본 발명은 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯 및 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯 및 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물은 당업자에게 알려진 통상의 방법으로 수득되며, 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯 및 노루궁뎅이버섯의 혼합비율은 다양하게 변화될 수 있으나, 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯의 건조물을 1:2:1:2의 중량비로 혼합 하였을 때가 추출물의 수율이 바람직하다.
예를 들어, 본 발명에서의 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯 및 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물은 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯의 건조물을 분쇄하여 혼합하고, 그 건조 중량의 1~15배 부피량의 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올 또는 이들 저급 알코올과 물과의 혼합용매 중에서 선택된 추출용매를 부가하여 4∼30℃에서 3∼20일간 침적시켜 유효성분을 추출한 후, 추출용매를 감압농축기로 농축하여 수득된다. 또한, 본 발명에서의 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯 및 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물은 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯 및 노루궁뎅이버섯의 건조물을 분쇄하여 혼합하고, 그 건조 중량의 1~15배 부피량의 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올 또는 이들 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 에틸아세테이트, 물, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 사용하며, 이어서 용매가 증발되는 것을 방지하기 위하여 냉각 콘덴서를 구비한 추출기로 30∼100℃에서 3∼48시간 동안 가열 추출하거나 5∼30℃에서 1~5일간 침적시켜 유효성분을 추출하고, 추출 용매를 감압농축기로 농축하여 수득된다.
이렇게 하여 제조된 본 발명에서의 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯 및 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물은 베타글루칸을 함유하고 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯 및노루궁뎅이버섯 혼합 추출물은 액상 중량으로서 0.1%~10%의 양을 화장료에 첨가할 수 있고, 또한 그 건조중량으로서 0.001∼5중량%, 바람직하게는 0.01∼3중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있다.
본 발명의 항알러지 및 아토피 피부 개선 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 화장수, 영양로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩 등의 제형을 가질 수 있다.
또한, 각 제형의 항알러지 및 아토피 피부 개선 화장료 조성에 있어서, 상기의 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물 외에 다른 성분들을 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다.
이하, 제조예, 비교제조예, 실시예 및 비교실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 상세히 설명하나, 본 발명이 이들에만 한정되는 것은 아니다.
차가버섯
,
말굽잔나비버섯
,
신령버섯
,
노루궁뎅이버섯의
혼합 비율에 따른 수 추출물 제조
제조예
1.
차가버섯 25g, 말굽잔나비버섯 25g, 신령버섯 25g, 노루궁뎅이버섯의 각 건조분말 25g 즉, 중량 1:1:1:1 비율로 한 시료에 증류수 1㎏을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 100℃로 8시간 끓여서 추출한 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 1주일간 방치하여 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 47mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기를 이용하여 50℃에서 완전히 농축하여 건조 중량 31.7 g을 얻었다.
제조예
2 ~ 11.
하기 표1의 시료 혼합 비율(차가버섯:말굽잔나비버섯:신령버섯:노루궁뎅이버섯)로 증류수를 사용하고 제조예 1과 동일한 방법으로 추출하여 제조예 2 내지 11의 추출물을 수득하였다. 그 결과를 하기 표1과 같다.
|
시료 혼합 비율 (차가버섯:말굽잔나비버섯:신령버섯:노루궁뎅이버섯) |
수득량 (g) |
제조예 2 |
2 : 1 : 1 : 1(40g:20g: 20g:20g) |
28.3 |
제조예 3 |
1 : 2 :1 : 1(20g:40g: 20g:20g) |
30.8 |
제조예 4 |
1 : 1 : 2 : 1(20g:20g: 40g:20g) |
27.2 |
제조예 5 |
1 : 1 : 1 : 2(20g:20g: 20g:40g) |
31.1 |
제조예 6 |
2 : 2 :1 : 1(33g:33g: 17g:17g) |
28.8 |
제조예 7 |
2 : 1 : 2 : 1(33g:17 g: 33g:17g) |
27.2 |
제조예 8 |
2 : 1 : 1 : 2(33g:17g: 17g: 33g) |
28.6 |
제조예 9 |
1 : 2 : 2 : 1(17g:33g: 33g:17g) |
29.9 |
제조예 10 |
1 : 2 : 1 : 2(17g:33g: 17g: 33g) |
32.9 |
제조예 11 |
1 : 1 : 2 : 2(17g:17g: 33g: 33g) |
28.5 |
여러가지
용매를 사용한
차가버섯
,
말굽잔나비버섯
,
신령버섯
,
노루궁뎅이버섯
혼합 추출물의 제조
제조예
12 ~ 19.
차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯의 조성 비율을 1 : 2 : 1 : 2 즉, 17g : 33g : 17g : 33g으로 하여 하기 표2의 용매를 사용하고 제조예 1과 동일한 방법으로 추출하여 제조예 12 내지 19의 추출물을 수득하였다. 그 결과는 하기 표2와 같다.
|
용매 |
수득량(g) |
제조예 12 |
30% 함수 에탄올 |
19.5 |
제조예 13 |
50% 함수 에탄올 |
17.3 |
제조예 14 |
70% 함수 에탄올 |
17.8 |
제조예 15 |
메탄올 |
18.7 |
제조예 16 |
10% 함수 1,3 부틸렌 글리콜 |
23.6 |
제조예 17 |
50% 함수 1,3 부틸렌 글리콜 |
20.2 |
제조예 18 |
10% 함수 프로필렌렌 글리콜 |
24.1 |
제조예 19 |
50% 함수 프로필렌 글리콜 |
20.6 |
비교제조예
1
차가버섯
추출물의 제조
차가버섯 100g을 증류수 1㎏에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 100℃로 8시간 끓여서 추출한 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 1주일간 방치하여 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 47mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기를 이용하여 50℃에서 완전히 농축하여 건조 중량 27.3 g을 얻었다.
비교제조예
2.
말굽잔나비버섯
추출물의 제조
말굽잔나비버섯 100g을 증류수 1㎏에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 100℃로 8시간 끓여서 추출한 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 1주일간 방치하여 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 47mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기를 이용하여 50℃에서 완전히 농축하여 건조 중량 30.6 g을 얻었다.
비교제조예
3.
신령버섯
추출물의 제조
신령버섯 100g을 증류수 1㎏에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 100℃로 8시간 끓여서 추출한 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 1주일간 방치하여 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 47mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기를 이용하여 50℃에서 완전히 농축하여 건조 중량 31.3 g을 얻었다.
비교제조예
4.
노루궁뎅이버섯
추출물의 제조
노루궁뎅이버섯 100g을 증류수 1㎏에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 100℃로 8시간 끓여서 추출한 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 1주일간 방치하여 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 47mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기를 이용하여 50℃에서 완전히 농축하여 건조 중량 32.9 g을 얻었다.
차가버섯
,
말굽잔나비버섯
,
신령버섯
,
노루궁뎅이버섯
혼합 추출물을 이용한 화장품 제조
실시예
1. 화장수 제조
차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물 분말(제조예10)을 함유한 화장수(스킨로션)를 하기의 표의 함량으로 하기 제조방법을 이용하여 제조하였다.
번호 |
원 료 |
함량 (중량%) |
1 |
차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물 분말(제조예10) |
1.0 |
2 |
글리세린 |
3.0 |
3 |
부틸렌 글리콜 |
2.0 |
4 |
프로필렌 글리콜 |
2.0 |
5 |
폴리옥시에칠렌 경화피마자유 |
1.0 |
6 |
에탄올 |
10.0 |
7 |
트리에탄올아민 |
0.1 |
8 |
방부제 |
미량 |
9 |
색소 |
미량 |
10 |
향료 |
미량 |
11 |
정제수 |
잔량 |
상기 표 중 11번 물질에 2,3,4,8번 물질을 순서대로 투입하고 교반하여 용해시킨 후, 5번 물질을 60℃ 정도로 가열하여 용해시켰다. 이 후, 10번 물질을 투입하여 용해한 후 11번 물질에 투입하였다. 마지막으로 1,6,7,9번 물질을 투입하여 충분히 교반한 뒤 숙성시켜 표제의 화장수를 제조하였다.
실시예
2. 영양로션 제조
차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물 분말(제조예10)을 함유한 영양로션을 하기의 표의 함량으로 하기 제조방법을 이용하여 제조하였다.
번호 |
원 료 |
함량(중량%) |
1 |
차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물 분말(제조예10) |
1.0 |
2 |
밀납 |
1.0 |
3 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
4 |
솔비탄 세스퀴올레이트 |
0.5 |
5 |
유동 파라핀 |
10.0 |
6 |
소르비탄 스테아레이트 |
1.0 |
7 |
친유형 모노스테아린산 글리세린 |
0.5 |
8 |
스테아린산 |
1.5 |
9 |
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트 |
1.0 |
10 |
프로필렌글리콜 |
3.0 |
11 |
카르복시폴리머 |
0.1 |
12 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
13 |
방부제 |
미량 |
14 |
색소 |
미량 |
15 |
향료 |
미량 |
16 |
정제수 |
잔량 |
상기 표 중, 10, 11, 13, 16번 물질을 혼합교반하면서 80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12번 물질을 80 ~ 85℃사이로 가열 용해한 후 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번 물질을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번 물질을 투입하고 35℃에서 1번 물질을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켜 표제의 영양로션을 제조하였다.
실시예
3. 영양크림 제조
차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물 분말(제조예10)을 함유한 영양크림을 하기의 표의 함량으로 하기 제조방법을 이용하여 제조하였다.
번호 |
원 료 |
함량(중량%) |
1 |
차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물 분말(제조예10) |
1.0 |
2 |
스테아린산 |
2.0 |
3 |
세틸알콜 |
2.0 |
4 |
글리세릴모노스테아레이트 |
2.0 |
5 |
폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트 |
0.5 |
6 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
0.5 |
7 |
글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트 |
1.0 |
8 |
왁스 |
1.0 |
9 |
유동파라핀 |
4.0 |
10 |
스쿠알란 |
4.0 |
11 |
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 |
4.0 |
12 |
카르복시비닐폴리머 |
0.3 |
13 |
부틸렌글리콜 |
5.0 |
14 |
글리세린 |
3.0 |
15 |
트리에탄올아민 |
0.5 |
16 |
정제수 |
잔량 |
상기 표 중 12, 13, 14, 16번 물질을 혼합교반하면서 80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11번 물질을 80 ~ 85℃사이로 가열하여 용해한 후 15번 물질을 투입 교반하여 제조부에 투입하고 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각하고 1번 물질을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켜 표제의 영양로션을 제조하였다.
실시예
4. 에센스 제조
차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물 분말(제조예10) 을 함유한 에센스를 하기의 표의 함량으로 하기 제조방법을 이용하여 제조하였다.
번호 |
원 료 |
함량(중량%) |
1 |
차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물 분말(제조예10) |
1.0 |
2 |
시토 스테롤 |
1.7 |
3 |
폴리글리세릴 2-올레이트 |
1.5 |
4 |
세라마이드 |
0.7 |
5 |
스테아레스-4 |
1.2 |
6 |
콜레스테롤 |
1.5 |
7 |
디세틸포스페이트 |
0.4 |
8 |
농글리세린 |
5.0 |
9 |
마카다미아 오일 |
15.0 |
10 |
카르복시비닐폴리머 |
0.2 |
11 |
산탄검 |
0.2 |
12 |
방부제 |
미량 |
13 |
향료 |
미량 |
14 |
정제수 |
잔량 |
상기 표에서 2, 3, 4, 5 및 6번 물질을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질을 제조하였다. 이 비이온계 양친매성 지질과 1, 7, 8 및 14번 물질을 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루이다이져를 통과시키고 이어 9번 물질을 50 ~60℃ 에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루이다이져에 재차 통과시켰다. 그 후, 10, 11, 12, 13번 물질을 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시켜 표제의 에센스를 제조하였다.
비교실시예
1 내지 5 . 영양크림 제조
차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯 또는 노루궁뎅이버섯 단독 추출물 분말을 각각 함유한 화장료 중 영양크림을 하기의 표의 함량으로 하기 제조방법을 이용하여 제조하였다.
번호 |
원 료 |
비교실시예1 |
비교실시예2 |
비교실시예3 |
비교실시예4 |
비교실시예5 |
2 |
스테아린산 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
3 |
세틸알콜 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
4 |
글리세릴모노스테아레이트 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
5 |
폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
6 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
7 |
글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
8 |
왁스 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
9 |
유동파라핀 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
10 |
스쿠알란 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
11 |
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
12 |
카르복시비닐폴리머 |
0.3 |
0.3 |
0.3 |
0.3 |
0.3 |
13 |
부틸렌글리콜 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
14 |
글리세린 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
15 |
트리에탄올아민 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
16 |
정제수 |
잔량 |
잔량 |
잔량 |
잔량 |
잔량 |
17 |
물 |
1.0 |
- |
- |
- |
- |
18 |
비교제조예 1 |
- |
1.0 |
- |
- |
- |
19 |
비교제조예 2 |
- |
- |
1.0 |
- |
- |
20 |
비교제조예 3 |
- |
- |
- |
1.0 |
- |
21 |
비교제조예 4 |
- |
- |
- |
|
1.0 |
상기 표에서, 12, 13, 14, 16번 물질을 혼합교반하면서 80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11번 물질을 80 ~ 85℃사이로 가열하여 용해한 후 15번 물질을 투입교반하여 제조부에 투입하고 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각하고 17, 18, 19, 20, 21번 물질을 각각의 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켜, 비교실시예 1 내지 5를 제조하였다.
실험예
1. 세포증식효과 확인
상기 제조예 10, 비교제조예 1, 2, 3, 4에서 제조된 추출물 건조분말에 대하여 세포배양을 이용한 세포 증식 효과를 측정하였다.
1) 실험방법
세포 독성 및 증식 실험을 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 배양하고 있는 세포(파이브로블라스트,3T3)를 96 웰 마이크로플레이트에 5,000세포/웰로 분주하여 30분간 항온조에서 배양하고, 시료를 농도 별 각각 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0(%,W/V))로 투여하여 72시간동안 배양하였다. 그리고 티아졸린 블루(Thiazoline blue)를 투여하고 4시간동안 추가 배양을 하였다. 배양액을 모두 버리고 마이크로플레이트의 각 웰에 반응 정지액(acidic isopropanol)을 가하고 5분간 교반한 후, 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 주입량만큼 10 % 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) 배지를 투여하여 세포 성장의 최적 조건으로 동시배양을 하였으며, 대조군의 세포증식을 100%로 하고 시료 투입 실험군의 세포 증식률을 계산하였다.
2) 실험결과
세포증식률은 하기 식1에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었으며, 도1의 그래프로 도식화하였다.
추출물 농도(%) |
세포 증식률(%) |
제조예 10 |
비교제조예 1 |
비교제조예 2 |
비교제조예 3 |
비교제조예 4 |
대조군 |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
0.01 |
105.75 |
102.31 |
104.38 |
106.73 |
103.22 |
0.05 |
118.86 |
109.44 |
110.14 |
111.27 |
110.29 |
0.1 |
127.35 |
120.62 |
119.83 |
122.86 |
120.93 |
0.5 |
143.11 |
129.79 |
129.07 |
131.30 |
130.29 |
1.0 |
146.86 |
133.11 |
136.09 |
138.24 |
137.38 |
표 3에 나타난 바와 같이, 세포 성장 최적 조건에서의 세포 증식을 100%로 하였을 때, 차가버섯 단일 추출물인 비교제조예 1, 말굽잔나비버서 단일추출물인 비교제조예 2, 신령버섯 단일 추출물인 비교제조예 3, 노루궁뎅이버섯 단일 추출물인 비교제조예 4의 효과는 1.0%(W/V)에서 133.11%, 136.09%, 138.24%, 137.38%인 반면에 농도 1.0%(W/V)의 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물인 제조예10은 146.86%로 우수한 세포 증식 효과를 나타내었다.
한편, 세포 증식 효과가 있음은 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물이 세포에 대한 독성이 없다는 것을 의미하는 것으로, 상기 세포 증식효과 실험으로부터 본 발명의 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물의 우수한 세포증식 효과와 더불어 세포독성이 없는 안전한 것임을 확인할 수 있었다. 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물의 세포증식 효과를 도식화하여 도1에 표시하였다.
실험예
2.
자유라디칼
소거효과 확인(항산화 효과 확인)
상기 제조예 10, 비교제조예 1, 2, 3, 4에 대하여 자유라디칼(Free Radical) 소거 효과를 측정하였으며 비교 물질로 퀘르세틴(Quercetin)을 사용하였다.
1)실험방법
DPPH(1,1-디페닐-2피크릴-히드라질)법 (참조:Blois.M.S.Nature 181, 1190, 1958)을 사용하여 실험을 수행하였으며, DPPH와 퀘르세틴은 시그마(SIGMA)사의 것을 사용하였다. 0.2mM DPPH 메탄올 용액 1ml에 2ml의 여러 농도(5, 10, 20, 30ppm)의 제조예 10, 비교제조예 1, 2, 3, 4, 퀘르세틴의 에탄올 용액을 첨가하고 잘 교반한 후 실온에서 10분간 반응시켰다. 그 후 517nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 공시험으로 각 시료 대신 정제수를 사용하였다.
하기 식2를 이용하여 자유라디칼 소거효과를 구하고 그 결과를 아래의 표 4에 기재하였다.
[식2]
2) 실험결과
농도 (ppm) |
자유라디칼 소거 효과(%) |
제조예 10 |
비교제조예 1 |
비교제조예2 |
비교제조예3 |
비교제조예4 |
퀘르세틴 |
0
|
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
5
|
22.5 |
21.8 |
23.5 |
19.3 |
22.1 |
27.4 |
10
|
50.3 |
50.3 |
52.7 |
43.6 |
50.6 |
50.8 |
20
|
75.2 |
75.6 |
73.9 |
69.2 |
72.8 |
94.2 |
30
|
93.7 |
92.9 |
93.6 |
91.4 |
94.3 |
|
제조예 10의 SC50 : 13.53ppm
비교제조예 1의 SC50 : 13.61ppm
비교제조예 2의 SC50 : 13.41ppm
비교제조예 3의 SC50 : 14.75ppm
비교제조예 4의 SC50 : 13.66ppm
퀘르세틴의 SC50 : 10.23ppm
표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 제조예 10의 자유라디칼 50% 소거 농도(SC50)는 13.53ppm으로 퀘르세틴의 10.23ppm에 비해 다소 낮은 효과이나 퀘르세틴이 단일 물질이며 이를 추출하여 그 순수 물질의 수득과 사용상의 안정성 및 비용을 고려한다면 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물의 자유라디칼 소거 효과가 더 우수하며, 사용 및 생산 비용적인 면에서도 더 효과적이다는 것을 알 수 있다.
또한, 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물인 제조예10의 자유라디칼의 소거 효과를 도식화하여 도2에 표시하였다.
실험예
3.
리폭시게나아제
활성억제 효과 확인
상기 제조예 10, 비교제조예 1, 2, 3, 4,에 대하여 리폭시게나아제(Lpoxygenase) 활성억제 효과를 측정하였으며 비교 물질로 퀘르세틴을 사용하였다.
1)실험방법
TBAS법을 사용하여 실험을 수행하였으며, 실험에 사용하는 리놀산(Linoleic acid), 리폭시게네이즈(Lipoxygenase), 티오바르툴산(Thiobarbitulic acid) 및 퀘르세틴(Quercetin)은 시그마(SIGMA)사의 것을 사용하였다. 1mM의 리놀산 1ml에 여러 농도(1, 5, 10, 20, 30ppm)의 제조예 10, 비교제조예 1, 2, 3, 4 및 퀘르세틴을 0.05ml를 첨가하고 리콕시게네이즈 0.95ml를 투여 후, 잘 교반하고 25℃에서 10분간 반응을 시켰다. 그리고 트리클로로아세트산(Trichloroacetic acid)을 0.5ml 투여하고 티오바르툴산 1ml 첨가한 후 10분간 가열한 후 얼음물에서 2~3분간 냉각시켜 반응을 종료시켰다. 종결된 반응액에 부탄올 2ml를 넣고 4000g로 5분간 원심분리 한 후 535nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조군으로 각 시료 대신 정제수를 사용하였다.
하기 식3를 이용하여 리폭시게네이즈 활성억제 효과를 구하고 그 결과를 아래의 표 5에 기재하였다.
[식3]
농도 (ppm) |
리폭시게나아제 활성억제 효과(%) |
제조예 10 |
비교제조예 1 |
비교제조예 2 |
비교제조예 3 |
비교제조예 4 |
퀘르세틴 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
7.3 |
6.2 |
7.9 |
5.8 |
7.2 |
9.2 |
5 |
25.8 |
20.3 |
23.7 |
18.9 |
25.3 |
28.6 |
10 |
60.4 |
56.1 |
61.3 |
53.8 |
65.5 |
61.4 |
20 |
94.1 |
90.8 |
93.6 |
90.2 |
94.5 |
94.6 |
제조예 10의 IC50 : 9.82 ppm
비교제조예 1의 IC50 : 10.51 ppm
비교제조예 2의 IC50 : 9.87 ppm
비교제조예 3의 IC50 : 10.73 ppm
비교제조예 4의 IC50 : 9.57 ppm
퀘르세틴의 IC50 : 9.57 ppm
표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 제조예 10의 리폭시게나아제 50% 활성억제 농도(IC50)는 9.82ppm 이고, 차가버섯 단일 추출물인 비교제조예 1은 10.51ppm, 말굽잔나비버섯 단일 추출물인 비교제조예 2는 9.87ppm, 신령버섯 단일 추출물인 비교제조예 3은 10.73ppm, 노루궁뎅이버섯 단일 추출물인 비교제조예 4는 9.57ppm로 단일 추출물 보다 우수하거나 비슷한 효과를 나타내었다. 퀘르세틴은 9.57ppm으로 제조예10인 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출보다는 약간의 좋은 효과가 있었다. 그러나 퀘르세틴이 단일 물질이며 이를 추출하여 그 순수 물질의 수득과 사용상의 안정성 및 비용을 고려한다면 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물의 리폭시게나아제 활성억제 효과가 더 우수하며, 사용 및 생산 비용적인 면에서도 더 효과적이다는 것을 알 수 있다.
또한, 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물의 리폭시게나아제 활성억제 효과를 도식화하여 도3에 표시하였다.
실험예
4.
히아루노니다아제의
활성 억제효과 확인
상기 제조예 10, 비교제조예 1, 2, 3, 4에 대하여 히아루로니다아제(Hyaluronidase) 활성 억제효과를 측정하였다.
1) 실험방법
Morgan-Elson 법을 응용하여, 히아루로니다아제의 최종 효소 활성을 400NF unit/㎖, 히아루론산(Hyaluronic Acid)의 최종 농도를 0.4㎎/㎖로 하고, 활성제인 화합물48/80(Compound 48/80 효소) 완충용액(buffer solution)(0.1㎎/㎖)을 사용하여 Hyaluronidase 활성을 측정하였다. 시료를 buffer에 용해하여 시료 용액으로 하고 대조군은 시료용액 대신에 녹차추출물을 사용하였다. 또한 각각의 blank로는 효소용액 대신에 buffer를 사용하였다.
하기 식4를 이용하여 히아루로니다아제 활성억제 효과를 구하고 그 결과를 아래의 표 6에 기재하였다.
[식4]
히아루로니다아제 활성 억제 효과(%)
=100-(각시료의 반응흡광도/대조군의 반응흡광도*100)
농도 (%) |
히아루로니다아제 활성억제 효과(%) |
제조예 10 |
비교제조예 1 |
비교제조예 2 |
비교제조예 3 |
비교제조예 4 |
녹차추출물 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0.5 |
22.5 |
14.5 |
17.8 |
12.3 |
18.4 |
8.1 |
1 |
43.8 |
36.4 |
39.2 |
27.8 |
38.7 |
19.6 |
3 |
80.6 |
75.7 |
78.3 |
70.4 |
77.7 |
44.9 |
5 |
98.2 |
94.4 |
97.1 |
87.9 |
96.2 |
88.3 |
제조예 10의 IC50 : 1.95 %
비교제조예 1의 IC50 : 2.21 %
비교제조예 2의 IC50 : 2.09 %
비교제조예 3의 IC50 : 2.48 %
비교제조예 4의 IC50 : 2.10 %
녹차추출물 의 IC50 : 2.94 %
표 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 제조예 10의 히아루로니다아제 50% 활성억제 농도(IC50)는 1.95% 이고, 차가버섯 단일 추출물인 비교제조예 1은 2.21%, 말굽잔나비버섯 단일 추출물인 비교제조예 2는 2.09%, 신령버섯 단일 추출물인 비교제조예 3은 2.48%, 노루궁뎅이버섯 단일 추출물인 비교제조예 4는 2.10%로 단일 추출물 보다 우수한 효과를 나타내었다. 또한 비교예인 녹차추출물의 2.94%보다 제조예10인 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물이 히아루로니다아제 활성억제 효과 가 매우 우수함을 알 수 있었다.
또한, 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물(제조예 10)의 히아루로니다아제 활성억제 효과를 도식화하여 도4에 표시하였다.
실험예
5. 면역세포의
탈과립화
억제 효과
상기 제조예 10, 비교제조예 1, 2, 3, 4에 대하여 면역세포의 탈과립화 효과를 측정하였다.
1) 실험방법
본 발명의 제조예 10을 RBL-2H3 세포주(Rat mast cell line)에 처리하여 안티젠에 의한 탈과립화를 억제하는 효과를 확인하였다.
RBL-2H3 세포주를 1% 어린 소 혈청(Fetal bovine serum)과 L-글루타민(Glutamine)을 포함하는 둘베코(Dulbeccos)에 의해 수정된 이글(Eagle)의 배지(Dulbeccos' modified Eagle's medium, 이하 DMEM)을 이용하여 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하며, 고착성을 갖는 세포를 트립신(Trypsin)-EDTA 용액을 사용하여 부유시키고, 이를 분리, 회수하여 실험에 이용하였다.
RBL-2H3 세포주를 활성인자(Dinitrophenol-conjugated human serum albumin, (DNP-HSA)-specific IgE)로 활성화 시킨 후, 활성화된 세포에 안티젠(DNP-HSA) 50 ng/mL을 처리하고 제조예 10, 비교제조예 1, 2, 3, 4를 각각 0, 5, 25, 125 ㎍/㎖로 처리하여 60분동안 배양하였다 이후 엘리사 관측기(ELISA reader)를 이용하여 배지 내로 분비된 β-헥소사미니다제(hexosaminidase) 양을 측정하였다. β-헥소사미니다제 분비 양의 억제는 면역세포의 탈과립화를 방지함을 의미한다.
농도 (ug/ml) |
면역세포 탈과립화 억제 효과(%) |
제조예 10 |
비교제조예 1 |
비교제조예 2 |
비교제조예 3 |
비교제조예 4 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
5 |
28.8 |
14.6 |
23.7 |
22.5 |
26.4 |
25 |
62.9 |
53.7 |
60.3 |
57.8 |
61.5 |
125 |
98.1 |
90.3 |
95.6 |
94.1 |
97.3 |
제조예 10의 IC50 : 42.70 ug/ml
비교제조예 1의 IC50 : 54.96 ug/ml
비교제조예 2의 IC50 : 46.67 ug/ml
비교제조예 3의 IC50 : 48.77 ug/ml
비교제조예 4의 IC50 : 44.45 ug/ml
표 7에서 확인할 수 있는 바와 같이 제조예 10의 면역세포의 탈과립화 50% 억제 농도(IC50)는 42.70ug/ml 이고, 차가버섯 단일 추출물인 비교제조예 1은 54.96ug/ml, 말굽잔나비버섯 단일 추출물인 비교제조예 2는 46.67ug/ml, 신령버섯 단일 추출물인 비교제조예 3은 48.77ug/ml, 노루궁뎅이버섯 단일 추출물인 비교제조예 4는 44.45ug/ml로 단일 추출물 보다 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물이 면역세포의 탈과립화에 매우 우수한 효과를 나타내었다.
실험예
6. 아토피 피부 개선효과 확인
실시예 3의 화장료에 대한 아토피 피부 개선효과의 임상 평가를 측정하였다.
실시예 3 화장료의 아토피 피부의 개선 효과를 평가하기 위해, 아토피성 피부를 가지고 한의원 및 병원에 내원하여 치료받는 소인 50명을 대상으로 다음과 같은 실험을 실시하였다. 시험 시료를 이중 맹검법(double-blinded test)에 의하여 각각 오른쪽과 왼쪽으로 나누어 전신에 도포하되, 가능한 시험시료의 효과에 영향을 미칠 수 있는 다른 보습제의 사용은 금지하였다. 시험 시료를 도포한 지 1, 2, 4, 8주 후의 효과를 스코래드 SCORAD:SCORing Atopic Dermatitis) 측정법으로 평가하여 그 결과를 하기 표 8에 나타냈다.
1) 판정기준
① 정도 기준(Extent criteria) : 면적 = 피손부위/100
② 강도 기준(intensity criteria)
- 홍반 (1/2/3)
- 부종 (1/2/3)
- 삼출 (1/2/3)
- 피부 벗겨짐 (1/2/3)
- 태선화 정도 (1/2/3)
- 건조 정도 (1/2/3)
③ 주관적 기준
- 가려움 (1-10)
- 불면증 (1-10)
*스코래드 계산 = (정도기준/5) + (강도기준/7) + 주관적기준
분류 |
0주 |
1주 |
2주 |
4주 |
8주 |
실시예3 |
65.1 |
30.4 |
18.6 |
12.7 |
8.3 |
0.00% |
53.30% |
71.43% |
80.49% |
87.25% |
비교실시예1 |
62.5 |
45.2 |
36.9 |
24.5 |
17.1 |
0.00% |
27.68% |
40.96% |
60.80% |
72.64% |
비교실시예2 |
64.3 |
40.2 |
30.5 |
21.3 |
14.6 |
0% |
37.48% |
52.57% |
66.87% |
77.29% |
비교실시예3 |
66.7 |
41.2 |
32.7 |
22.9 |
13.5 |
0% |
38.23% |
50.97% |
65.67% |
79.76% |
비교실시예4 |
60.9 |
40.8 |
29.6 |
21.6 |
16.3 |
0% |
33.00% |
51.40% |
64.53% |
73.23% |
비교실시예5 |
62.3 |
39.5 |
28.3 |
20.4 |
14.3 |
0% |
36.60% |
54.57% |
67.26% |
77.05% |
표 8을 참조하면, 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물을 함유하는 실시예3의 화장료가 단순히 물을 함유한 비교실시예 1 및 단일 추출물을 함유하는 비교실시예 2, 3, 4, 5에 비해 아토피 피부 개선효과가 매우 우수하다는 것을 알 수 있다. 특히, 본발명의 조성물은 8주 후, 87% 정도의 우수한 개선 효과를 나타내고 있다. 또한, 아토피 피부의 개선율을 도식화하여 도6에 표시하였다.
또한 차가버섯, 말굽잔나비버섯, 신령버섯, 노루궁뎅이버섯 혼합 추출물을 함유하는 화장품의 사용 전후에 대한 임상적 결과 사진을 도7에 표시하였다.
한편, 보호자가 느끼는 아토피 피부염 완화 효과를 살펴보기 위하여, 실시예 3 및 비교실시예 1, 2, 3, 4, 5의 화장료를 1개월 동안 사용한 후, 사용자의 부모가 하기 기준에 따라 피부염의 가려움증, 홍반 변화, 피부 건조증에 대한 만족도와 함께 전반적인 피부염 개선 정도 및 시험시료에 의한 부작용 여부 등을 평가하도록 하여 하기 표 9에 나타냈다.
(판정기준)
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
효과없음 |
약간있음 |
보통 |
우수 |
매우우수 |
매우불만 |
불만 |
보통 |
만족 |
매우만족 |
분류 |
피부가려움증 |
홍반 변화 |
피부 건조증 |
전반적 개선효과 |
부작용 |
실시예 3 |
4.2 |
4.1 |
3.6 |
4.5 |
4.3 |
비교실시예1 |
2.3 |
3.1 |
2.9 |
3.3 |
4.0 |
비교실시예2 |
2.9 |
3.2 |
3.0 |
3.4 |
4.1 |
비교실시예3 |
2.4 |
3.6 |
3.1 |
3.5 |
4.0 |
비교실시예4 |
2.7 |
3.4 |
3.5 |
3.5 |
4.2 |
비교실시예5 |
3.0 |
3.9 |
3.4 |
3.7 |
4.3 |
상기 표 9에서와 같이, 본 발명에 따른 실시예 3의 화장료는 피시험자인 아토피성 피부를 갖는 소아에 대하여 전 평가항목에서 개선 효과가 있음을 확인할 수 있다.