CN112763553B - 一种基于分子印迹技术对蛋白质的电化学检测方法 - Google Patents

一种基于分子印迹技术对蛋白质的电化学检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于分子印迹技术对蛋白质的电化学检测方法；包括：步骤1，配置所需要溶液；步骤2，制备UT‑g‑C3N4；步骤3，用UT‑g‑C3N4修饰GCE电极；步骤4，制备MIPs/UT‑g‑C3N4/GCE；步骤5，将所有电极放在相同浓度电解质溶液和相同扫描条件下，获得循环伏安曲线，对比分析。本发明以二维纳米材料g‑C3N4为基质负载于玻碳电极上，以牛血清白蛋白(BSA)为模板分子，以丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(DAC)为功能单体，N,N'‑亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂，采用新型表面分子印迹技术，在水溶液中制备专一性识别BSA分子的分子印迹电化学传感器，并通过循环伏安法对目标蛋白质进行检测。本发明是一种具有生物兼容的分子印迹电化学传感器制备方法，用以简便快速，低成本的识别蛋白质。

Description

一种基于分子印迹技术对蛋白质的电化学检测方法
技术领域
本发明属于应用新型材料用于分析检测技术领域；尤其涉及一种基于分子印迹技术对蛋白质的电化学检测方法。
背景技术
目标蛋白质是人体所有细胞和组织的重要组成部分，在基因表达、信息复制和催化代谢等方面发挥着重要作用。它们的应用极其广泛，最主要的方面应该是蛋白质组学和生物医学两大领域。例如癌症病人血清中低丰度的肿瘤蛋白标志物的水平可以提供有关疾病状态的有用信息，可用于癌症诊断、预后和流行病学研究。因此，高选择性、高特异性的肿瘤蛋白标志物的检测不仅可以提高早期诊断的可靠性，而且可以大大提高治疗的疗效。因此，在复杂的生物样本中准确、选择性地检测具有重要生物学功能的低丰度蛋白是蛋白质组学研究、生物医学应用和临床诊断的重要课题。
目前常用的蛋白质专一性检测方法仍然是免疫检测分析法，如酶联免疫吸附法(ELISA)，依赖于抗体和抗原之间的特异性识别检测目标分析物，即将已知的抗原或抗体包被于固相支持物上，加入酶标记抗体与吸附在固相载体上的抗原或抗体特异性结合，通过底物使酶显色来判断免疫发生的程度达到检测的目的。然而依赖于单克隆抗体的酶免疫检测技术，存在抗体制备困难、生产成本高、稳定性差、环境要求苛刻、使用寿命短等问题。因此，建立一个快速、简单、特异、高通量的蛋白质等生物大分子的检测方法已成为分析检测科学的研究热点之一。
分子印迹聚合物(Molecular imprinted polymers,MIPs)被认为是一种很有前途的抗体替代品，MIPs与目标分子结合的过程类似于抗原和抗体的结合，与生物抗体相比，MIPs具有稳定性好、成本低、开发时间短、生产方便等优点。得益于纳米新材料的应用，新型纳米材料是合成生物大分子印迹聚合物薄层的优良载体材料，克服了生物大分子分子印迹的局限性。将分子印迹的专一识别性能与新型导电纳米材料结合在一起所制备的分子印迹电化学传感器，即可以绑定目标分子并进行特异性识别，又可以将生物信号实时转换为电信号，从而实现对目标蛋白分子定性定量的精准检测。
发明内容
本发明的目的是提供了一种基于分子印迹技术对蛋白质的电化学检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
步骤1，制备UT-g-C3N4；
步骤2，用UT-g-C3N4修饰GCE电极；
步骤3，制备MIPs/UT-g-C3N4/GCE；
步骤4，利用制备成功的MIPs/UT-g-C3N4/GCE对牛血清白蛋白(BSA)进行电化学检测。
优选地，步骤1中，所述制备UT-g-C3N4具体步骤为：采用三聚氰胺高温聚合法制备块状g-C3N4；在室温下，将块状的g-C3N4用5-10mol/l盐酸搅拌,并用去离子水反复冲洗以除去余酸，得到质子化的g-C3N4；将质子化g-C3N4散于去离子水中，用超声波细胞破碎仪超声2-4h、离心除去未脱落的团聚体，最后得到UT-g-C3N4分散液。
优选地，步骤2中，所述GCE电极的玻碳电极直径为3mm-9mm，用抛光粉末α-Al2O3粉末打磨抛光，并用无水乙醇、去离子水交替冲洗；用循环伏安法扫描至稳定后，将其取出晾干备用；量取5-20μL已处理好的UT-g-C3N4分散液滴涂在已处理好的GCE表面，室温干燥后即可得到UT-g-C3N4/GCE。
优选地，步骤3中，在UT-g-C3N4/GCE表面负载分子印迹聚合膜，向容器中加入中性PBS缓冲溶液，再加入150：1-250：1的丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(DAC)和BSA相互反应，在35-55℃水浴锅中恒温反应10-30min；加入交联剂20％-30％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺MBA，通入N2排尽装置中的空气，再加入1％的引发剂过硫酸铵和亚硫酸氢钠，把修饰氮化碳的玻碳电极悬空浸入溶液中，过夜反应后取出电极，在1-3mol/L氢氧化钠中浸电极浸泡30-60min，并用去离子水清洗，制得可供使用的MIPs/UT-g-C3N4/GCE。
优选地，步骤4中，应用所制备MIPs/UT-g-C3N4/GCE电极作为工作电极，参比电极(Ag/AgCl电极)和辅助电极(铂丝电极)，采用电化学工作站三电极体系进行循环伏安法(Cyclic Voltammetry,CV)扫描检测不同浓度梯度的待测溶液。
本发明的制备原理为：
第一步：块状g-C3N4质子化后超声形成UT-g-C3N4；
Figure GDA0002973079460000031
第二步：单体DAC与模板BSA通过强静电相互作用结合到一起；
Figure GDA0002973079460000032
第三步：氧化还原引发体系在溶液中生成自由基；
(NH4)2S2O8+NaHSO3→2SO4 ·-+SO4 2-
第四步：同时进行DAC接枝聚合和BSA印迹。
(NH4)2S2O8+NaHSO3→2SO4 ·-+SO4 2-
本发明具有以下优点：
(1)本发明以超薄二维纳米材料g-C3N4为基质负载于玻碳电极上，以牛血清白蛋白(BSA)为模板分子，以丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(DAC)为功能单体，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂，采用新型表面分子印迹技术，在水溶液中制备专一性识别BSA分子的分子印迹电化学传感器，并通过循环伏安法对目标蛋白质进行检测。
(2)本发明旨在建立具有高选择性和高灵敏度的快速检测目标蛋白质的分析方法，即寻求一种具有生物兼容的分子印迹电化学传感器制备方法，用以简便快速，低成本的识别蛋白质。
附图说明
图1是本发明实施例1中BSA@MIP/UT-g-C3N4/GCE制备过程图；
图2是本发明实施例1中MIP/UT-g-C3N4/GCE的红外表征图；
图3是本发明实施例2修饰电极的循环伏安图；
图4是本发明实施例2MIPs/UT-g-C3N4/GCE的响应时间；
图5是本发明MIPs/UT-g-C3N4/GCE进行选择性评估图；
图6是本发明MIPs/UT-g-C3N4/GCE进行稳定性评估图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
实施例1
本实施例涉及一种基于分子印迹技术对蛋白质的电化学检测方法，见图1所示：包括以下步骤：
步骤1，采用三聚氰胺高温聚合法制备块状g-C3N4。三聚氰胺在氮气条件下加热5min，升温5h，温度为550℃。将得到的产物冷却至室温，得到黄色块状g-C3N4。取1g上述块状g-C3N4溶于25mL盐酸中，盐酸浓度为10M，在室温下搅拌1h。然后过滤溶液，并用去离子水反复冲洗以除去余酸，室温条件下干燥，最后得到质子化的g-C3N4。取50mg质子化g-C3N4分散在100mL去离子水中，用超声波细胞破碎仪超声2h，然后以4000rpm/min转速离心10min除去未脱落的团聚体，最后获得超薄氮化碳(Ultrathin-g-C3N4,UT-g-C3N4)分散液。
步骤2，将直径为3mm的玻碳电极(Glassy carbon electrode，GCE)依次用1μm，0.3μm，0.05μm颗粒度的α-Al2O3粉末抛光，“8”字型打磨5min，并将完成打磨的电极用无水乙醇、去离子水交替冲洗2～3min，后将电极置于铁氰化钾和氯化钾的混合溶液中进行循环伏安法测试。将循环伏安法扫描电位范围、扫描速率分别设置为-0.2～+0.6V、50mV/s，当伏安图稳定后，将其取出晾干备用。使用移液枪量取5μL已处理好的UT-g-C3N4分散液滴涂在已处理好的GCE表面，室温干燥6h后即可得到UT-g-C3N4/GCE。
步骤3，在修饰了UT-g-C3N4的GCE表面负载分子印迹聚合膜。先准备好水浴锅、三口烧瓶、冷凝管、充N2管、磁转子、瓶塞等并安装好装置；向25mL三口烧瓶中加入950μL的PBS溶液；加入50μL的DAC和30mg的BSA相互反应，放置在35℃水浴锅中恒温反应10min；称取1.6mgMBA并加入到溶液中；向三口烧瓶中通入N2，排尽装置中的空气，反应10min；把0.0058g过硫酸铵溶于2.5ml PBS溶液中，把0.0029g亚硫酸氢钠溶于2.5ml PBS溶液中，各取250μL两种溶液加入三口烧瓶中；把修饰氮化碳的玻碳电极悬空浸入溶液中，过夜反应后取出电极，室温下干燥，所得电极为印迹有BSA的MIPs/UT-g-C3N4/GCE(BSA@MIPs/UT-g-C3N4/GCE)，其见图2所示。为了得到可以利用的MIPs/UT-g-C3N4/GCE，将BSA@MIPs/UT-g-C3N4/GCE置于PBS缓冲液中，利用CV在电位范围-0.2～0.6V和扫描速率50mV/s的条件下循环扫描20圈，并用去离子水淋洗，然后在1mol/L氢氧化钠中浸电极泡60min，达到除去模板蛋白的效果，并用去离子水清洗，制得可供使用的MIPs/UT-g-C3N4/GCE。
步骤4，采用电化学工作站三电极体系进行循环伏安法(Cyclic Voltammetry,CV)扫描检测，即工作电极(玻碳电极)、参比电极(Ag/AgCl电极)和辅助电极(铂丝电极)。将所有电极(GCE、UT-g-C3N4/GCE、MIPs-UT-g-C3N4/GCE以BSA@MIPs-UT-g-C3N4/GCE)放在相同浓度电解质溶液、相同扫描条件下获得循环伏安曲线，然后对比分析，说明纳米材料氮化碳以及分子印迹的修饰效果。
实施例2
本实施例涉及一种基于分子印迹技术对蛋白质的电化学检测方法，包括以下步骤：
步骤1，采用三聚氰胺高温聚合法制备块状g-C3N4。三聚氰胺在氮气条件下加热5min，升温5h，温度为650℃。将得到的产物冷却至室温，得到黄色块状g-C3N4。取1g上述块状g-C3N4溶于25mL盐酸中，盐酸浓度为5M，在室温下搅拌1h。然后过滤溶液，并用去离子水反复冲洗以除去余酸，室温条件下干燥，最后得到质子化的g-C3N4。取50mg质子化g-C3N4分散在100mL去离子水中，用超声波细胞破碎仪超声1h，然后以8000rpm/min转速离心除去未脱落的团聚体，最后获得超薄氮化碳(Ultrathin-g-C3N4,UT-g-C3N4)分散液。
步骤2，将直径为6mm的玻碳电极(Glassy carbon electrode，GCE)依次用1μm，0.3μm，0.05μm颗粒度的α-Al2O3粉末抛光，“8”字型打磨5min，并将完成打磨的电极用无水乙醇、去离子水交替冲洗2～3min，后将电极置于铁氰化钾和氯化钾的混合溶液中进行循环伏安法测试。将循环伏安法扫描电位范围、扫描速率分别设置为-0.1～+0.8V、100mV/s，当伏安图稳定后，将其取出晾干备用。使用移液枪量取10μL已处理好的UT-g-C3N4分散液滴涂在已处理好的GCE表面，室温干燥后即可得到UT-g-C3N4/GCE。
步骤3，在修饰了UT-g-C3N4的GCE表面负载分子印迹聚合膜。向10mL三口烧瓶中加入1000μL的PBS溶液；加入100μL的DAC和50mg的BSA相互反应，放置在45℃水浴锅中恒温反应30min；称取3mg MBA并加入到溶液中；向三口烧瓶中通入N2，排尽装置中的空气；把0.007g过硫酸铵和0.003g亚硫酸氢钠溶于5ml PBS溶液中，各取250μL两种溶液加入三口烧瓶中；把修饰氮化碳的玻碳电极悬空浸入溶液中，过夜反应后取出电极，室温下干燥，所得电极为印迹有BSA的MIPs/UT-g-C3N4/GCE(BSA@MIPs/UT-g-C3N4/GCE)。为了得到可以利用的MIPs/UT-g-C3N4/GCE，将BSA@MIPs/UT-g-C3N4/GCE置于PBS缓冲液中，利用CV在电位范围-0.1～0.7V和扫描速率100mV/s的条件下循环扫描20圈，并用去离子水淋洗，然后在2mol/L氢氧化钠中浸电极泡30min，达到除去模板蛋白的效果，并用去离子水清洗，制得可供使用的MIPs/UT-g-C3N4/GCE。
步骤4，采用电化学工作站三电极体系进行循环伏安法(Cyclic Voltammetry,CV)扫描检测，即工作电极(玻碳电极)、参比电极(Ag/AgCl电极)和辅助电极(铂丝电极)。见附图3所示。将所有电极(GCE、UT-g-C3N4/GCE、MIPs-UT-g-C3N4/GCE以BSA@MIPs-UT-g-C3N4/GCE)放在相同浓度电解质溶液、相同扫描条件下获得循环伏安曲线，然后对比分析，说明纳米材料氮化碳以及分子印迹的修饰效果。见附图4所示。
MIPs/UT-g-C3N4/GCE的选择性评估：
将BHb溶液配制成和BSA溶液相同的浓度阶梯，用MIPs/UT-g-C3N4/GCE进行选择性评估，记录CV曲线的氧化峰电流，结果见图5。显然，分子印迹上的空穴对BSA的结构识别能力更强，即相对于BHb，电极仍然对BSA的选择性更好。为了更好地证明所制备的传感器对BSA分子有更高的选择性，用配制好的PBS溶液配制浓度均为0.1mg/mL的BSA和BHb溶液进行1:1混合，得到BSA/BHb二元溶液。为考察MIPs-g-C3N4电化学传感器对BSA分子的选择性，测定CV曲线峰电流变化值ΔI。由表1MIP-g-C3N4竞争实验相关系数表可知，BSA印迹的MIPs-g-C3N4对BSA表现出优异的选择性。
表1
Figure GDA0002973079460000061
MIPs/UT-g-C3N4/GCE的稳定性评估
为了实现制备的电化学生物传感器在检测实际样品时保持良好的性能，将使用过的UT-g-C3N4/GCE和MIPs-UT-g-C3N4/GCE放在4℃环境下保存5天，并进行CV扫描示意不管是UT-g-C3N4/GCE还是MIPs/UT-g-C3N4/GCE的CV测试，五条曲线的电流、电位变化不大且基本吻合，证明在较短的时间内所制备的修饰电极稳定性较高。见图6所示。UT-g-C3N4/GCE的电流响应在第一天略有波动，随后保持稳定；MIPs/UT-g-C3N4/GCE的电流响应出现较图3和图4中明显的氧化还原峰，证明此时电极表面的修饰材料稳定性不如只有纳米材料UT-g-C3N4的稳定性高，可能是因为电极负载材料太多，出现黏合不紧密的问题，使得电子有更多机会穿过材料到达电级表面，使得电流响应更高。
本发明以二维纳米材料g-C3N4为基质负载于玻碳电极上，以牛血清白蛋白(BSA)为模板分子，以丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(DAC)为功能单体，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂，采用新型表面分子印迹技术，在水溶液中制备专一性识别BSA分子的分子印迹电化学传感器，并通过循环伏安法对目标蛋白质进行检测。
本发明旨在建立具有高选择性和高灵敏度的快速检测目标蛋白质的分析方法，即寻求一种具有生物兼容的分子印迹电化学传感器制备方法，用以简便快速，低成本的识别蛋白质。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。

Claims (1)

1.一种基于分子印迹技术对蛋白质的电化学检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，制备UT-g-C3N4；
步骤2，用UT-g-C3N4修饰GCE电极；
步骤3，制备MIPs/UT-g-C3N4/GCE；
步骤4，利用制备成功的MIPs/UT-g-C3N4/GCE对牛血清白蛋白进行电化学检测；
步骤1中，所述制备UT-g-C3N4具体步骤为：采用三聚氰胺高温聚合法制备块状g-C3N4；在室温下，将块状的g-C3N4用5-10mol/l盐酸搅拌,并用去离子水反复冲洗以除去余酸，得到质子化的g-C3N4；将质子化g-C3N4分散于去离子水中，用超声波细胞破碎仪超声2-4h、离心除去未脱落的团聚体，最后得到UT-g-C3N4分散液；
步骤2中，所述GCE电极的玻碳电极直径为3mm-9mm，用抛光粉末α-Al2O3粉末打磨抛光，并用无水乙醇、去离子水交替冲洗；用循环伏安法扫描至稳定后，将其取出晾干备用；量取5-20μL已处理好的UT-g-C3N4分散液滴涂在已处理好的GCE表面，室温干燥后即可得到UT-g-C3N4/GCE；
步骤3中，在UT-g-C3N4/GCE表面负载分子印迹聚合膜，向容器中加入中性PBS缓冲溶液，再加入150：1-250：1的丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵和BSA相互反应，在35-55℃水浴锅中恒温反应10-30min；加入交联剂20％-30％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺MBA，通入N2排尽装置中的空气，再加入1％的引发剂过硫酸铵和亚硫酸氢钠，把修饰氮化碳的玻碳电极悬空浸入溶液中，过夜反应后取出电极，在1-3mol/L氢氧化钠中浸电极浸泡30-60min，并用去离子水清洗，制得MIPs/UT-g-C3N4/GCE；
步骤4中，将所制备MIPs/UT-g-C3N4/GCE电极作为工作电极、参比电极和辅助电极，采用电化学工作站三电极体系进行循环伏安法扫描检测不同浓度梯度的待测溶液。
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