CN105906714A - 一种布鲁氏菌病特异性融合蛋白抗原的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种布鲁氏菌病特异性融合蛋白抗原，是将布鲁氏菌外膜蛋白BP26、OMP31、OMP16、OMP2b优势抗原表位的氨基酸序列进行串联，构建了融合蛋白基因，插入pET‑28b中，在大肠杆菌BL21(DE3)表达的融合蛋白，在构象上接近天然蛋白，并保持了天然蛋白的抗原性与可溶性，并以其为诊断抗原制备了人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒。该试剂盒克服了传统病原学诊断分离培养增菌时间长、容易对环境造成污染和传染人的不足，同时可改善传统免疫学方法交叉反应严重的缺点。该检测方法具有特异性强、重复性好、灵敏度高的优点，为布鲁氏菌病的快速、准确、特异诊断提供手段，也为布鲁氏菌病患者的早诊断、早治疗提供依据。

Description

一种布鲁氏菌病特异性融合蛋白抗原的制备及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术和免疫学领域。具体涉及一种布鲁氏菌特异性融合蛋白抗原及其在布鲁氏菌病诊断试剂盒中的应用。
背景技术
布鲁氏菌病（Brucellosis），也称波状热，是由布鲁氏菌（Brucella）侵入机体，引起的急性或慢性传染病，属人兽共患传染病。目前，全球有 160 多个国家和地区发现布鲁氏菌病的流行，每年有超过 50 万的布鲁氏菌病新发病例的报道。我国在 1989 年制定的《中华人民共和国传染病防治法》将布鲁氏菌病列为法定传染病，从 2004 年实施传染病网络直报以来，发现布鲁氏菌病的发病率呈现出逐年增高的趋势，并已经波及到 31 个省市、自治区和直辖市，其中以山西省、吉林省、黑龙江省和内蒙古自治区最为严重。2009 年我国农业部将布鲁氏菌病收录《人畜共患传染病名录》，要求各级卫生组织加强对其监督和检测。
布鲁氏菌是一种胞内寄生、兼性厌氧的革兰氏阴性短小杆菌，根据其易感染宿主的不同，分为羊型布鲁菌（B.melitensis）、牛型布鲁菌（B.abortus）、猪型布鲁菌（B.suis）、绵羊型布鲁菌（B.ovis）、犬型布鲁菌（B.canis）、沙林鼠型布鲁菌（B.neotomae）等，我国以羊型布鲁菌感染最为常见，其次是牛型布鲁菌和猪型布鲁菌感染。
布鲁氏菌可通过多种途径感染人体，接触带菌的羊、牛、猪等牲畜，进食感染布鲁氏菌的奶及奶制品、肉及肉制品等，均导致发病。人布鲁氏菌病的主要临床表现为波浪热或马耳他热、多汗、乏力、关节痛、神经痛、肝脾肿大等，慢性病例多表现为肌痛、关节痛、长期低热、寒颤或寒意、胃肠道症状等，严重损伤身体，丧失工作能力。布鲁氏菌病还可引起脑膜炎、心内膜炎、深静脉血栓、睾丸炎、流产等并发症。布鲁氏菌病的自然病程长短不一，短则1 个月，长则可达数年，经有效治疗后，多数患者可于 3～6 个月康复，且预后良好。但如果布鲁氏菌患者得不到及时诊断和治疗，该病会严重影响患者的身体健康和生活质量。因此，对布鲁氏菌病进行早期、快速、准确诊断，是控制布鲁氏菌病、改善患者预后的首要任务。
现有对布鲁氏菌病的临床诊断方法，主要是血清学诊断、病原学诊断和分子生物学诊断。血清学诊断方法主要包括血清凝集试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，其中虎红平板凝集试验（RBPT）和试管凝集试验（SAT）是临床上布鲁氏菌病诊断的指定试验，具有操作简便、价廉等优点，但易受环境温度和凝集时间的影响较大，容易出现假阳性结果。ELISA方法具有敏感、稳定、简单等优点，但传统的ELISA方法采用全菌或脂多糖作为抗原对血清中的抗体进行检测，而全菌的成分复杂，所含有的脂多糖等成分与其他菌存在交叉反应，影响特异性。病原学诊断方法被认为是布鲁氏菌病诊断的金标准，但该方法需要先对病原菌分离后再进行鉴定，操作繁琐、耗时长，一般需要 2 周左右，同时由于布鲁氏菌病的传染性较强，对检测环境和检测人员的防护要求比较严格，需要在相应生物安全级别的实验室中进行，一般的实验室和医院受实验室条件限制很难进行。分子生物学检测方法主要包括基因芯片、PCR 等方法，其能从基因水平实现对病原菌进行检测，灵敏度高，特异性好，但在布鲁氏菌病诊断方面仍处于实验室研究阶段。因此，开发新型、快速、准确、特异的布鲁氏菌病诊断方法仍然十分必要。
融合蛋白技术是采用基因工程的原理和方法，为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达技术，利用该技术可以构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白，目前该技术已广泛应用于DNA疫苗、多功能酶、定向药物等的研究中。布鲁氏菌的外膜蛋白主要起着结构支撑、抗原保护及免疫原性的作用。已发现的布鲁氏菌外膜蛋白根据分子量大小可分为三组，第一组外膜蛋白包括 OMP10、OMP16 和 OMP19 ，第二组外膜蛋白包括 OMP2a 和 OMP2b，第三组外膜蛋白包括 OMP25 和OMP31，其中第二组和第三组外膜蛋白的基因排列因布鲁氏菌的种属和宿主的不同而不同。因此，可利用融合蛋白技术将我国常见且高发的羊型、猪型、牛型布鲁氏菌共有的外膜蛋白上的优势抗原表位进行融合，利用融合蛋白技术制备出布鲁氏菌病新型诊断抗原，这种抗原既能够提高诊断的准确度，还能够避免传统的全菌抗原（或脂多糖抗原）的交叉性严重以及在制备过程中存在潜在生物危害的缺陷，这对布鲁氏菌病的诊断具有重要的意义。
本研究拟利用生物信息学技术对羊型、牛型、猪型布鲁氏菌的优势外膜蛋白进行筛选，并对外膜蛋白上的B细胞抗原表位进行预测，将优势抗原表位进行串联，利用分子生物学技术构建能够特异性识别布鲁氏菌病抗体的融合蛋白氨基酸序列，并进行融合蛋白的表达。将表达的融合蛋白作为一种新型抗原，用于布鲁氏菌病的诊断。
发明内容
本发明为了解决传统的ELISA方法采用全菌作为抗原对血清中的抗体进行检测时，与其它菌存在交叉反应的问题，而提供一种布鲁氏菌病特异性融合蛋白抗原。
一种布鲁氏菌病特异性融合蛋白抗原，它的氨基酸序如序列表SQ ID No.1所示。
一种布鲁氏菌病特异性融合蛋白抗原基因，它的碱基序如序列表SQ ID No.2所示。
一种原核表达载体，它是在含有T7启动子的原核融合蛋白表达载体中插入了如序列表SQ ID No.2所示的基因；
所述原核表达载体为pET-28b。
一种大肠杆菌工程菌，它是转染了上述原核表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)。
一种布鲁氏菌病的检测试剂盒，它的诊断抗原为上述的一种布鲁氏菌病特异性融合蛋白抗原；
所述的检测试剂盒为人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒。
本发明提供了一种布鲁氏菌病特异性融合蛋白抗原，是利用布鲁氏菌的优势外膜蛋白BP26、OMP31、OMP16、OMP2b的氨基酸序列，采用Bepipred Linear EpitopePrediction、ABCpred prediction Server、COBEpro 等软件对羊型、牛型、猪型布鲁氏菌的抗原表位进行预测，在相邻表位之间加入一段连接肽序列，优化抗原表位及连接肽序列，反推密码子，并进行原核表达密码子优化，进行串联构建了融合蛋白基因，插入pET-28b中，在大肠杆菌BL21(DE3)表达的融合蛋白，在构象上接近天然蛋白，并保持了天然蛋白的抗原性与可溶性，并以其为诊断抗原制备了人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒。
特异性交叉实验显示，人大肠埃希菌、人肺炎克雷伯杆菌、人阴沟肠杆菌、人金黄色葡萄球菌、人表皮葡萄球菌、人凝固酶阴性葡萄球菌、人沙门氏菌、人草绿色链球菌、人唾液链球菌、人皮氏罗尔斯顿菌阳性血清与阴性血清的OD450值的比值均小于2.1，而人布鲁氏菌阳性血清与阴性血清的OD450值的比值为3.993，大于2.1，表明建立的人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒特异性很好。
重复试验显示，板内变异系数在1.81%~9.52%，板间变异系数在3.97%~9.07%，均小于10%，表明建立的人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒重复性良好。
特异性阻断试验结果显示，阳性血清的阻断率为71.56%，阴性血清的阻断率为1.11%。表明布鲁氏菌多表位融合蛋白能与人布鲁氏菌阳性血清特异性识别并发生中和反应。
在191份收集的待测血清中，利用试管凝集试验检测人布鲁氏菌病抗体阳性的有124份，阴性的有67份，124份阳性血清中，采用人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒检测阳性的有111份，阳性符合率为89.52%，67份阴性血清中，采用人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒检测阴性的有65份，阴性符合率为97.01%，总符合率为92.15%，两种检测方法的符合率较高，说明本研究建立的人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒能够准确的用于人布鲁氏菌病的临床诊断。
本研究建立的人布鲁氏菌抗体ELISA试剂盒克服了传统病原学诊断分离培养增菌时间长、容易对环境造成污染和传染人的缺点，还能够改善传统免疫学方法交叉反应严重、全菌抗原在制备过程中存在危险性的不足，具有特异性强、重复性好、灵敏度高的优点，为布鲁氏菌病的快速、准确、特异诊断提供手段，也为布鲁氏菌病患者的早诊断、早治疗提供依据。
附图说明
图1布鲁氏菌多表位融合蛋白免疫学信息预测结果；
图2布鲁氏菌多表位融合蛋白空间结构预测模型；
图3布鲁氏菌多表位融合蛋白表达条件的优化结果（M为蛋白质Marker； 1为诱导前全菌；2为20℃ 220r/min诱导12h收集的上清，3为20℃ 220r/min诱导12h收集的沉淀；4为37℃ 220r/min 诱导5h收集的上清；5为37℃ 220r/min 诱导5h收集的沉淀）；
图4布鲁氏菌多表位融合蛋白表达SDS-PAGE鉴定结果（M为蛋白质Marker； 1为布鲁氏菌多表位融合蛋白）；
图5 布鲁氏菌多表位融合蛋白表达Western Blot鉴定结果（M为蛋白质Marker； 1为布鲁氏菌多表位融合蛋白）；
图6 布鲁氏菌多表位融合蛋白的蛋白含量测定标准曲线；
图7 Western blot测定布鲁氏菌多表位融合蛋白免疫原性（M为蛋白质marker；1为人布鲁氏菌病阳性血清；2为阴性血清）。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施中未注明具体条件的实验方案，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1 布鲁氏菌多表位融合基因的设计及质粒的构建
从Pubmed数据库中调取布鲁氏菌的优势外膜蛋白的氨基酸序列，采用BepipredLinear Epitope Prediction、ABCpred prediction Server、COBEpro 等软件对布鲁氏菌的抗原表位进行预测，选择优势抗原表位，在相邻表位之间加入一段连接肽序列，采用DNAStar对抗原表位的串联顺序和连接肽的选择进行优化，选择的α螺旋、β折叠少、亲水性和抗原性好的序列作为目的氨基酸序列，用于下一步布鲁氏菌多表位融合蛋白的表达及布鲁氏菌病诊断用ELISA检测试剂盒的制备。
采用DNAStar对所设计的布鲁氏菌多表位融合蛋白的α螺旋、β折叠、柔性、亲水性、抗原性等免疫学参数进行预测，结果见附图1，采用I-TASSER对融合蛋白的分子模型进行预测，结果见附图2。根据设计布鲁氏菌多表位融合蛋白的氨基酸序列进行密码子优化，人工合成或PCR方法构建融合蛋白基因序列如SEP ID NO.2所示，将所构建的融合蛋白基因连接于PET-28b载体的多克隆酶切位点处。
上述步骤中的优势外膜蛋白为布鲁氏菌BP26、OMP31、OMP16和OMP2b。
上述步骤中的抗原表位见表1。
上述连接肽序列Linker的编码 “GGGS”。
实施例2 布鲁氏菌多表位融合蛋白的表达条件的优化
表达宿主菌大肠杆菌BL21（DE3）菌种由吉林大学公共卫生学院卫生检验教研室保存；含布鲁氏菌多表位融合蛋白的表达载体PET-28b质粒由实施例1中构建；各种分子生物学试剂均购于生物试剂公司。
将实施例1中获得的PET-28b质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）表达菌，42℃热击90s，冰上静置2min后涂LA平板（含30μg/mL卡那霉素），37℃培养过夜。挑取表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）的单个菌落于LB培养基（含30μg/mL卡那霉素）中，37℃，220r/min培养过夜。次日将过夜培养物与新鲜LB培养基（含30μg/mL卡那霉素）按体积比1:100扩大培养，当菌液的OD600达到0.6左右时，添加终浓度为0.2mmol/L的IPTG，诱导条件分别为20℃，220r/min诱导12h；37℃，220r/min 诱导5h；同时设定未添加IPTG诱导剂的作为阴性对照。收集菌液，12000r/min离心10min，收集菌体。采用SDS-PAGE检测布鲁氏菌多表位融合蛋白的表达量，结果如附图3所示。结果显示，诱导条件为20℃，220r/min诱导12h时，诱导的表达宿主菌经超声裂解后在沉淀与上清中均有表达，且表达量最高，即20℃，220r/min诱导12h是布鲁氏菌多表位融合蛋白的最佳表达条件。之后按照此条件对布鲁氏菌多表位融合蛋白进行大量表达。
为了获得可溶性的布鲁氏菌多表位融合蛋白，将收集的菌体用破碎缓冲液（7mol/L 盐酸胍，50mmol/L Tris，300mmol/LNaCl，0.1% Trition X-100，DNase Ⅰ，RNase，溶菌酶，pH=8.0）重悬后，冰浴中超声破碎菌体，超声功率为400W，超声3s，暂停5s为一个循环，共进行150个循环；超声后，12000rpm，4℃离心20min，取上清，上清中即含有布鲁氏菌可溶性多表位融合蛋白。
实施例3 布鲁氏菌多表位融合蛋白的纯化
取上述实施例2超声破碎后的细菌上清液，所述细菌上清液中含有布鲁氏菌可溶性多表位融合蛋白，采用镍琼脂糖亲和层析和阴离子交换层析对细菌上清液中的布鲁氏菌可溶性多表位融合蛋白进行纯化，纯化液和纯化方法按试剂盒的说明书进行，将收集的纯化蛋白液用超滤离心管进行离心浓缩，然后置于4℃、-20℃、-80℃保存。将纯化后的布鲁氏菌多表位融合蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western Blot检测，结果如附图4和附图5所示，所表达的融合蛋白分子量介于60KD和75KD之间，条带清晰且没有杂带。经SK3071非干扰型蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，标准曲线见附图6经计算，纯化后的蛋白浓度为0.76mg/mL。
实施例4 布鲁氏菌多表位融合蛋白免疫原性检测
可溶性的布鲁氏菌多表位融合蛋白免疫原性检测采用Western Blot法，具体步骤如下：按最优化条件表达的可溶性布鲁氏菌多表位融合蛋白，进行SPDS-PAGE，将电泳后的凝胶转移至PVDF膜上，150mA转印40min，取出PVDF膜，以含5%脱脂奶粉的TBST溶液4℃封闭过夜，次日，以1:100稀释的人布鲁氏菌病阳性血清和阴性血清在室温中摇动孵育1h，TBST溶液摇动洗膜三次，每次10min，随后加入1:2000稀释的山羊抗人IgG于室温摇动孵育1h，TBST洗膜三次，用吸水纸略吸取过多的液体，于暗室中将PVDF膜与超敏发光液充分接触5min，将膜固定于暗盒内，蛋白面朝上，放入胶片，压片曝光数分钟，将胶片放入显影液中观察显影情况，待目的条带清晰可见时，将胶片放入定影液中定影，流水冲洗胶片，然后将胶片干燥保存，结果如附图6示，所制备的布鲁氏菌多表位融合蛋白疫苗能够很好的识别人布鲁氏菌病阳性血清，而对阴性血清则没有明显的反应。
实施例5 布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原ELISA检测试剂盒的制备
间接ELISA法检测人布鲁氏菌病的具体步骤如下：
（1）抗原包被酶标反应板：取实施例2获得的纯化的布鲁氏菌多表位融合蛋白，以100μL/孔包被于酶标板中，PBST洗板3次，每次3min，拍干；
（2）加入封闭液，300μL/孔进行封闭，同上洗板；
（3）加入待检人血清，100μL/孔，同上洗板；
（4） 加入工作浓度的HRP标记的山羊抗人IgG,，100μL/孔，同上洗板；
（5）加入TMB底物显色液，100μL/孔，室温避光反应；
（6）加入终止液（2mol/L H2SO4），50μL/孔；
（7）酶标仪读取OD450值。
为了获得最佳的检测效果，对间接ELISA反应条件进行优化，选择P/N值最大者作为最佳反应条件。
ELISA方法的反应条件优化
（1）最佳抗原包被浓度及血清稀释度
将实施例3获得的纯化后的布鲁氏菌多表位融合蛋白分别作10.0μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL稀释，包被于酶标反应板中，4℃过夜；人布鲁氏菌病阳/阴性血清分别作1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200稀释，每个浓度设4个重复，酶标仪读取OD450值后取平均值，结果如表2所示。选择P/N值最大者作为最佳抗原包被浓度及血清稀释度。
由表2可知，当布鲁氏菌多表位融合蛋白的包被浓度为2.5μg/mL，血清的稀释度为1:400时效果最佳。
（2）最佳抗原包被条件
分别在4℃过夜、37℃孵育2h和37℃孵育1h三种条件下包被布鲁氏菌多表位融合蛋白，同时设置人布鲁氏菌病阳性和阴性血清，各4复孔，酶标仪读取OD450值后取平均值，结果如表3所示。选择P/N值最大者作为最佳抗原包被条件。
由表3可知，37℃孵育1h包被布鲁氏菌多表位融合蛋白为最佳抗原包被条件。
（3）最佳封闭液、封闭时间选择
分别选择0.1%BSA、0.5%BSA、1%BSA、1%脱脂奶粉、5%脱脂奶粉和5%胎牛血清作为封闭液，选择37℃孵育1h和2h作为封闭时间，同时设置人布鲁氏菌病阳性和阴性血清，各4复孔，酶标仪读取OD450值后取平均值，结果如表4所示。选择P/N值最大者作为最佳封闭液和封闭时间。
由表4可知， 1%脱脂奶粉为最佳封闭液、37℃孵育1h为最佳封闭时间。
（4）最佳血清反应时间
分别选择30min、60min、90min和120min作为待测血清的反应时间，同时设置人布鲁氏菌病阳性和阴性血清，每个血清反应时间每种血清均设置4个重复，酶标仪读取OD450值后取平均值，结果如表5所示。选择P/N值最大者作为最佳封闭液和封闭时间。
由表5可知，待测血清的最佳反应时间为90min。
（5）最佳酶标抗体稀释度和反应时间
将酶标抗体（Thermo fisher公司的HRP山羊抗人IgG，浓度为1mg/mL）分别作1:5000、1:10000、1:15000和1:20000浓度稀释，同时设置人布鲁氏菌病阳性和阴性血清，每个浓度每种血清均设置4个重复，酶标仪读取OD450值后取平均值，结果如表6所示。设置酶标抗体的反应时间为30min、60min、90min和120min，设置人布鲁氏菌病阳性和阴性血清，各4个重复，酶标仪读取OD450值后取平均值，结果如表7所示。选择P/N值最大者作为最佳酶标抗体稀释度和反应时间。
由表6、表7可知，酶标抗体的最佳稀释度为1:5000，最佳反应时间为30min。
（6）最佳底物显色时间
分别选择5min、10min、15min和20min作为底物显色时间，同时设置人布鲁氏菌病阳性和阴性血清，每个底物显色时间每种血清均设置4个重复，酶标仪读取OD450值后取平均值，结果如表8所示。选择P/N值最大者作为最佳封闭液和封闭时间。
由表8可知，最佳底物显色时间为20min。
根据以上优化条件建立的人布鲁氏菌病抗体的间接ELISA试剂盒，具体为：将纯化后的布鲁氏菌多表位融合蛋白以浓度2.5μg/mL用PBS缓冲液稀释，按每孔100μL包被于酶标反应板中，37℃孵育1h，PBST洗板3次，以1%脱脂奶粉300μL/孔37℃封闭1h，PBST洗板3次，血清以1:400稀释度稀释后按100μL/孔加入酶标反应板，37℃孵育1.5h，PBST洗板3次，HPR标记的山羊抗人IgG以1:5000稀释后按100μL/孔加入酶标反应板，37℃孵育0.5h，PBST洗板3次，加入100μL/孔显色液，室温避光显色20min，加入50μL/孔终止液，酶标仪读取OD450值。
根据上述间接ELISA方法的优化条件，对检测人布鲁氏菌病抗体的ELISA试剂盒进行评价：
（1）特异性交叉实验
用建立的人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒检测人大肠埃希菌、人肺炎克雷伯杆菌、人阴沟肠杆菌、人金黄色葡萄球菌、人表皮葡萄球菌、人凝固酶阴性葡萄球菌、人沙门氏菌、人草绿色链球菌、人唾液链球菌、人皮氏罗尔斯顿菌阳性血清，设置人布鲁氏菌阳性、阴性血清对照，每个血清设置4个重复，酶标仪读取OD450值后取平均值，结果如表9所示。
结果显示，人大肠埃希菌、人肺炎克雷伯杆菌、人阴沟肠杆菌、人金黄色葡萄球菌、人表皮葡萄球菌、人凝固酶阴性葡萄球菌、人沙门氏菌、人草绿色链球菌、人唾液链球菌、人皮氏罗尔斯顿菌阳性血清与阴性血清的OD450值比值均小于2.1，而人布鲁氏菌阳性血清与阴性血清的OD450值比值大于2.1，表明建立的人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒特异性很好。
（2）特异性阻断实验
将布鲁氏菌多表位融合蛋白稀释至10μg/mL，与人布鲁氏菌病阳性血清以400:1进行混合，37℃中和反应1h，用建立的人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒进行检测，设置阴性血清对照，每个血清设置3个重复，酶标仪读取OD450值后取平均值，计算阻断率，结果如表10所示。
结果显示，阳性血清的阻断率为71.56%，阴性血清的阻断率为1.11%，表明布鲁氏菌多表位融合蛋白能与人布鲁氏菌阳性血清特异性识别并发生中和反应。
（3）重复性实验
用同一批次纯化的布鲁氏菌多表位融合蛋白包被同一块酶标反应板，检测8份布鲁氏菌病阳性血清的OD450值，每份血清设置4个重复，检测其板内变异系数，结果如表11所示。将同一批次纯化的布鲁氏菌多表位融合蛋白包被与3块酶标反应板中，检测检测8份布鲁氏菌病阳性血清的OD450值，每份血清设置4个重复，检测其板间变异系数，结果如表11所示。
结果显示，板内变异系数在1.81%~9.52%，板间变异系数在3.97%~9.07%，均小于10%，表明建立的人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒重复性良好。
（4）阳性阈值确定
用布鲁氏菌多表位融合蛋白包被酶标反应板，检测40份阴性血清的OD450值，计算cut-off值，40份阴性血清检测结果如表12所示。
结果显示：阳性阈值为0.238+3×0.050=0.388。
（5）灵敏度检测
取8份布鲁氏菌病阳性血清，分别从1:100开始进行二倍比稀释，用建立的人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒进行检测，结果如表13所示。
结果显示，所建立的ELISA试剂盒检测人布鲁氏菌病血清的灵敏度为1:1600。
（7）布鲁氏菌多表位融合蛋白ELISA试剂盒与试管凝集试验检测的符合率比较
从疾病预防控制中心收集191份血清，采用现在疾病预防控制中心常用的布鲁氏菌病诊断方法试管凝集试验进行布鲁氏菌病血清抗体的检测，同时采用本研究建立的布鲁氏菌多表位融合蛋白ELISA试剂盒进行检测，结果见表14和表15。
结果显示，191份收集的待测血清中，利用试管凝集试验检测人布鲁氏菌病抗体阳性的有124份，阴性的有67份，124份阳性血清中，采用人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒检测阳性的有111份，阳性符合率为89.52%，67份阴性血清中，采用人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒检测阴性的有65份，阴性符合率为97.01%，总符合率为92.15%，两种检测方法的符合率较高，说明本研究建立的人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒能够准确的用于人布鲁氏菌病的临床诊断。
综上，利用本发明制备所得的可溶性布鲁氏菌多表位融合蛋白建立的ELISA试剂盒检测人布鲁氏菌病患者血清抗体具有特异性强、重复性好、灵敏度高的优点，可用于临床布鲁氏菌病患者血清样本的检测。
应当理解，虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明内容作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之进行一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
<110> 吉林大学
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<130> 2016
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Lys Lys Ala Gly Ile Glu Asp Arg Asp Leu Gln Thr Gly Gly Ile Asn
　　　 5 10 15
Ile Gln Pro Ile Tyr Val Tyr Pro Asp Asp Lys Asn Asn Leu Lys Glu
20 25 30
Pro Thr Ile Thr Gly Tyr Gly Gly Gly Ser Gly Val Asn Gln Gly Gly
35 40 45
Asp Leu Asn Leu Val Asn Asp Asn Pro Ser Ala Val Ile Asn Gly Gly
50 55 60
Gly Ser Ala Ala Ala Pro Asp Asn Ser Val Pro Ile Ala Ala Gly Glu
65 70 75 80
Asn Ser Tyr Asn Val Ser Val Asn Val Gly Gly Gly Ser Val Ser Glu
85 90 95
Pro Ser Ala Pro Thr Ala Ala Pro Val Asp Thr Phe Ser Trp Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Asn Ala Gly Tyr Ala Gly Gly Lys Phe Lys His Pro Phe Ser
115 120 125
Ser Phe Asp Lys Glu Asp Asn Glu Gln Val Ser Gly Ser Leu Asp Val
130 135 140
Thr Ala Gly Gly Phe Val Gly Gly Gly Ser Ser Val Thr Gly Ser Ile
145 150 155 160
Ser Ala Gly Ala Ser Gly Leu Glu Gly Lys Ala Glu Thr Lys Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu His Thr Trp Ser Asp Lys Thr
180 185 190
Lys Ala Gly Trp Thr Leu Gly Ala Gly Ala Glu Tyr Ala Ile Asn Asn
195 200 205
Asn Trp Thr Leu Lys Ser Glu Tyr Leu Tyr Thr Asp Leu Gly Lys Arg
210 215 220
Asn Leu Val Asp Val Asp Asn Ser Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gln Tyr Ser Ile Thr Ile Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr Arg
245 250 255
Glu Gly Gly Gly Ser Ala Ser Arg Gly Val Pro Thr Asn Arg Met Arg
260 265 270
Thr Ile Ser Tyr Gly Asn Glu Arg Pro Val Ala Val Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Asp Val Lys Gly Gly Asp Asp Val Tyr Ser Gly Thr Asp Arg Asn Gly
290 295 300
Trp Asp Lys Gly Gly Gly Ser Ala Leu Glu Gln Gly Gly Asp Asn Asp
305 310 315 320
Gly Gly Tyr Thr Gly Thr Thr Asn Gly Gly Gly Ser Val Ile Glu Glu
325 330 335
Trp Ala Ala Lys Val Arg Gly Asp Val Asn Ile Thr Asp Gln Phe Ser
340 345 350
Val Trp Leu Gln Gly Ala Tyr Ser Ser Ala Ala Thr Pro Asp Gln Asn
355 360 365
Tyr Gly Gln Trp Gly Gly Gly Ser Tyr Ser Ser Ala Ala Thr Pro Asp
370 375 380
Gln Asn Tyr Gly Gln Trp Gly Gly Asp Trp Ala Gly Gly Gly Ser Ala
385 390 395 400
His Asp Asp Trp Gly Lys Thr Ala Val Thr Gly Gly Gly Ser Thr Val
405 410 415
Thr Pro Glu Val Ser Tyr Thr Lys Phe Gly Gly Glu Trp Lys Asp Thr
420 425 430
Val Ala Glu Asp Asn Ala Trp Gly Gly
435 440
<210> 2
<211> 1360
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
catatgaaaa aggctggcat cgaggaccgc gacctgcaaa ccggtggtat caacatccag 60
ccaatctacg tctacccgga cgacaagaac aacctgaagg agccgaccat taccggttat 120
ggcggtggca gcggtgtgaa ccagggtggc gacctgaacc tggtcaacga caacccttcc 180
gctgtcatca acggtggcgg ttccgcagct gctcctgata acagcgtccc aatcgcagca 240
ggtgagaact cttacaacgt gtccgtgaac gtgggtggcg gctctgtgag cgaaccgtct 300
gcaccgactg ctgcaccggt agatactttc agctggggtg gcggttctaa cgcaggttac 360
gcaggtggca agttcaaaca cccgttcagc agcttcgaca aagaggacaa cgagcaggtg 420
agcggtagcc tggacgtgac tgcaggtgtt cagcagcttc gacaaagagg acaacgagca 480
ggtgagcggt agcctggacg tgactgcagg tgtaaagcgg aaacgaaagg cggcggtagc 540
ggcgatgatg cttctgctct gcacacttgg tctgacaaaa ccaaagcggg ttggaccctg 600
ggtgctggtg ctgaatacgc tatcaacaat aattggaccc tgaaatccga atacctgtac 660
acggacctgg gcaaacgtaa cctggtagac gttgacaaca gcttcctgga aagcggtggc 720
ggtagccagt actccatcac gattgaaggt cacgccgacg aacgtggtac ccgcgaaggt 780
ggcggctccg cctcccgtgg tgttccgacc aaccgtatgc gtaccatttc ctacggtaac 840
gaacgcccgg tagcggtagg cggtggttct gacgttaaag gtggcgacga cgtatattcc 900
ggtaccgacc gtaacggttg ggataaaggc ggtggctctg ctctggaaca aggtggcgat 960
aacgatggcg gttacaccgg tactacgaac ggcggcggtt ctgttattga agaatgggcg 1020
gcgaaagttc gtggcgatgt taatattacc gatcagtttt ccgtttggct gcagggcgcg 1080
tactcctctg ccgccacccc ggatcagaac tatggccagt ggggcggtgg ctcctattct 1140
tctgcggcga ctccggatca gaattatggt cagtggggcg gcgattgggc gggcggcggt 1200
tccgcgcatg atgattgggg taaaactgcc gttactggcg gtggtagcac cgttaccccg 1260
gaagtttctt ataccaaatt tggcggcgaa tggaaagata ccgtagcgga agataatgcg 1320
tggggcggct aactcgagca ccaccaccac caccactgag 1360

Claims (7)

1.一种布鲁氏菌病特异性融合蛋白抗原，它的氨基酸序如序列表SQ ID No.1所示。
2.一种布鲁氏菌病特异性融合蛋白抗原基因，它的碱基序如序列表SQ ID No.2所示。
3.一种原核表达载体，它是在含有T7启动子的原核融合蛋白表达载体中插入了如序列表SQ ID No.2所示的基因。
4.根据权利要求3所述的一种原核表达载体，其特征在于：所述的原核表达载体为pET-28b。
5.一种大肠杆菌工程菌，它是转染了上述原核表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)。
6.一种布鲁氏菌病的检测试剂盒，其特征在于：它的诊断抗原为权利要求1所述的特异性融合蛋白抗原。
7.根据权利要求6所述的一种布鲁氏菌病的检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒人布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒。
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