KR100931972B1

KR100931972B1 - 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본을함유하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR100931972B1
Application number: KR1020070125125A
Authority: KR
Inventors: 이희구; 윤도영; 김재화; 송은영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-12-04
Filing date: 2007-12-04
Publication date: 2009-12-15
Also published as: KR20090058378A

Abstract

본 발명은 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본을 함유하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 쑥으로부터 분리 정제하여 얻은 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본을 함유함으로써 종래의 화장료에 비하여 인체에 염증을 일으키거나 그에 의한 질병의 원인이 되는 병원미생물을 더욱더 억제할 수 있고 아토피 피부를 현저하게 개선할 수 있는 화장료 조성물을 제공할 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있다.

쑥, 아토피, 화장료, 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본, 5,6,3',5'-tetramethoxy 7,4'-hydroxy flavone

Description

5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본을 함유하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition for improving atopic dermatitis comprising 5,6,3',5'-tetramethoxy 7,4'-hydroxy flavone from Artemisia absinthium}

본 발명은 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본을 함유하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 쑥으로부터 분리 정제하여 얻은 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본을 함유함으로써 인체에 염증을 일으키거나 그에 의한 질병의 원인이 되는 병원미생물을 억제하고 아토피 피부를 개선할 수 있는 화장료 조성물에 관한 것이다.

일반적으로, 아토피 피부는 종전 유아기에 주로 발생하여 태열이라고도 하였으며 주로 각질층 내의 세라마이드(ceramides)의 함량이 감소됨에 따라 발생하는 것으로서 각질층의 수분유지기능이 떨어짐에 따라 피부가 건조되어 각질이 쉽게 일어나며 피부장벽(skin barrier) 기능이 저하됨에 따라 자극유발물질이 각질층 내로 침입하여 자극을 유발하고 정상피부에서는 침입하기 어려운 항원 단백질이 침입함에 따라 피부 알러지 등이 쉽게 발생하여 견디기 힘들만큼의 소양증 증상을 나타낸 다. 그러므로 아토피 환자의 90% 이상이 포도상구균에 감염되어 있는데 이 균은 환자가 가려움을 참지 못해 긁어서 생기기도 하지만 최근의 보고에 의하면 이 세균의 외독소가 우리 몸의 면역체계를 자극하여 알레르기를 일으키는 화학물질을 나오게 하여 아토피를 악화시킨다고 한다. 즉, 이 세균 자체가 알레르겐으로 작용한다는 것이다.

이러한 아토피 피부의 발생 원인에 대해서는 지금까지 크게 네 가지로 밝혀져 있는데, 첫째는 유전적 원인에 의한 것으로 피부보호기능을 담당하는 피부 보호막인 세포막의 인지질과 각질세포간의 결합물질인 세포간 지질을 구성하는 필수 지방산인 감마-리놀레인산(γ-linoleic acid; GLA)이 부족한 상태로 인해 피부 보호막을 단단하게 만들지 못하므로 피부표면의 수분이 쉽게 소실되고 외부자극에 의해 쉽게 알러지가 발생한다는 것이다. 둘째는 환경적 요인에 의한 것으로 현대인의 주거환경의 변화로 아파트생활이 보편화되면서 생활환경이 건조한 상태로 변화됨에 따라 세계적으로 아토피 피부가 증가되고 있으며, 이로 인해 수분 보유력이 저하되고 피부보호기능이 상실되어 적은 자극에도 민감하게 반응하여 알러지가 발생한다는 것이다. 셋째는 활성산소에 의한 것으로 활성산소에 의해 과산화지질이 생성하게 되고 이것에 의해 아토피 피부가 발생한다는 것이다. 넷째는 세균, 바이러스, 곰팡이에 감염되어 발생한다는 것으로서 이러한 원인들이 복합적으로 관계하여 발생한다고 보고 있다(피부과학, 대한피부과학회 간행위원회, 여문각, 1992).

따라서, 이러한 아토피를 치료하기 위해서는 항균, 보습, 항염의 효과가 우수하며, 부작용이 없고 비용이 저렴한 물질의 개발 및 그 물질을 함유하는 사용이 용이한 화장료의 개발이 필수적이다.

쑥은 초롱꽃목 국화과 쑥속의 총칭으로 약 250종이 있으며 세계에 널리 분포하고 사막에도 생육한다. 대부분 여러해살이풀이지만 작은 관목도 있다. 잎과 열매 등이 식용되나 약용에 쓰이는 것이 많다. 꽃은 풍매화로 크고 아름다운 국화종류인데, 곤충이 없는 건조한 지역에 퍼지기 직전에 풍매화가 되었다고 한다. 봄에 거친 땅의 마른 풀 속에서 녹색의 모습을 보이는 것이 타래쑥으로서 아르테미시아 프린셉스(A. princeps)와 쑥으로서 아르테미시아 아시아티카(A. asiatica)이다. 줄기는 잘 분지하고 곧게 서며 수십 ㎝나 된다. 잎은 어긋나며 잔 톱니가 있고 뒷면에 회백색의 부드러운 털이 빽빽히 나 있다. 가을에는 줄기 윗부분의 작은 가지에 황백색의 작은 두화(頭花)가 아래로 향해 많이 핀다. 땅속줄기는 특히 발달하여 번식력이 강하다. 타래쑥과 쑥 모두 한국 각지를 비롯하여 인도·중국·동남아시아에 걸쳐 분포한다. 이 밖의 쑥속 식물로는 제비쑥·사철쑥·뺑쑥 등이 있다.

쑥에는 또 무기질과 비타민의 함량이 많은 것이 특색이다. 특히 비타민 A가 많아 약 80g만 먹어도 하루에 필요한 양을 공급할 수 있는 셈이다. 비타민 A가 부족하면 우리 몸에 여러 세균이 침입했을 경우 저항력이 약해진다.

현재 일반적으로 사용되고 있는 아토피 피부를 치료하는 방법으로는 1) 보습제 사용, 2) 타르제제를 사용 3) 트리암시놀론(triamcinolone)이나 플루오시놀론(fluocinolone)과 같은 바르는 스테로이드 제제와 먹는 스테로이드 제제 사용, 4) 자외선 치료, 5) 클린다마이신(clindamycin), 디클록사실린(dicloxacilline)과 같은 항생제, 6) 항소양제, 7) 포타슘 퍼망가네이트(potassium permanganate), 세 트리미드(cetrimide), 클로르헥시딘(chlorhexidine), 클로로자일레놀(chloroxylenol), 디브로모프로파미딘(dibromopropamidine), 폴리녹실린(polynoxylin), 포비돈 아이오딘(povidone iodine), 트리클로산(triclosan)과 같은 항균제, 8) 면역조절, 면역억제, 면역치료제, 9) 식품, 향기, 한방 등의 방법을 사용하고 있다. 그러나 타르제제는 알코올 성분이 있어 냄새가 좋지 않고 건조한 피부를 자극하는 단점이 있고, 스테로이드 제제는 발진, 피부색 변화, 고혈압, 백내장 등의 부작용이 심각하다. 자외선 치료는 햇볕의 화상, 가려움증 유발, 색소 침착과 장기간 치료 시에는 피부의 조기 노화와 암의 위험이 높고, 항생제는 주로 내복약으로 사용하는 단점이 있으며, 항균제는 농도에 따른 피부 자극이 있다. 면역조절, 억제제 등이 최근 가장 많이 사용되고 있으나 수두, 대상포진 등의 바이러스에 감염된 얼굴에 사용해서는 안 되는 등 사용상 어려움과 수입에 의존함으로 인해 비용이 비싼 경우가 있어 그 사용에 한계가 있다. 또한 식품요법, 한방치료, 기타 향기요법 등은 사용상의 부작용은 없지만 그 효과가 미비한 경우가 많아 근본적인 치료가 되기 어려워 사용상에 그 한계가 있을 수 있다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 대장균 및 황색포도상구균, 장구균, 세라티아균, 녹농균, 바실러스균, 살모넬라균, 폐렴간균 등의 병원미생물에 대한 우수한 항균력, 항염 및 항 소양증을 가지고 전반적으로 아토피 피부를 개선할 수 있는 뛰어난 물질을 개발하기 위해 노력한 결과, 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본을 함유한 화장료 조성물이 항균, 항산화, 항염 및 항 소양 효과가 우수하고 아토피 피부를 전반적으로 현저하게 개선시킬 수 있음을 확인함으 로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 항염, 항산화, 항균, 세포증식, 피부 가려움증 개선, 아토피 피부 개선 등의 효능이 우수하고 안정성 및 안전성에 문제가 없는 천연 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본을 함유하는 아토피 피부 개선용 천연 화장료 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본(TMHF)을 함유하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본은 쑥으로부터 분리 및 정제하여 얻을 수도 있고 합성할 수도 있다.

5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본(TMHF)은 세포 증식 효과를 나타내며 세포 독성은 없다.

또한, TMHF는 항산화 활성을 나타내고, 병원성 이질균과 대장균, 황색포도상구균, 장구균, 세라티아균, 녹농균, 바실러스균, 살모넬라균, 폐렴간균 등의 다양한 병원성 균에 대하여도 뛰어난 항균활성을 보임으로써 아토피 피부에서 발생하는 병원성 균에 의한 감염을 억제하여 아토피 피부를 현저하게 개선하는 것으로 확인되었다.

본 발명에서 TMHF는 하기 단계를 포함하는 분리방법으로 쑥으로부터 분리될 수 있다:

쑥을 분쇄한 후 알콜 수용액을 쑥 함량 대비 3 ~ 10배 넣어 상온에서 용매 추출하는 단계;

상기 추출액을 감압·농축하여 증류수에 현탁한 후 에틸아세테이트로 용매 추출을 하는 단계;

상기 에틸아세테이트의 활성 분획을 실리카겔 크로마토그래피에서 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 메탄올의 혼합액으로 전개시켜, 클로로포름: 메탄올 (50;1, V/V)에서 활성 분획을 얻어 농축하는 단계;

상기 활성 분획을 RP-18 컬럼 크로마토그래피에서 60~100% MeOH로　전개시켜, 70% MeOH에서 활성 분획을 얻는 단계;

활성분획을 모아 농축한 후 세파덱스 LH-20 크로마토그래피에서 클로로포름:헥산:메탄올(2: 3: 1, V/V)에서 분획을 얻는 단계;

상기 분획을 예비의 HPLC에서 75% 메탄올을 사용하여 최종 분획만을 농축하는 단계; 및

상기 최종 분획을 분석용 HPLC에서 45% 아세토 나이트릴을 사용하여 체류시간 29분대에 순수한 화합물을 얻는 단계.

본 발명의 화장료 조성물에서 TMHF는 전체 화장료 조성물 중 0.1~10중량%로 함유되는 것이 아토피 피부 개선 효과면에서 바람직하다. 만일 TMHF가 0.1중량%보다 적게 함유되면 아토피 피부 개선 효과가 떨어지고 10중량%보다 많이 함유되더라도 아토피 피부 개선 효과가 특별히 증진되지 않을 뿐만 아니라 다른 조성물과의 제형 형성도 곤란한 단점이 있다.

본 발명의 아토피 피부 개선용 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들어 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 영양로션, 영양크림, 아이크림, 마사지크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우다, 팩 등의 제형을 가질 수 있다.

또한, 각 제형의 아토피 피부 개선용 화장료 조성물에 있어서, 상기의 TMHF외에 다른 성분들을 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본을 함유하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물은 쑥으로부터 분리 정제하여 얻은 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본을 함유함으로써 종래의 화장료에 비하여 인체에 염증을 일으키거나 그에 의한 질병의 원인이 되는 병원미생물을 더욱더 억제할 수 있고 아토피 피부를 현저하게 개선할 수 있는 화장료 조성물을 제공할 수 있는 매우 뛰어난 효과를 가진다.

이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 쑥으로부터 TMHF 의 분리 정제

애엽(Artemisia absinthium)으로부터 5, 6, 3',5'-테트라메톡시 7,4'-히드록시 플라본을 하기와 같이 분리 및 정제하였다.

애엽(Artemisia absinthium, 2㎏)을 분쇄한 후 알콜 수용액을 애엽 함량 대비 3 ~ 10배 넣어 2회 상온에서 용매 추출한 액을 감압·농축하여 증류수에 현탁 한 후 에틸아세테이트 등으로 용매 추출을 하였다. 상기 에틸아세테이트의 활성 분획을 실리카겔 크로마토그래피에서 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 메탄올의 혼합액으로 전개시켜, 클로로포름: 메탄올 (50;1, V/V)에서 활성 분획을 얻어 농축하였다. 상기 활성 분획을 RP-18 컬럼 크로마토그래피에서 60~100% MeOH로　전개시켜, 70% MeOH에서 활성 분획을 얻었다. 활성분획을 모아 농축한 후 세파덱스 LH-20 크로마토그래피에서 클로로포름:헥산:메탄올(2: 3: 1, V/V)에서 얻은 분획을 예비의 HPLC(J'sphere ODS-H80, 150×20mm I.D., S-4㎛, 80Å, 254nm, Simadzu LC-6AD)에서 75% 메탄올을 사용하여 최종 분획만을 농축한 후 분석용 HPLC(J'sphere ODS-H80, 250×10mm I.D., S-4㎛, 80Å, 254nm, Simadzu LC-6AD, 45% 아세토 나이트릴, 유속: 1.2㎖/분)에서 체류시간 29분대에서 순수한 상기 화합물을 얻었으며 감압 농축 시 엷은 황색의 분말의 형태로 얻을 수 있었다(도 1). ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼(미도시) 및 HMBC(도 2)를 통해 상기 화합물이 하기 화학식 1의 구조를 가진 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-히록시 플라본(5,6,3',5'-tetramethoxy 7,4'-hydroxy flavone)임을 확인하였다.

실험예 1: TMHF 의 세포 독성 및 증식 효과 조사

상기 실시예 1에서 분리한 TMHF에서 제조된 추출물 건조분말에 대하여 세포배양을 이용한 세포 증식 효과를 측정하였다.

배양하고 있는 세포(파이브로블라스트,3T3)를 96 웰 마이크로플레이트에 5,000세포/웰로 분주하여 30분간 항온조에서 배양하고, 시료를 농도별로 각각 0.05, 0.07, 0.1, 0.3, 0.5, 1.0(%,W/V))로 투여하여 72시간 동안 배양하였다. 그리고 티아졸린 블루(Thiazoline blue)를 투여하고 4시간 동안 추가 배양을 하였다. 배양액을 모두 버리고 마이크로플레이트의 각 웰에 반응 정지액을 가하고 5분간 교반한 후, 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 주입량만큼 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) 배지를 투여하여 세포 성장의 최적 조건으로 동시배양을 하였으며, 대조군의 세포증식을 100%로 하고 시료 투입 실험군의 세포 증식율 을 계산하였다.

세포증식 효과는 하기 수학식 1에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었으며, 도 3의 그래프로 도식화하였다.

농도(%)	세포 증식율(%)
농도(%)	TMHF	나린진	헤스페리딘	크리소파닉산
대조군	100	100	100	100
0.01	105.71	104.88	105.93	103.35
0.05	111.59	110.84	109.76	105.93
0.1	119.69	115.70	118.49	110.82
0.3	131.66	128.41	130.54	113.72
0.5	154.32	139.81	142.82	118.23
1.0	191.46	160.88	166.73	119.34

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 세포 성장 최적 조건에서의 세포 증식을 100%로 하였을 때, 항염 효과로 잘 알려진 나린진(Naringin)과 헤스페리딘(Hesperidine), 크리소파닉산(Chrysophanic acid)의 효과는 1.0%(W/V)에서 160.88%, 166.73%, 119.34%인 반면, 상기 실시예 1의 쑥으로부터 분리한 TMHF의 경우 농도 1.0%(W/V)에서 191.46%로 아주 우수한 세포 증식 효과를 나타내었다. 또한, 세포 증식 효과가 있음은 쑥으로부터 분리한 TMHF이 세포에 대한 독성이 없다는 것을 의미하는 것으로, 상기 세포 증식효과 실험으로부터 본 발명의 쑥으로부터 분리한 TMHF의 우수한 세포증식 효과와 더불어 세포독성이 없는 안전한 물질임을 확인할 수 있었다. TMHF의 세포증식 효과를 도식화하여 도 3에 나타내었다.

실험예 2: TMHF 의 자유라디칼 소거능력 조사

상기 실시예 1의 TMHF에 대하여 자유라디칼(Free Radical) 소거 효과를 측정하였으며 비교 물질로 퀘르세틴(Quercetin)을 사용하였다.

DPPH(1,1-디페닐-2피크릴-히드라질)법 (참조:Blois.M.S.Nature 181, 1190, 1958)을 사용하여 실험을 수행하였으며, DPPH와 퀘르세틴은 시그마(SIGMA)사의 것을 사용하였다. 0.2mM DPPH 메탄올 용액 1ml에 여러 농도(5, 10, 20, 30ppm)의 TMHF, 나린진, 헤스페리딘 그리고 퀘르세틴의 에탄올 또는 메탄올 용액 2ml를 첨가하고 잘 교반한 후 실온에서 10분간 반응을 시킨다. 그리고 517nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 공시험으로 각 시료 대신 정제수를 사용하였다.

하기 수학식 2를 이용하여 자유라디칼 소거효과를 구하고 그 결과를 하기 표 2에 기재하였다.

농도 (ppm)	자유라디칼 소거 효과(%)
농도 (ppm)	퀘르세틴	TMHF	나린진	헤스페리딘	크리소파닉산
0	0	0	0	0	0
5	29.16	29.8	20.32	23.75	25.93
10	49.7	52.7	40.85	44.57	46.37
20	73.83	93.28	66.92	68.39	70.81
30	91.23		87.35	88.27	89.27
40			92.5	93.7	94.3
퀘르세틴의 SC₅₀ : 13.42ppm TMHF의 SC₅₀ : 10.07ppm 나린진의 SC₅₀ : 16.94ppm 헤스페리딘의 SC₅₀ : 16.94ppm 크리소파닉산의 SC₅₀ : 15.48ppm

상기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, TMHF의 자유라디칼 50% 소거 농도(SC₅₀)는 10.07ppm로 가장 우수하였다. 이는 단일 물질로서 순수 물질의 수득과 사용상의 안정성 및 비용을 고려했을 경우 쑥으로부터 분리한 TMHF의 자유라디칼 소거 효과가 다른 물질들에 현저히 우수하며 사용 및 생산 비용적인 면에서도 더 효과적임을 알 수 있는 결과라 판단되었다. 자유라디칼의 소거 효과를 도식화하여 도 4에 표시하였다.

실험예 3: TMHF 의 리폭시게나아제 활성억제 효과 조사

리폭시게나아제(Lpoxygenase) 활성억제 효과를 측정하였으며 비교 물질로 퀘르세틴을 사용하였다.

TBAS법을 사용하여 실험을 수행하였으며, 실험에 사용하는 리놀레익산(Linoleic acid)과 리폭시게나아제, 티오바비툴릭산(Thiobabitulic acid), 퀘르세틴은 시그마(SIGMA)사의 것을 사용하였다. 1mM 리놀레익산 1ml에 여러 농도(1, 5, 10, 20, 30ppm)의 TMHF , 나린진, 헤스페리딘 그리고 퀘르세틴 0.05ml를 첨가하고 리폭시게나아제 0.95ml를 투여 후 잘 교반하고 25℃에서 10분간 반응을 시켰다. 그 다음 트리클로로아세트산(Trichloroacetic acid)을 0.5ml 투여하고 티오바비툴릭산 1ml 첨가한 후 10분간 가열한 후 얼음물에서 2~3분간 냉각시켜 반응을 종료시켰다. 반응이 종결된 반응액에 부탄올 2ml를 넣고 4000g로 5분간 원심분리 한 후 535nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 공시험으로 각 시료 대신 정제수를 사용하였다.

하기 수학식 3을 이용하여 리폭시게나아제 활성억제 효과를 구하고 그 결과를 하기 표 3에 기재하였다.

농도 (ppm)	억제율 (%)
농도 (ppm)	TMHF	퀘르세틴	나린진	헤스페리딘	크리소파닉산
1.0	5.07	9.21	3.04	4.37	4.88
5.0	19.88	28.64	15.66	16.32	17.23
10.0	45.82	61.49	39.97	40.55	33.57
20	89.33	94.64	88.12	85.77	60.29
30	98.69	98.97	95.78	95.41	89.06
TMHF의 IC₅₀ : 12.95ppm 퀘르세틴의 IC₅₀ : 11.34ppm 나린진의 IC₅₀ : 13.9ppm 헤스페리딘의 IC₅₀ : 13.9ppm 크리소파닉산의 IC₅₀ : 13.9ppm

상기 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 TMHF의 리폭시게나아제 50% 활성억제 농도(IC₅₀)는 12.95ppm이고, 나린진은 13.9ppm, 헤스페리딘은 13.9ppm, 크리소파닉산은 13.9ppm으로 TMHF이 비교대상의 물질보다 우수한 효과를 나타내었다. 비교대상 중 퀘르세틴은 11.34ppm으로 TMHF 보다는 약간의 좋은 효과가 있었다. 그러나 퀘르세틴이 단일 물질로 이를 추출하여 그 순수 물질의 수득과 사용상의 안정성 및 비용을 고려한다면 쑥으로부터 분리한 TMHF의 리폭시게나아제 활성억제 효과가 더 우수하며, 사용 및 생산 비용적인 면에서도 더 효과적이다는 것을 알 수 있다. 리폭시게나아제 활성억제 효과를 도식화하여 도 5에 나타내었다.

실험예 4: TMHF 의 병원성 이질균에 대한 항균력 측정

TMHF에서 제조된 추출물 건조분말에 대하여 병원성 이질균을 이용한 항균력 효과를 측정하였다.

병원성 이질균을 이용한 항균력 실험을 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

먼저, 시험관(Test tube)에 MIC Test 배지를 8㎖씩 시료의 수만큼 분취하였다. 단, 첫 번째 시험관에는 배지를 9㎖을 넣었다. 각 시료의 첫 번째 시험관에 각각의 시료를 100㎍/㎖씩 투여하였다. 각 시료의 첫 번째 시험관에서 1㎖를 취해 다음 시험관에 투여하는 방법으로 순차적으로 10배씩 희석하고 각각의 시험관에 배양하고 있는 이질균(Shigella sonnei)을 1㎖씩 투여하여 24시간 배양한 후에 각각의 시험관에 있는 배양액을 600㎚에서 흡광을 측정한다. 초기의 흡광도는 배양하고 있는 이질균을 0.1%가 되게 배지에 넣은 후 흡광도를 측정하여 초기값으로 하였다. 각각의 시료는 TMHF, 포도열매추출물(Grape Fruit Extract), 암피실린(Ampicillin), 테트라사이클린(Tetracycline), EtOH를 사용하였으며, 포도열매추출물(Grape Fruit Extract)은 유통되고 있는 항균 추출물로 비교하기 위함이고, 암피실린과 테트라사이클린은 항균제로 양성 대조구(Positive control)이며, EtOH는 음성 대조구(Negative control)로 사용하였다.

항균력 효과 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

시 료			Concentration (ug/ml)
시 료			100.	10.0	1.0	0.1	0.01	0.001	0.0001
실험군		TMHF	0.0440	0.0906	0.1205	0.1356	0.1395	0.1410	0.1481
		TMHF S.D	0.0058	0.0003	0.0064	0.0123	0.0053	0.0170	0.0049
		Crysophanic A.	0.0599	0.0681	0.0675	0.0682	0.0727	0.1125
		Crysophanic A. S.D	0.0107	0.0083	0.0124	0.0076	0.0097	0.0036
비교군	Positive Control	Ampicillin	0.0375	0.0386	0.0417	0.0414	0.0410	0.0429
		Ampicillin S.D	0.0004	0.0005	0.0030	0.0016	0.0007	0.0003
		Tetracycline	0.0579	0.0661	0.0633	0.0636	0.0697	0.1031
		Tetracycline S.D	0.0037	0.0168	0.0069	0.0086	0.0137	0.0136
	Negative Control	EtOH	0.1444	0.1455	0.1444	0.1433	0.1447	0.1444	0.1387
	Negative Control	EtOH S.D	0.0037	0.0037	0.0041	0.0049	0.0064	0.0058	0.006

상기 표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 TMHF는 우수한 항균효과가 있었으며, 양성 대조구인 암피실린 보다는 조금 낮고 테트라사이클린 보다는 조금 우수한 것으로 대등한 항균효과가 있음을 알 수 있었다. 암피실린과 테트라사이클린은 시중에 유통되는 항균제로 부작용 및 사용상의 한계점과 생산 비용적인 면을 고려한다면 쑥으로부터 분리한 TMHF는 사용상에 안전하고 부작용이 없는 항균효과가 대단히 우수한 것으로 생산 비용적인 면에서도 더 효과적이다는 것을 알 수 있었다.

실험예 5: TMHF 의 병원성 미생물에 대한 항균력 조사

쑥으로부터 분리한 TMHF에 대하여 병원성 미생물을 이용한 항균력 효과를 측정하였다.

상기 실시예 1에서 얻은 TMHF 분말 0.1중량%를 항균력 평가의 시료로 사용하였다. 각각의 병원미생물을 액체 배양하여 soft agar배지(tryptone 1g, yeast extract 0.5g, NaCl 1g, agar 0.5g, D.W 100mL) 3mL에 혼합한 후 LB 평판배지 (tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, agar 15g, D.W 1L)에 붓고 상기의 시료를 점적한 페이퍼 디스크(paper disk)(직경 6mm)를 배지 중앙에 올려놓고 24시간 동안 배양한 후, 클리어 존(clear zone)의 길이를 재어 생육 억제환을 측정하였으며, 대조군은 희석용매인 D.W로 하였다.

표 5에 이질균 외의 병원미생물에 대한 상기 시료의 항균력에 대한 결과를 나타내었다.

균주명	성장억제환(mm)
균주명	TMHF	메틸 파라벤	프로필 파라벤	크리소파닉산
대장균	18	18	15	20
황색포도상구균	20	18	15	21
장구균	17	16	12	18
세라티아균	15	15	14	16
녹농균	12	11	10	15
바실러스균	20	16	15	19
살모넬라균	19	16	15	19
폐렴간균	15	14	13	16

상기 표 5에 나타난 바와 같이, 쑥으로부터 분리한 TMHF은 대장균, 황색포도상구균, 장구균, 세라티아균, 녹농균, 바실러스균, 살모넬라균, 폐렴간균의 다양한 병원성 균에 대하여 광범위하게 항균력이 우수함을 알 수 있었다.

처방예 1: TMHF 을 함유한 화장수

상기 실시예 1과 같이 쑥으로부터 분리한 TMHF 분말을 함유한 화장수(스킨로션)는 하기 표 6의 조성으로 다음과 같이 제조하였다.

정제수에 글리세린, 부틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 방부제를 순서대로 투입하고 교반하여 용해시켜 혼합액을 얻었다. 폴리옥시에칠렌 경화피마자유를 60℃ 정도 가열하여 용해시킨 다음 향료를 투입하여 용해한 후 상기 혼합액에 투입하였다. 마지막으로 쑥으로부터 분리한 TMHF 분말, 에탄올, 트리에탄올아민, 색소를 투입하여 충분히 교반한 뒤 숙성시켰다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	쑥으로부터 분리한 TMHF 분말(TMHF)	1.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌 글리콜	2.0
4	프로필렌 글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	트리에탄올아민	0.1
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	잔량

처방 예 2: TMHF 를 함유하는 영양로션

TMHF의 쑥으로부터 분리한 TMHF 분말을 함유한 영양로션을 하기 표 7과 같은 조성으로 다음과 같이 제조하였다.

프로필렌글리콜, 카르복시폴리머, 방부제, 정제수를 혼합교반하면서 80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 밀납, 폴리솔베이트 60, 솔비탄 세스퀴올레이트, 유동 파라핀, 소르비탄 스테아레이트, 친유형 모노스테아린산 글리세린, 스테아린산, 글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트, 트리에탄올아민을 80 ~ 85℃사이로 가열 용해한 후 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 향료를 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 색소를 투입하고 35℃에 쑥으로부터 분리한 TMHF 분말(TMHF)을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	쑥으로부터 분리한 TMHF 분말(TMHF)	1.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5
4	솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	10.0
6	소르비탄 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	미량
14	색소	미량
15	향료	미량
16	정제수	잔량

처방예 3: TMHF 를 함유한 영양크림

TMHF의 쑥으로부터 분리한 TMHF 분말을 함유한 영양크림을 하기 표 8의 조성으로 다음과 같이 제조하였다.

카르복시비닐폴리머, 부틸렌글리콜, 글리세린, 정제수를 혼합 교반하면서 80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 스테아린산, 세틸알콜, 글리세릴모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트, 솔비탄세스퀴올레이트, 글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트, 왁스, 유동파라핀, 스쿠알란, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드를 80 ~ 85℃사이로 가열하여 용해한 후 트리에탄올아민을 투입 교반하여 제조부에 투입하고 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각하고 TMHF를 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

비교예 1 내지 4: TMHF 를 함유하지 않은 영양크림

TMHF의 쑥으로부터 분리한 TMHF 분말을 함유하지 않은 영양크림을 하기 표 8의 조성으로 다음과 같이 제조하였다.

카르복시비닐폴리머, 부틸렌글리콜, 글리세린, 정제수를 혼합교반하면서 80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 스테아린산, 세틸알콜, 글리세릴모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트, 솔비탄세스퀴올레이트, 글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트, 왁스, 유동파라핀, 스쿠알란, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드를 80 ~ 85℃사이로 가열하여 용해한 후 트리에탄올아민을 투입교반하여 제조부에 투입하고 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각하고 비교예 1의 경우 정제수를, 비교예 2의 경우 나린진을, 비교예 3의 경우 헤스페리딘을, 비교예 4의 경우 크리소파닉산을 각각 1.0중량%씩 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

번호	원 료	처방예3	비교예1	비교예2	비교예3	비교예4
1	TMHF	1.0	-	-	-	-
2	스테아린산	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
3	세틸알콜	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
4	글리세릴모노스테아레이트	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
5	폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
6	솔비탄세스퀴올레이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
7	글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
8	왁스	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
9	유동파라핀	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
10	스쿠알란	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
11	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
12	카르복시비닐폴리머	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
13	부틸렌글리콜	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
14	글리세린	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
15	트리에탄올아민	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
16	정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량
17	정제수	-	1.0	-	-	-
18	Naringin	-	-	1.0	-	-
19	Hesperidine	-	-	-	1.0	-
20	Crysophanic Acid	-	-	-	-	1.0

처방예 4: 에센스

TMHF의 쑥으로부터 분리한 TMHF 분말을 함유한 에센스를 하기 표 9의 조성으로 다음과 같이 제조하였다.

시토 스테롤, 폴리글리세릴 2-올레이트, 세라마이드, 스테아레스-4 및 콜레스테롤을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭하였다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 쑥으로부터 분리한 TMHF 분말(TMHF), 디세틸포스페이트, 농글리세린 및 정제수를 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루이다이져를 통과하고 이어 마카다미아 오일을 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루이다이져에 재차 통과시켰다. 그리고 카르복시비닐폴리머, 산탄검, 방부제, 향료를 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시켰다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	쑥으로부터 분리한 TMHF 분말(TMHF)	1.0
2	시토 스테롤	1.7
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.5
4	세라마이드	0.7
5	스테아레스-4	1.2
6	콜레스테롤	1.5
7	디세틸포스페이트	0.4
8	농글리세린	5.0
9	마카다미아 오일	15.0
10	카르복시비닐폴리머	0.2
11	산탄검	0.2
12	방부제	미량
13	향료	미량
14	정제수	잔량

실험예 5: 본 발명 쑥 유래의 TMHF 함유 화장료 조성물의 아토피 피부 개선효과 조사

상기 처방예 3의 화장료에 대한 아토피 피부 개선효과의 임상 평가를 측정하였다.

처방예 3 화장료의 아토피 피부의 개선 효과를 평가하기 위해, 아토피성 피부를 가지고 한의원 및 병원에 내원하여 치료받는 소인 30명을 대상으로 다음과 같은 실험을 실시하였다. 시험 시료를 이중 맹검법(double-blinded test)에 의하여 각각 오른쪽과 왼쪽으로 나누어 전신에 도포하되, 가능한 한 시험시료의 효과에 영향을 미칠 수 있는 다른 보습제의 사용은 금지하였다. 시험 시료를 도포한 지 1, 2, 3, 4주 후의 효과를 스코래드 SCORAD:SCORing Atopic Dermatitis) 측정법으로 평가하여 그 결과를 하기 표 10에 나타냈다.

1) 판정기준

① 정도 기준(Extent criteria) : 면적 = 피손부위/100

② 강도 기준(intensity criteria)

- 홍반 (1/2/3)

- 부종 (1/2/3)

- 삼출 (1/2/3)

- 피부 벗겨짐 (1/2/3)

- 태선화 정도 (1/2/3)

- 건조 정도 (1/2/3)

③ 주관적 기준

- 가려움 (1-10)

- 불면증 (1-10)

*스코래드 계산 = (정도기준/5) + (강도기준/7) + 주관적기준

분류	0주	1주	2주	3주	4주
처방예3	67.6	36.7	20.1	14.5	11.3
처방예3	0%	45.7%	70.3%	78.6%	83.3%
비교예1	57.2	46.6	32.2	19.4	10.4
비교예1	0%	18.6%	30.9%	39.7%	46.2%
비교예2	60.2	45.2	29.7	22.8	20.6
비교예2	0%	24.9%	50.66%	62.12%	65.78%
비교예3	63.9	47.6	30.3	21.6	20.7
비교예3	0%	25.5%	52.58%	66.20%	67.6%
비교예4	66.2	49.3	43.8	37.2	35.3
비교예4	0%	25.53%	33.84%	43.81%	46.68%

상기 표 10을 통해, 쑥으로부터 분리한 TMHF을 함유하는 처방예 3의 화장료가 비교예 1 내지 4에 비해 아토피 피부 개선효과가 현저히 우수하다는 것을 알 수 있었다. 특히, 4주 후의 결과를 보면 83% 정도의 우수한 개선 효과를 나타내고 있었다. 아토피 피부의 개선율을 도식화하여 도 6에 표시하였다. 또한 TMHF를 함유하는 화장품의 사용 전후에 대한 임상적 결과 사진을 도 7에 나타내었다.

한편, 보호자가 느끼는 아토피 피부염 완화 효과를 살펴보기 위하여, 처방예 3 및 비교예 1의 화장료를 1개월 동안 사용한 후, 사용자의 부모가 하기 표 11의 기준에 따라 피부염의 가려움증, 홍반 변화, 피부 건조증에 대한 만족도와 함께 전반적인 피부염 개선 정도 및 시험시료에 의한 부작용 여부 등을 평가하도록 하여 그 결과를 하기 표 12에 나타냈다.

1	2	3	4	5
효과없음	약간있음	보통	우수	매우우수
매우불만	불만	보통	만족	매우만족

분류	피부가려움증	홍반 변화	피부 건조증	전반적 개선효과	부작용
처방예 3	4.01	3.96	3.70	4.36	4.04
비교예 1	2.55	3.27	3.65	3.22	3.97
비교예2	3.00	3.31	3.52	3.36	3.94
비교예3	3.21	3.22	3.55	3.45	4.00
비교예4	3.33	2.26	3.03	2.82	3.56

상기 표 12에서와 같이, 본 발명에 따른 처방예 3의 화장료는 피시험자인 아토피성 피부를 갖는 소아에 대하여 전 평가항목에서 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

이상 상기 실험예 및 실시예를 통해 설명한 바와 같이, 본 발명 쑥 유래의 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본을 함유하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물은 쑥으로부터 분리 정제하여 얻은 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본을 함유함으로써 종래의 화장료에 비하여 인체에 염증을 일으키거나 그에 의한 질병의 원인이 되는 병원미생물을 더욱더 억제할 수 있고 아토피 피부를 현저하게 개선할 수 있는 화장료 조성물을 제공할 수 있는 매우 뛰어난 효과를 가지므로 화장품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 쑥 유래의 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본의 HPLC 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 쑥 유래의 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본의 HMBC를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 쑥 유래의 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본을 세포에 처리하여 세포 증식 효과를 측정한 결과를 그래프로 도식화한 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 쑥 유래의 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본의 자유라디칼 소거 효과를 측정한 결과를 그래프로 도식화한 것이다.

도 5는 본 발명에 따른 쑥 유래의 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본의 리폭시게나아제 활성억제 효과를 측정한 결과를 그래프로 도식화한 것이다.

도 6은 본 발명에 따른 쑥 유래의 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본을 함유하는 영양크림 제형의 화장료 조성물을 사용한 경우 아토피 피부의 개선율을 도식화하여 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명에 따른 쑥 유래의 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본을 함유하는 영양크림 제형의 화장료 조성물을 사용하기 전과 사용한 후에 나타난 임상적 결과를 보여주는 사진이다.

Claims

5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본(5,6,3',5'-tetramethoxy 7,4'-hydroxy flavone)을 전체 화장료 조성물 중 0.1~10중량% 함유하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본은 병원성 이질균, 대장균, 황색포도상구균, 장구균, 세라티아균, 녹농균, 바실러스균, 살모넬라균 및 폐렴간균에 대한 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화장료 조성물의 제형이 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 영양로션, 영양크림, 아이크림, 마사지크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우다 또는 팩인 것을 특징으로 하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 5,6,3',5'-테트라메톡시 7,4'-하이드록시 플라본은 쑥 추출물로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물.