CN112946265B - 一种基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物芯片技术领域，具体公开了一种基于抗原‑抗体结合的单体修饰芯片的工艺。本发明工艺包括芯片粗清洗步骤、芯片活化步骤、芯片单体涂层步骤、涂层固化步骤，再同时包被BP26抗原和OMP16抗原，获得成品芯片；芯片粗清洗步骤中，使用空气作为介质对芯片进行等离子清洗；芯片活化步骤中，在空气等离子中进行活化，获得活化后的芯片；芯片单体涂层步骤中，使用丙烯酸单体在活化后的芯片表面完成等离子涂层，获得涂层芯片。本发明中不同批次生产的成品芯片的一致性好，芯片良品率高，操作简单，生产成本低，方便质控。并且芯片同时包被BP26抗原和OMP16抗原，提升了使用单个抗原作为探针的灵敏度，降低了假阴率。
Description
技术领域
本发明涉及生物芯片技术领域，尤其是涉及一种基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的工艺。
背景技术
生物芯片是根据生物分子间特异相互作用的原理，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。狭义的生物芯片概念是指通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、cDNA、gDNA、多肽、抗体、抗原等）固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的生物分子点阵。快检生物芯片修饰加工方法中，使用人工完成APTES成膜和交联，生物芯片上再包被上布鲁氏菌的LPS或者BP26抗原作为生物探针。
但是该方法存在一些弊端：如加工费时、费力；人工操作，新手易导致一致性差，良品率不够高，甚至一批芯片全部作废；产能提升受限：人工操作APTES成膜，每个人1次只能操作1片，每天最多操作20片；并且现通常使用布鲁氏菌的LPS作为抗原检测，此抗原直接采用布氏杆菌菌体本身或提取培养物，生产与制备过程涉及活菌的培养，存在一定的生物安全危险，必须采取严格的生物安全措施，提高了生产制备的成本。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的工艺，本发明的工艺提高了芯片良品率，提升了批内一致性，并且还提高了布鲁氏杆菌抗体检测的灵敏度。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的工艺，包括芯片粗清洗步骤、芯片活化步骤、芯片单体涂层步骤、涂层固化步骤，再同时包被BP26抗原和OMP16抗原，获得成品芯片；
所述芯片粗清洗步骤中，使用甲苯、丙酮、乙醇、水依次进行清洗芯片，使用空气作为介质对芯片进行等离子清洗；所述芯片活化步骤中，在空气等离子中进行活化，获得活化后的芯片；所述芯片单体涂层步骤中，使用丙烯酸单体在活化后的芯片表面完成等离子涂层，获得涂层芯片。
本发明能够将生物分子良好地固定在芯片上，特别是良好地固定在芯片的电极片上，以便芯片能够用于基于电学检测的生物芯片检测方法中，促进基于电学检测的生物芯片检测方法的发展。并且，本发明中不同批次生产的成品芯片的一致性好，芯片良品率高，操作简单，生产成本低。并且芯片同时包被BP26抗原和OMP16抗原，提升了使用单个抗原作为探针的灵敏度，降低了假阴率。
本发明采用丙烯酸单体在活化后的芯片表面形成等离子涂层，进而保护芯片电极，而如果采用丙烯酸衍生物，例如甲基丙烯酸则会遇到溶解等问题。
作为本发明所述基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的工艺的优选实施方式，所述芯片粗清洗步骤、芯片活化步骤和芯片单体涂层步骤在同一个等离子机器中连续进行。
本发明芯片粗清洗步骤、芯片活化步骤和芯片单体涂层步骤在同一个等离子机器中连续进行，提高批内一致性，并且本发明工艺连续在一个等离子机器中完成了两种等离子体的操作，进行芯片粗清洗步骤、芯片活化步骤使用的是等离子机器的一个管路，进行芯片单体涂层步骤使用的是等离子机器的另一个管路，该操作避免了芯片活化以后不能及时涂层等问题。
作为本发明所述基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的工艺的优选实施方式，所述BP26抗原和OMP16抗原的浓度比为(1-2):1。
本发明使用BP26抗原和OMP16抗原的混合物作为探针，提高了使用单个抗原作为探针的灵敏度，降低了假阴率，而采用其他抗原两两混合时，提高灵敏度、降低假阴率的效果不及本发明的BP26抗原和OMP16抗原。
作为本发明所述基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的工艺的优选实施方式，所述BP26抗原和OMP16抗原的浓度比为1:1。
当BP26抗原和OMP16抗原的浓度比为1:1时，提高抗原作为探针的灵敏度最佳，降低假阴率效果最佳。
作为本发明所述基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的工艺的优选实施方式，所述涂层固化步骤中，涂层芯片在相对湿度为20-60%和温度为18-25℃的条件下放置1-2天。
本发明限定了涂层固化步骤的条件，使得芯片批内一致性佳，提高芯片质量；如果涂层芯片放置时间太短，则会发现芯片一致性不好，如果涂层芯片放置时间太长，则会发现芯片响应太小，因此，需要选择合适的固化时间。
作为本发明所述基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的工艺的优选实施方式，所述芯片粗清洗步骤中，等离子机器的功率为100-300瓦，清洗时间为5-10min，所述芯片活化步骤中，等离子机器的功率为10-100瓦，活化时间为5-15min。
在本发明的技术方案中，芯片粗清洗步骤采用大功率清洗，其目的是去除有机物；芯片活化步骤中采用小功率活化，其目的是结合上基团。
作为本发明所述基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的工艺的优选实施方式，所述芯片单体涂层步骤中，等离子机器的功率为10-300瓦，6-15min。
在本发明的技术方案中，参数的选择极为重要，参数的不同直接影响到最后的检测结果。芯片单体涂层的时间小于6min的时候，同一批芯片的质控结果CV>30%，一致性比较差；当单体涂层的时间大于15min的时候，质控结果没有响应，灵敏度为0，原因可能是膜太厚，不能有效传感。
作为本发明所述基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的工艺的优选实施方式，还包括封闭和干燥步骤，在同时包被BP26抗原和OMP16抗原后的芯片中加入平衡盐溶液，用氮气吹干，然后再加入牛血清白蛋白封闭液，于室温中封闭0.5h，再加入平衡盐溶液，用氮气吹干，获得成品芯片。
作为本发明所述基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的工艺的优选实施方式，所述芯片活化步骤前，对芯片进行第一次镜检：利用金相显微镜观察芯片表面，取无断条、无连条、无粘附杂质的芯片进行芯片活化步骤；所述芯片单体涂层步骤后，对涂层芯片进行第二次镜检：利用金相显微镜观察涂层芯片的表面，取断条、无连条、无粘附杂质的涂层芯片进行涂层固化步骤。
芯片活化步骤前对芯片进行第一次镜检，芯片单体涂层步骤后对涂层芯片进行第二次镜检，剔除不合格的芯片，判断芯片表面无粘附杂质的依据为：在电极片叉指部位（即电极片之间的间隙）没有大于0.5μm的斑点、颗粒、赃物和尘埃粒子，如有就判定为不合格。
第二方面，本发明提供了上述基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的工艺制备的芯片。
本发明基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的工艺，可以提高生产芯片的产能，以前1个人每天最多做20片，现在1个人就可以操作100片以上（由等离子机器容量决定）；提升了批内一致性；提升了良品率。
并且通过BP26抗原和OMP16抗原的混合物作为探针，提升了布鲁氏杆菌抗体检测的灵敏度，降低了假阴率。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的工艺，该工艺操作简单，本发明能够将生物分子良好地固定在芯片上，特别是良好地固定在芯片的电极片上，以便芯片能够用于基于电学检测的生物芯片检测方法中，促进基于电学检测的生物芯片检测方法的发展。并且，本发明中不同批次生产的成品芯片的一致性好，芯片良品率高，操作简单，生产成本低。并且芯片同时包被BP26抗原和OMP16抗原，提升了使用单个抗原作为探针的灵敏度，降低了假阴率。
附图说明
图1为实施例1制备的成品芯片的厚度示意图；
图2为对比例7制备的成品芯片的厚度示意图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例和对比例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的工艺，包括以下步骤：包括芯片粗清洗步骤、芯片活化步骤、芯片单体涂层步骤、涂层固化步骤，再同时包被BP26抗原和OMP16抗原，获得成品芯片；芯片包括电极片，本实施例中的芯片选用中国专利CN104965081B、专利名称为“基于移动设备的抗体抗原检测方法”中的反应单元，反应单元包括一个顶部开口的反应腔，反应腔底部设置有一块检测板，检测板上铺设有至少一对电极片，电极片的接线端穿过并固定在反应腔和盒体上。本实施例中，铺设有电极片的检测板的结构可以参见发明人在先发表论文（Development of an AC electrokinetics-based immunoassay systemfor on-site serodiagnosis of infectious diseases，Xiaozhu Liu，Sensors andActuators A， 171 (2011) 406–413，Fig. 3.（b））。通常反应腔和检测板为硅制材料（si），电极片均为金属材质（铝、金或铜，本实施为铝材质）。
1）预处理步骤
芯片活化步骤前，对芯片进行第一次镜检，利用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，取无断条、无连条、无粘附杂质的芯片，剔除不合格芯片。过程中，判断芯片表面无粘附杂质的依据为：在电极片叉指部位（即电极片之间的间隙）没有大于0.5μm的斑点、颗粒、赃物和尘埃粒子，如有就判定为不合格。
2）芯片粗清洗步骤
使用乙醇完成对芯片的表面清洁并用水清洗，然后使用空气作为介质，利用现有技术中的等离子清洗机对芯片进行等离子清洗，其中，等离子清洗机的真空度为0.5mbar，功率为200瓦（可选择范围为100-300瓦），清洗时长为5min。
3）芯片活化步骤
然后在空气等离子中进行活化，利用等离子表面活化机对芯片进行等离子活化，等离子表面活化机的功率为10瓦（可选择范围为10-100瓦），活化时间为5min，得到活化后的芯片。该步骤的目的是对芯片表面进行表面清洗和修饰，使用空气中氧气，通过氧化反应，在表面生成-OH、-C=O、-COOH等基团；并使用空气中氮气，在芯片表面生成-NH2基团。
4）芯片单体涂层步骤
芯片涂层步骤中，直接在原等离子机器上使用第二个管路，使用丙烯酸单体在活化后的芯片表面完成等离子涂层，等离子活化机的功率为50瓦，作用时间为10min，获得涂层芯片。对涂层芯片进行第二次镜检，利用金相显微镜在10倍目镜下观察涂层芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，取断条、无连条、无粘附杂质的芯片，剔除不合格芯片。过程中，判断芯片表面无粘附杂质的依据同第一次镜检。
5）涂层固化步骤
涂层芯片在相对湿度为20%和温度为20℃的条件下放置1天。
6）包被步骤
在固化后的芯片上滴加生物分子溶液，于22℃（可选择范围18-25℃）孵育20h（可选择范围2-24h），得到包被后的芯片。本实施例中，在固化过的芯片上滴加10μL 按浓度比为1:1混合的10μg/mL布鲁氏OMP16抗原和10μg/mL BP26抗原，其中，使用硼酸缓冲液（BBS）作为溶剂分散和溶解上述抗原，硼酸缓冲液的配制方法为：在0.05-0.2M硼酸溶液中加入0.0125-0.05四硼酸钠溶液，直至pH值为5-8。本实施例中，硼酸缓冲液（即100mM BBS）的配制方法为：在0.1M硼酸溶液中加入0.025四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4。
在芯片包被步骤中，芯片孵育5min后，使用阻抗仪对芯片进行阻抗检测，具体地，使用组抗议连接于电极片的接线端进行阻抗频率扫描测量和分析，扫描频率范围为1MHz到100Hz，激励电压为5mV（可选择范围1mV-100mV），采样点数201点，测量时间为3s，保存各芯片阻抗频率扫描数据（称为包被前阻抗扫描，获得在不同扫描频率下的电极片各响应参数，如阻抗、相位、电阻分量、电容分量、电感分量等，作图获得包被前上述参数随频率变化的曲线）。
在包被前阻抗扫描结束后，将芯片放在保湿盒中，于22℃孵育20h，获得包被后的芯片。包被结束后，从保湿盒中取出芯片，然后用阻抗仪对包被后的芯片进行阻抗检测，同样地，扫描频率范围为1MHz到100Hz，激励电压为5mV（可选择范围1mV-100mV），采样点数201点，测量时间为3s，保存各芯片阻抗频率扫描数据（称为包被后阻抗扫描，获得在不同扫描频率下的电极片各响应参数，如阻抗、相位、电阻分量、电容分量、电感分量等，作图获得包被前上述参数随频率变化的曲线）。
对比包被前阻抗扫描和包被后阻抗扫描结果，判定芯片是否合格，判定方法为：在上述阻抗扫描频率下，计算包被后扫描获得的电容值与包被前扫描获得的电容值的变化率，具体计算方法为：电容变化率=（包被后扫描的电容值-包被前扫描的电容值）/包被前扫描的电容值×100%。电容变化率需控制在-50.0～150.0%范围内，不在此范围内的芯片为不合格芯片，需要丢弃。特定阻抗扫描频率是通过包被前电容随频率变化的曲线和包被后电容随频率变化的曲线来确认的，具体的确认方法为：计算获得包被前扫描和包被后扫描的同一频率下的电容变化率，电容变化率最大值所对应的扫描频率值即为特定阻抗扫描频率。在本实施例中，具体是在频率50KHz（即特定阻抗扫描频率）下计算电容变化率，并控制特定阻抗扫描频率下的电容变化率在60.0～100.0%范围内，其中，特定阻抗扫描频率下的电容变化率又称为扫描前后最大电容变化率。由于芯片批次以及包被的生物分子不一样会使得特定阻抗扫描频率存在差异，所以需要在包被前后进行阻抗扫描，获得特定阻抗扫描频率，在该特定阻抗扫描频率下的电容变化率需要维持在一定范围内，才能保证成品芯片的合格率。
接下来用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第三次镜检），判断方法同第一次镜检。
7）封闭与干燥
每片包被后的芯片用200μL移液器加入20μL的100mM BBS，然后用氮气吹干，重复1次。每片芯片用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第四次镜检），判断方法同第一次镜检。用10μL移液器滴加10μL 10%牛血清白蛋白封闭液（溶剂为 100mM BBS)，于室温中封闭0.5h。每片芯片用200μL移液器加入20μL 100nM BBS，然后用氨气吹干，重复1次，获得成品芯片。
每片成品芯片用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第五次镜检），判断方法同第一次镜检。
操作方法：1）将样本和稀释液按1:100进行稀释；2）滴加10 uL稀释后的样本到芯片内；3）测试。
实施例2-3、对比例1-5基本同实施例1，不同点如表1所示。
实施例4
与实施例1相似，区别在于：
2）芯片粗清洗步骤：等离子清洗机的功率为100瓦；
3）芯片活化步骤：离子表面活化机的功率为100瓦；
4）芯片单体涂层步骤：等离子活化机的功率为10瓦，作用时间为6min；
5）涂层固化步骤：涂层芯片在相对湿度为60%和温度为18℃的条件下放置1天。
实施例5
与实施例1相似，区别在于：
2）芯片粗清洗步骤：等离子清洗机的功率为300瓦；
3）芯片活化步骤：离子表面活化机的功率为10瓦；
4）芯片单体涂层步骤：等离子活化机的功率为300瓦，作用时间为15min；
5）涂层固化步骤：涂层芯片在相对湿度为50%和温度为25℃的条件下放置1天。
对比例6
与实施例1相似，区别在于：步骤4）中，等离子活化机的功率为50瓦，作用时间为5min。
对比例7
与实施例1相似，区别在于：步骤4）中，等离子活化机的功率为50瓦，作用时间为20min。
试验例一
对128例来源于重庆理工大学和重庆市动物疫病预防控制中心消毒灭绝后的牛布鲁氏菌病阳性样本做了测试，测出结果为阳性的统计值如下表2所示。
表2
| 组别 | 检出阳性 |
| 实施例1 | 127 |
| 实施例2 | 125 |
| 实施例3 | 123 |
| 对比例1 | 120 |
| 对比例2 | 119 |
| 对比例3 | 123 |
| 对比例4 | 110 |
| 对比例5 | 98 |
从表2的数据可知，本发明使用BP26抗原和OMP16抗原的混合物包被芯片，可以提高提升了布鲁氏杆菌抗体检测的灵敏度，降低了假阴率，而当采用其他组合的抗原时，检出阳性的样本数量不及本发明使用BP26抗原和OMP16抗原的混合物检出阳性的样本数量，说明其抗原的选择不是任意选择就可以得到的。实施例4和实施例5检出阳性样本的效果与实施例1-3相似，但效果要好于对比例1-5。
试验例二
对比例6-7基本同实施例1，不同点在于，步骤4）中等离子活化机的作用时间，对比例8-对比例12基本同实施例1，不同点在于涂层固化时间，具体不同点见表3。
质控测试如下：使用溶解在100 mM BBS里的1ng/mL的BP26抗原配对抗体与溶解在100 mM BBS里的1ng/mL的OMP16抗原配对抗体，按1:1混合后得到的溶液作为阳性对照，100mM BBS背景液作为阴性对照，对阳性样品和阴性样品各测量7次。
表3
涂层芯片在相对湿度为20%和温度为20℃的条件下放置1天的情况下，芯片单体涂层时间在6分钟以下的时候，同一批芯片的质控结果CV>30%，一致性比较差；当单体涂层时间在15分钟以上的时候，质控结果没有响应，灵敏度为0，原因可能是膜太厚，不能有效传感。本发明限定了芯片单体涂层时间和涂层芯片放置时间，使得芯片批内一致性佳，提高了成品芯片质量；如图1为涂层参数满足本发明需求时芯片的厚度分布在25-30nm。图2为单体涂层时间太长时，可以看见芯片的厚度在30-35nm。
如果涂层芯片放置时间太短，则会发现芯片一致性不好，如果涂层芯片放置时间太长，则会发现芯片响应太小，因此，需要选择合适的固化时间。
如果芯片单体涂层步骤时间太长，则会发现最后芯片没有响应，即灵敏度丢失，其原因是膜太厚，导致检测环境条件下电极不能有效传感膜上物质发生的变化。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (4)
1.一种基于抗原-抗体结合的单体修饰芯片的方法，其特征在于，包括芯片粗清洗步骤、芯片活化步骤、芯片单体涂层步骤、涂层固化步骤，再同时包被BP26抗原和OMP16抗原，获得成品芯片；
所述芯片粗清洗步骤中，使用甲苯、丙酮、乙醇、水依次进行清洗芯片，使用空气作为介质对芯片进行等离子清洗；所述芯片活化步骤中，在空气等离子中进行活化，获得活化后的芯片；所述芯片单体涂层步骤中，使用丙烯酸单体在活化后的芯片表面完成等离子涂层，获得涂层芯片；
所述BP26抗原和OMP16抗原的浓度比为(1-2):1；所述芯片单体涂层步骤中，等离子机器的功率为50瓦，6-15min；所述芯片粗清洗步骤、芯片活化步骤在等离子机器的一个管路进行，所述芯片单体涂层步骤在等离子机器的另一个管路中进行；
所述涂层固化步骤中，涂层芯片在相对湿度为20%和温度为20℃的条件下放置1天；
所述芯片粗清洗步骤中，等离子机器的功率为200瓦，清洗时间为5min，所述芯片活化步骤中，等离子机器的功率为10瓦，活化时间为5min；
工艺还包括封闭和干燥步骤，在同时包被BP26抗原和OMP16抗原后的芯片中加入平衡盐溶液，用氮气吹干，然后再加入牛血清白蛋白封闭液，于室温中封闭0.5h，再加入平衡盐溶液，用氮气吹干，获得成品芯片。
2.如权利要求1所述的单体修饰芯片的方法，其特征在于，所述BP26抗原和OMP16抗原的浓度比为1:1。
3.如权利要求1所述的单体修饰芯片的方法，其特征在于，所述芯片活化步骤前，对芯片进行第一次镜检：利用金相显微镜观察芯片表面，取无断条、无连条、无粘附杂质的芯片进行芯片活化步骤；
所述芯片单体涂层步骤后，对涂层芯片进行第二次镜检：利用金相显微镜观察涂层芯片的表面，取断条、无连条、无粘附杂质的涂层芯片进行涂层固化步骤。
4.如权利要求1-3任一项所述的单体修饰芯片的方法制备的芯片。
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