CN105866428A - 一种检测EV71病毒IgG抗体的免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明创造提供一种检测EV71病毒IgG抗体的免疫检测试剂盒，包括抗EV71病毒IgG抗体标准品、辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG酶标抗体溶液、浓缩洗液、底物溶液和终止液。本发明创造能够快速检测血清中抗EV71病毒IgG抗体的浓度，并具有较高的灵敏度和准确度。

Description

一种检测EV71病毒IgG抗体的免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种肠道病毒71型(EV71)抗体免疫检测试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术
肠道病毒71型(EV71)是1969年首次从加利福尼加患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的一种肠道病毒，常引起儿童手足口病、病毒性咽峡炎，严重的会出现脑炎、肺水肿等。手足口病和中枢神经系统感染是EV71感染引起的两大常见临床病症。
EV71感染疾病常发生于4-9月，人群密切接触是其重要的传播方式，儿童可通过接触被病毒污染过的用品引起感染；由于患者咽喉分泌物或者唾液中的病毒可通过空气进行传播，因此近距离接触患儿可造成感染；食用被病毒污染的水或食物也可发生感染。
由于肠道病毒感染容易引起并发症，并且往往在一周之内就会转成重症，所以它的快速诊断，使患者得到第一时间的对症治疗就显得尤为重要。
目前国内外开展的检测方法主要有以下几种：
(1)常规病毒培养法，该法灵敏度较低，耗时长；
(2)微量细胞培养法，该法操作复杂，需连续几天观察细胞病变效应，耗时长；
(3)荧光PRC(RT-PCR)法，该法检测准确性较高，特异性较强，快速，但操作步骤复杂、周期较长、成本高，不利于基层医院开展；
(4)免疫学检测法：通过特异性检测血清中EV71病毒的抗体实现对其检测，其灵敏度和特异性较前两种方法有很大的优势。
免疫标记检测技术是利用抗原抗体之间能够特异性结合的性质，通过检测标记在反应物上的标记物，对抗原或抗体进行定性或定量检测的方法。根据标记物的不同，可分为酶联免疫分析技术、免疫荧光技术、放射免疫测定和免疫胶体金标记技术等。目前国内外临床上用来检测EV71的免疫学方法主要有酶联免疫方法和胶体金法，其中酶联免疫方法以其操作简单快速、技术和设备要求简单，利于EV71感染的及时防控而受到越来越多的医疗机构的青睐。目前国内市场上检测EV71的产品不多，有北京万泰的EV71-IgM胶体金检测试剂盒和EV71-IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)。
胶体金检测方法操作简单快捷，结果清晰易辨，但灵敏度和敏感度与酶联免疫检测相比较差，适合突发事件的大批量现场检测。EV71-IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)采用的是捕获法，其方法是先将抗人的IgM抗体包被在酶标板上，加入待检样本、抗原和辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgM抗体，待检样本中的抗体会与包被抗体及抗原特异性结合，然后酶标抗体与抗原特异性结合，再加入TMB(四甲基联苯胺)显色，颜色的深浅和待检抗体的浓度呈正相关，从而实现EV71的检测。该试剂盒为了排除IgG的干扰采用捕获法，与一般的间接法相比增加了一个步骤，使整个实验过程比较复杂。目前市场上也没有通过检测IgG抗体的方法来检测EV71的产品。因此，在EV71的临床 检测领域中，迫切需要一种更为简便的诊断试剂盒产品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒，包括EV71 VP1蛋白包被的酶标板和辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体，还包括EV71 IgG抗体标准品、辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG酶标抗体、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒的制备方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
本发明所述EV71抗原(EV71 VP1蛋白)和抗EV71 VP1单克隆抗体为下述抗原和抗体：
所述EV71 VP1蛋白，是由下述方法得到的：
a)引物设计用Primer Premier5.0设计EV71 VP1基因的两条引物，正向引物：5’-CGGGATCCGGAGATAGGGTGGCAGATGTA-3’(下划线处为BamHⅠ酶切位点)；反向引物为：5’-CGGAATCCAGTAGTGATCGCCGTGCG-3’(下划线处为EcoRⅠ酶切位点)。
b)目的基因的扩增EV71 VP1基因购自天津汇滨，全基因序列见GenBank accession No:FJ360544。扩增反应：50μL反应体系包括d NTP、PCR缓冲液、正反向引物、模板和Taq DNA聚合酶，混匀后，94℃变性5min，然后94℃变性30S、50℃退火30s、72℃延伸60s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
c)表达载体的构建EV71 VP1 PCR扩增产物琼脂用糖凝胶电泳回收，将扩增产物和载体p UC19用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收，用T4DNA连接酶连接，16℃水浴过夜连接，转化感受态E.coli TOP10菌株，涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。挑取单菌落接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定。将鉴定为阳性的质粒进行测序，测序正确后保存质粒。将该阳性质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21gold(DE3)感受态细胞中，并涂布到含100μg/ml氨苄青霉素，25μg/ml四环素的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆BL21gold(DE3)/Top10-VP1。
d)重组蛋白VP1的诱导表达及SDS-PAGE鉴定将BL21gold(DE3)/Top10-VP1接种到3ml含100μg/ml氨苄青霉素，25μg/ml四环素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。第二日，按照1:20的体积比接种至3ml含100μg/ml氨苄青霉素，25μg/ml四环素的LB液体培养基中，37℃培养2h至A600达到0.6，加入终浓度0.05mmol/L的IPTG，诱导表达4h后10000r/min离心收集菌体。收集到的菌体用700μL 0.02mol/L PBS重悬，在冰浴中进行超声破碎。超声破碎后12000r/min离心5min，取上清90μL。沉淀继续用700μL0.02mol/L PBS重悬，混匀后取样90μL，与之前的上清各加30μL 4*SDS上样缓冲液，煮沸5min，进行SDS-PAGE检测诱导表达的蛋白。
e)蛋白的表达与纯化与小量诱导条件相同，将体积扩大为1L大量诱导蛋白表达，结束后将培养物4000r/min，离心20min，收集菌体。用0.02mol/L PBS缓冲液洗涤2次后重悬，冰浴中超声破碎。获得的裂解液在4℃条件下10000r/min离心15min，弃去上清，收集到的沉淀为粗制包涵体。用5ml/L Triton X-100洗涤，10000r/min离心15min，弃去上清，将沉淀用含6mol/L盐酸胍的0.02mol/L的PB(PH7.8)溶解后备用，Ni2+亲和层析柱用含6mol/L盐酸胍的0.02mol/L的PB(PH7.8)平衡，上样，分别用含50、100、200mmol/L咪唑、6mol/L盐酸胍的0.02mol/L的PB(PH7.8)洗脱，收集样品。取收集的样品90μL，加入等体积100g/L的三氯乙酸，4℃放置30min，12000r/min离心15min，弃去上清，用无水乙醇洗涤沉淀2次，加入1*SDS上样缓冲液，煮沸5min后进行SDS-PAGE分析结果。
所述抗EV71 VP1单克隆抗体，可与EV71 VP1蛋白特异性结合，用SDS-PAGE显示为均一抗体产物，用VP1包被，间接法ELISA检测显示其效价不低于1:1×10 5，所述抗体是由下述方法得到的：用EV71 VP1蛋白作为免疫原免疫小鼠，用杂交瘤融合技术制备抗EV71 VP1的单克隆抗体。将筛选获得的单克隆细胞株注射进小鼠腹腔，制备腹水，纯化腹水中的单抗。
上述抗EV71 VP1单克隆抗体的制备方法，具体步骤为：
(1)杂交瘤细胞的融合和筛选
(a)收集骨髓瘤细胞，用无血清培养基洗3次(37℃)，计数；
(b)收集已免疫小鼠的脾细胞，用无血清培养基洗3次(37℃)，计数；
(c)按1:5混合骨髓瘤细胞和脾细胞，离心弃去上清，并用消毒滤纸将多余上清吸干净；
(d)将1ml 40％PEG一滴滴加入细胞团中，60S内加完，同时不断轻微转动离心管；
(e)加入1ml无血清培养基，期间不断转动离心管，60S内加完；
(f)5分钟内缓慢加完20ml无血清培养基，800r/min离心8Min，弃去上清，用10ml完全培养基悬浮，轻轻混匀，加入96孔板中，每孔50微升；
(g)将96孔板放入5％CO2培养箱中，37℃培养，24h后更换为HAT选择性培养基；
(h)7-10天后用HAT培养基半量换液，以后每隔2-3天半量换液一次，两周后改用HT培养基半量换液；
(i)2-3周后出现杂交细胞集落，待其生长至1/3孔时进行抗体检测；
(j)有限稀释法获得单克隆细胞株，检测抗体效价，将效价高的细胞扩大培养，确定阳性克隆后冻存；
(k)将上述克隆再次进行克隆化，获得的稳定的阳性克隆即为杂交瘤细胞系，保存细胞株。
(2)小鼠腹水的制备
(a)取经产小鼠腹腔注射石蜡油0.5ml/只；
(b)5天后腹腔接种杂交瘤细胞0.5*106/只，7-10天收获腹水，每只小鼠可收集几次，至小鼠死亡。腹水中加入0.01％叠氮钠，12000r/min离心10min,保留上清，测效价，进行抗体纯化、分装和保存。
(3)抗体纯化
(a)取2ml腹水，加等体积的生理盐水，再加入4ml饱和硫酸铵溶液，于4℃沉淀过夜；
(b)10000g低温离心10分钟，弃上清，将沉淀用2ml PBS溶解，缓慢滴加1ml饱和硫酸铵溶液，在4℃静置1小时；
(c)10000g低温离心10分钟，弃上清，将沉淀用1ml PBS溶解，用PBS溶液4℃透析过夜；
(d)用5-10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；
(e)用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
(f)将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；
(g)用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
(h)用2-5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，得到抗EV71 VP1单克隆抗体。
(4)抗体人源化
本公司与天津汇滨生物科技有限公司合作对鼠源单克隆抗体进行人源化处理，主要包括人源化方案的设计和人源化抗体序列的获得，人源化抗体库的制备与筛选。即得到了人源化的特异针对EV71 VP1的IgG抗体。
一种EV71病毒IgG抗体的免疫检测试剂盒，包括EV71 VP1蛋白包被的酶标板和HRP标记的兔抗人IgG抗体。
优选的，上述EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒，还包括EV71 IgG抗体标准品a、EV71 IgG抗体标准品b、EV71 IgG抗体标准品c、EV71 IgG抗体标准品d、EV71 IgG抗体标准品e、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液。
其中，所述EV71 VP1蛋白包被的酶标板采用下述方法获得：
(a)EV71 VP1包被液的配制：采用以下缓冲溶液将EV71 VP1稀释至10ng/100μL～2μg/100μL：0.01M～0.2M PBS(磷酸盐缓冲溶液)，其pH7.0～pH8.0；0.02～0.2M CBS(碳酸盐缓冲溶液)，其pH9.0～pH9.6；0.01mol/L Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液)，其pH10.0～pH10.6；
(b)封闭液的配制：将2％～5％的脱脂奶粉或者1％～5％BSA(牛血清白蛋白)加入下述缓冲溶液中，配制成封闭液：缓冲溶液，0.01M～0.2M PBS(磷酸盐缓冲溶液)，其pH7.0～pH8.0；
(c)包被酶标板：
①将配制的EV71VP1包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入50μL～200μL包被液；
②酶标板置于2-8℃环境下包被8～16h；
③将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入50μL～200μL封闭液，置于37℃温箱，30～90分钟；
④从温箱取出酶标板后弃去封闭液，37℃恒温30～90分钟，即得。
其中，所述EV71 IgG抗体标准品a的浓度为500Au/ml、EV71 IgG抗体标准品b 的浓度为250Au/ml、EV71 IgG抗体标准品c的浓度为125Au/ml、EV71 IgG抗体标准品d的浓度为62.5Au/ml、EV71 IgG抗体标准品e的浓度为31.25Au/ml。
其中，所述的辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体溶液是将辣根过氧化物酶标记兔羊抗人酶标抗体用HRP偶联物稳定剂以1:3000～1:20000的比例稀释而成。
其中，所述的浓缩洗液由下述组分配制而成，按重量份数计，氯化钠96.0份，氯化钾2.40份，十二水合磷酸氢二42.96份，磷酸二氢钾2.88份，吐温-20 0.05份，超纯水1000份。
其中，所述样本稀释液为含0.5％新生牛血清的0.1M PBS，其PH为7.0-8.0；含1％新生牛血清的0.01M PBS，其PH为7.0-8.0；含0.5％BSA(牛血清白蛋白)的0.1M PBS，其PH为7.0-8.0；含1％BSA(牛血清白蛋白)的0.01M PBS，其PH为7.0-8.0；含1％脱脂奶粉的0.1M PBS，其PH为7.0-8.0；优选为含BSA的磷酸盐缓冲液。
其中，所述底物溶液为TMB(四甲基联苯胺)，作为酶的反应底物发生显色反应，且颜色的深浅和待测样品中EV71病毒浓度呈正相关。
其中，所述终止液为硫酸溶液，优选为2mol/L硫酸溶液，可以采用将浓硫酸与超纯水1:8稀释配制而成，用于终止酶的显色反应。
上述HRP标记的兔抗人IgG抗体、以及EV71 IgG抗体标准品a、EV71 IgG抗体标准品b、EV71 IgG抗体标准品c、EV71 IgG抗体标准品d、EV71 IgG抗体标准品e、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液分别放入各个试剂瓶中，上述各试剂瓶由海绵托架固定，并同EV71 VP1蛋白包被的酶标板、说明书和封板膜一同置于试剂盒盒体内。
优选的，上述EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒检测EV71 IgG浓度的应用为间接ELISA方法，具体步骤如下：
(1)将待检测物用样本稀释液稀释，优选的稀释比例为1:300-1:1000；
(2)将步骤(1)所得的待测样本加入EV71 VP1蛋白包被的酶标板中孵育20～90min，孵育后洗板；
(3)向步骤(2)酶标板中加入兔抗人酶标抗体并孵育20～90min，孵育后洗板；
(4)向步骤(3)的酶标板中加入TMB显色15min，加入终止液后进行检测，于酶标仪上读取450nm处的吸光光度值。
上述EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒的应用原理如下：
1)将EV71 VP1蛋白包被在固相载体上，制成固相抗原；
2)将待检样本加入1)的固相上并孵育，使待检抗体与包被抗原结合；
3)恒温反应并彻底洗涤1)，加入与酶标抗体；
4)经过恒温反应并彻底洗涤，再加入酶的反应底物TMB显色，颜色的深浅和待检样本中EV71 IgG抗体浓度呈正相关；
5)用酶标仪在一定波长下测定吸光度，通过标准曲线实现对抗体的检测。
本发明的有益效果是：
本发明所述EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒采用间接法，先将EV71 VP1蛋白包被在酶标板上，再将待检样本加入酶标板中与抗原特异性结合，再经辣根过氧化物酶与底物发生显色反应，测定结果的颜色深浅和待检抗体的浓度呈正相关，其所用抗体为人源化的抗EV71 VP1单克隆抗体，可根据EV71 IgG标准品绘制标准曲线，根据标准曲线方程计算待检抗体的浓度值，该检测试剂盒具有较好的敏感性和特异性，结果与参比试剂符合率高，能提供更准确可靠的检验结果，所述试剂盒操作简便易行，检测快速灵敏，所用酶标仪简单、普及，价格低廉，该检测试剂盒为EV71 IgG抗体定量检测提供了一种有效工具，并且与本公司的EV71 IgM抗体定量试剂盒联合检测大大提高了检测的特意性和灵敏度。
附图说明
图1显示了EV71 VP1蛋白基因PCR扩增电泳图；
图2显示了EV71 VP1蛋白纯化后SDS-PAGE蛋白电泳图；
图3显示了鼠IgG型单克隆抗体的效价测定的结果；
图4显示了EV71 IgG试剂盒标准曲线图。
具体实施方式
实施例1 EV71 VP1抗原制备
一、PCR引物设计，具体步骤如下：
用Primer Premier5.0设计EV71 VP1基因的两条引物，正向引物：5’-CGGGATCCGGAGATAGGGTGGCAGATGTA-3’(下划线处为BamHⅠ酶切位点)；反向引物为：5’-CGGAATCCAGTAGTGATCGCCGTGCG-3’(下划线处为EcoRⅠ酶切位点)。
二、用PCR进行目的基因的扩增，具体步骤如下：
EV71 VP1基因购自天津汇滨，全基因序列见GenBank accession No:FJ360544。扩增反应：50μL反应体系包括d NTP、PCR缓冲液、正反向引物、模板和Taq DNA聚合酶，混匀后，94℃变性5min，然后94℃变性30S、50℃退火30s、72℃延伸60s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
三、表达载体的构建，具体步骤如下：
EV71 VP1 PCR扩增产物琼脂用糖凝胶电泳回收，将扩增产物和载体p UC19用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收，用T4 DNA连接酶连接，16℃水浴过夜连接，转化感受态E.coli TOP10菌株，涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。挑取单菌落接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定。将鉴定为阳性的质粒进行测序，测序正确后保存质粒。将该阳性质粒转化到大肠杆菌表达菌株 BL21gold(DE3)感受态细胞中，并涂布到含100μg/ml氨苄青霉素，25μg/ml四环素的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆BL21gold(DE3)/Top10-VP1。
四、重组蛋白VP1的诱导表达及SDS-PAGE鉴定，具体步骤如下：
将BL21gold(DE3)/Top10-VP1接种到3ml含100μg/ml氨苄青霉素，25μg/ml四环素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。第二日，按照1:20的体积比接种至3ml含100μg/ml氨苄青霉素，25μg/ml四环素的LB液体培养基中，37℃培养2h至A600达到0.6，加入终浓度0.05mmol/L的IPTG，诱导表达4h后10000r/min离心收集菌体。收集到的菌体用700μL 0.02mol/L PBS重悬，在冰浴中进行超声破碎。超声破碎后12000r/min离心5min，取上清90μL。沉淀继续用700μL 0.02mol/L PBS重悬，混匀后取样90μL，与之前的上清各加30μL 4*SDS上样缓冲液，煮沸5min，进行SDS-PAGE检测诱导表达的蛋白。
五、蛋白的表达与纯化，具体步骤如下：
与小量诱导条件相同，将体积扩大为1L大量诱导蛋白表达，结束后将培养物4000r/min，离心20min，收集菌体。用0.02mol/L PBS缓冲液洗涤2次后重悬，冰浴中超声破碎。获得的裂解液在4℃条件下10000r/min离心15min，弃去上清，收集到的沉淀为粗制包涵体。用5ml/L Triton X-100洗涤，10000r/min离心15min，弃去上清，将沉淀用含6mol/L盐酸胍的0.02mol/L的PB(PH7.8)溶解后备用，Ni2+亲和层析柱用含6mol/L盐酸胍的0.02mol/L的PB(PH7.8)平衡，上样，分别用含50、100、200mmol/L咪唑、6mol/L盐酸胍的0.02mol/L的PB(PH7.8)洗脱，收集样品。取收集的样品90μL，加入等体积100g/L的三氯乙酸，4℃放置30min，12000r/min离心15min，弃去上清，用无水乙醇洗涤沉淀2次，加入1*SDS上样缓冲液，煮沸5min后进行SDS-PAGE分析结果。
实施例2 人源化抗EV71 VP1单克隆抗体的制备
所述抗EV71 VP1单克隆抗体，可与EV71 VP1蛋白特异性结合，用VP1包被，间接法ELISA检测显示其效价不低于1:1×10 5，所述抗体是由下述方法得到的：用EV71 VP1蛋白作为免疫原免疫小鼠，用杂交瘤融合技术制备抗EV71 VP1的单克隆抗体。将筛选获得的单克隆细胞株注射进小鼠腹腔，制备腹水，纯化腹水中的单抗。具体步骤为：
(1)杂交瘤细胞的融合和筛选
(a)收集骨髓瘤细胞，用无血清培养基洗3次(37℃)，计数；
(b)收集已免疫小鼠的脾细胞，用无血清培养基洗3次(37℃)，计数；
(c)按1:5混合骨髓瘤细胞和脾细胞，离心弃去上清，并用消毒滤纸将多余上清吸干净；
(d)将1ml 40％PEG一滴滴加入细胞团中，60S内加完，同时不断轻微转动离心管；
(e)加入1ml无血清培养基，期间不断转动离心管，60S内加完；
(f)5分钟内缓慢加完20ml无血清培养基，800r/min离心8Min，弃去上清，用10ml完全培养基悬浮，轻轻混匀，加入96孔板中，每孔50微升；
(g)将96孔板放入5％CO2培养箱中，37℃培养，24h后更换为HAT选择性培养基；
(h)7-10天后用HAT培养基半量换液，以后每隔2-3天半量换液一次，两周后改用HT培养基半量换液；
(i)2-3周后出现杂交细胞集落，待其生长至1/3孔时进行抗体检测；
(j)有限稀释法获得单克隆细胞株，检测抗体效价，将效价高的细胞扩大培养，确定阳性克隆后冻存；
(k)将上述克隆再次进行克隆化，获得的稳定的阳性克隆即为杂交瘤细胞系，保存细胞株。
(2)小鼠腹水的制备
(a)取经产小鼠腹腔注射石蜡油0.5ml/只；
(b)5天后腹腔接种杂交瘤细胞0.5*106/只，7-10天收获腹水，每只小鼠可收集几次，至小鼠死亡。腹水中加入0.01％叠氮钠，12000r/min离心10min,保留上清，测效价，进行抗体纯化、分装和保存。
(3)抗体纯化
(a)取2ml腹水，加等体积的生理盐水，再加入4ml饱和硫酸铵溶液，于4℃沉淀过夜；
(b)10000g低温离心10分钟，弃上清，将沉淀用2ml PBS溶解，缓慢滴加1ml饱和硫酸铵溶液，在4℃静置1小时；
(c)10000g低温离心10分钟，弃上清，将沉淀用1ml PBS溶解，用PBS溶液4℃透析过夜；
(d)用5-10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；
(e)用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
(f)将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；
(g)用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
(h)用2-5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，得到抗EV71VP1单克隆抗体。
(4)抗体人源化
本公司与天津汇滨生物科技有限公司合作对鼠源单克隆抗体进行人源化处理，主要包括人源化方案的设计和人源化抗体序列的获得，人源化抗体库的制备与筛选。即得到了人源化的特异针对EV71VP1的IgG抗体。
实施例3 EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒的制备
一、酶标板的制备
1、包被液的配制：
所述的EV71 VP1包被液，采用0.01M磷酸盐缓冲溶液将EV71 VP1蛋白稀释至20ng/100μL，pH7.0～pH7.4。
2、封闭液的配制：
1)所述的封闭液，采用0.01M磷酸盐缓冲溶液，其pH7.0～pH7.4；
2)将2％的脱脂奶粉加入上述溶液中，配制成封闭液。
3、酶标板的包被方法：
1)将配制的包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入50μL包被液；
2)上述酶标板置于2-8℃环境下包被8h；
3)将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入50μL封闭液，置于37℃温箱，30分钟；
4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液，37℃恒温30分钟。
二、标准品的制备(定量标准曲线的建立)
标准品的制备是将EV71 IgG抗体母液用含蛋白的PBS稀释而成，稀释浓度分别是500Au/ml，250Au/ml，125Au/ml，62.5Au/ml，31.25Au/ml。
三、酶标抗体溶液的配制
酶标抗体溶液的配制是将辣根过氧化物酶标记的兔抗人酶标抗体用HRP偶联物稳定剂以1:3000的比例稀释而成。
四、浓缩洗液(20×0.01M PBS)
浓缩洗液：氯化钠96.0份，氯化钾2.40份，十二水合磷酸氢二钠42.96份，磷酸二氢钾2.88份，吐温-20 0.05份，超纯水1000份。
五、样本稀释液
含0.5％新生牛血清的0.1M PBS，其PH为7.0～8.0
六、底物溶液(TMB)
TMB四甲基联苯胺(3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine)
七、终止液(2mol/L硫酸溶液)
将浓硫酸与超纯水1:8稀释，配制成终止液。
实施例4-9EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒的制备
分别采用下述表1的溶液将EV71 VP1蛋白稀释至20ng/100μL，分别获得pH如下表1的EV71VP1蛋白抗原包被液，其余步骤同实施例3。
表1
实施例 溶液 pH
实施例4 0.1M磷酸盐缓冲溶液 7.6-8.0
实施例5 0.2M磷酸盐缓冲溶液 7.6-8.0
实施例6 0.02M碳酸盐缓冲溶液 9.0-9.6
实施例7 0.1M碳酸盐缓冲溶液 9.0-9.6
实施例8 0.2M碳酸盐缓冲溶液 9.0-9.6
实施例9 0.05M Tris缓冲溶液 10.0-10.6
实施例10 EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒的制备
一、酶标板的制备
1、包被液的配制：
所述的EV71 VP1包被液，采用0.01M磷酸盐缓冲溶液将EV71 VP1蛋白稀释至200ng/100μL，其pH7.2～pH7.4。
2、封闭液的配制：
1)所述的封闭液，采用0.1M PBS磷酸盐缓冲溶液，其pH7.2～pH7.4；
2)将3％的脱脂奶粉加入上述溶液中，配制成封闭液。
3、酶标板的包被方法：
1)将配制的包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入100μL包被液；
2)上述酶标板置于2-8℃环境下包被12h；
3)将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入100μL封闭液，置于37℃温箱，60分钟；
4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液，37℃恒温60分钟。
二、标准品的制备(定量标准曲线的建立)
标准品的制备是将EV71 IgG抗体用含蛋白的PBS配制而成，稀释浓度分别是500Au/ml，250Au/ml，125Au/ml，62.5Au/ml，31.25Au/ml。
三、酶标抗体溶液的配制
酶标抗体溶液的配制是将辣根过氧化物酶标记的兔抗人酶标抗体用HRP偶联物稳定剂以1:10000的比例稀释而成。
四、浓缩洗液(20×0.01M PBS)
浓缩洗液：氯化钠96.0份，氯化钾2.40份，十二水合磷酸氢二钠42.96份，磷酸二氢钾2.88份，吐温-20 0.05份，超纯水1000份。
五、样本稀释液
含0.5％新生牛血清的0.1M PBS，其PH为7.0～8.0
六、底物溶液(TMB)
TMB四甲基联苯胺(3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine)
七、终止液(2mol/L硫酸溶液)
将浓硫酸与超纯水1:8稀释，配制成终止液。
实施例11-15 EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒的制备
在制备所述封闭液的过程中，采用0.1M磷酸盐缓冲溶液，其pH7.6-8.0，并分别将下述表2中的原料加入该PBS磷酸盐缓冲溶液中，制成所述封闭液，其余步骤同实施例10。
表2
实施例 原料
实施例11 5％的脱脂奶粉
实施例12 1％的BSA(牛血清白蛋白)
实施例13 2％的BSA(牛血清白蛋白)
实施例14 4％的BSA(牛血清白蛋白)
实施例15 5％的BSA(牛血清白蛋白)
实施例16 EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒的制备
一、酶标板的制备
1、包被液的配制：
将EV71 VP1用0.1M磷酸盐缓冲液(氯化钠4.25份、十二水合磷酸氢二钠15.4份、磷酸二氢钾0.95份，超纯水500份，pH7.4)稀释至1μg/100μL，配制成包被液。
2、封闭液的配制：
1)所述的封闭液，采用0.1M PBS(磷酸盐缓冲溶液)，其pH7.2～pH7.4；
2)将4％BSA(牛血清白蛋白)加入上述溶液中，配制成封闭液。
3、酶标板的包被方法：
1)将配制的包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入200μL包被液；
2)上述酶标板置于2-8℃环境下包被12h；
3)将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入200μL封闭液，置于37℃温箱，90分钟；
4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液，37℃恒温90分钟。
二、标准品的制备(定量标准曲线的建立)
标准品的制备是将EV71 IgG抗体用含蛋白的PBS配制而成，稀释浓度分别是500Au/ml，250Au/ml，125Au/ml，62.5Au/ml，31.25Au/ml。
三、酶标抗体溶液的配制
酶标抗体溶液的配制是将辣根过氧化物酶标记的兔抗人酶标抗体用HRP偶联物稳定剂以1:20000的比例稀释而成。
四、浓缩洗液(20×0.01M PBS)
浓缩洗液：氯化钠96.0份，氯化钾2.40份，十二水合磷酸氢二钠42.96份，磷酸二氢钾2.88份，吐温-20 0.05份，超纯水1000份。
五、样本稀释液
含0.5％新生牛血清的0.1M PBS，其PH为7.0～8.0
六、底物溶液(TMB)
TM B四甲基联苯胺(3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine)
七、终止液(2mol/L硫酸溶液)
将浓硫酸与超纯水1:8稀释，配制成终止液。
实施例17 EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒的制备
所述的EV71 VP1包被液，采用0.01M磷酸盐缓冲溶液将EV71 VP1蛋白稀释至2μg/100μL，其pH7.2～pH7.4，其余步骤同实施例16。
实施例18 EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒的制备
一、酶标板的制备
1、包被液的配制：
将EV71 VP1用0.1M磷酸盐缓冲液(氯化钠4.25份、十二水合磷酸氢二钠15.40份、磷酸二氢钾0.95份，超纯水500份，pH7.4)稀释至2μg/100μL，配制成包被液。
2、封闭液的配制：
1)所述的封闭液，采用0.1M PBS(磷酸盐缓冲溶液)，其pH7.2～pH7.4；
2)将4％BSA(牛血清白蛋白)加入上述溶液中，配制成封闭液。
3、酶标板的包被方法：
1)将配制的包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入200μL包被液；
2)上述酶标板置于2-8℃环境下包被16h；
3)将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入200μL封闭液，置于37℃温箱，90分钟；
4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液，37℃恒温90分钟。
二、标准品的制备(定量标准曲线的建立)
标准品的制备是将EV71 IgG抗体用含蛋白的PBS配制而成，稀释浓度分别是500Au/ml，250Au/ml，125Au/ml，62.5Au/ml，31.25Au/ml。
三、酶标抗体溶液的配制
酶标抗体溶液的配制是将辣根过氧化物酶标记的兔抗人酶标抗体用HRP偶联物稳定剂以1:10000的比例稀释而成。
四、浓缩洗液(20×0.01M PBS)
浓缩洗液：氯化钠96.0份，氯化钾2.40份，十二水合磷酸氢二钠42.96份，磷酸二氢钾2.88份，吐温-20 0.05份，超纯水1000份。
五、样本稀释液
含0.5％新生牛血清的0.1M PBS，其PH为7.0～8.0
六、底物溶液(TMB)
TMB四甲基联苯胺(3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine)
七、终止液(2mol/L硫酸溶液)
将浓硫酸与超纯水1:8稀释，配制成终止液。
实施例19 EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒的制备
在制备所述样本稀释液的过程中，采用下表3中不同浓度的PBS磷酸盐缓冲溶液，其pH7.6-8.0，并分别将下述表3中的原料加入相对应的PBS磷酸盐缓冲溶液中，制成所述样本稀释液，其余步骤同实施例18。
表3
实施例 原料 缓冲液
实施例19 1％新生牛血清 0.01M PBS
实施例20 0.5％BSA(牛血清白蛋白) 0.1M PBS
实施例21 1％BSA(牛血清白蛋白) 0.01M PBS
实施例22 1％脱脂奶粉 0.1M PBS
实施例23 EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒检测步骤
1)取出已预包被抗原的96孔酶标板；
2)配制工作洗涤液：浓缩洗液稀释20×(1份浓缩洗液(20×0.01M PBS)加19份的无 菌去离子水或超纯水)；
3)样本稀释：分别设标准曲线组、待测样品组，其中
标准曲线组：各标准曲线点(31.25Au/ml～500Au/ml)
待测样本组：样本稀释液稀释后的待测样本
将两组分别加入酶标板孔中，每孔加入50μL，在37℃下孵育20min；
4)洗涤：甩掉反应液，每孔每次加入不少于300μL的洗液，静置40s后拍干，重复上述洗涤操作，共洗涤3次；
5)加入酶标抗体：洗涤结束后，每孔加入羊抗兔酶标抗体50μL，在37℃下孵育20min；
6)洗涤：同步骤4)；
7)显色：洗涤结束后，每孔加入底物溶液50μL，在37℃孵育15min，避光；
8)终止：每孔内加入50μL终止液，混匀后，在OD450nm处读数；
9)结果判断：在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值，根据计算软件绘制的半对数标准曲线和方程，即可自动计算出各待测样品中EV71 IgG抗体的浓度值。
实施例24 EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒检测步骤
1)取出已预包被抗原的96孔酶标板；
2)配制工作洗涤液：浓缩洗液稀释20×(1份浓缩洗液(20×0.01M PBS)加19份的无菌去离子水或超纯水)；
3)样本稀释：分别设标准曲线组、待测样品组，其中
标准曲线组：各标准曲线点(31.25Au/ml～500Au/ml)
待测样本组：样本稀释液稀释后的待测样本
将两组分别加入酶标板孔中，每孔加入80μL，在37℃下孵育40min；
4)洗涤：甩掉反应液，每孔每次加入不少于300μL的洗液，静置40s后拍干，重复上述洗涤操作，共洗涤3次；
5)加入酶标抗体：洗涤结束后，每孔加入羊抗兔酶标抗体80μL，在37℃下孵育30min；
6)洗涤：同步骤4)；
7)显色：洗涤结束后，每孔加入底物溶液80μL，在37℃孵育15min，避光；
8)终止：每孔内加入50μL终止液，混匀后，在OD450nm处读数；
9)结果判断：在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值，根据计算软件绘制的半对数标准曲线和方程，即可自动计算出各待测样品中EV71 IgG抗体的浓度值。
实施例25 EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒检测步骤
1)取出已预包被抗原的96孔酶标板；
2)配制工作洗涤液：浓缩洗液稀释20×(1份浓缩洗液(20×0.01M PBS)加19份的无菌去离子水或超纯水)；
3)样本稀释：分别设标准曲线组、待测样品组，其中
标准曲线组：各标准曲线点(31.25Au/ml～500Au/ml)
待测样本组：样本稀释液稀释后的待测样本
将两组分别加入酶标板孔中，每孔加入100μL，在37℃下孵育60min；
4)洗涤：甩掉反应液，每孔每次加入不少于300μL的洗液，静置40s后拍干，重复上述洗涤操作，共洗涤3次；
5)加入酶标抗体：洗涤结束后，每孔加入羊抗兔酶标抗体100μL，在37℃下孵育40min；
6)洗涤：同步骤4)；
7)显色：洗涤结束后，每孔加入底物溶液100μL，在37℃孵育15min，避光；
8)终止：每孔内加入50μL终止液，混匀后，在OD450nm处读数；
9)结果判断：在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值，根据计算软件绘制的半对数标准曲线和方程，即可自动计算出各待测样品中EV71 IgG抗体的浓度值。
实施例26 EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒检测步骤
1)取出已预包被抗原的96孔酶标板；
2)配制工作洗涤液：浓缩洗液稀释20×(1份浓缩洗液(20×0.01M PBS)加19份的无菌去离子水或超纯水)；
3)样本稀释：分别设标准曲线组、待测样品组，其中
标准曲线组：各标准曲线点(31.25Au/ml～500Au/ml)
待测样本组：样本稀释液稀释后的待测样本
将两组分别加入酶标板孔中，每孔加入150μL，在37℃下孵育90min；
4)洗涤：甩掉反应液，每孔每次加入不少于300μL的洗液，静置40s后拍干，重复上述洗涤操作，共洗涤3次；
5)加入酶标抗体：洗涤结束后，每孔加入羊抗兔酶标抗体150μL，在37℃下孵育60min；
6)洗涤：同步骤4)；
7)显色：洗涤结束后，每孔加入底物溶液150μL，在37℃孵育15min，避光；
8)终止：每孔内加入50μL终止液，混匀后，在OD450nm处读数；
9)结果判断：在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值，根据计算软件绘制的半对数标准曲线和方程，即可自动计算出各待测样品中EV71 IgG抗体的浓度值。
实施例27 试剂盒的临床应用(应用了实施例14的试剂盒和实施例25的检测步骤)EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒参考值的确定
临床确诊为手足口病阳性样本30例，同时检测正常人样本200例，测定OD450值，根据标准曲线(表4，图4)计算抗原浓度值(表5)，最终确定参考值判断标准(表6)。
表4检测标准曲线
抗原浓(Au/mL) OD450
500 1.826
250 0.973
125 0.483
62.5 0.251
31.25 0.141
表5 EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒参考值的确定ELISA临床检测结果
注：*表示与正常人比较P<0.01；
表6
阳性 疑似 阴性
抗体浓度≥120Au/ml 80Au/ml<抗体浓度<120Au/ml 抗体浓度<80Au/ml
如果样本的检测结果落在可疑区间，则需要进行第二次检测。
根据标准曲线的结果计算检测抗体的浓度，通过检测200例正常人样本，取95％置信区间的抗体的浓度值为Cut-off上限：x(平均值)+2s(标准偏差)＝50.82+2*14.59＝80，通过检测30例阳性病人，取95％置信区间的抗体的浓度值为Cut-off下限：x(平均值)－2s(标准偏差)＝189.35－2*34.68＝120，抗体的浓度值在80Au/ml～120Au/ml之间为疑似病人。
实施例28 试剂盒的方法学考察(应用了实施例14的试剂盒和实施例25的检测步骤)
1、敏感性实验
收集临床确诊样本20例进行检验。
诊断敏感性＝阳性样本检出例数/阳性样本总例数×100％，由实验结果见表7，说明本实验的敏感性在85％以上。
表7敏感性检测实验结果
2、特异性实验
检测20例健康人样本。特异性＝阴性样本检出例数/阴性样本总例数×100％，由实验结果见表8，说明本实验的敏感性在90％以上。
表8特异性检测实验结果
3、回收率实验
选择正常人血液添加EV71 IgG抗体300Au/ml、200Au/ml后检测，计算真实值与期望值的比值，得到回收率，见表9。回收率介于80-120％之间认为合格。由实验结果说明本实验的回收率介于80％-120％之间，回收率良好。
表9回收率结果实验
4、批内精密度
合格标准：将同一标本在同一批次实验中平行测定10组数据。计算其均值M、标准差SD与变异系数CV，变异系数CV≤15％为合格，见表10。本产品批内精密度(即变异系数CV)为5.3％，小于15％，符合标准，验证合格。
表10批内精密度结果实验
5、稳定性实验
将组装好的试剂盒在37℃环境中放置，每天做标准曲线检测已知浓度的抗体溶液，连续检测5天，检测值变化率(即变异系数CV)小于20％，见表11，证明试剂盒稳定。其结果显示5天的变异系数CV≤20％，说明本发明稳定性良好。
表11稳定性试验结果
上述参照具体实施方式对该一种EV71 IgG抗体免疫检测试剂盒及其制备方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种检测EV71病毒IgG抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于：包括EV71 VP1蛋白包被的酶标板和辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的检测EV71病毒IgG抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于：还包括EV71 IgG抗体标准品、辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG酶标抗体、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液。
3.根据权利要求2所述的检测EV71病毒IgG抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于：所述抗EV71病毒IgG抗体标准品为若干浓度不同的抗EV71病毒IgG抗体溶液，其中EV71 IgG抗体标准品a的浓度为500Au/ml、EV71 IgG抗体标准品b的浓度为250Au/ml、EV71 IgG抗体标准品c的浓度为125Au/ml、EV71 IgG抗体标准品d的浓度为62.5Au/ml、EV71 IgG抗体标准品e的浓度为31.25Au/ml。
4.根据权利要求2所述的检测EV71病毒IgG抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体溶液是将辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体用HRP偶联物稳定剂以1:3000～1:20000的比例稀释而成。
5.根据权利要求2所述的检测EV71病毒IgG抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗液由下述组分配制而成：按重量份数计，氯化钠96.0份，氯化钾2.40份，十二水合磷酸氢二钠42.96份，磷酸二氢钾2.88份，吐温-200.05份，超纯水1000份。
6.根据权利要求2所述的检测EV71病毒IgG抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于：所述样本稀释液为含BSA的PBS(磷酸盐缓冲液)。
7.根据权利要求2所述的检测EV71病毒IgG抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于：所述底物溶液为TMB溶液。
8.根据权利要求2所述的检测EV71病毒IgG抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于：所述终止液为2mol/L硫酸溶液。
9.权利要求1-8任一项所述的检测EV71病毒IgG抗体的免疫检测试剂盒在检测EV71病毒浓度方面的应用。
10.根据权利要求1-8任一项所述的检测EV71病毒IgG抗体的免疫检测试剂盒的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备酶标板
(a)EV71VP1包被液的配制：采用以下缓冲溶液将EV71VP1稀释至10ng/100μL～2μg/100μL：0.01M～0.2M PBS(磷酸盐缓冲溶液)，其pH7.0～pH8.0；0.02～0.2M CBS(碳酸盐缓冲溶液)，其pH9.0～pH9.6；0.01mol/L Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液)，其pH10.0～pH10.6；
(b)封闭液的配制：将2％～5％的脱脂奶粉或者1％～5％BSA(牛血清白蛋白)加入下述缓冲溶液中，配制成封闭液：缓冲溶液，0.01M～0.2M PBS(磷酸盐缓冲溶液)，其pH7.0～pH8.0；
(c)包被酶标板：
①将配制的EV71VP1包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入50μL～200μL包被液；
②酶标板置于2-8℃环境下包被8～16h；
③将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入50μL～200μL封闭液，置于37℃温箱，30～90分钟；
④从温箱取出酶标板后弃去封闭液，37℃恒温30～90分钟，即得；
(2)标准品的制备(定量标准曲线的建立)
标准品的制备是将EV71VP1用人工血清配制而成，稀释浓度分别是500Au/ml，250Au/ml，125Au/ml，62.5Au/ml，31.25Au/ml；
(3)酶标抗体溶液的配制：将辣根过氧化物酶标记的羊抗人酶标抗体用HRP偶联物稳定剂以1:3000～1:20000的比例稀释而成；
(4)浓缩洗液(20×0.01M PBS)的配制：按重量份数称取氯化钠96.0份，氯化钾2.40份，十二水合磷酸氢二钠42.96份，磷酸二氢钾2.88份，吐温-20 0.05份，超纯水1000份；
(5)样本稀释液为：含0.5％新生牛血清的0.1M PBS，其PH为7.0-8.0；含1％新生牛血清的0.01M PBS，其PH为7.0-8.0；含0.5％BSA(牛血清白蛋白)的0.1M PBS，其PH为7.0-8.0；含1％BSA(牛血清白蛋白)的0.01M PBS，其PH为7.0-8.0；含1％脱脂奶粉的0.1M PBS，其PH为7.0-8.0；
(6)底物溶液为：TMB(四甲基联苯胺)；
(7)终止液的配制：将浓硫酸与超纯水1:8稀释，配制成2mol/L硫酸溶液的终止液。
11.根据权利要求1-8任一项所述的检测EV71病毒IgG抗体的免疫检测试剂盒检测EV71IgG抗体浓度的应用为间接ELISA方法，具体步骤如下：
(1)将待检测物用样本稀释液稀释，优选的稀释比例为1:300-1:1000；
(2)将步骤(1)所得的待测样本加入EV71VP1蛋白包被的酶标板中孵育20～90min，孵育后洗板；
(3)向步骤(2)酶标板中加入兔抗人酶标抗体并孵育20～90min，孵育后洗板；
(4)向步骤(3)的酶标板中加入TMB显色15min，加入终止液后进行检测，于酶标仪上读取450nm处的吸光光度值。
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