales como estabilizadores, conservadores, antioxidantes, disolventes, fragancias, agentes quelantes, absorbentes de olor, filtros químicos o minerales, pigmentos minerales, agentes tensoactivos, polímeros, aceites de silicón y colorantes o exfoliantes. La finalidad de los siguientes ejemplos es evaluar los efectos de un ingrediente activo basado en péptidos de arroz sobre la pigmentación y fotoprotección cutánea. Pigmentación: Evaluación multiparamétrica de los siguientes efectos: - Efecto sobre la producción de melanina de melanocitos humanos normales cocultivados con queratinocitos irradiados o no irradiados (NHEM-NHEK) (ejemplo 2). - Efecto sobre la actividad de tirosinasa en cultivos de melanocito (NHEM) (ejemplo 3). - Efecto sobre la formación de dendrita en melanocitos cocultivados con queratinocitos (NHEM-NHEK) (ejemplo 4). - Efecto sobre la transferencia de melanosoma de los melanocitos a los queratinocitos vecinos (ejemplo 5). - Efecto sobre la pigmentación de piel viva (ejemplo 6).

Fotoprotección: - Efecto sobre la síntesis de glutatión (GSH) de fibroblastos cutáneos humanos irradiados con UVA (ejemplo 7).

EJEMPLO 1 Péptidos de arroz de la invención Los péptidos de arroz se obtienen por hidrólisis enzimática de proteínas de arroz. Las proteínas residuales se eliminan por ultrafiltración con un umbral de corte de 10,000 Da. Los péptidos se concentran por evaporación de agua al vacío o por nanofiltracion (200 Da) hasta 5% de materia seca. La materia seca se puede obtener por evaporación a sequedad, liofilización o atomización. Las características de los péptidos de arroz obtenidos se resumen en el cuadro 1 siguiente: CUADRO 1 Características de los péptidos de arroz Después, estos péptidos de arroz se prueban en los ejemplos 2 a 7 que se dan más abajo.

EJEMPLO 2 Medición de la melanina producida por melanocitos humanos normales cocultivados con queratinocitos irradiados o no irradiados (NHEM- NHEK) Cocultivos de NHEM/NHEK se inocularon en placas de 24 pocilios. Se prepararon tres series de placas idénticas para evaluar: a) Cantidad de melanina por espectrofotometría. b) Viabilidad celular al final del experimento (prueba MTT); c) Cantidad de proteína. Después de 24 horas de incubación a 37 °C, el medio de cultivo se desechó y se reemplazó con un medio que contenía (o no contenía: control) péptidos de arroz (a 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml y 2 mg/ml), o la molécula de referencia propigmentadora (IBMX = isobutilmetilxantina a 200 µ?), y después los cocultivos se incubaron a 37 °C durante 10 días. Un lote de las placas no se irradió (lote de NHEM/NHEK de cocultivo no irradiado). El segundo lote se irradió durante cuatro días consecutivos a una dosis de 25 mJ/cm2 de UVB más 300 mJ/cm2 de UVA, y después se cambió el medio de cultivo que contenía o no contenía los productos (péptidos de arroz o IBMX). Después, los cocultivos se cultivaron 72 horas sin irradiación y después se irradiaron nuevamente con 25 mJ/cm2 de UVB más 300 mJ/cm2 de UVA durante cuatro días consecutivos (con un cambio de medio después de 48 h). Al final del tratamiento, el medio de cultivo de desechó y la melanina contenida en las células se extrajo con una solución de NaOH 0.5 N, y después se evaluó la cantidad de melanina producida bajo cada condición de cocultivo, midiendo la densidad óptica de las muestras a 405 nm contra una escala de melanina exógena.

Viabilidad celular y cantidad de proteina Los resultados de la prueba MTT se presentan más abajo en el cuadro 2: CUADRO 2 Evaluación de la viabilidad celular en los cocultivos de NHEM/NHEK Los resultados de la concentración de proteínas se presentan abajo en el cuadro 3: CUADRO 3 Concentraciones de proteína en los cocultivos Los péptidos de arroz no exhiben ninguna toxicidad sobre los cocultivos de NHEM/NHEK (la misma observación para IBMX). Por el contrario, se observó un aumento de la cantidad de proteína celular y actividad metabólica en presencia de péptidos de arroz e IBMX.

Medición de melanina. Los resultados se presentan más abajo en el cuadro 4: CUADRO 4 Modulación de la producción de melanina en los cocultivos de NHEM/NHEK * Estadísticamente diferente del control (p<0.01 , prueba de Dunnett) $ Estadísticamente diferente del control (p<0.05; prueba de Dunnett) Bajo condiciones sin irradiación, los péptidos de arroz probados a concentraciones de 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml y 2.0 mg/ml, aumentaron significativamente la cantidad de melanina (en +15%, +12% y +29%, respectivamente, en comparación con el control; p<0.01 ). Bajo condiciones con irradiación, los péptidos de arroz probados a 2 mg/ml aumentaron significativamente la cantidad de melanina (+ 1% en comparación con el control; p<0.01 ). A 0.5 mg/ml y 0.1 mg/ml, esta estimulación fue menos notable. Los péptidos de arroz actúan sobre la síntesis de melanina de la misma manera que la molécula de referencia propigmentadora (IBMX). Además, en cuanto a IBMX, la estimulación de la síntesis de melanina con los péptidos de arroz se correlaciona con un aumento de la cantidad de proteína celular y la actividad metabólica (% de viabilidad) (véanse los cuadros 2 y 3).

EJEMPLO 3 Efecto sobre la actividad de tirosinasa en cultivos de melanocito (NHEM) Los melanocitos (NHEM) se cultivaron previamente en placas de 96 pocilios durante 24 horas, y después las células se trataron con péptidos de arroz o IBMX (200 µ?) durante 72 horas a 37 °C. Al final del tratamiento, la tirosinasa contenida en las células se extrajo y la reacción de oxidación de L-DOPA a DOPA-quinona se monitoreó durante 1 hora a 37 °C después de añadir L-DOPA (el substrato de reacción). Después se evaluó la actividad de tirosinasa midiendo la densidad óptica de las muestras a 450 nm contra una escala estándar de tirosinasa. Los resultados se presentan más abajo en el cuadro 5: CUADRO 5 Efecto de los tratamientos sobre la actividad de tirosinasa de melanocitos humanos * Estadísticamente diferente del control (p<0.01 , prueba de Dunnett).

Los péptidos de arroz, probados a 0.5 mg/ml y 2 mg/ml, estimularon significativamente la actividad de tirosinasa de los melanocitos humanos, de una manera dependiente de la dosis (+59% y +172%, respectivamente, en comparación con el control; p<0.01 ).

EJEMPLO 4 Evaluación de la formación de dendrita de los melanocitos en cocultivo con queratinocitos (NHEM/NHEK) Cocultivos de NHEM/NHEK se inocularon 24 horas antes de la prueba en placas de 96 pocilios y después se incubaron durante 72 horas en presencia (o ausencia: control) de péptidos de arroz (a 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml y 2.0 mg/ml), o IBMX (a 200 µ?). La formación de dendrita se observó por marcación fluorescente usando un anticuerpo específico para melanosomas anti-Mel-5 (TRP-1 , proteína relacionada con tirosinasa 1 ). La marcación fue revelada por un anticuerpo secundario, GAM-FITC. Este análisis hizo posible determinar la densidad de las extensiones de melanocito (número y longitud total de dendritas por melanocito).

Efecto sobre la formación de dendrita de los melanocitos en cocultivo con queratinocitos CUADRO 6 Medición de la formación de dendrita de los melanocitos en cocultivo NHEM-NHEK: Análisis del número de dendritas por melanocito Estadísticamente diferente del control (p<0.01 , prueba de Dunnett) CUADRO 7 Medición de la formación de dendrita de los melanocitos en cocultivo NHEM/NHEK: Análisis de la longitud de dendrita * $ Estadísticamente diferente del control (* p<0.01 , $ p<0.05, prueba de Dunnett) Los péptidos de arroz probados a 2 mg/ml y 0.5 mg/ml aumentaron de manera dependiente de la dosis el número y la longitud de las extensiones del melanocito. A 0.1 mg/ml, el efecto sobre el número de dendritas no es visible, aunque se observa todavía un efecto menor sobre la longitud.

EJEMPLO 5 Efecto sobre la transferencia de melanosomas de melanocitos a queratinocitos vecinos Protocolo: Antes de la inoculación, los melanocitos se "cargaron" con la sonda fluorescente para rastrear la transferencia del éster diacetato succinimidilo de carboxifluoresceína (CFDA) de los melanosomas. Los melanocitos "cargados" se incubaron entonces en cocultivo con queratinocitos a 37 °C (NHEM/NHEK). Se realizaron varios análisis para ajustar los parámetros para la adquisición por citometria de flujo: - Cocultivo de NHEM/NHEK "no cargado". - Cultivos de NHEK solo. - Cultivos de NHEM "cargados" o "no cargados" probados solos. A 60%-80% de confluencia, el medio de cultivo se reemplazó con un medio que contenía péptidos de arroz (0.5 mg/ml y 2 mg/ml) o IBMX, o un medio que no los contenia (control), y después las células se cultivaron a 37 °C. Después de 72 h de incubación, las células se volvieron a tratar igual que antes y después se incubaron durante 72 h a 37 °C. Cada condición de tratamiento se realizó por triplicado. Al final del tratamiento las células se sometieron a tripsinación, se fijaron, se hicieron permeables y después se marcaron con un anticuerpo anti-citoqueratina (específico para queratinocitos). La marcación se reveló usando un anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo anti-citoqueratina y acoplado con ficoeritrina. Los parámetros de fluorescencia se midieron por citometria de flujo.

Análisis de resultados por citometria de flujo: El análisis citométrico se parametrizó (usando los diversos análisis efectuados) para seleccionar de la población celular total (NHEM/NHEK) los queratinocitos positivos, es decir, los queratinocitos que incorporaron la sonda fluorescente de CFDA (indicando la transferencia de melanosoma), y que exhibieron marcación anti-citoqueratina (específica para queratinocitos). Esta población de queratinocitos "marcados doblemente" es obligatoriamente el resultado de la transferencia de melanosoma del melanocito al queratinocito.

Resultados y conclusiones: Los resultados se presentan más abajo en el cuadro 8: CUADRO 8 Efecto de los tratamientos sobre la transferencia de melanosomas de los melanocitos a los queratinocitos $ Estadísticamente diferente del control (* p<0.01 , $ p<0.05, prueba de Dunnett) Los péptidos de arroz probados a 0.5 mg/ml y 2 mg/ml indujeron un aumento significativo de la transferencia de melanosoma (29% y 28%, respectivamente, en comparación con el control). Así, los péptidos de arroz exhiben un efecto estimulador sobre la transferencia de melanosoma.

EJEMPLO 6 Efecto sobre la pigmentación de piel viva Muestras de piel obtenidas de una biopsia mamaria se trataron por aplicación tópica de péptidos de arroz (a 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml y 2.0 mg/ml), o IBMX (a 200 µ?) (aplicación de 20 µ?, o aproximadamente 5 mg/cm2). Los explantes se mantuvieron entonces durante 144 horas a 37 °C. Las áreas tratadas y de control se fotografiaron al final del tratamiento y la coloración de la piel se analizó visualmente. La IBMX aumentó ligeramente la pigmentación de la piel después de 144 horas de cultivo. Los péptidos de arroz aumentaron la pigmentación de la piel de una manera dependiente de la dosis después de 144 h de cultivo. El ingrediente activo exhibe un efecto promotor de la pigmentación consistente con los resultados obtenidos en las otras pruebas realizadas.

Conclusión de los ejemplos 2 a 6: Los ejemplos antes mencionados muestran un efecto promotor de la pigmentación de los péptidos de arroz. En realidad, se mostró que los péptidos de arroz aumentan la síntesis de meianina en cocultivos de NHEM/NHEK irradiados o no irradiados; aumentan la actividad de tirosinasa (enzima clave en la melanogénesis); aumentan el número y longitud de las extensiones de melanocito; aumentan la transferencia de melanosomas de los melanocitos a los queratinocitos, y aumentan la pigmentación de los explantes de piel. Además, la actividad de los péptidos de arroz en los diversos estudios realizados es comparable a la actividad de IBMX, usada aquí como una molécula promotora de la pigmentación de referencia. Así, el ingrediente activo basado en péptido de arroz es un acelerador del bronceado. En realidad, con o sin exposición a la luz UV, induce una estimulación fuerte de la pigmentación cutánea.

EJEMPLO 7 Efecto sobre la síntesis de glutatión (GSH) en fibroblastos cutáneos humanos irradiados con UVA Fibroblastos dérmicos se inocularon en cajas de Petri de 60 mm. Las células se trataron previamente durante 18 horas con 5 mM de péptidos de arroz o N-acetil-cisteína (NAC = molécula antioxidante de referencia), y después se irradiaron a una dosis de 15 J/cm2 de UVA. Después de la irradiación, los fibroblastos se incubaron 3 h más a 37 °C. Al final del tratamiento se recolectaron dos series de muestras para su evaluación: (a) Cantidad total de proteínas de acuerdo con el método de Lowry. (b) La proporción de glutation intracelular según la prueba (equipo comercial). Los resultados se presentan más abajo en el cuadro 9: CUADRO 9 Modulación de glutation intracelular en fibroblastos dérmicos irradiados con UVA La irradiación a una dosis de 15 J/cm2 redujo casi en 9% la proporción de GSH intracelular en los fibroblastos en comparación con las células no irradiadas. La NAC, a una concentración de 5 mM, aumentó en 29% la proporción de GSH en las células irradiadas. Los péptidos de arroz, a concentraciones de 0.5%-1.0% DM y 1.5% DM, aumentaron en 13%, 20% y 29%, respectivamente, la proporción de GSH en los fibroblastos sometidos a estrés por UVA. En otras palabras, los péptidos de arroz son capaces de compensar la disminución de las proporciones de GSH intracelular después de irradiación UVA.

Conclusión general: Los péptidos de arroz estimulan el bronceado protegiendo a la piel de los efectos nocivos del sol.

EJEMPLO 8 Formulaciones 8a Crema facial % Isononanoato de ¡sononilo 6.000 Malato de di-alquilo(Ci2-i3) 3.000 Estearato de isocetilo 4.000 Butilenglicol 1.000 Péptidos de arroz 3.000 Eter de dicaprililo 5.000 Salicilato de silanodiol 1.000 Alcohol araquidílico 1 .650 Trometamina 1.180 Alcohol cetílico 0.5 Acido salicílico 1 .000 Glucósido de ascorbilo 1 .000 Glicina 1.000 Acetato de tocoferilo 1 .000 Alcohol behenílico 0.900 Escualeno 0.790 Citrato de sodio 0.660 Copolímero PPG-12/SMDI 0.100 Glucósido araquidílico 0. 350 Fragancia 0.400 Goma de Sclerotium 0.300 Alcohol cetearílico 0.430 Acido cítrico 0. 10 Sepigel 305* 0.100 Sistema conservador c.s. Agua c.b.p. 100 * producto vendido por Seppic 8b - Producto cosmético bronceador y antienvejecimiento para el 100 q) % Agua 64.83 Péptidos de arroz 7 Furánico insaponificable de aguacate 2 Butilenglicol 3 Alcohol cetílico 6 Lactato de alquilo de Ci2- 13 2 Aceite mineral 7 Ceteth 20 2 Acido esteárico 1 Cinamato 5 Mexoryl SX 3 Mexoryl XL 4 Dióxido de titanio ultrafino 7 Oxido de zinc 2 Tinosorb M y S 4 Acetato de tocoferol 0.50 Propilenglicol 0.56 EDTA d ¡sódico 0.52 Trietanolamina 0.80 Conservador 0.30 Acido cítrico 0.25 Metilparabeno 0.1 1 Steareth -20 1 Metabisulfíto de sodio 0.05 Sulfito de sodio 0.05 Propilparabeno 0.03 8c - Producto anti-manchas blancas para aplicador de bola (cantidad: 100 q) % Vaselina 6.00 Aceite hidrogenado de palma 4.00 Caprilo caprato de glicerol 2.00 Ester de sacarosa 7 (diestearato de sacarosa) 6.00 Escualeno 1.00 Cera de candelilla 2.00 Ester de sacarosa 1 1 (estearato de sacarosa) 0.50 Péptidos de arroz 2.00 Concentrado de girasol 2.00 Glicerol 5.00 Glucodextrina 1.00 Trometamina 0.01 Goma de xantano 0.20 Hidroximetilglicinato A 0.60 Acido cítrico 0.32 Ciclometiconol 5.00 Ceramida/Colesterol 0.60 Agua purificada 5.00 8d - Crema de verano para el mantenimiento del bronceado (cantidad: 100 q) % Escualeno 1.00 Ester de eritritilo 4.00 Pentanoato de decilo 4.00 Glucósido de cetearilo 2.00 Eter laurílico 23 OE 1.00 Cutina CBSV 1.00 Cera de abejas 0.50 Miristato de miristilo 1.00 Conservador 0.30 Vaselina espesa 5.00 Gel de escualeno 3.00 Péptidos de arroz 5.00 Agua purificada 56.51 Fenoxietanol 0.80 EDTA disódico 0.10 Acido cítrico 0.14 Sorbato de potasio 0.45 Glicerina 5.00 Espesante 0.50 Sosa cáustica 0.30 Gel de poliacrilamida 60° 1.00 Acetato de vitamina E 35° 0.50 Fragancia 0.50 Péptido lupino 1.00 Ciclometiconol 7.00 Sílice TiO2 1.00 Genisteína al 85% 0.10 PEG 300 0.90 8e - Crema bronceadora para vitíligo e hipopigmentación (cantidad: 100 g) % Montanov 68 3 Amphisol K 0.50 Miglyol 812 6 Conservador 0.30 Manteca de karité 1 Péptidos de arroz 1 Polifenol 0.5 DHA 2 EDTA Na2 0.10 Acido cítrico 0.01 Conservador 0.40 Butilenglicol 1 Agente gelificante 0.25 Sosa cáustica 0.4 Gluconato de manganeso 0.05 Sal de zinc 0.10 Agua purificada c.b.p 8f - Cápsula blanda nutracéutica y capilar de autobronceado y fortificante % Péptidos de arroz 500 Vitamina del grupo B 1 Hidrolizados de chícharo 50 Hidrolizados de pluma de pato 50 Excipiente es. 8g - Tratamiento de hipopigmentación por vía oral % Mucílago (alginato de sodio) 500 mg Aceite de pescado 500 mg Péptídos de arroz 100 mg Sal de zinc 1 mg Extracto de zanahoria 325 mg Licopeno 50 mg Excipiente de cápsula blanda es. 8h - Crema en gel antienvejecimiento y bronceadora sin sol (cantidad: 100 % Carbopol Etd 2020 0.6 Goma de xantano 0.15 Genisteína al 85% 0.1 Retinol 0.5 NaOH 0.001 Conservador 0.9 Péptidos de arroz 2 Glucodextrina 2 Fragancia 0.7 Silicon 0.3 Agua purificada es. 8i - Paños pigmentadores (cantidad: 100 g) % Poloxamer 184 1 .0000 Fragancia 0.2000 Agua purificada 91.1550 PEG-32 4.0000 Conservador 1 .0000 Clorhexidina 0.1500 Fenoxietanol 0.1000 Alantoína 0.2000 Péptidos de arroz 5.0000 Solubilizante 1.0000 Trometamina 0.1950 8¡ - Solución hidro-glico-alcohólica para hacer crecer el cabello y pintarlo % Alcohol desnaturalizado 70% Ciclodextrina 2% Glicol 25% Aminexil 1 % Minoxidil 0.3% Agua c.b.p. 100%

Claims (1)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- El uso de un hidrolizado de proteína de arroz para producir una composición destinada a pigmentar, hiperpigmentar o repigmentar la piel y las estructuras de la piel. 2 - El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición está destinada para aplicaciones seleccionadas del grupo comprendido de: aumentar e intensificar la pigmentación normal de la piel sin la luz solar, acelerar e intensificar el bronceado, estimular la fotoprotección constitutiva y fortalecer el fototipo, prevenir la fotocarcinogénesis cutánea, y prevenir el fotoenvejecimiento. 3. - El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición está destinada a repigmentar las manchas blancas cutáneas, en particular las manchas resultantes de una afección o sensibilización seleccionada del grupo comprendido de vitíligo, pitíriasis, el uso de cortícosteroides dérmicos, cicatrización, o exposición intensa al sol. 4. - El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición es un tratamiento capilar para prevenir y tratar las canas. 5. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el hidrolizado de proteína de arroz comprende péptidos, de los cuales por lo menos el 50% tienen un peso molecular de entre 300 Da y 10,000 Da, más particularmente entre 300 Da y 3,500 Da. 6.- El uso que se reclama en la reivindicación 5, en donde por lo menos 50% de los péptidos tienen un peso molecular entre 300 Da y 1 ,200 Da. 7.- El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición comprende de 0.1% a 20% en peso, con respecto al peso total de la composición, del hidrolizado de proteína de arroz anteriormente mencionado. 8. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición comprende, además, antioxidantes, foto protectores, agentes hidratantes, colorantes, agentes hiperpigmentadores, o agentes antienvejecimiento. 9. - Un método de tratamiento cosmético para estimular la pigmentación constitutiva o adquirida, caracterizado porque se aplica por vía tópica una composición que comprende por lo menos un hidrolizado de proteína de arroz. 10. - El método de tratamiento cosmético de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque está destinado a acelerar el bronceado y el color natural de la piel sin la luz solar.