KR101033921B1 - 피부 염증 및 자극 완화 효과를 갖는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부 염증 및 자극 완화 효과를 갖는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 죽백란, 젠티안, 당아욱, 오레가노 및 서양산사나무의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 염증 및 자극 완화 효과를 갖는 화장료 조성물 또는 피부외용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 화장품 원료에 의해 유발되는 피부 자극을 크게 개선할 뿐만 아니라, 염증 반응과 관련된 산화질소, 히스타민, 베타-헥소사미니다제의 분비를 억제하여 피부 염증을 완화할 수 있다.

피부, 자극, 염증, 죽백란, 젠티안, 당아욱, 오레가노, 서양산사나무

Description

피부 염증 및 자극 완화 효과를 갖는 조성물{Composition for reducing irritation and inflammation in skin}

본 발명은 피부 염증 및 자극 완화 효과를 갖는 조성물에 관한 것이다.

피부는 신체의 전 표면을 덮고 있는 기관으로서, 외부의 환경 및 자극으로부터 인체를 보호하고, 체내의 수분 증발을 억제하는 기능을 수행하고 있다. 따라서, 피부는 외부환경에 직접적으로 노출될 수 밖에 없다.

이러한 피부를 구성하는 세포의 활성과 외부 감염원에 대한 피부 방어능은 오존층 파괴에 따라 지표에 도달하는 자외선 증가, 스트레스에 의한 면역력 약화 및 유해 화학 물질 등의 오염원에 대한 노출이 증가되면서 감소하게 된다. 이에 따라, 피부는 외부 자극에 민감하게 반응하게 되고, 홍반, 부종, 가려움증 등의 피부 자극 및 염증 반응이 유발된다. 또한, 염증 반응 과정에서 생성되는 물질들이 부수적으로 피부의 색소 침착을 일으키고, 피부 탄력 섬유와 콜라겐 섬유의 붕괴를 촉진시켜 피부 주름의 증가에까지 영향을 미친다.

또한, 현대사회에서 남녀 노소를 불문하고 많은 사람들이 화장품을 사용하고 있는데, 화장품의 사용으로 인해 피부 자극, 염증, 가려움증 및 알러지 등이 유발 될 수 있다. 일반적으로 화장품 제조에 다양한 원료들이 사용되며, 통상적으로는 수십 종의 원료를 사용하게 된다. 특히, 레티노이드류나 과일산과 같은 기능성 원료, 제형화를 위해 첨가되는 계면활성제들이 피부에 자극을 일으키는 주된 물질이다. 이들이 갖는 부작용을 줄이기 위해 그 농도 제한하거나, NaOH나 KOH 등의 강알칼리를 첨가하여 산도를 중화시켜 자극을 완화하는 방법이 제안되었으나, 기능성 원료의 효능을 저하되는 문제점이 있다.

최근에는 피부 자극이 더 많이 유발될 수 있는 기능성 화장품 제조가 늘어나고 있어 화장품 제조업자들은 일반적으로 사용되는 자극 완화 물질을 제품에 적용시켜줌으로써 화장품 원료의 자극을 최소화시키기 위한 노력을 진행하고 있다. 따라서, 기능성 원료의 효과를 그대로 유지하면서 화장품에 의한 부작용을 줄이고 피부자극을 완화할 수 있는 물질의 선별이 필요하다.

화장품의 사용에 의해 일어날 수 있는 피부 자극에는 가려움(itching), 따끔거림(stinging) 및 화끈거림(burning) 등의 자극감과 홍반(erythema) 및 부종 (edema) 등의 염증성 자극이 있다. 이러한 피부 자극은 화장품이 피부에 침투되어, 표피 혹은 진피 세포와 상호 작용을 함으로써 면역체계가 활성화되어 자극 및 염증반응이 일어난다고 할 수 있다. 또한, 외부의 자극 물질에 의해 피부에서 나타나는 국소적 염증반응으로서 접촉성 피부염이 유발될 수 있고, 이러한 접촉성 피부염은 자극성 접촉 피부염, 알러지성 접촉 피부염, 감각성 자극 및 광독성 피부염 등이 있다.

이와 같은 염증은 외부 물질에 대한 생체조직의 방어 작용으로, 국소 혈관 또는 체액 내에 존재하는 염증 매개인자 및 면역세포의 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 면역세포 이동, 조직 파괴 등의 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등의 외적 증상을 나타낸다. 염증반응의 주요 원인으로는 미생물 감염, 과민반응, 물리적 요인, 화학적 요인 및 조직의 괴사 등이 있다. 특히, 산화질소합성효소(nitric oxide synthase; NOS)에 의해 생성되는 산화질소(nitric oxide;NO)와 비만세포에서 분비되는 히스타민(histamine) 및 베타-헥소사미니다제(β-hexosaminidase)는 염증반응을 유발시키는 주요 전달물질이다. 따라서, 비만세포에서 분비되는 히스타민, 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase)의 분비를 억제하거나 산화질소의 생성을 감소시킬 수 있는 물질은 일반적인 염증 반응은 물론 아토피성 피부염 등과 같은 피부염 완화에 적합한 효능을 제공할 수 있다.

본 발명자들은 젠티안, 당아욱, 오레가노 및 서양산사나무의 추출물이 소디움 라우릴설페이트에 의한 피부자극을 완화하는 것을 확인하고, 이들 추출물을 포함하는 피부자극 완화용 화장료 조성물을 대한민국 특허등록 제10-0782517호로 등록받은 바 있다.

또한, 본 발명자들은 상기 추출물을 기초로 하여 피부 염증을 개선할 수 있는 조성물에 대하여 다각적인 연구를 수행한 결과, 상기 추출물과 함께 죽백란 추출물을 사용하는 경우, 피부 자극을 완화할 뿐만 아니라 산화질소, 히스타민, 베타-헥소사미니다제의 분비를 억제하여 피부 염증을 개선할 수 있음을 발견하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 피부 자극을 개선하고, 염증 반응과 관련된 산화질소, 히스타민, 베타-헥소사미니다제의 분비를 억제하여 피부 염증을 완화할 수 있는 피부 염증 및 자극 완화 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 염증 유발 물질의 분비 억제 효과를 갖는 피부 염증 및 알러지의 예방 및 치료용 피부외용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 죽백란, 젠티안, 당아욱, 오레가노 및 서양산사나무의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 염증 및 자극 완화 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 죽백란, 젠티안, 당아욱, 오레가노 및 서양산사나무의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 염증 및 알러지의 예방 및 치료용 피부외용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 염증, 알러지, 부종, 홍반과 같은 피부 자극을 완화하고, 염증 유발 물질인 산화질소, 히스타민, 베타-헥소사미니다제의 분비를 억제하여 항염증 활성을 나타내므로, 피부 자극 및 염증 완화를 위한 화장료 조성물 또는 피부 염증 및 알러지 치료 및 예방을 위한 피부외용 약학 조성물로 사용될 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 언급되는 '피부 염증'은 일반적인 각종 피부염을 의미하는 것으로, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염을 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 죽백란(Cymbidium lancifolium), 젠티안(Gentiana lutea), 당아욱(Malva sylvestris), 오레가노(Origanum vulgare) 및 서양산사나무(Crataegus oxyacantha)의 추출물을 유효성분으로 포함한다. 이때, '추출물'은 각 식물의 다양한 기관 또는 부분으로부터 추출하여 얻은 것으로, 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 껍질 및 종자 등의 추출물이 모두 가능하다.

죽백란(Cymbidium lancifolium)은 잎이 긴 타원 모양이고, 진한 녹색이며 길이 20∼30cm, 나비 2∼3cm이고 끝 가장자리에 톱니가 있다. 끝은 뾰족하고 잎자루가 길다. 마디 부분과 잎이 대나무와 비슷하여 죽백이라는 불리며, 제주도 한라산 에 분포한다. 죽백란의 모든 부분을 사용할 수 있으며, 잎을 사용하는 것이 바람직하다.

젠티안(Gentiana lutea)은 줄기와 타원형의 잎을 가진 다년생 식물로써 크기는 대략 1.8m 정도이며, 부분적으로 건조된 근경 또는 뿌리가 이용되는 것이 바람직하다. 주요 성분은 폴리페놀, 폴리사카라이드, 겐티오피크로사이드, 아마로겐틴, 산톤(xanthone) 등이 알려져 있다.

당아욱(Malva sylvestris)은 아시아가 원산지로 높이가 60∼90cm이다. 잎은 어긋나고 둥근 모양이지만 5∼9개로 갈라지며 가장자리에 작은 톱니가 있다. 잎, 뿌리, 꽃 부분이 이용될 수 있으며, 그 중에서 꽃 부분을 사용하는 것이 바람직하다. 주요성분으로는 안토시아닌(말빈, 말비딘), 플라보노이드, 탄닌, 비타민 A, B1, B2, C, E 등이 알려져 있다.

오레가노(Origanum vulgare)는 다년생 식물로 가지가 있으며 크기는 0.9m 정도이고, 건조된 식물과 잎이 이용될 수 있으며, 이 중에서 잎이 사용되는 것이 바람직하다. 오레가노 추출물은 빵 제조시 향을 좋게 하고 박테리아의 활성억제효과로 인해 빵 제조 등에 있어서 식품 첨가물로서 많이 사용되고 있다. 주요성분은 플라보노이드, 카페인산 유도체, 탄닌 성분 등이 알려져 있다.

서양산사나무(Crataegus oxyacantha)는 혈관확장 작용, 강압작용, 강심작용이나 소화촉진작용, 건위 작용, 지사 작용, 진통진정 작용 등이 알려져 있다. 부분적으로 건조된 열매가 이용되는 것이 바람직하며, 열매에는 우르솔산, 올레아놀릭산, 루틴, 등이 함유되어 있고, 종자에는 아미그달린, 하이페린, 지방유가 함유 되어 있고, 수피에는 애스쿨린이 함유되어 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 유효성분인 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 용매를 사용하여, 통상적으로 이용되는 열수추출, 실온추출, 가온추출, 초음파추출, 초임계추출 등의 방법으로 제조될 수 있다.

바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 6의 저급글리콜, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출한다. 가장 바람직하게는 1,3-부틸렌글리콜을 추출용매로 하여, 실온에서 초음파추출기로 1 내지 12 시간 동안 추출한다. 상기 초음파추출의 시간은 추출하고자 하는 시료의 양에 따라 달라질 수 있으며, 추출결과물을 여과 또는 정제하는 과정을 거칠 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 추출물의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 30.0 중량%이며, 바람직하게는 0.1 내지 5.0 중량%이다. 상기 추출물의 함량이 상기 범위 미만인 경우에는 효과를 나타내는데 문제점이 있고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않고, 제형의 안정성이 저하되는 문제점이 있다.

바람직하게, 본 발명은 죽백란 30 내지 70 중량부, 젠티안 5 내지 15 중량부, 당아욱 5 내지 10 중량부, 오레가노 1 내지 10 중량부 및 서양산사나무 20 내지 40 중량부로 이루어진 혼합원료로부터 추출된 추출물을 포함한다. 또한, 바람직하게 본 발명의 화장료 조성물은 죽백란 추출물 30 내지 70 중량부, 젠티안 추 출물 5 내지 15 중량부, 당아욱 추출물 5 내지 10 중량부, 오레가노 추출물 1 내지 10 중량부 및 서양산사나무 추출물 20 내지 40 중량부를 포함한다. 이와 같은 혼합비는 본 발명 화장료 조성물의 피부 자극 및 염증 완화를 극대화할 수 있는 범위이다.

본 발명의 화장료 조성물은 공지된 바의 어떠한 제형으로 제조될 수 있으며, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다.

또한 각 제형의 조성들은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 포함하여 제조된다.

본 발명의 식물 혼합 추출물은 통상적으로 사용되는 자극원인 젖산에 의한 세포 독성의 완화능과(실험예 1 참조), 염증 유발 물질의 분비 억제 효과를 나타냈다(실험예 2 내지 4 참조). 또한, 인체 첩포시험결과 피부자극 완화 효과가 뛰어 났다(실험예 6 참조).

본 발명의 죽백란, 젠티안, 당아욱, 오레가노 및 서양산사나무의 추출물은 염증 유발 물질의 분비를 억제하므로 피부 염증 및 알러지의 예방 및 치료용 피부외용 약학 조성물로 적용이 가능하다.

상기 추출물의 함량은 피부외용 약학조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 30 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 5.0 중량%이다. 상기 추출물의 함량이 상기 범위 미만인 경우에는 효과를 나타내는데 문제점이 있고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않고, 제형의 안정성이 저하되는 문제점이 있다.

본 발명의 피부외용 약학조성물은 피부의 염증 및 알러지를 완화시키는 피부외용제로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명 약학 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 성인의 경우 추출물을 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏의 용량으로 투여할 수 있 다. 이때, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회에 나누어 투여할 수 도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 단독으로, 또는 외과적 수술요법 등의 방법들과 병행하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 죽백란, 젠티안, 당아욱, 오레가노 및 서양산사나무 혼합 추출물의 제조

죽백란 50g, 젠티안 10g, 당아욱 7.5g, 오레가노 2.5g 및 서양산사나무 30g를 혼합하고 믹서를 이용하여 분쇄한 후, 40% 1,3-부틸렌글라이콜 수용액 1,000 ml을 첨가하고, 실온에서 초음파추출기로 4시간 동안 추출하였다. 여과지(Whatman Paper Filter No.3)를 이용하여 1차 감압여과하고 2일 동안 냉장보관하고 침전물이 생성되면 2차 감압여과를 통하여 혼합 추출물을 얻었다.

실시예 1 내지 3 및 비교예 1

상기 표 1의 조성으로 통상의 방법에 따라 실시예 1 내지 3 및 비교예 1의 에멀전 화장료 조성물을 제조하였다.

성분 함량(중량%)	실시예 1	실시예 2	실시예 3	비교예 1
혼합 추출물	2.0	5.0	10.0	-
글리세린	5.0	5.0	5.0	5.0
프로필렌글리콜	4.0	4.0	4.0	4.0
토코페릴아세테이트	3.0	3.0	3.0	3.0
유동파라핀	5	5	5	5
트리에탄올아민	1.0	1.0	1.0	1.0
스쿠알란	3.0	3.0	3.0	3.0
마카다미아너트오일	2.5	2.5	2.5	2.5
폴리솔베이트60	1.6	1.6	1.6	1.6
솔비탄세스퀴롤레이트	1.6	1.6	1.6	1.6
프로필파라벤	0.2	0.2	0.2	0.2
카르복실비닐폴리머	1.5	1.5	1.5	1.5
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량
계	100	100	100	100

실험예 1: 세포독성 완화 효과 시험

본 발명에 따른 추출물의 세포 독성 완화 효과를 확인하기 위해, 피부자극제인 젖산(lactic acid)으로 세포 사멸을 유도한 뒤 추출물 첨가에 따른 세포의 생존율을 측정하였다.

섬유아세포(Cascade, 영국)를 T-75 플라스크 (Nunc, 미합중국)에 80% 정도 증식할 때까지 배양하였다. 배양된 세포를 다시 24-웰 플레이트 (Nunc, 미합중국)의 각 웰에 세포 2×10⁵ 개를 옮겨 24시간 동안 배양하였다.

배양 후 현미경을 통해 세포가 완전히 부착되어 잘 자라는지 여부를 확인한 뒤 피부 세포 자극제인 젖산을 이용하여 실험을 진행하였다. 이때 젖산은 피부 세포를 모두 사멸시키는 농도인 0.2%(w/v)로 사용하였다. 즉, 24-웰 플레이트의 각 웰에 0.2% 젖산이 함유된 DMEM (시그마, 미합중국) 배지를 1 ㎖씩 첨가하고, 상기 제조예 1에서 수득한 추출물을 0, 10, 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 농도로 조절하여 첨가하였다. 이때, 젖산과 추출물을 모두 첨가하지 않은 것을 대조군으로 사용하였다.

시험 물질을 첨가하고 12 시간 경과 후 세포의 생존율을 비교하기 위하여 MTT([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 시약을 각 웰에 200 ㎕씩 첨가하였다. MTT 시약을 첨가하여 4 시간이 경과된 후에 엘라이저 리더 (ELISA Reader)를 이용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 이용해 하기 수학식 1에 따라 세포 생존율을 계산하고, 그 결과를 아래 표 2에 나타내었다.

세포 생존율(%) = [시험 물질 흡광도/대조군 흡광도]×100

혼합 추출물 농도 (ug/ml)	대조군	0	10	50	100	200
세포 생존률(%)	100	0	44	58	78	91

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 추출물의 농도가 증가할 수록 세포 생존율이 증가하였으며, 본 발명의 추출물은 젖산에 의한 세포의 사멸을 억제함을 하여 세포 독성 완화 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 2: NO 분비량 억제 효과 확인

본 발명에 따른 추출물의 피부염증 완화 효과를 평가하기 위해, 산화질소(nitric oxide;NO)의 분비량 변화를 측정하였다.

생쥐의 대식세포인 Raw 264.7 세포를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에 10% FBS(fetal bovine serum), 100 units/mL 페니실린(penicillin)과 100 ㎍/mL 스트렙토마이신(streptomycine)을 첨가하여 배양기(37 ℃, 5% CO₂)에서 배양하였다.

세포가 100 mm 디쉬(dish) 바닥의 80% 정도까지 자랐을 때 세포의 염증 반응을 유도하기 위하여 1% FBS가 함유된 DMEM 배양액에 지질다당류(lipopolysaccharide)를 100 ng/mL의 농도로 첨가하였다.

Raw 264.7 세포에 상기 제조예 1에서 얻은 추출물 또는 지질다당류를 첨가하여 24시간 배양한 후, 그 배양액을 수집하여 NO 분비량을 그리스 시약(Griess reagent) 시스템으로 측정하고(Kim JK et al., Biochem Biophys Res Commun., 345 , pp1215-1223, 2006), 얻어진 결과를 아래 표 3에 나타내었다.

혼합 추출물 농도 (ug/ml)	대조군	10	50	100	200
NO 분비량 (대조군의 분비량에 대한 %)	100	71	57	31	10

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 추출물을 처리한 경우 지질다당류에 의해 유도된 NO 생성을 농도 의존적으로 감소시켰다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 추출물을 사용하는 경우 피부 염증을 효과적으로 완화할 수 있을 것으로 기대된다.

실험예 3: 히스타민(histamine) 분비량 억제 효과 확인

본 발명에 따른 추출물의 피부염증 완화 효과를 평가하기 위해, 히스타민의 분비량 변화를 측정하였다.

히스타민은 인터류킨-2 (interleukin-2), P 물질 (substance P), 오피오이드 펩타이드 (opoid peptide), 프로스타글란딘 E (prostagladin E)와 같이 염증 반응을 매개하는 매개체(mediator)로 널리 알려져 있으며, 주로 비만 세포 (mast cell)에서 유리되며 가려움과 통증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 히스타민의 분비 억제 능력은 염증 반응과 가려움, 통증 등 일련의 염증 유발 반응을 억제하는 데 이용될 수 있다.

쥐의 호염기성 백혈구인 RBL-2H3 세포를 EMEM(Eagles Minimum Essential Medium) 배지에 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 글루타민, 100 units/mL 페니실린(penicillin)과 100 ㎍/mL 스트렙토마이신(streptomycine)을 첨가하여 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다.

100 mm 디쉬(dish) 바닥의 80% 정도까지 자랐을 때 트립신/versene을 처리하여 세포를 취하고 세포 2 X 10⁶ 개를 24 웰 플레이트에 접종하여 18시간 배양하였다. 배지를 제거하고 IgE(0.2 ug/ml)가 포함된 EMEM 배지를 넣어 1시간 배양하고 Anti-IgE가 함유된 release buffer 0.2ml을 첨가하여 10분 반응시켰다. 방출된 히스타민은 방사선 면역 분석 키트(radioimmunoassay kit, Immunotech, Marseille, France)로 정량하고, 얻어진 결과를 아래 표 4에 나타내었다.

혼합 추출물 농도 (ug/ml)	대조군	1	5	10	20
히스타민 분비량 (대조군의 분비량에 대한 %)	100	88	61	47	37

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 추출물 처리군은 쥐의 호염기성 백혈구의 히스타민 분비량을 농도 의존적으로 억제하였다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 추출물을 사용하는 경우 피부 염증을 효과적으로 완화할 수 있을 것으로 기대된다.

실험예 4: 베타-헥소사미니다제 분비 억제효과 확인

본 발명에 따른 혼합 추출물의 피부염증 완화 효과를 평가하기 위해, 베타-헥소사미니다제의 분비량 변화를 측정하였다.

베타-헥소사미니다제(β-hexosaminidase)는 비만세포(mast cell)에 함유되어 있는 효소로, 비만세포가 면역반응에 의해 활성화되면 히스타민과 함께 방출된다. 따라서, 베타-헥소사미니다제는 비만세포의 탈과립 지표로 사용될 수 있다.

쥐의 호염기성 백혈구인 RBL-2H3 세포를 EMEM(Eagles Minimum Essential Medium) 배지에 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 글루타민, 100 units/mL 페니실린(penicillin)과 100 ㎍/mL 스트렙토마이신(streptomycine)을 첨가하여 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다.

100 mm 디쉬(dish) 바닥의 80% 정도까지 자랐을 때 트립신/versene을 처리하여 세포를 취하고, 24 웰 플레이트에 세포를 웰당 2 X 10⁶ 개 접종하여 18 시간 배양하였다. 배지를 제거하고 1 μg/ml의 항-DNP-IgE로 세포를 18시간 반응시켜 감작시킨 뒤 시료를 1 시간 전처리하였고, 10 μg/ml의 DNP-BSA를 처리한 10분 뒤 상층을 얻었다.

얻은 상층액 50 μl와 0.2 M 구연산염 버퍼(citrate buffer, pH 4.5)에 녹인 5 mM p-nitrophenyl-N-acetyl-β-glucosamide 50μl를 30분 동안 인큐베이터에서 반응시켰다. 반응을 정지시키기 위해 1N HCl을 넣은 후 405 nm에서 베타-헥소사미니다제의 방출량을 측정하였다. 총 베타-헥소사미니다제의 방출량을 측정하기 위해 0.1% Triton X-100으로 세포를 용혈시켜 얻은 상층액으로 동일하게 실험하였다.

혼합 추출물 농도 (ug/ml)	대조군	10	20	50	100
베타-헥소사미니다제 분비량 (대조군의 분비량에 대한 %)	100	98	95	89	85

상기 표 5를 참조하면, 본 발명에 따른 추출물 처리군은 RBL-2H3 세포의 베타-헥소사미니다제 분비량을 농도 의존적으로 억제하여 항알러지 효과가 있는 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 추출물을 사용하는 경우 피부 염증 및 알러지를 효과적으로 완화할 수 있을 것으로 기대된다.

실험예 5: 혼합 추출물을 함유하는 에멀전 제형의 안정성 시험

본 발명의 화장료 제형의 보관 온도에 따른 안정성을 시험하였다. 혼합 추출물을 함유한 상기 실시예 1 내지 3과 비교예 1를 불투명 초자 용기에 담아 45 ℃로 일정하게 유지되는 항온조에서 16주 동안 보관하고, 또한 4 ℃로 일정하게 유지되고 완전히 차광된 냉장고 내에서 16주 동안 보관한 후 변색 정도를 비교 측정하였다. 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다. 이때 제품의 변색정도는 다음 표 6의 6등급으로 분류하여 평가하였다.

제품 변색 평가 기준

점수	평가기준
0	변화 없음
1	극히 조금 변함
2	조금 변함
3	조금 심하게 변함
4	심하게 변함
5	극히 심하게 변함

보관기간	시험물질의 변색정도
	4 ℃				45 ℃
	실시예1	실시예2	실시예3	비교예1	실시예1	실시예2	실시예3	비교예1
0주	0	0	0	0	0	0	0	0
1주	0	0	0	0	0	0	0	0
2주	0	0	0	0	0	0	0	0
4주	0	0	0	0	0	0	0	0
8주	0	0	0	0	0	0	0	0
12주	0	0	0	0	0	0	0	0
16주	0	0	0	0	0	0	1	0

상기 표 7의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 혼합 추출물을 포함하지 않는 비교예 1에서는 변색이 일어나지 않는 것으로 보아 에멀전의 기타 함유 성분에 의해서는 변색이 일어나지 않는 것을 알 수 있었고, 혼합 추출물을 10% 함유하는 실시예 3의 제형에서 16 주간 보관하였을 때 변색이 조금 일어난 반면 혼합추출물을 5% 이하로 함유하는 에멀전을 45에서 16주 동안 보관하였을 때 변색이 일어나지 않았다. 혼합 추출물을 5% 이하로 함유하는 실시예 1, 2 의 제형은 추출물을 함유하지 않은 비교예 1과 같이 제형의 안정성이 우수한 것을 알 수 있었다.

실험예 6: 피부자극 완화 효과 확인

본 발명에 따른 혼합 추출물의 피부자극 완효 효과를 평가하기 위해, 피부첩포 실험을 통해 소듐 도데실 설페이트(Sodium Dodecyl Sultafe, SDS)에 의한 자극 유발과 이에 대한 피부 반응도를 측정하였다.

우선, 하기 표 8의 조성으로 에멀전 화장품을 제조하였다.

성분 함량(중량%)	실시예 4	비교예 2	대조예
혼합 추출물	2.0	-	-
소듐 도데실 설페이트	1.0	1.0	-
글리세린	5.0	5.0	5.0
프로필렌글리콜	4.0	4.0	4.0
토코페릴아세테이트	3.0	3.0	3.0
유동파라핀	5	5	5
트리에탄올아민	1.0	1.0	1.0
스쿠알란	3.0	3.0	3.0
마카다미아너트오일	2.5	2.5	2.5
폴리솔베이트60	1.6	1.6	1.6
솔비탄세스퀴롤레이트	1.6	1.6	1.6
프로필파라벤	0.2	0.2	0.2
카르복실비닐폴리머	1.5	1.5	1.5
정제수	잔량	잔량	잔량
계	100	100	100

상기와 같이 제조된 실시예 4 및 비교예 2의 에멀전 제형으로 계면활성제에 의한 피부 자극 완화 효과를 비교 측정하였다.

과거력상 피부자극에 과민반응을 보인 적이 없으며, 현재 피부병 내지 피부 알러지 증상이 없는 20 내지 30대 여성 20명을 대상으로 하였다. 우선 시험 부위를 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시켰다. 준비된 시험물질을 15 ㎍씩 핀 챔버(Finn chamber, 100×10, EPITEST, 핀란드) 내에 적하시킨 후 시험 대상자의 전박(forearm) 안쪽 부위에 밀폐 첩포하였다. 24 시간 동안 첩포하고, 첩포를 제거한 후 표시펜으로 시험부위를 표시하였다. 각각 1 시간 및 24 시간 후(첩포 제거 후 1 시간, 24 시간 후 = 첩포 부착 포함 24시간, 48시간), 확대경 (8MC-150, DAZOR, 미합중국)을 이용하여 시험 부위의 홍반 및 부종 유무를 관찰하였다.

피부반응은 국제접촉피부염연구회(ICDRG: International Contact Dermatitis Research Group)의 규정(하기 표 8)에 따라 판정하였으며, 하기 수학식 2에 의하여 평균 피부 반응도를 계산하고, 그 결과를 표 9에 나타내었다

기 호	점 수	평 가 기 준
-	0.0	무반응
±	0.5	희미한 또는 가벼운 홍
+	1.0	경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진
++	2.0	뚜렷한 홍반, 구진 및 소수포
+++	3.0	심한 홍반, 대수포, 가피형성

평균 피부 반응도 (mean score) = {(점수 × 반응 피검자수) / (최대 점수 × 총피검자수)} ×100

구분	24시간				48 시간				평균 피부반응도 (n=20)
	±	+	++	+++	±	+	++	+++
대조예	-	-	-	-	-	-	-	-	0.00
실시예 4	2	-	-	-	-	-	-	-	0.83
비교예 2	4	1	-	-	2	-	-	-	3.33

상기 표 10에서 알 수 있듯이, 피부 첩포실험에서 소듐 도데실 설페이트를 함유한 비교예 2에 대한 강한 피부자극이 보였고, 본 발명의 추출물을 함유한 실시예 4는 자극완화 효과를 나타내었다.

이하, 본 발명의 처방예로서 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스 및 팩을 예시하고 있으나, 본 발명의 화장료 조성물의 제형은 이에 제한되는 것은 아니다.

제형예 1: 유연화장수 (스킨로션)

하기 표 11에 나타난 바와 같이 유연화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
혼합 추출물	0.3
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
PEG 1500	1.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
벤조페논-9	0.04
소듐 히아루로네이트	5.0
에탄올	10.0
옥틸도데세스-16	0.2
폴리솔베이트 20	0.2
유니사이드-유 13	0.01
증류수	잔량
합계	100

제형예 2: 수렴화장수

하기 표 12에 나타난 바와 같이 수렴화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
혼합 추출물	0.3
글리세린	2.0
1,3-부틸렌글리콜	2.0
알란토인	0.2
DL-판테놀	0.2
EDTA-2Na	0.02
벤조페논-9	0.04
소듐 히아루로네이트	3.0
에탄올	15.0
폴리솔베이트 20	0.3
위치하겔 추출물	2.0
구연산	미량
유니사이드-유 13	0.01
증류수	잔량
합계	100

제형예 3: 영양화장수

하기 표 13에 나타난 바와 같이 영양화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
혼합 추출물	0.3
글리세릴 스테아레이트 SE	1.5
세테아릴알콜	1.5
라놀린	1.5
폴리솔베이트 60	1.3
솔비탄스테아레이트	0.5
경화식물유	1.0
광물유	5.0
스쿠알란	3.0
트리옥타노인	2.0
디메치콘	0.8
초산 토코페롤	0.5
카르복시비닐 폴리머	0.12
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
소듐히아루로네이트	5.0
트리에탄올아민	0.12
유니사이드-유 13	0.02
증류수	잔량
합계	100

제형예 4: 영양크림

하기 표 14에 나타난 바와 같이 영양크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
혼합 추출물	0.3
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0
세테아릴알콜	2.2
스테아린산	1.5
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6
경화식물유	1.0
스쿠알란	3.0
광물유	5.0
트리옥타노인	5.0
디메치콘	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1
글리세린	5.0
베타인	3.0
트리에탄올아민	1.0
소듐히아루로네이트	4.0
유니사이드-유13	0.02
증류수	잔량
합계	100

제형예 5: 맛사지 크림

하기 표 15에 나타난 바와 같이 맛사지 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
혼합 추출물	0.3
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.5
세테아릴알콜	1.5
스테아린산	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6
이소스테아릴 이소스테레이트	5.0
스쿠알란	5.0
광물유	35.0
디메치콘	0.5
히드록시에틸셀룰로오스	0.12
글리세린	6.0
트리에탄올아민	0.7
유니사이드-유13	0.02
증류수	잔량
합계	100

제형예 6: 에센스

하기 표 16에 나타난 바와 같이 에센스를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
혼합 추출물	0.3
글리세린	10.0
베타인	5.0
PEG 1500	2.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
벤조페논-9	0.04
히드록시에틸 셀룰로오스	0.1
소듐 히아루로네이트	8.0
카르복시비닐폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.18
옥틸도데칸올	0.3
옥틸도데세스-16	0.4
에탄올	6.0
유니사이드-유 13	0.01
증류수	잔량
합계	100

제형예 7: 팩

하기 표 17에 나타난 바와 같이 팩을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
혼합 추출물	0.3
폴리비닐알콜	15.0
셀룰로오스 검	0.15
글리세린	3.0
PEG 1500	2.0
시이크데스트린	0.15
DL-판테놀	0.4
알란토인	0.1
글리시리진산 모노암모늄	0.3
니코틴아미드	0.5
에탄올	6.0
PEG 40 경화피마자유	0.3
유니사이드-유13	0.02
증류수	잔량
합계	100

Claims (8)

1. 죽백란(Cymbidium lancifolium), 젠티안(Gentiana lutea), 당아욱(Malva sylvestris), 오레가노(Origanum vulgare) 및 서양산사나무(Crataegus oxyacantha)의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 염증 및 자극 완화 효과를 갖는 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 추출물은 죽백란 30 내지 70 중량부, 젠티안 5 내지 15 중량부, 당아욱 5 내지 10 중량부, 오레가노 1 내지 10 중량부 및 서양산사나무 20 내지 40 중량부로 이루어진 혼합원료로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서,

   상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 저급글리콜, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종의 추출용매로 추출된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서,

   상기 추출물의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 30 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서,

   상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 죽백란(Cymbidium lancifolium), 젠티안(Gentiana lutea), 당아욱(Malva sylvestris), 오레가노(Origanum vulgare) 및 서양산사나무(Crataegus oxyacantha)의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 염증 및 알러지의 예방 및 치료용 피부외용 약학 조성물.
7. 제6항에 있어서,

   상기 추출물의 함량은 약학 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 30 중량%인 것을 특징으로 하는 피부외용 약학 조성물.
8. 제6항에 있어서,

   상기 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부외용 약학 조성물.