CN103257237B - 一种食品中过敏原的体外检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种食品中过敏原的体外检测方法，包括以下步骤：1）以过敏原免疫小鼠，建立IgE高反应性食品过敏动物模型；2）致敏RBL-2H3细胞，过敏原或大鼠抗小鼠IgE抗体激发，检测β-氨基己糖苷酶的释放率。本发明方法检测成本低，检测灵敏度高、特异性高，能够准确地反映过敏原诱发IgE介导的过敏反应的能力，可用于评价食品原料及各种加工食品的致敏性，从根本上降低了食品过敏的风险。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，具体地说，涉及一种食品中过敏原的体外检测方法。
背景技术
食品过敏是过敏性疾病的一种，可能成为某些严重过敏性疾病并发症的诱因。据流行病学调查，近年来过敏症发病率呈逐年上升的趋势，发达国家每年有3%～4%的成年人发生食品过敏，儿童及婴幼儿的发病率为5%。我国过敏性疾病发病率同样呈快速增长的趋势，已受到卫生部门的高度重视。食物过敏在相当程度上侵扰着过敏人群健康，保护消费者食用安全已成为食品安全管理部门和食品生产商面临严峻的问题。因此，食物过敏已被视为一个严重的公共营养卫生问题，并引起了全球广泛的关注。
食品过敏是免疫球蛋白E（IgE）介导的速发型过敏反应，临床表现为恶心、呕吐、哮喘、腹泻、消化性溃疡、荨麻疹、过敏性皮炎等不同形式的症状，严重时可导致过敏性休克，甚至危及生命。迄今为止，食品过敏尚无特效治疗方法，严格避免食用任何可能含有过敏原的食品是避免过敏发作的唯一方法。但由于食品配料的多样化，使食品的组成变得十分复杂，食品过敏患者必须倍加小心，才能免受其害。因此建立精确、定量的过敏原检测方法对于保护消费者的安全十分必要。
一般地，食品过敏原的检测分为在体检测、动物实验和体外检测。在体检测方法主要是皮肤试验，往往需皮内同时注射30～50种抗原，根据皮试的风团和红斑反应推测肥大细胞释放组胺的量，进而推测患者是否对某过敏原过敏，这种方法虽简便、易操作、成本低，但存在特异性不高，局部痛感、潜在危险较大等缺点，皮肤试验可能引起严重不良反应而给患者带来额外的痛苦，而且这种方法的诊断结果有时与免疫化学分析方法不一致，常会出现假阳性或假阴性。
动物模型是近年来出现的评价食品潜在过敏性的方法，大鼠、小鼠、豚鼠、猪、狗等动物模型均被用于各种食品过敏研究。它虽可模拟过敏原在人体内产生的过敏反应，却不能反映人体经膳食暴露后发生的免疫反应，且不同的致敏途径产生的免疫反应也不同。
食品过敏原的体外检测方法主要有免疫化学试验（如IgE抑制试验、免疫印迹试验）、介质释放试验（组胺释放率检测、β-氨基己糖苷酶释放率检测等）。免疫化学试验是目前体外检测过敏原的重要手段，通过检测过敏患者血清中特异性IgE含量来进行过敏诊断。该方法只需过敏患者少许血清即可同时检测多种过敏原，不受药物影响、对被检测者无危险，但基于人体特异性IgE的免疫试验的结果易受相同特异性IgG的影响，而且常与皮肤试验获得的数据不一致。利用免疫化学手段研究显示，过敏患者血清中IgE水平与临床症状并无直接的关系，因此特异性IgE测定不能用作分析食品过敏原的直接指标。
食品导致的过敏及其严重程度取决于嗜碱性粒细胞、肥大细胞表面结合的IgE与相应变应原相互作用后导致介质释放的程度和靶器官对这些介质的反应，如血清中的组胺和β-氨基己糖苷酶水平都与过敏反应严重程度直接相关。因此体外介质释放试验比单纯测定血清中的IgE水平能更全面地反应机体的过敏状态。
无论是嗜碱性粒细胞组胺释放试验还是嗜碱性粒细胞体外激活试验，其灵敏性和特异性都较高，但嗜碱性粒细胞不能在体外稳定传代培养，都需要大量的人体血清，且获取血清样本后要立即进行试验，而且这种细胞不易获得，这些都限制了人类嗜碱性粒细胞体外介质释放这一方法的广泛应用。
同嗜碱性粒细胞一样，肥大细胞也是机体参与过敏反应的主要效应细胞，但目前尚未获得大量特性均一能用于体外研究的人肥大细胞株。来自Wistar大鼠的RBL-2H3细胞系具有与人的肥大细胞相似的细胞结构和脱颗粒反应，可在体外稳定传代培养，可作为人肥大细胞的替代方法来研究人体肥大细胞在过敏反应发生时的反应。另外，由于鼠源和人源肥大细胞膜上与IgE结合的FcεRI受体不同，RBL-2H3细胞需采用鼠血清致敏，因此在进行细胞试验之前通过动物实验获取致敏血清，由RBL-2H3细胞结合鼠的血清池建立一种体外细胞模型评价方法。
但目前尚缺乏一种普遍适用的标准的体外检测食品中过敏原的方法，目前的检测食品过敏原致敏性的RBL-2H3细胞评价方法没有普遍意义，不适用所有食品过敏原，不能准确反映过敏原诱发IgE介导的过敏反应。
发明内容
本发明目的是提供一种食品中过敏原的体外检测方法，以解决现有评价方法不能准确反映过敏原诱发IgE介导的过敏反应的问题。
为建立一种用于食品中过敏原检测的方法，本发明选用3种有代表性、致敏性不同的蛋白，分别为大豆球蛋白（Glycinin,Gly）、卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）、马铃薯酸性磷酸酶（potato acidphosphatase,PAP）。大豆球蛋白是11S球蛋白主要成分，由6个亚基相互作用构成的六聚体蛋白，分子质量大约为350kDa，其过敏原学名是Gly m6，是一种较强的致敏原；卵清白蛋白是鸡蛋的主要过敏原，约占蛋清蛋白的54%，是一种由385个氨基酸组成的糖蛋白，分子量为44.5kDa，其过敏原学名是Gal d2，是一种中度的致敏原，在动物评价方法中常作为阳性过敏原；马铃薯酸性磷酸酶是一种由448个氨基酸组成的蛋白，无致敏活性，在动物评价方法中常作为阴性过敏原。本发明并不限于此3种蛋白，还包括所有具有潜在致敏性的蛋白。
本发明采用3种具有不同潜在致敏性的蛋白（Gly,OVA,PAP）对Balb/c小鼠进行经口灌胃致敏，通过检测血清中免疫球蛋白水平（特异性IgE和特异性IgG1）、血浆中组胺水平以及血管渗透性等与机体过敏关系密切的指标来验证3种蛋白的致敏性，并获取用于建立细胞检测方法的致敏血清进行RBL-2H3细胞介质释放试验（β-氨基己糖苷酶释放率），由此建立一种用于评价食品过敏原的体外检测方法。
本发明检测食品中过敏原的方法，包括以下步骤：
1）以过敏原免疫小鼠，建立IgE高反应性食品过敏动物模型；
2）致敏RBL-2H3细胞，过敏原或大鼠抗小鼠IgE抗体激发，检测β-氨基己糖苷酶的释放率。
动物实验包括下述步骤：
1）实验动物进行适应性喂养后开始实验，动物按体重随机分为若干组，自由饮水和进食，每周进行称重；
2）在第0、7、14、21、28天，对每一组实验动物分别使用不同受试物进行实验，其中一组实验动物接受佐剂对照，一组实验动物接受阴性对照；
3）在致敏前一天和第35天，对动物进行眼部内眦静脉采血；
4）在第42天进行大剂量刺激，20min后采血，之后进行过敏症状测定。
其中，实验动物优选为，SPF级的3～4周龄雌性BALB/c小鼠。
具体地，将动物按体重随机分为5组，所使用的受试蛋白为大豆球蛋白（Glycinin,Gly）、卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）、马铃薯酸性磷酸酶（potato acid phosphatase,PAP），剂量为1mg，均吸附于10μg霍乱毒素佐剂（100μl生理盐水稀释），佐剂对照组仅接受10μg霍乱毒素佐剂，阴性对照组接受相同体积的生理盐水。
其中，步骤3）的采血检测步骤为：对动物进行眼部内眦静脉采血，5000r/min、4℃下离心10min，取血清，分装50μl冻存于-20℃，用于特异性抗体（特异性IgE和特异性IgG1）水平的检测以及RBL-2H3细胞试验。其中，RBL-2H3细胞检测方法的建立如下详细描述。
具体地，特异性抗体的检测步骤如下：
1）包被
将受试蛋白分别用包被缓冲液稀释至10mg/L，在96孔板上选择需要包被的孔，每孔加入包被液100μl，4℃过夜；
2）洗涤
倒掉孔内液体，每孔加入250μl PBS/0.1%BSA-Tween20洗涤液，室温放置5min，甩净洗涤液，在吸水纸上拍打数次，至孔内无明显液滴，重复两次；
3）封闭
每孔加入150μl PBS/1%BSA，于37℃恒温培养箱中温育1h，洗涤三次；
4）加一抗
每孔加入100μl的待检血清，每个测试血清做三个平行孔，每板做三个阴性对照。于37℃恒温培养箱中温育1h，洗涤六次；
5）加二抗
每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的IgG1二抗（购自Abcom公司）或生物素标记的大鼠抗小鼠IgE抗体（购自GE公司）、HRP标记的链霉亲和素（购自Thermo Scientific公司），置于37℃恒温培养箱中温育1h，洗涤六次；
6）显色
每孔加入100μl TMB显色液，置于37℃恒温培养箱中，显色15min，每孔加入50μl2N硫酸终止液；
7）测定
于终止显色30min内用酶标仪测定各孔在450nm下的吸光值（A）。
其中，步骤4）的采血检测步骤为：对动物进行眼部内眦采血，置于含EDTA-K2抗凝剂的离心管中，5000r/min、4℃下离心10min，取血浆。血浆样本保存在-20℃，用于组胺水平的检测。血浆中组胺的检测采用小鼠组胺ELISA试剂盒测定，按照试剂盒要求的步骤进行测定。过敏症状测定为血管渗透性定量和定性检测。
由上述动物实验验证致敏性的蛋白以及获取的致敏血清用于以下RBL-2H3细胞检测方法的建立，包括下述步骤：
1）细胞培养
RBL-2H3细胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的Eagle’s MEM培养基中，37℃、5%CO2条件下培养。
2）细胞接种
RBL细胞以2×105mL-1(200μl/孔)接种到96孔细胞培养板上，培养24h；
3）致敏
用PBS缓冲液洗涤后加入100μl/孔的过敏血清（用不含FBS的培养液稀释），在培养箱中培养24h；
4）诱导
致敏24h后，用NaPIPES缓冲液洗涤3次，洗液全部吸净后，各组依次加入200μl/孔的过敏原溶液（用NaPIPES缓冲液稀释）或大鼠抗小鼠IgE抗体，在37℃反应45min；
5）检测
反应结束后，放入冰盒中终止反应，检测β-氨基己糖苷酶的释放率。
其中，步骤5）中β-氨基己糖苷酶释放率检测步骤为：转移30μl上清液至96孔板，加入50μl溶解1mmol/l4-nitrophenylNacetyl-β-D-glucosaminide(PNAG)的柠檬酸溶液(柠檬酸溶液为空白对照)，37℃反应1h，细胞脱颗粒反应释放的β-氨基己糖苷酶可将PNAG水解为对硝基苯酚，加200μl碳酸钠缓冲液显色，测定波长405nm，酶标仪上测定各孔吸光度值（A）。
其中，对细胞介质释放实验的参数进行了研究，包括致敏血清稀释度的确定、过敏原浓度的确定、细胞培养时间的确定、过敏原激发时间的确定。
1.致敏血清（或纯化小鼠IgE）稀释度的试验步骤：
1）血清总IgE浓度测定
采用小鼠总IgE ELISA试剂盒测定，具体步骤参考试剂盒的要求；
2）细胞接种
RBL细胞以2×105ml-1(1ml/孔)接种到24孔细胞培养板上，培养24h；
3）致敏
用PBS缓冲液洗涤后加入400μl/孔的含有不同总IgE浓度的过敏血清（0～160ng/ml）或纯化小鼠IgE（0～20μg/ml），在培养箱中培养24h；
4）加PE标记的大鼠抗小鼠IgE抗体
用1ml流式缓冲液吹打后，将细胞转移到流式管中，离心，倒掉上清液，每管加200μl流式缓冲液，加5μl PE标记的大鼠抗小鼠IgE抗体（0.5μg），4℃避光孵育30min；
5）检测
若当天可以检测，直接进流式细胞仪检测；若第二天检测，避光孵育后离心，倒净上清液，加50μl固定液，4℃避光过夜。通过流式细胞仪检测，得出最大荧光值对应的血清总IgE浓度，以下的研究就采用稀释到含有此总IgE浓度的血清。
2.过敏原浓度的试验步骤：
1）细胞接种
RBL细胞以2×105mL-1(200μl/孔)接种到96孔细胞培养板上，培养24h；
2）致敏
用PBS缓冲液洗涤后加入100μl/孔的过敏血清（用不含FBS的培养液稀释），在培养箱中培养24h；
3）诱导
24h后，用NaPIPES缓冲液洗涤3次，洗液全部吸净后，各组依次加入200μl/孔的一系列不同浓度的过敏原溶液（0.001～1000ng/ml），在37℃反应45min；
4）检测
反应结束后，放入冰盒中终止反应，检测β-氨基己糖苷酶的释放率。
3.细胞培养时间的试验步骤：
1）细胞接种
取不同代的RBL细胞以2×105mL-1(1mL/孔)接种到24孔细胞培养板上，培养24h；
2）致敏
用PBS缓冲液洗涤后加入400μl/孔最佳浓度的纯化小鼠IgE，在培养箱中培养24h；
3）加PE标记的大鼠抗小鼠IgE抗体
用1ml流式缓冲液吹打后，将细胞转移到流式管中，离心，倒掉上清液，每管加200μl流式缓冲液，加5μl PE标记的大鼠抗小鼠IgE抗体（0.5μg），4℃避光孵育30min；
4）检测
若当天可以检测，直接进流式细胞仪检测；若第二天检测，避光孵育后离心，倒净上清液，加50μl固定液，4℃避光过夜。通过流式细胞仪检测各管的荧光值。
4.过敏原激发时间的试验步骤：
1）细胞接种
RBL细胞以2×105mL-1(200μl/孔)接种到96孔细胞培养板上，培养24h；
2）致敏
用PBS缓冲液洗涤后加入100μl/孔的最佳稀释度过敏血清（用不含FBS的培养液稀释），在培养箱中培养24h；
3）诱导
24h后，用NaPIPES缓冲液洗涤3次，洗液全部吸净后，各组依次加入200μl/孔的最佳浓度的过敏原溶液，在37℃反应5、15、30、45、60min；
4）检测
反应结束后，放入冰盒中终止反应，检测β-氨基己糖苷酶的释放率。
其中，所述抗过敏原小鼠血清稀释到含有80～120ng/ml总IgE抗体的血清，优选为100ng/ml；所述过敏原浓度为10～100ng/ml；所述大鼠抗小鼠IgE抗体浓度为5～10μg/ml；所述激发时间为45～60min；细胞培养时间的延长对细胞脱颗粒程度无影响。
为了验证本发明构建的体外细胞检测方法对受试物的致敏评价的正确性，本实验还通过2001年FAO/WHO推荐的体外评价食品中外源蛋白致敏性的模拟胃液消化实验，与动物检测方法得到的结果进行比较，以确认评价结果的正确性。
食品过敏原大多都具有抗消化性，所以抗消化性也是评价潜在食品过敏原是否具有致敏性的一个指标。模拟胃液消化是在体外模拟人体的胃消化过程，判断潜在食品过敏原是否具有抗消化性。
将模拟胃液与蛋白样品溶液（对照样品或受试蛋白）按照19：1（v/v）的比例混合，快速振荡混匀，置于37℃水浴中，开始计时。在0s，15s，2min，30min，60min时间点取样，向模拟胃液中快速加入碳酸氢钠溶液终止反应，再加入5×上样缓冲液，沸水煮5min，进行蛋白电泳。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色、脱色，并拍照。具体步骤参照农业部869号公告-2-2007，即《转基因生物及其产品食用安全检测模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性试验方法》。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）检测成本低，本发明得到的细胞介质释放实验中β-氨基己糖苷酶的检测只需生化法即可测得，无需昂贵的检测试剂盒
（2）检测灵敏度高，本发明得到的细胞介质释放试验只需10ng/ml的过敏原即可诱发细胞脱颗粒，能够检测到食品中微量的致敏蛋白；检测特异性高，用抗卵清白蛋白的小鼠血清致敏细胞，大豆球蛋白诱导后，细胞未发生脱颗粒。
（3）本发明采用流式细胞术确定与细胞IgE受体结合最佳的总IgE浓度，后续的细胞试验均采用稀释到含有此总IgE浓度的血清，具有普遍意义。
（4）本发明能够准确地反映过敏原诱发IgE介导的过敏反应的能力，可用于评价食品原料及各种加工食品的致敏性，从根本上降低了食品过敏的风险。
（5）本发明基于过敏反应的细胞机制，建立了一种体外细胞检测方法，可以用于评价过敏原的免疫学活性。
（6）本发明建立的体外检测方法能够在体外稳定传代培养，而且血清可以冻存以作备用。
附图说明
图1为Balb/c小鼠血清中特异性IgE抗体滴度的检测结果，CK为阴性对照、CT为霍乱毒素佐剂、Gly为大豆球蛋白、OVA为卵清白蛋白、PAP为马铃薯酸性磷酸酶；
图2为Balb/c小鼠血清中特异性IgG1抗体滴度的检测结果，CK为阴性对照、CT为霍乱毒素佐剂、Gly为大豆球蛋白、OVA为卵清白蛋白、PAP为马铃薯酸性磷酸酶；
图3为Balb/c小鼠血浆中组胺含量的检测结果，CK为阴性对照、CT为霍乱毒素佐剂、Gly为大豆球蛋白、OVA为卵清白蛋白、PAP为马铃薯酸性磷酸酶；
图4为Balb/c小鼠血管渗透性的定性和定量检测结果，CK为阴性对照、CT为霍乱毒素佐剂、Gly为大豆球蛋白、OVA为卵清白蛋白、PAP为马铃薯酸性磷酸酶；
图5为纯化小鼠IgE与RBL-2H3细胞的结合能力检测结果；
图6为小鼠血清IgE与RBL-2H3细胞的结合能力检测结果，Glycinin为大豆球蛋白、OVA为卵清白蛋白、PAP为马铃薯酸性磷酸酶；
图7为不同浓度过敏原溶液诱发致敏细胞脱颗粒的检测结果，Glycinin为大豆球蛋白、OVA为卵清白蛋白、PAP为马铃薯酸性磷酸酶；
图8为过敏原诱发致敏细胞脱颗粒时间的检测结果，Glycinin为大豆球蛋白、OVA为卵清白蛋白、PAP为马铃薯酸性磷酸酶；
图9为不同浓度大鼠抗小鼠IgE抗体诱发致敏细胞脱颗粒的检测结果，Glycinin为大豆球蛋白、OVA为卵清白蛋白、PAP为马铃薯酸性磷酸酶；
图10为体系阳性和阴性对照模拟胃液消化SDS-PAGE凝胶电泳结果，BLG为阳性蛋白、BSA为阴性蛋白；
图11为受试蛋白模拟胃液消化SDS-PAGE凝胶电泳结果，Gly为大豆球蛋白、OVA为卵清白蛋白、PAP为马铃薯酸性磷酸酶。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。大豆球蛋白（Glycinin,Gly）、卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）、马铃薯酸性磷酸酶（potato acidphosphatase,PAP）购自Sigma公司。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1动物实验
一、实验动物
SPF级的3～4周龄雌性BALB/c小鼠。
二、受试物
受试蛋白为大豆球蛋白（Glycinin,Gly）、卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）、马铃薯酸性磷酸酶（potato acid phosphatase,PAP），均加入10μg霍乱毒素佐剂（CT，100μl生理盐水稀释）
三、动物分组
实验动物按照体重随机分为5组，分别是：Gly+CT组，OVA+CT组，PAP+CT组，CT对照组和阴性对照组。
四、剂量
受试蛋白为1mg，均吸附于10μg霍乱毒素佐剂（100μl生理盐水稀释），CT对照组接受10μg霍乱毒素佐剂，阴性对照组接受相同体积的生理盐水。
五、动物处理
实验动物进行适应性喂养1周后进行实验。自由饮水和进食，每周进行称重。
在第0、7、14、21、28天对每一组实验动物进行灌胃处理；
在致敏前一天和第35天，对动物进行眼部内眦静脉采血，5000r/min、4℃下离心10min，取血清，分装50μl冻存于-20℃，用于特异性抗体水平的检测以及RBL-2H3细胞试验的使用。
在第42天进行大剂量刺激，20min后对实验动物进行眼部内眦采血，置于含EDTA-K2抗凝剂的离心管中，5000r/min、4℃下离心10min，取血浆。血浆样本保存在-20℃，用于组胺水平的检测。再测定过敏症状，包括血管渗透性定量和定性检测。
数据处理采用SPSS13.0统计分析软件。试验结果以平均数±标准差表示，进一步采用单因素方差分析(One-way ANOVA)多重比较，差异显著性水平为P<0.05。
实施例2特异性IgE的检测
1）包被
将受试蛋白分别用包被缓冲液稀释至10mg/L，在96孔板上选择需要包被的孔，每孔加入包被液100μl，4℃过夜；
2）洗涤
倒掉孔内液体，每孔加入250μl PBS/0.1%BSA-Tween20洗涤液，室温放置5min，甩净洗涤液，在吸水纸上拍打数次，至孔内无明显液滴，重复两次；
3）封闭
每孔加入150μl PBS/1%BSA，于37℃恒温培养箱中温育1h，洗涤三次；
4）加一抗
每孔加入100μl的待检血清，每个测试血清做三个平行孔，每板做三个阴性对照。于37℃恒温培养箱中温育1h，洗涤六次；
5）加二抗
每孔加入100μl生物素标记的大鼠抗小鼠IgE二抗工作液（1:2000），置于37℃恒温培养箱中温育1h，洗涤六次；
6）加辣根过氧化物酶交联的链霉亲和素
每孔加入100μl辣根过氧化物酶交联的链霉亲和素（1:4000），置于37℃恒温培养箱中温育1h，洗涤六次；
7）显色
每孔加入100μl TMB显色液，置于37℃恒温培养箱中，显色15min，每孔加入50μl2N硫酸终止液；
8）测定
于终止显色30min内用酶标仪测定各孔在450nm下的吸光值（A）。
实验结果：间接ELISA法测定Balb/c小鼠血清中特异性IgE抗体的结果见图1。如图1所示，CK组（灌胃生理盐水）与CT组之间无显著性差异(P<0.05)，说明CT并未引发小鼠的过敏反应；与CK组、CT组相比，灌胃大豆球蛋白Gly+CT和卵清白蛋白OVA+CT的小鼠血清中特异性IgE抗体水平显著增加(P<0.05)；灌胃马铃薯酸性磷酸酶PAP+CT的小鼠激发的特异性IgE抗体较低，与CK组、CT组均无显著性差异(P<0.05)；同时Gly+CT组特异性IgE抗体滴度显著高于OVA+CT组、PAP+CT组(P<0.05)，OVA+CT组特异性IgE抗体滴度显著高于PAP+CT组(P<0.05)。
实施例3特异性IgG1的检测
1）包被
将受试蛋白分别用包被缓冲液稀释至10mg/L，在96孔板上选择需要包被的孔，每孔加入包被液100μl，4℃过夜；
2）洗涤
倒掉孔内液体，每孔加入250μl PBS/0.1%BSA-Tween20洗涤液，室温放置5min，甩净洗涤液，在吸水纸上拍打数次，至孔内无明显液滴，重复两次；
3）封闭
每孔加入150μl PBS/1%BSA，于37℃恒温培养箱中温育1h，洗涤三次；
4）加一抗
每孔加入100μl的待检血清，每个测试血清做三个平行孔，每板做三个阴性对照。于37℃恒温培养箱中温育1h，洗涤六次；
5）加二抗
每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的大鼠抗小鼠IgG1二抗（1:2000），置于37℃恒温培养箱中温育1h，洗涤六次；
6）显色
每孔加入100μl TMB显色液，置于37℃恒温培养箱中，显色15min，每孔加入50μl2N硫酸终止液；
7）测定
于终止显色30min内用酶标仪测定各孔在450nm下的吸光值（A）。
实验结果：同特异性IgE抗体，特异性IgG1抗体也是有Th2型免疫细胞和细胞因子诱发产生的。间接ELISA法测定Balb/c小鼠血清中特异性IgG1抗体的结果见图2。如图2所示，与CK组相比，各组小鼠血清中特异性IgG1抗体水平显著增加(P<0.05)；与CT组相比，仅灌胃Gly+CT和OVA+CT组小鼠血清中特异性IgG1抗体水平显著增加(P<0.05)；同时Gly+CT组特异性IgG1抗体滴度最高，其次是OVA+CT组，PAP+CT组最低，而且各组之间均有显著性差异(P<0.05)。
实施例4组胺水平的检测
血浆中组胺的检测采用小鼠组胺ELISA试剂盒（购自CUSABIOBIOTECH）测定。
1）将各种试剂移至室温（18～25℃）平衡至少30min，按试剂盒要求配制试剂，备用；
2）加样
分别设标准样孔、待测样孔。每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育2小时；
3）弃去液体，甩干，不用洗涤；
4）每孔加生物素标记抗体工作液100μl，覆上新的板贴，37℃温育1小时；
5）弃去孔内液体，甩干，洗板3次。每次浸泡2min，200μl/孔，甩干；
6）每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，覆上新的板贴，37℃温育1小时；
7）弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2min，200μl/孔，甩干；
8）依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色15～30min；
9）依序每孔加终止溶液50μl，终止反应；
10）在反应终止5min内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的吸光值。
实验结果：组胺是导致产生系统性过敏症状的主要物质，通过测定血浆中组胺的水平可以评价Balb/c小鼠过敏症状的严重程度，进而反过来评价蛋白质的致敏性高低。组胺测定结果如图3，结果显示，与CK组、CT组相比，Gly+CT组和OVA+CT组的小鼠血浆中组胺水平显著增加(P<0.05)；而PAP+CT组较CK组、CT组均无显著性差异(P<0.05)；同时Gly+CT组组胺水平最高，其次是OVA+CT组，PAP+CT组最低，分别为（2048.83±321.39）、（1621.37±270.83）、（1258.11±239.14）pg/ml，各组之间均有显著性差异(P<0.05)。
实施例5血管渗透性定量检测
检测大刺激后40min腹腔液中白蛋白水平。向轻微麻醉的小鼠腹腔中注射3ml含10mM EDTA的PBS溶液，腹部按摩1min后，抽出腹腔液，在4℃、600r/min下离心6min，取上清液贮存于-80℃下备用。上清液中的白蛋白含量由BCA试剂盒（购自BIOMIGA）检测，按照试剂盒要求配置BCA工作液和标准溶液，将样品或标准溶液与BCA工作液混匀，在37℃放置30min，冷却至室温，在562nm下测定各孔的吸光值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
实验结果：腹腔液中白蛋白水平可以对血管渗透性进行定量分析。由图4可见，与CK组、CT组相比，各致敏组的白蛋白含量均有显著性差异(P<0.05)。同其他指标，Gly+CT组白蛋白含量最高，其次是OVA+CT组，PAP+CT组最低，分别为（914.91±179.56）、（698.03±100.70）、（519.44±38.85）μg/ml，各组之间均有显著性差异(P<0.05)。
实施例6血管渗透性定性检测
尾静脉注射100μl0.5%伊文氏蓝溶液后，经口灌胃10mg过敏原，30～40min时观察小鼠脚掌和小肠是否出现了蓝色。
实验结果：系统性过敏症状是由血管渗透性增加导致的，通过测定大剂量刺激后Balb/c小鼠的血管渗透性可以对其系统性过敏症状进行评价。图4显示出Gly+CT组、OVA+CT组和PAP+CT组的脚掌和小肠产生了不同深浅的蓝色，而CK组、CT组未出现蓝色。其中，Gly+CT组的蓝色最深，其次是OVA+CT组，PAP+CT组最浅。
结论：在动物实验中，本发明采用了霍乱毒素（CT）作为口服免疫佐剂。CT具有很强的黏膜佐剂活性，微量CT与其他抗原同时免疫动物时，能诱发较强的免疫反应。本发明的动物实验中各种指标检测结果显示CT组与生理盐水对照组（CK组）相比，均无显著性差异(P<0.05)，表明CT佐剂仅是提高过敏原的免疫反应，其本身并不会引发过敏反应。
在以往的动物检测方法研究中，OVA常作为阳性对照，而PAP作为阴性对照。本发明中，与CK组、CT组相比，OVA+CT组产生的过敏反应均显著增强(P<0.05)，而PAP+CT组的过敏反应无显著性变化(P<0.05)，综合分析动物实验各种指标的检测结果，显示大豆球蛋白（Gly）的致敏性最强，其次是卵清白蛋白（OVA），马铃薯酸性磷酸酶（PAP）的致敏性很低。说明本发明的动物模型建立成功，能够用于检测过敏原的致敏性。
实施例7体外细胞检测方法的建立
1.细胞
大鼠嗜碱性粒细胞（RBL-2H3）。
2.过敏原
大豆球蛋白（Glycinin,Gly）、卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）、马铃薯酸性磷酸酶（potato acid phosphatase,PAP）。
3.致敏血清
由实施例3获取的致敏血清。
4.细胞脱颗粒实验
1）细胞培养
RBL-2H3细胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的Eagle’s MEM培养基中，37℃、5%CO2条件下培养。
2）细胞接种
RBL-2H3细胞以2×105mL-1(200μl/孔)接种到96孔细胞培养板上，培养24h；
3）致敏
用PBS缓冲液洗涤后加入100μl/孔的过敏血清（用不含FBS的培养液稀释），在培养箱中培养24h；
4）诱导
致敏24h后，用NaPIPES缓冲液洗涤3次，洗液全部吸净后，各组依次加入200μl/孔的过敏原溶液（用NaPIPES缓冲液稀释）或大鼠抗小鼠IgE抗体，在37℃反应45min；（注：全部释放组的细胞用100μl1%Trition X-100在37℃下处理30min）
5）检测
反应结束后，放入冰盒中终止反应。
β-氨基己糖苷酶释放率检测方法为：转移30μl上清液至96孔板，加入50μl溶解1mmol/l4-nitrophenyl Nacetyl-β-D-glucosaminide(PNAG)的柠檬酸溶液(柠檬酸溶液为空白对照)，37℃反应1h，细胞脱颗粒反应释放的β-氨基己糖苷酶可将PNAG水解为对硝基苯酚，加200μl碳酸钠缓冲液显色，测定波长405nm，酶标仪上测定各孔吸光度值（A）。
β-氨基己糖苷酶释放率的计算方法为：
β-氨基己糖苷酶释放率=各孔释放量/总释放量（其中用TritionX-100处理的细胞释放出的β-氨基己糖苷酶的含量为总释放量）
过敏原生物活性=1/ED50，其中ED50为达到β-氨基己糖苷酶最大释放率一半的过敏原溶液的浓度。
实施例8致敏血清总IgE稀释度的确定
1）血清总IgE浓度测定
采用小鼠总IgE ELISA试剂盒测定，具体步骤参考试剂盒的要求；
2）细胞接种
RBL细胞以2×105ml-1(1ml/孔)接种到24孔细胞培养板上，培养24h；
3）致敏
用PBS缓冲液洗涤后加入400μl/孔的含有不同总IgE浓度的过敏血清（0～160ng/ml）或纯化小鼠IgE（0～20μg/ml），在培养箱中培养24h；
4）加PE标记的大鼠抗小鼠IgE抗体
用1ml流式缓冲液吹打后，将细胞转移到流式管中，离心，倒掉上清液，每管加200μl流式缓冲液，加5μl PE标记的大鼠抗小鼠IgE抗体（0.5μg），4℃避光孵育30min；
5）检测
若当天可以检测，直接进流式细胞仪检测；若第二天检测，避光孵育后离心，倒净上清液，加50μl固定液，4℃避光过夜。通过流式细胞仪检测，得出最大荧光值对应的血清总IgE浓度，以下的研究就采用稀释到含有此总IgE浓度的血清。
实验结果：图5为纯化小鼠IgE与RBL-2H3细胞结合能力的检测结果。采用一系列浓度的纯化小鼠IgE（0～20μg/ml）致敏细胞，24h后加入PE标记的大鼠抗小鼠IgE抗体，由流式细胞仪检测。结果以不加纯化小鼠IgE组平均荧光强度的倍数表示。由表5显示，纯化小鼠IgE为5μg/ml时，纯化小鼠IgE与RBL-2H3细胞结合最强。因此，在后续的“细胞培养时间的确定”实验中，采用5μg/ml纯化小鼠IgE致敏培养2周、4周、6周的细胞。
图6为小鼠血清IgE与RBL-2H3细胞结合能力的检测结果。采用含有不同总IgE浓度的过敏血清（0～160ng/ml）致敏细胞，24h后加入PE标记的大鼠抗小鼠IgE抗体，由流式细胞仪检测。结果以不加纯化小鼠IgE组平均荧光强度的倍数表示。由表5显示，随着过敏血清中总IgE含量的增加，血清总IgE与RBL-2H3细胞结合能力逐渐增强，当总IgE含量为100ng/ml时，达到平衡。因此，后续的细胞脱颗粒实验采用稀释到含有80～120ng/ml总IgE抗体的血清，优选为100ng/ml。
实施例9过敏原浓度的确定
1）细胞接种
RBL细胞以2×105mL-1(200μl/孔)接种到96孔细胞培养板上，培养24h；
2）致敏
用PBS缓冲液洗涤后加入100μl/孔的过敏血清（用不含FBS的培养液稀释），在培养箱中培养24h；
3）诱导
24h后，用NaPIPES缓冲液洗涤3次，洗液全部吸净后，各组依次加入200μl/孔的一系列不同浓度的过敏原溶液（0.001～1000ng/ml），在37℃反应45min；
4）检测
反应结束后，放入冰盒中终止反应，检测β-氨基己糖苷酶的释放率。
实验结果：采用含有100ng/ml总IgE抗体的血清致敏、一系列不同浓度的过敏原溶液（0.001～1000ng/ml）诱导RBL-2H3细胞，导致细胞脱颗粒的程度见图7。结果显示，随着过敏原浓度的增加，β-氨基己糖苷酶释放率先升高后降低；当过敏原浓度为10～100ng/ml时，释放率最高，优选10ng/ml。
实施例10细胞培养时间的确定
1）细胞接种
取培养2周、4周、6周的RBL细胞以2×105mL-1(1mL/孔)接种到24孔细胞培养板上，培养24h；
2）致敏
用PBS缓冲液洗涤后加入400μl/孔最佳浓度的纯化小鼠IgE，在培养箱中培养24h；
3）加PE标记的大鼠抗小鼠IgE抗体
用1ml流式缓冲液吹打后，将细胞转移到流式管中，离心，倒掉上清液，每管加200μl流式缓冲液，加5μl PE标记的大鼠抗小鼠IgE抗体（0.5μg），4℃避光孵育30min；
4）检测
若当天可以检测，直接进流式细胞仪检测；若第二天检测，避光孵育后离心，倒净上清液，加50μl固定液，4℃避光过夜。通过流式细胞仪检测各管的荧光值。
实验结果：采用5μg/ml纯化小鼠IgE致敏培养2周、4周、6周的细胞，24h后加入PE标记的大鼠抗小鼠IgE抗体，由流式细胞仪检测。结果以与IgE结合的细胞百分率表示。由表1可知，随着细胞培养时间的延长，RBL-2H3细胞与小鼠IgE结合程度并未发生显著性地变化。
表1不同培养时间的细胞RBL-2H3与小鼠IgE结合程度的分析
实施例11过敏原激发时间的确定
1．细胞接种
RBL细胞以2×105mL-1(200μl/孔)接种到96孔细胞培养板上，培养24h；
2．致敏
用PBS缓冲液洗涤后加入100μl/孔的最佳稀释度过敏血清（用不含FBS的培养液稀释），在培养箱中培养24h；
3．诱导
24h后，用NaPIPES缓冲液洗涤3次，洗液全部吸净后，各组依次加入200μl/孔的最佳浓度的过敏原溶液，在37℃反应5、15、30、45、60min；
4．检测
反应结束后，放入冰盒中终止反应，检测β-氨基己糖苷酶的释放率。
实验结果：采用含有100ng/ml总IgE抗体的血清致敏RBL-2H3细胞，加入10ng/ml过敏原溶液，在37℃反应0、5、15、30、45、60min，诱发细胞脱颗粒的程度见图8。结果显示，随着过敏原激发时间的延长，β-氨基己糖苷酶释放率逐渐升高，在45min时达到平衡。因此，最佳的过敏原激发时间为45～60min，优选45min。
实施例12细胞脱颗粒实验
1．阳性对照结果
采用含有100ng/ml总IgE抗体的血清致敏、一系列不同浓度的大鼠抗小鼠IgE抗体（5～10μg/ml）诱导RBL-2H3细胞，导致细胞脱颗粒的程度见图7。结果显示，各组在5μg/ml大鼠抗小鼠IgE抗体诱导下，细胞脱颗粒程度最高。Gly组、OVA组、PAP组的致敏血清诱发β-氨基己糖苷酶最大释放率分别为83%、58%、37%。
2．小鼠致敏血清致敏结果
由图7计算得出表2中的β-氨基己糖苷酶释放率和ED50值，其中1/ED50值表示过敏原的生物活性，结果显示三种蛋白的相对致敏活性为：Gly>OVA>PAP，结果与动物实验结果一致。
表2RBL-2H3细胞检测方法评价Gly、OVA、PAP的相对致敏活性
由以上实验可知，本发明为建立用于检测食品中过敏原的体外检测方法，首先对细胞检测方法过程中的实验参数进行了摸索，如血清稀释度、过敏原浓度、过敏原激发时间以及细胞培养时间。结果显示，最佳稀释度的血清为稀释到含有80～120ng/ml总IgE抗体的血清，优选为100ng/ml；最佳过敏原浓度为10～100ng/ml；最佳过敏原激发时间为45～60min；细胞培养时间的延长对细胞脱颗粒程度无影响。
本发明利用3种蛋白（Gly、OVA、PAP）致敏RBL-2H3细胞，结果显示这3种蛋白致敏性由强到弱分别是Gly，OVA，PAP，与动物实验结果一致，说明本发明建立的用于检测食品中过敏原的RBL-2H3细胞检测方法是有效的。
实施例13模拟胃液消化
1．将模拟胃液与蛋白样品溶液（对照样品或受试蛋白）按照19：1（v/v）的比例混合，快速振荡混匀，置于37℃水浴中，开始计时。在0s，15s，2min，30min，60min时间点取样，向模拟胃液中快速加入碳酸氢钠溶液终止反应，再加入5X上样缓冲液，向模拟肠液中直接加入5X上样缓冲液，沸水煮5min，进行蛋白电泳。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色、脱色，并拍照。具体步骤参照农业部869号公告-2-2007,即《转基因生物及其产品食用安全检测模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性试验方法》.
2.模拟胃肠消化结果
体系阳性蛋白（BLG）和阴性蛋白（BSA）的消化结果如图10所示，可以看出BSA可以在15s内被胃蛋白酶迅速消化，BLG在60min内均具有抗胃蛋白酶消化性，说明模拟消化体系工作正常。
Gly、OVA、PAP的的消化结果如图11所示。
Gly分A亚基和B亚基。模拟胃液消化的结果可以看出A亚基可以在2min内被完全消化，而B亚基具有一定的抗消化性，到60min仍旧不能被胃蛋白酶消化。
OVA和胃酶的条带存在一定的重合，从OVA的模拟胃液消化结果可以看出OVA具有一定的抗消化性，但是在2min后仍旧可以被胃蛋白酶完全消化。
PAP经胃蛋白酶消化15s时就被完全降解，不具有对胃蛋白酶的抗消化性。
模拟胃液消化实验结果显示Gly对胃蛋白酶的的抗消化性高于OVA，PAP不具有抗消化性，由此可预测三者的致敏性强弱为：Gly>OVA>PAP。
综上所述，动物实验、体外细胞实验和模拟胃液消化实验的结果均能证明本发明使用的3种食品过敏原具有不同强度的潜在致敏性，结论如下：
1）本发明中，阳性组（OVA+CT组）产生的过敏反应较CK组、CT组均显著增强，而阴性组（PAP+CT组）的过敏反应无显著性变化(P<0.05)，说明本发明的动物检测方法建立成功，能够用于验证过敏原的致敏性强弱。
2）本发明采用Balb/c小鼠动物检测方法对3种食品过敏原的致敏性强弱进行了验证，评价结果表明，大豆球蛋白（Gly）的致敏性最强，其次是卵清白蛋白（OVA），马铃薯酸性磷酸酶（PAP）的致敏性很低。
3）本发明建立的细胞检测方法对食品中过敏原的评价结果与已经广泛使用的模拟胃液消化实验评价方法结果一致，证明该评价方法可以应用于食品过敏原的鉴定及其致敏性的评价。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种食品中过敏原的体外检测方法，包括以下步骤：
1)以不同致敏性的过敏原经口分别免疫不同的雌性BALB/c小鼠，建立IgE高反应性食品过敏动物模型；所述不同致敏性的过敏原为大豆球蛋白、卵清白蛋白和马铃薯酸性磷酸酶；其中，步骤1)中所述过敏原以霍乱毒素为佐剂；
2)以抗过敏原小鼠血清致敏RBL-2H3细胞，过敏原或大鼠抗小鼠IgE抗体激发，检测β-氨基己糖苷酶的释放率；所述抗过敏原小鼠血清稀释到含有80～120ng/ml总IgE抗体的血清；其中，步骤2)中所述过敏原浓度为10～100ng/ml；所述大鼠抗小鼠IgE抗体浓度为5～10μg/ml；激发时间为45～60min。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1)雌性BALB/c小鼠免疫步骤如下：
①实验动物进行适应性喂养后开始实验，动物按体重随机分为若干组，自由饮水和进食，每周进行称重；
②在第0、7、14、21、28天，对每一组实验动物分别使用不同受试物进行实验，其中一组实验动物接受佐剂对照，一组实验动物接受阴性对照；
③在致敏前一天和第35天，对动物进行眼部内眦静脉采血；
④在第42天进行大剂量刺激，20min后采血，之后进行过敏症状测定；
其中，实验动物为，SPF级的3～4周龄雌性BALB/c小鼠。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，每1mg剂量的过敏原吸附于10μg霍乱毒素佐剂。
4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，步骤①中，将动物按体重随机分为5组，所使用的受试蛋白为大豆球蛋白、卵清白蛋白、马铃薯酸性磷酸酶，剂量为1mg，均吸附于100μl生理盐水稀释的10μg霍乱毒素佐剂，佐剂对照组仅接受10μg霍乱毒素佐剂，阴性对照组接受相同体积的生理盐水。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤2)抗过敏原小鼠血清稀释方法如下：
①血清总IgE浓度测定：采用小鼠总IgE ELISA试剂盒测定，具体步骤参考试剂盒的要求；
②细胞接种：RBL-2H3细胞以2×105ml-11ml/孔接种到24孔细胞培养板上，培养24h；
③致敏：用PBS缓冲液洗涤后加入400μl/孔的含有不同总IgE浓度的过敏血清，0～160ng/ml，在培养箱中培养24h；
④加PE标记的大鼠抗小鼠IgE抗体：用1ml流式缓冲液吹打后，将细胞转移到流式管中，离心，倒掉上清液，每管加200μl流式缓冲液，加5μl PE标记的大鼠抗小鼠IgE抗体，4℃避光孵育30min；
⑤检测：若当天可以检测，直接进流式细胞仪检测；若第二天检测，避光孵育后离心，倒净上清液，加50μl固定液，4℃避光过夜；通过流式细胞仪检测，得出最大荧光值对应的血清总IgE浓度，以下的研究就采用稀释到含有此总IgE浓度的血清。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，过敏原生物活性＝1/ED50，其中，ED50为达到β-氨基己糖苷酶最大释放率一半的过敏原溶液的浓度。
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| 霍乱毒素佐剂的研究进展;廖翔 等;《生物技术通讯》;20030131;第14卷(第1期);第60-63页 * |
| 鱼腥草注射液的被动皮肤过敏试验及体外过敏试验;安丹 等;《沈阳药科大学学报》;20111031;第28卷(第10期);第812-817页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103257237A (zh) | 2013-08-21 |
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