CN112903781B

CN112903781B - 一种电铜基MOFs敏感膜修饰电极的分子印迹电化学传感器及其制备方法和检测方法

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Publication number: CN112903781B
Application number: CN202110031209.4A
Authority: CN
Inventors: 罗爱芹; 梁阿新; 侯慧鹏; 唐珊珊; 刘毅权; 刘宗坤
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2021-01-11
Filing date: 2021-01-11
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2041-01-11
Also published as: CN112903781A

Abstract

本发明研究了一种基于电铜基MOFs敏感膜修饰电极的分子印迹电化学传感器及其制备方法和检测方法，属于电化学传感领域。本发明选择血清中特定蛋白人免疫球蛋白G(IgG)作为研究对象，通过结合纳米复合材料，新的印迹方法，新的模板处理思路、新的检测方法，成功构建了新型高灵敏分子印迹电化学传感器。首先用电沉积法在玻碳电极表面合成铜基MOFs修饰电极以提高导电性并增加比表面积，然后依次修饰上壳聚糖和戊二醛来提供IgG的附着位点，接着在修饰电极表面直接通过吡咯电聚合形成聚合物膜，最后洗脱模板得到分子印迹聚合物修饰的电极。该分子印迹电化学传感器灵敏度高、选择性好，已成功应用于实际样品中目标蛋白的检测。

Description

一种电铜基MOFs敏感膜修饰电极的分子印迹电化学传感器及其制备方法和检测方法

技术领域

本发明属于电化学传感领域，特别涉及一种电铜基MOFs敏感膜修饰电极的分子印迹电化学传感器的制备方法和检测方法。

背景技术

根据免疫球蛋白的化学结构以及作用方式，免疫球蛋白大致分为免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)。在人体作用中，免疫球蛋白通常扮演着抗体的作用，在与抗原等致病因子进行结合的过程中，对机体起到一定的防御保护作用。人免疫球蛋白G(IgG)是人体中最主要的一种免疫球蛋白。此外，IgG是唯一可以通过胎盘的免疫球蛋白，在新生儿的抗感染免疫中起着至关重要的作用。IgG在血清中含量最高，占血清中所有免疫球蛋白的75％-80％，分布广泛并且很容易穿透毛细管管壁，是一种存在于血管外的重要抗体。IgG含量异常会诱发某些疾病，例如甲状腺功能亢进症和系统性红斑狼疮(SLE)；因此，在质量监测，药物研究和医学诊断领域检测IgG的含量至关重要。

迄今为止，国内外研究中已经提出了多种分析技术，例如放射免疫扩散，酶联免疫测定，免疫比浊法和荧光免疫测定法来测定IgG。但是，在大多数这些技术中都存在一些局限性，例如昂贵的仪器，复杂的预处理步骤以及耗时的分析时间。与这些仪器方法相比，IgG的电化学测量具有简单，灵敏度高，响应速度快，检测限低的优点。为了通过电化学方法测定免疫球蛋白，已经进行了广泛的研究，值得注意的是，在大多数研究中，同种型免疫球蛋白G(IgG)在低含量检测期间占主导地位。此外，许多研究描述了制备经典模型分析物IgG特异性电化学传感器的多种策略。通常，基于纳米材料的电化学传感器可以通过增强电化学性能并利用生物识别分子来增加更大的传感表面负荷来提高传感器的灵敏度。

金属有机骨架(MOF)是由金属阳离子或离子簇与有机配体配位形成的，具有高结晶度、比表面积和孔隙率的三维网络结构。自从20世纪90年代末和21世纪初该领域开始应用以来，这些材料因其高孔隙率、稳定性好和化学可调整性而在气体储存、分离和催化等方面得到了广泛的研究。相比之下，MOFs的电学性质直到最近才受到相对较少的关注，这类材料作为导电多孔材料的潜力才刚刚开始被认识。

在大多数电化学或电化学相关的应用研究中，一般需要MOFs集成或滴涂于导电基底的表面。到目前为止，基于MOFs构建的碳糊修饰电极可以认为是一种相对简单，且报道较多的基于MOFs的电化学应用方式。但是，这些碳糊修饰电极稳定性、实用性及准确性较差，并且还不适合用于自动化的实时监测及其相关应用。作为一种替代方法，MOFs可通过一个电化学氧化过程或一个电化学还原过程直接电沉积于导电基底上。已知，在电化学法制备MOFs的过程中，合成MOFs所用的前驱体溶液(如，种类，浓度，pH值)以及电沉积参数(如，电位，沉积时间，温度)等决定了所合成MOFs的结构和表面特征(如，组成，形貌)。但是，关于用电化学还原方法合成MOFs敏感膜用于修饰电极制备分子印迹电化学传感器的报道至今还没有。所用配体对电化学合成MOFs性质(如，形貌，电化学性质等)和与分子印迹技术结合的应用的影响在文献中也没有明确的阐述。并且，电化学合成的MOFs敏感膜修饰电极的分子印迹电化学传感器在电化学测试过程中的稳定性的变化(如，形貌，晶型等)也是不清楚的。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备以电化学还原方法合成MOFs敏感膜修饰电极，在修饰电极表面制成分子印迹电化学传感器，并用于人免疫球蛋白G的快速检测。

本发明的目的主要通过以下技术手段实现：

本发明中一种电铜基MOFs敏感膜修饰电极的分子印迹电化学传感器的结构：

1)工作电极选用玻碳电极(GCE)，首先在电极表面电沉积一层Cu-MOF敏感膜(第一层)，记为Cu-MOF/GCE。

2)在Cu-MOF/GCE滴加一层壳聚糖膜(第二层)，记为CS/Cu-MOF/GCE。

3)然后在CS/Cu-MOF/GCE第二层电极表面滴加交联剂和人免疫球蛋白G(IgG)，将IgG蛋白通过戊二醛的交联作用连接到CS/Cu-MOF/GCE，由于蛋白质是生物大分子，不导电，接枝到电极表面之后相当于一层绝缘膜(第三层)，记为IgG/CS/Cu-MOF/GCE。

4)通过吡咯电聚合在电极表面包裹一层聚吡咯分子印迹膜(第四层)，记为PPy/IgG/CS/Cu-MOF/GCE。

5)最后通过洗脱剂将模板蛋白IgG去除，形成MIP/CS/Cu-MOF/GCE。

本发明中以电化学还原方法合成MOFs敏感膜修饰电极具体步骤如下：

1)称取一定量的三水合硝酸铜(Cu(NO₃)₂·3H₂O)、1,3,5-均苯三甲酸(H₃BTC)和盐酸三乙胺(Et₃NHCl)溶于一定量的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中；

2)采用电沉积方法在玻碳电极表面沉积Cu-MOF。电沉积过程采用恒电位模式进行电沉积。结束后将电极迅速从沉积底液中拿出，干燥备用。将制备出的电极命名为Cu-MOF/GCE。

本发明中制备人免疫球蛋白G分子印迹电化学传感器具体步骤如下：

3)称取一定量的壳聚糖溶液滴加到电极表面，室温晾干命名为CS/Cu-MOF/GCE。

4)在上述修饰电极表面滴加一定量的戊二醛溶液，室温活化应2小时，水洗晾干。

5)然后取一定量的人免疫球蛋白G滴加到电极表面，在室温条件下反应1小时后放在4℃的冰箱中反应12小时。之后，用pH＝7.4的磷酸盐溶液洗涤，以除去过量蛋白质。

6)在含有一定浓度吡咯的磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.8)中进行电聚合反应。

7)将得到的印迹聚合物电极用超纯水冲洗，并浸入到洗脱剂中以除去模板分子(人免疫球蛋白G)，记为MIP/CS/Cu-MOF/GCE。

8)作为对照组，按照相同的程序制备非印迹聚合物(NIP)，只是在聚合过程中不加入模板分子(人免疫球蛋白G)，记为NIP/CS/Cu-MOF/GCE。

基于电化学还原法合成MOF敏感膜修饰电极的分子印迹电化学传感器对人免疫球蛋白G的特异性识别和检测：

9)将修饰电极浸入到含[K₃Fe(CN)₆]的KCl溶液中，随后对各个修饰电极进行电化学伏安法扫描和交流阻抗法测量，扫描后便可得到相应的循环伏安(CV)图和交流阻抗(EIS)图。

10)将制备的电化学传感器浸入一定浓度的人免疫球蛋白G标准溶液，利用差分脉冲伏安法(DPV)进行测量，以溶度与DPV响应值作图。

11)选用溶菌酶(Lysozyme)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin)和牛血清蛋白(bovine Serum Albumin)作为人免疫球蛋白的结构类似物来测定MIP/CS/Cu-MOF/GCE的选择性。

进一步的，所述步骤1)中三水合硝酸铜：1,3,5-均苯三甲酸：盐酸三乙胺的摩尔比范围为1:1:1～1:2:1。

进一步的，所述步骤2)电沉积条件为恒电位模式，-1.1～-1.4V电沉积3～7分钟。

进一步的，所述步骤6)电聚合条件为在含有0.1mol/L吡咯的1mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.8)中进行电聚合反应，以80～120mV/s的扫描速率，在(-0.3～-0.4V)～(+0.8～+1V)的电位范围内进行循环伏安法电聚合4～8个循环。

进一步的，所述步骤6)洗脱剂为2mL 10％(v/v)乙酸：10％十二烷基硫酸钠洗脱10～20分钟。

本发明的有益效果：该方法合成的Cu-MOF敏感膜可以致密的包覆玻碳电极表面，导电性能好，具有良好的稳定性。制备的分子印迹电化学传感器对人免疫球蛋白G具有很好的选择性吸附能力，对人免疫球蛋白G的电信号响应快速，且电化学响应值对人免疫球蛋白G的浓度具有很好的线性关系。

本发明中，通过电化学还原方法在玻碳电极表面直接通过电沉积合成Cu-MOF，作为修饰电极。与传统的滴涂MOF材料作为修饰电极材料相比，这种电沉积方法不仅生成的膜更加致密，并且具有稳定性高和导电性能好的优点。本发明中，分子印迹合成采用吡咯电聚合的方法，与传统的分子印迹聚合物合成相比，具有操作简单，节省时间，印迹过程可调等优势。该分子印迹电化学传感器灵敏度高、选择性好，已成功应用于实际样品中目标蛋白的检测。

附图说明

图1是分子印迹电化学传感器(MIP/CS/Cu-MOF/GCE)高分辨SEM图

图2是通过电化学还原法合成的Cu-MOF高分辨SEM电镜图

图3不同修饰电极在含有K₃Fe(CN)₆的KCl溶液中的循环伏安(CV)图

图4是分子印迹电化学传感器(MIP/CS/Cu-MOF/GCE)DPV响应值与人免疫球蛋白G浓度的线性关系图

具体实施方式

实施例1

1.一种电铜基MOFs敏感膜修饰电极的分子印迹电化学传感器，包括工作电极，其特征在于，在所述工作电极外依次连接有Cu-MOF敏感膜、壳聚糖膜、交联剂与目标蛋白绝缘层和聚吡咯分子印迹层，所述聚吡咯分子印迹层具有目标蛋白的印迹空穴。

2.所述工作电极为玻碳电极，所述电铜基MOF敏感膜为修饰电极，是一种新型的高度有序多孔材料，有着大的比表面积、多孔和功能可调控等优势。表面膜由100nm MOFs堆积而成，表面较致密。MOFs通过电化学还原过程直接电沉积于导电基底上，所形成的Cu-MOFs敏感膜层状结构更加丰富。此外，Cu-MOFs敏感膜具有较多的活性位点，表现出较好的电化学活性。通过电化学还原方法合成MOFs敏感膜用于修饰电极制备分子印迹电化学传感器的报道至今还没有。

3.所述壳聚糖膜为修饰电极，形成一层均匀致密的膜，这不仅能提高电极表面的稳定性，还能通过连接交联剂来提高负载模板蛋白质的量。

4.所述交联剂与目标蛋白绝缘层为固定目标蛋白。通过交联剂戊二醛将非电活性IgG蛋白质交联到CS/Cu-MOF/GCE上，IgG蛋白修饰到电极表面之后相当于一层绝缘膜，阻碍电子传输。

5.所述聚吡咯分子印迹层，提供目标蛋白的印迹空穴。吡咯单体与模板蛋白通过共价进行预组装，单体在电极表面聚合的同时，模板蛋白嵌入聚合物膜中，从而将选择性识别位点引入至聚合膜中。聚吡咯分子印迹层膜厚可以通过扫描圈数决定，膜的导电状态及聚合过程中发生氧化还原反应可以通过循环伏安图直观地反应出来。

6.所述绝缘层为交联剂与目标蛋白交联层，在聚合聚吡咯分子印迹层后洗脱目标蛋白形成印记空穴。

7.所述目标蛋白为人免疫球蛋白G。

实施例2

1)称取10mmol三水合硝酸铜(Cu(NO₃)₂·3H₂O)、15mmol 1,3,5-均苯三甲酸(H₃BTC)和10mmol盐酸三乙胺(Et₃NHCl)溶于50mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中；

2)采用电沉积方法在玻碳电极表面沉积Cu-MOF。电沉积过程采用恒电位模式，-1.3V电沉积5分钟。结束后将电极迅速从沉积底液中拿出，干燥备用。将制备出的电极命名为Cu-MOF/GCE。

3)称取3μL 0.25mg/mL(in 0.02mol/L乙酸)的壳聚糖溶液滴加到电极表面，室温晾干命名为CS/Cu-MOF/GCE。

4)在上述修饰电极表面滴加10μL 2.5％的戊二醛溶液，室温活化2小时，水洗晾干。

5)然后取5μL的100μg/mL的人免疫球蛋白G滴加到电极表面，在室温条件下反应1小时后放在4℃的冰箱中反应12小时。之后，用pH＝7.4的磷酸盐溶液洗涤，以除去过量蛋白质。

6)在含有0.1mol/L吡咯的1mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.8)中进行电聚合反应：以80mV/s的扫描速率，在-0.35～+0.85V的电位范围内进行循环伏安法电聚合6个循环。

7)将得到的印迹聚合物电极用超纯水冲洗，并浸入到10％乙酸和10％十二烷基硫酸钠溶液(v/v)中15分钟以除去模板分子(人免疫球蛋白G)，记为MIP/CS/Cu-MOF/GCE。

实施例3

基于实例2制备出的分子印迹电化学传感器进行检测：

1)将修饰电极浸入到50mmol/l[K₃Fe(CN)₆]的1mol/l KCl溶液中，随后对各个修饰电极进行电化学伏安法扫描和交流阻抗法测量，扫描后便可得到相应的循环伏安(CV)图和交流阻抗(EIS)图。

2)将制备的电化学传感器浸入含有0,0.001,0.01,0.05,0.1,0.5,1,5ng/mL的人免疫球蛋白G标准溶液，利用差分脉冲伏安法(DPV)进行测量，以溶度与DPV响应值作图。

3)选用溶菌酶(Lysozyme)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin)和牛血清蛋白(bovine Serum Albumin)作为人免疫球蛋白的结构类似物来测定MIP/CS/Cu-MOF/GCE的选择性。

如附图4所示，峰电流值与IgG浓度在0.001～5ng/mL范围内呈现良好的线性关系，线性回归方程为I＝0.58647Log C(ng/mL)+2.35499(R²＝0.997)。本工作与其他文献中检测IgG方法的结果对比，具有更宽的线性范围和较低的检测限，实际用于痕量检测灵敏度更高。

实施例4

除了“步骤1)中三水合硝酸铜：1,3,5-均苯三甲酸：盐酸三乙胺的摩尔比为2:3:2”之外，其它各步骤及操作与实施例1的均相同。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤

1）将三水合硝酸铜、1,3,5-均苯三甲酸和盐酸三乙胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，制成电沉积液；

2）采用电沉积方法在玻碳电极表面沉积Cu-MOF；电沉积采用恒电位模式，在-1.1 ～-1.4 V电压下进行电沉积，放于50 ℃烘箱干燥；

3）将溶于浓度0.02 mol/L乙酸溶液的0.25 mg/mL壳聚糖溶液滴加到电极表面，室温晾干形成壳聚糖膜；

4）用浓度为2.5%的戊二醛溶液在室温下活化应2小时，水洗晾干；

5）将100 μg/mL的人免疫球蛋白G滴加到电极表面，在室温条件下初反应，然后在4 ℃温度下后反应，之后，用pH=7.4的磷酸盐溶液洗涤，以除去过量蛋白质；

6）在pH为6.8，含有浓度为0.1 mol/L吡咯的1 mmol/L磷酸盐缓冲溶液中进行电聚合反应：以80～120 mV/s的扫描速率，在（-0.3～-0.4 V）～（+0.8～+1 V）的电位范围内进行循环伏安法电聚合若干循环；

7）浸入体积比为1:1的浓度为10%乙酸和浓度为10%十二烷基硫酸钠混合溶液中除去人免疫球蛋白G。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤7）后进行步骤8）制备对照组，按照步骤1）-7）的方法制备非印迹聚合物，聚合过程中不加入人免疫球蛋白G。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述三水合硝酸铜、1,3,5-均苯三甲酸和盐酸三乙胺溶于N，N-二甲基甲酰胺，其中三水合硝酸铜：1,3,5-均苯三甲酸：盐酸三乙胺的摩尔比范围为1 : 1 : 1 ~ 1 : 2 : 1。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2）电沉积条件为采用恒电位模式，-1.3 V电沉积5分钟。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤6）吡咯电聚合反应条件：以80mV/s的扫描速率，在-0.35～+0.85 V的电位范围内进行循环伏安法电聚合6个循环，步骤7）浸入到10%乙酸和10%十二烷基硫酸钠溶液中15分钟以除去模板分子。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述三水合硝酸铜、1,3,5-均苯三甲酸和盐酸三乙胺溶于N，N-二甲基甲酰胺，其中三水合硝酸铜：1,3,5-均苯三甲酸：盐酸三乙胺的摩尔比为2 : 3 : 2。

7.一种根据权利要求1的制备方法制备的电铜基MOFs敏感膜修饰电极的分子印迹电化学传感器，包括工作电极，其特征在于，在所述工作电极外依次连接有Cu-MOF敏感膜、壳聚糖膜、交联剂与目标蛋白绝缘层和聚吡咯分子印迹层，所述聚吡咯分子印迹层具有目标蛋白的印迹空穴。

8.一种采用权利要求7所述分子印迹电化学传感器检测人免疫球蛋白G的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将所述电铜基MOFs敏感膜修饰电极的分子印迹电化学传感器浸入到50 mL浓度为50mmol/L [K₃Fe(CN)₆]和1 mol/L KCl溶液中，随后对电化学传感器进行电化学伏安法扫描和交流阻抗法测量，扫描后便可得到相应的循环伏安（CV）图和交流阻抗（EIS）图；

2）将所述电铜基MOFs敏感膜修饰电极的分子印迹电化学传感器浸入含有不同浓度梯度的人免疫球蛋白G标准溶液，利用差分脉冲伏安法（DPV）进行测量，以浓度与DPV响应值作图；

3）选用溶菌酶（Lysozyme）、人血清白蛋白（Human Serum Albumin）和牛血清蛋白（bovine Serum Albumin）作为人免疫球蛋白的结构类似物来测定所述电铜基MOFs敏感膜修饰电极的分子印迹电化学传感器的选择性。