CN112595765B - 一种基于温敏型蛋白质印迹凝胶的抗污染电化学生物传感器的制备方法 - Google Patents

一种基于温敏型蛋白质印迹凝胶的抗污染电化学生物传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于电化学生物传感器领域，具体涉及一种基于温敏型蛋白质印迹凝胶的抗污染电化学生物传感器的制备方法。该制备方法通过以下步骤实现的：玻碳电极在氧化铝悬浮液中抛光，超声，先后用乙醇和水冲洗；分别称取丙烯酰胺、N,N‑亚甲基二丙烯酰胺、过硫酸铵、异丙基丙烯酰胺、转铁蛋白或人免疫球蛋白G和四甲基乙二胺，均匀分散在磷酸缓冲溶液中，得混合溶液；将配制好的混合溶液滴加到预处理之后的GCE表面，在氮气环境下，自由基聚合反应，水冲洗电极表面。本发明制备的生物传感器抗污染性能优异，抗污染性能将提升1~3倍；检测灵敏度高；操作简便，制备方法简单易操作。

Description

一种基于温敏型蛋白质印迹凝胶的抗污染电化学生物传感器 的制备方法
技术领域
本发明属于电化学生物传感器领域，具体涉及一种基于温敏型蛋白质印迹凝胶的抗污染电化学生物传感器的制备方法。
背景技术
水凝胶是一种由三维网络结构的高分子化合物交联而成的一类特殊的湿软性，这种具有三维网络结构的亲水性高分子材料能够在水中显著溶胀但不溶解。现有的基于聚丙烯酰胺凝胶制备的温敏型生物传感器，其技术的主要关注点在于：不同温度对于模板蛋白与聚合凝胶的结合与脱离、以及对凝胶结构的影响。目前存在的温敏性生物传感器并没有对凝胶的抗污染及抗菌性能进行探索。由于生物传感器界面的抗污染/抗菌性能直接影响到传感器对目标分析的能力以及传感器在临床应用中的潜力及前景。现有生物传感器在真实样品（血液、血清、汗液、细胞粉碎液、组织提取液、尿液等）检测中遭遇的蛋白质非特异性吸附导致的选择性差、灵敏度低、准确性低等缺点。
目前，聚丙烯酰胺凝胶薄膜的抗污染/抗菌性能还有待改善，从而能够加快电化学生物传感器在临床医学应用中的进程。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于温敏型蛋白质印迹凝胶的抗污染电化学生物传感器的制备方法。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种基于温敏型蛋白质印迹凝胶的抗污染电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）电极的预处理：玻碳电极GCE分别在1.0、0.3、0.05 µm的氧化铝悬浮液中抛光，超声，先后用乙醇和水冲洗；
（2）聚合溶液的配制：分别称取丙烯酰胺、N,N-亚甲基二丙烯酰胺、过硫酸铵、异丙基丙烯酰胺、转铁蛋白/人免疫球蛋白G和四甲基乙二胺，均匀分散在磷酸缓冲溶液中，得混合溶液；
（3）传感器的构建：将配制好的混合溶液滴加到预处理之后的GCE表面，在氮气环境下，自由基聚合反应，水冲洗电极表面。
进一步的，所述丙烯酰胺、N,N-亚甲基二丙烯酰胺、过硫酸铵、异丙基丙烯酰胺、转铁蛋白/人免疫球蛋白G和四甲基乙二胺的料液比为1mg：1mg：1mg ：60mg ：1µL。
进一步的，所述四甲基乙二胺和磷酸缓冲溶液的体积比为1：200。
本发明所使用的磷酸缓冲液的浓度为0.2M。
进一步的，步骤（3）中具体过程为：取7~10 µL配制好的混合溶液滴加到预处理之后的GCE表面，在氮气环境下，自由基聚合反应30 min，水冲洗电极表面。
本发明还提供了一种利用上述制备方法制备的电化学生物传感器在检测生物样本中人血清蛋白含量的应用。
本发明所使用的氧化铝悬浮液为氧化铝粉末的水溶液。采用本发明构建的电化学生物传感器，其显著的特性是具有优异的抗污染性能，即消除蛋白质非特异性吸附的能力，因此，有望直接应用于实际血清样品中目标蛋白的高选择性、高灵敏性检测。
本发明的有益效果为：
1）抗污染性能优异：聚丙烯酰胺凝胶呈高亲水性、电荷近中性，能够有效地消除蛋白质/细菌在凝胶表面的黏附。利用该凝胶制备的蛋白质分子印迹传感器能够实现对目标蛋白的高灵敏、高特异性、高准确性检测。与现有的抗污染生物传感界面相比，该凝胶界面的抗污染性能将提升1~3倍。
2）检测灵敏度高：基于该亲水性凝胶优异的抗污染效用，与现有的蛋白质生物传感界面相比较，该凝胶印迹的生物传感器针对目标蛋白的最低检测限至少下降1~2个数量级。
3）操作简便：本发明制备的蛋白质印迹聚合凝胶中蛋白质的洗脱不需要采用其他试剂，比如十二烷基硫酸钠（SDS）等，有效避免了其他离子的引入对凝胶界面的破坏，制备方法简单易操作。
附图说明
图1为不同温度下聚合凝胶织网状结构孔的大小变化的扫描电镜图；
其中，A和B为20℃下、C和D为37℃下。
图2为实施例2制备的聚合凝胶的接触角图。
图3为制备的聚合凝胶界面在不同浓度的牛血清白蛋白和胎牛血清溶液中分别浸泡３０分钟之后的电化学交流阻抗曲线图。
图4为制备的聚合凝胶对Hela细胞吸附的荧光显微图像。
图5为制备的蛋白质印迹的聚合凝胶传感器(IgG-MI/GCE)以及无蛋白质印迹的聚合凝胶传感器（NIP/GCE）对目标蛋白IgG检测的线性曲线图。
图6为制备的聚合凝胶的电化学交流阻抗信号响应的长期稳定性图。
图7为制备的蛋白质印迹的聚合凝胶传感器(IgG-MI/GCE)以及无蛋白质印迹的聚合凝胶传感器（NIP/GCE）对目标蛋白分析的特异性测试图。
图8 为制备的蛋白质印迹的聚合凝胶传感器(IgG-MI/GCE)以及无蛋白质印迹的聚合凝胶传感器（NIP/GCE）在10%的胎牛血清存在下对目标蛋白检测的线性曲线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的解释和说明。
实施例1
1）电极的预处理：玻碳电极GCE分别在1.0、0.3、0.05 µm的氧化铝悬浮液中抛光，超声，先后用乙醇和水冲洗3分钟。
2）聚合溶液的配制：分别称取5.0 mg丙烯酰胺、5.0 mg N,N-亚甲基二丙烯酰胺、5.0 mg过硫酸铵、300.0 mg异丙基丙烯酰胺、5.0 mg转铁蛋白和5.0 µL四甲基乙二胺，均匀分散在1.0 mL磷酸缓冲溶液中。
3）传感器的构建：取7~10 µL配制好的混合溶液滴加到预处理之后的GCE表面，在氮气环境下，自由基聚合反应30 min。水冲洗电极表面，去除未发生反应的液体。
4）模板分子的解离与再结合：由于温敏聚合物的存在，37℃条件下，采用电化学方法可以完全解离出模板蛋白分子。20℃条件下，模板蛋白可以再度与聚合凝胶结合。通过电子显微镜技术验证不同温度下聚合凝胶织网状结构孔的大小变化。
实施例2
1）电极的预处理：玻碳电极GCE分别在1.0、0.3、0.05 µm的氧化铝悬浮液中抛光，超声，先后用乙醇和水冲洗3分钟。
2）聚合溶液的配制：分别称取5.0 mg丙烯酰胺、5.0 mg N,N-亚甲基二丙烯酰胺、5.0 mg过硫酸铵、300.0 mg异丙基丙烯酰胺、5.0 mg人免疫球蛋白G和5.0 µL四甲基乙二胺，均匀分散在1.0 mL磷酸缓冲溶液中。
3）传感器的构建：取7~10 µL配制好的混合溶液滴加到预处理之后的GCE表面，在氮气环境下，自由基聚合反应30 min。水冲洗电极表面，去除未发生反应的液体。
效果验证：
（一）模板分子的解离与再结合：由于温敏聚合物的存在，37℃条件下，采用电化学方法可以完全解离出模板蛋白分子。20℃条件下，模板蛋白可以再度与聚合凝胶结合。通过电子显微镜技术验证不同温度下聚合凝胶织网状结构孔的大小变化，具体结果如图1所示，从图中可以看出，37℃下，聚合凝胶织网状结构孔大，模板分子能够方便的进行移除。
（二）抗污染性能的测试：
1）采用静态水的接触角图像测试聚合凝胶的接触角大小，验证凝胶的亲水性能。足够的亲水性可以消除蛋白质通过疏水作用于界面的吸附，具体结果如图2所示。
2）采用电化学交流阻抗技术，验证传感器凝胶表面对蛋白质的非特异性吸附作用，具体结果如图3所示。
3）采用细胞成像技术，验证凝胶表面对细胞的吸附作用，具体结果如图4所示。
（三）传感性能分析：主要采用电化学技术测试该传感器对目标蛋白的分析检测能力（设置对照组，同时检测了非蛋白质分子印迹凝胶生物传感器(NIH/GCE)对目标的检测能力）。同时，测试其选择性、稳定性等其他传感性能，具体结果如图5和图6、图7所示所示，从图5中可以看出，本发明制备的电化学传感器，其线性检测范围：0.5 – 200.0 ng/mL， 最低检测限：0.03 ng/mL；从图6中可以看出，本发明制备的电化学传感器，进行15天放置，信号变化不大，其稳定性好；图7中，其他干扰蛋白的浓度（1.0 × 104 ng/mL）为目标蛋白浓度（10.0 ng/mL IgG）的3个数量级，Mix为所有物质的混合，本发明制备的电化学生物传感器具有特异性，选择性好。
（四）实用性能检测：采用加标法，在10%（V/V）的胎牛血清溶液中测试传感器的传感性能，具体结果如图8所示。检测范围为0.5 – 200.0 ng/mL，说明胎牛血清中其他生物分子的存在对传感器的分析检测能力没有大的影响，进一步表明了该传感器优异的抗污染性能。

Claims (5)

1.一种基于温敏型蛋白质印迹凝胶的抗污染电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）电极的预处理：玻碳电极GCE分别在1.0、0.3、0.05 µm的氧化铝悬浮液中抛光，超声，先后用乙醇和水冲洗；
（2）聚合溶液的配制：分别称取丙烯酰胺、N,N-亚甲基二丙烯酰胺、过硫酸铵、异丙基丙烯酰胺、转铁蛋白/人免疫球蛋白G和四甲基乙二胺，均匀分散在磷酸缓冲溶液中，得混合溶液；
（3）传感器的构建：将配制好的混合溶液滴加到预处理之后的GCE表面，在氮气环境下，自由基聚合反应，水冲洗电极表面即可；
所述丙烯酰胺、N,N-亚甲基二丙烯酰胺、过硫酸铵、异丙基丙烯酰胺、转铁蛋白/人免疫球蛋白G和四甲基乙二胺的料液比为1mg：1mg：1mg ：60mg ：1µL。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述四甲基乙二胺和磷酸缓冲溶液的体积比为1：200。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸缓冲溶液的浓度为0.2M。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中具体过程为：取7~10 µL配制好的混合溶液滴加到预处理之后的GCE表面，在氮气环境下，自由基聚合反应30 min，水冲洗电极表面。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的制备方法制备的电化学生物传感器在检测生物样本中人血清蛋白含量的应用。
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