CN115201302A - 一种电化学传感器及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种电化学传感器的制备方法：(1)将牛血清白蛋白BSA溶液与三羧乙基膦TCEP溶液混合，得到淀粉样蛋白质溶液；(2)首先利用氧化铝粉末对玻碳电极的界面进行抛光，然后在超声波条件下进行清洗；(3)将预处理后的玻碳电极浸泡于3,4‑乙烯二氧噻吩EDOT和离子液体IL的混合溶液中，在常温下采用循环伏安法制备PEDOT‑IL修饰电极；(4)将PEDOT‑IL修饰电极浸泡在淀粉样蛋白质溶液中常温反应，即得。本发明操作步骤简单、使用成本低；另外，由于淀粉样蛋白质涂层的引入，本发明可以有效抵抗非目标生物分子在电化学传感器表面的粘附，提升电化学传感器在复杂环境中的抗污染能力和检测灵敏度，对人体体液中生物标志物的直接检测具有重要意义。

Description

一种电化学传感器及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及电化学分析检测技术领域，更具体的说是涉及一种电化学传 感器及其制备方法与应用。

背景技术

高效的传感和有效的抗污染能力是电化学传感器在临床生物标志物检测 应用中的关键要求。生物标志物往往存在于复杂的人体体液中，如血液、血 清和尿液，这些体液通常由许多复杂的生物分子组成。在这种情况下，电化 学传感器在使用过程中尤其容易受到共存复杂生物分子的污染，从而导致不 准确的电响应和较差的灵敏度，这也严重限制其实际应用。也就是说，对于 一个表面没有抗污染性能的电化学传感器，最终会因为界面的生物污染而无 法使用，更不用说长期的临床应用。因此，寻找有效的抗污染策略成为当前 的研究热点，对电化学传感的发展具有重要的现实意义。

目前，已有多种抗污染策略被用于保持传感器在复杂介质中的传感性能， 并被证明是有效的。例如，由于电位响应与传感器的比表面积无关，使用电 位信号代替电流信号作为输出信号可以有效地避免蛋白质吸附的干扰，如电 氧化还原电位滴定。表面形貌工程是构建抗污染界面的另一种方法，通过构 建合理的纳米孔结构，传感界面不仅可以防止非特异性干扰物的附着，还可 以实现对目标小分子的检测。此外，将抗污染材料集成到传感界面也为减少 生物污染提供了一种有前景的方法，许多新型的抗污染电化学传感器通过在 传感界面引入抗污染材料(如聚乙二醇(PEG)、两性离子聚合物、寡核苷酸、 生物膜、多肽和肽类等)而成功构建。然而，上述材料的固定通常需要复杂 的结构设计，以及引入锚固构件，组装程序复杂，成本较高，难以大规模实 施。

相变牛血清白蛋白(PTB，又称淀粉样牛血清白蛋白)是三(2-羧乙基)膦 (TCEP)诱导牛血清白蛋白(BSA)的二硫键还原，发生淀粉样聚集的产物， 被认为是一种新型有效的抗污染材料。它结合了锚定和抗污染性能，作为一 种蛋白纳米膜，可以不经预处理直接牢固地附着在任何类型的基底上，并对 广谱干扰物表现出满意的抗污染性能。牛血清白蛋白的相变过程伴随着淀粉 样快速聚集，从天然牛血清白蛋白形成PTB低聚物。实验表明，PTB低聚物 纳米颗粒倾向于在两相界面上组装(气/液、固/液)形成二维纳米膜。界面修饰 可通过简单的喷涂或浸泡进行。

因此，如何开发一种基于淀粉样蛋白质的抗污染电化学传感器对于实现 复杂人体体液中生物标志物的直接检测具有十分重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种电化学传感器及其制备方法与应 用，以解决现有技术中的不足。

本发明开发了一种基于淀粉样蛋白质的抗污染电化学传感器，操作步骤 简单，使用成本低；另外，由于淀粉样蛋白质涂层的引入，本发明可以有效 抵抗非目标生物分子在电化学传感器表面的粘附，提升电化学传感器在复杂 环境中的抗污染能力和检测灵敏度，对人体体液中生物标志物的直接检测具 有重要意义。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种电化学传感器的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)淀粉样蛋白质溶液的制备

将牛血清白蛋白BSA溶液与三羧乙基膦TCEP溶液混合，得到淀粉样蛋 白质溶液，备用；

(2)玻碳电极的预处理

首先利用氧化铝粉末对玻碳电极的界面进行抛光，然后在超声波条件下 依次用水、无水乙醇、水进行清洗，得到预处理后的玻碳电极；

(3)PEDOT-IL修饰电极的制备

将预处理后的玻碳电极浸泡于3,4-乙烯二氧噻吩EDOT和离子液体IL的 混合溶液中，在常温下采用循环伏安法制备PEDOT-IL修饰电极；

(4)电化学传感器的组装

将PEDOT-IL修饰电极浸泡在淀粉样蛋白质溶液中常温反应，即得电化学 传感器。

本发明以玻碳电极为基底，将离子液体(IL)掺杂的3,4-乙烯二氧噻吩 (EDOT)作为第一层电极修饰材料，再继续修饰淀粉样蛋白质，通过离子液 体对目标物的电化学催化作用，产生明显的电流信号，实现对目标物的灵敏 检测。

进一步，上述步骤(1)中，牛血清白蛋白BSA溶液的浓度不小于1.5 mg/mL；三羧乙基膦TCEP溶液的pH值为5.5～6.5，浓度不小于50mM；牛 血清白蛋白BSA溶液和三羧乙基膦TCEP溶液的体积比为1:1。

采用上述进一步技术方案的有益效果在于，通过简单地将牛血清白蛋白 BSA溶液与三羧乙基膦TCEP等体积混合，常温下引发蛋白质的相转变，即 可制得淀粉样蛋白质溶液。

进一步，上述步骤(3)中，离子液体IL为1-乙基-3-甲基咪唑二(氟甲 基磺酰)酰亚胺；3,4-乙烯二氧噻吩EDOT和1-乙基-3-甲基咪唑二(氟甲基 磺酰)酰亚胺的体积比为20:1。循环伏安法的扫描电压为-0.5～1.2V，扫描圈 数为2圈。

采用上述进一步技术方案的有益效果在于，采用循环伏安法在预处理后 的玻碳电极上电沉积PEDOT-IL聚合物膜，修饰方法简单，只需十几秒或几 分钟就可以完成。同时，PEDOT-IL聚合物膜稳定性好，电流响应信号明显。

进一步，上述步骤(4)中，反应的时间不小于1h；还包括：反应结束 后，用去离子水冲洗PEDOT-IL修饰电极表面，除去未自组装的淀粉样蛋白质。

采用上述进一步技术方案的有益效果在于，通过将PEDOT-IL修饰电极浸 泡在淀粉样蛋白质溶液中常温反应，能够使淀粉样蛋白质在修饰界面自组装。

本发明还请求保护一种上述制备方法制得的电化学传感器。

本发明还请求保护一种上述制备方法制得的电化学传感器在尿酸UA定 量检测中的应用。

进一步，上述定量检测具体为：将电化学传感器置于PBS缓冲液中，并 施加磁力搅拌，通过i-t测试记录电流信号，待电流信号稳定后，依次加入不 同浓度的目标物尿酸UA，并连续记录电化学传感器的电流响应，以实现对目 标物尿酸UA的检测；依次加入不同浓度的目标物尿酸UA的时间间隔为 20～50s；尿酸UA的线性检测范围为1.53～563.2μM，最低检测限为0.77μM (S/N＝3)。

值得说明的是，血清尿酸UA是惰性嘌呤代谢的最终产物。过度合成或排 尿缺陷导致高尿酸血症，血清尿酸含量升高，与糖尿病、高血压和痛风等多 种疾病的发生有关。现在已经确定尿酸UA是自由基的强还原剂。健康人血清 中UA的浓度范围约为240～520μmol/L，进入尿液排出的浓度范围约为1.49 4.46mmol/L/24h。生物体液中尿酸含量的测定在各种疾病的诊断中占有非常 重要的地位。本发明以尿酸UA作为目标检测物，具有一定的代表性。

本发明还请求保护一种上述制备方法制得的电化学传感器在血清样品检 测中的应用。

本发明电化学传感器可以有效地抵抗实际人类体液样本中的生物污染， 在应用于血清中尿酸检测时，淀粉样蛋白质可以有效防止共存蛋白质等生物 分子在传感界面的粘附，有效提高了电化学传感器的检测灵敏度和准确性， 且经验证具有良好的实际应用潜力。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、本发明以掺杂离子液体的导电聚合物复合物为电化学基底，并将淀粉 样蛋白质作为抗污染涂层修饰到导电聚合物复合物基底上，通过离子液体对 尿酸的电化学催化作用产生明显的电流信号，实现对尿酸的灵敏检测。

2、本发明电化学传感器对实际样品中目标物尿酸的检测具有电流响应快 速且明显、灵敏度高、抗干扰能力强的特点。

3、本发明淀粉样蛋白质抗污染涂层制备简单，成本低，对基底具有广泛 适用性，具有广谱抗污染效果且抗污染能力优异。

4、本发明淀粉样蛋白质的使用能够有效抵抗共存干扰物在传感界面的粘 附，提高了电化学传感器在真实体液样本中检测的灵敏度和准确性，具有极 大的实际应用潜力。

5、本发明制备方法简单，易于操作，适用于推广与应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面 描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不 付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明化学尿酸传感器的制备方法的流程示意图；

图2为不同修饰电极的扫描电子显微镜图像；

图3为不同修饰电极经ThT染色后的激光共聚焦图像；

图4为不同工作电极在负电探针[Fe(CN)₆]^3-/4-中的CV响应曲线；

图5为牛血清白蛋白和淀粉样蛋白质的圆二色谱图；

图6为不同物质的荧光光谱图；

图7为经ThT处理的淀粉样蛋白质随时间变化的荧光光谱图；

图8为不同修饰电极在有无尿酸时的CV响应曲线；

图9为不同修饰电极在有无尿酸时的i-t响应曲线；

图10为牛血清白蛋白浓度的优化图(修饰电极在20％人血清中的信号抑制 率)；

图11为牛血清白蛋白相转变时间的优化图(修饰电极在20％人血清中的信 号抑制率)；

图12为TCEP溶液pH的优化图(修饰电极在20％人血清中的信号抑制率)；

图13为不同电势下传感器对尿酸催化的安培响应图；

图14为不同修饰电极在牛血清白蛋白加入前后的安培响应图；

图15为不同修饰电极在人血清中抵抗非特异性吸附的抗污染测试图；

图16为不同修饰电极在人血清和缓冲液中进行尿酸测试的灵敏度比；

图17为不同修饰电极在0.2mg·mL^-1的荧光蛋白质中孵育前后的激光共聚 焦图；

图18为尿酸传感器对不同浓度尿酸的安培响应图，其中，左上图为尿酸 传感器的线性曲线，左下图为对尿酸安培响应曲线前300s的放大图；

图19为尿酸传感器对不同浓度UA、LA、Glu、Urea、GSH的安培响应图；

图20为尿酸传感器在含0.56mM的AA、DA和UA的PBS中的DPV信号响应 图；

图21为尿酸传感器在连续循环伏安测试中的稳定性曲线图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描 述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明 中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所 有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中，仪器设备和试剂的详情如下。

1、仪器设备：

①所有电化学测试采用三电极系统，均在CHI 660E电化学工作站(中国 上海)上完成。其中，三电极系统由工作电极(直径为3.0mm的裸或改性玻 碳电极GCE)、对电极(铂丝)和参比电极(饱和甘汞电极SCE)组成。

②修饰电极的表面形貌通过扫描电子显微镜(JEOL JSM-7500F SEM)来 表征。

③荧光光谱采用FL-4600荧光光谱仪(日立，日本)进行。

④ZetasizerNano-ZS(Malvern Instruments,Malvern,U.K.)对PTB和BSA 的Zeta电位进行表征。

⑤ESCALAB 250Xi光谱分析仪(Thermo Fisher Scientific,U.K.)测量X 射线光电子能谱(XPS)。

⑥ThT染色试验和非特异性吸附(荧光素标记蛋白和细胞)测量使用共 聚焦激光显微镜TCS-SP5仪器(莱卡，德国)进行。

⑦圆二色性(CD)光谱仪对PTB和BSA的二级结构进行表征。

2、试剂：

①3,4-乙二氧噻吩(EDOT)和离子液体(IL)1-乙基-3-甲基咪唑双(三 氟甲基磺酰)亚胺(电化学级，>97％纯度)购买于阿拉丁试剂(中国上海)。

②三(2-羧基乙基)膦(TCEP)和荧光素二乙酸酯(FDA)由上海生工 生物技术有限公司提供。

③牛血清白蛋白(BSA)、多巴胺(DA)和荧光素异硫氰酸盐标记的牛 血清白蛋白(FITC-BSA)由Adamas-Beta试剂(中国上海)提供。

④尿酸(UA)购买于Acros Organics。

⑤硫黄素-T(ThT)由Sigma-Aldrich提供。

⑥抗坏血酸(AA)、乳酸(LA)和葡萄糖(Glu)从国药化学试剂(上 海)有限公司购得。

⑦谷胱甘肽(GSH)购自麦克林试剂。

⑧胎牛血清购自Biological Industries。

⑨人血清样本由青岛市第八人民医院(中国青岛)提供。

⑩磷酸盐缓冲盐水(PBS,0.2M,pH 7.4，含0.9％NaCl)作为相关实验的 缓冲液。

所有试剂均为分析级。所有实验均在室温下进行。所有实验均使用超纯 水。

实施例1

电化学传感器的制备方法，如图1所示，具体包括以下步骤：

(1)淀粉样蛋白质溶液的制备

先将牛血清白蛋白BSA分散于去离子水中，制得终浓度为1.5mg·mL^-1的牛血清白蛋白BSA溶液；将三羧乙基膦TCEP分散于去离子水中，并用5M NaOH调节其pH至5.0，制得终浓度为50mM的三羧乙基膦TCEP溶液；然 后将牛血清白蛋白BSA溶液与三羧乙基膦TCEP溶液等体积混合，得到淀粉 样蛋白质溶液(PTB溶液)，备用；

(2)玻碳电极的预处理

首先利用氧化铝粉末对玻碳电极的界面进行抛光，然后在超声波条件下 依次用水、无水乙醇、水进行清洗，得到预处理后的玻碳电极(GCE)；

(3)PEDOT-IL修饰电极的制备

将预处理后的玻碳电极浸泡于体积比为20:1的3,4-乙烯二氧噻吩EDOT 和离子液体IL 1-乙基-3-甲基咪唑二(氟甲基磺酰)酰亚胺的混合溶液中，在 常温下采用循环伏安法CV在预处理后的玻碳电极表面电沉积导电聚合物复 合物PEDOT-IL，扫描电压为-0.5-1.2V，扫描2圈，得到PEDOT-IL修饰电 极(PEDOT-IL/GCE)；

(4)电化学传感器的组装

将PEDOT-IL修饰电极浸泡在淀粉样蛋白质溶液中常温反应1h，反应结 束后，用去离子水冲洗PEDOT-IL修饰电极表面，除去未自组装的淀粉样蛋白 质，即得电化学传感器(PTB/PEDOT-IL/GCE)。

实施例2

电化学传感器的制备方法，如图1所示，具体包括以下步骤：

(1)淀粉样蛋白质溶液的制备

先将牛血清白蛋白BSA分散于去离子水中，制得终浓度为2mg·mL^-1的 牛血清白蛋白BSA溶液；将三羧乙基膦TCEP分散于去离子水中，并用5M NaOH调节其pH至5.5，制得终浓度为50mM的三羧乙基膦TCEP溶液；然 后将牛血清白蛋白BSA溶液与三羧乙基膦TCEP溶液等体积混合，得到淀粉 样蛋白质溶液(PTB溶液)，备用；

(2)玻碳电极的预处理

首先利用氧化铝粉末对玻碳电极的界面进行抛光，然后在超声波条件下 依次用水、无水乙醇、水进行清洗，得到预处理后的玻碳电极(GCE)；

(3)PEDOT-IL修饰电极的制备

将预处理后的玻碳电极浸泡于体积比为20:1的3,4-乙烯二氧噻吩EDOT 和离子液体IL 1-乙基-3-甲基咪唑二(氟甲基磺酰)酰亚胺的混合溶液中，在 常温下采用循环伏安法CV在预处理后的玻碳电极表面电沉积导电聚合物复 合物PEDOT-IL，扫描电压为-0.5-1.2V，扫描2圈，得到PEDOT-IL修饰电极 (PEDOT-IL/GCE)；

(4)电化学传感器的组装

将PEDOT-IL修饰电极浸泡在淀粉样蛋白质溶液中常温反应1.5h，反应 结束后，用去离子水冲洗PEDOT-IL修饰电极表面，除去未自组装的淀粉样蛋 白质，即得电化学传感器(PTB/PEDOT-IL/GCE)。

实施例3

电化学传感器的制备方法，如图1所示，具体包括以下步骤：

(1)淀粉样蛋白质溶液的制备

先将牛血清白蛋白BSA分散于去离子水中，制得终浓度为2.5mg·mL^-1的牛血清白蛋白BSA溶液；将三羧乙基膦TCEP分散于去离子水中，并用5M NaOH调节其pH至6.0，制得终浓度为50mM的三羧乙基膦TCEP溶液；然 后将牛血清白蛋白BSA溶液与三羧乙基膦TCEP溶液等体积混合，得到淀粉 样蛋白质溶液(PTB溶液)，备用；

(2)玻碳电极的预处理

首先利用氧化铝粉末对玻碳电极的界面进行抛光，然后在超声波条件下 依次用水、无水乙醇、水进行清洗，得到预处理后的玻碳电极(GCE)；

(3)PEDOT-IL修饰电极的制备

将预处理后的玻碳电极浸泡于体积比为20:1的3,4-乙烯二氧噻吩EDOT 和离子液体IL 1-乙基-3-甲基咪唑二(氟甲基磺酰)酰亚胺的混合溶液中，在 常温下采用循环伏安法CV在预处理后的玻碳电极表面电沉积导电聚合物复 合物PEDOT-IL，扫描电压为-0.5-1.2V，扫描2圈，得到PEDOT-IL修饰电 极(PEDOT-IL/GCE)；

(4)电化学传感器的组装

将PEDOT-IL修饰电极浸泡在淀粉样蛋白质溶液中常温反应2h，反应结 束后，用去离子水冲洗PEDOT-IL修饰电极表面，除去未自组装的淀粉样蛋白 质，即得电化学传感器(PTB/PEDOT-IL/GCE)。

性能测试

取实施例2中制得的各种样品，分别进行以下性能测试。

1、PEDOT-IL及PTB/PEDOT-IL修饰电极的表征

首先，利用扫描电镜对PEDOT-IL改性GCE的表面形貌进行表征。不同修 饰电极的扫描电子显微镜图像如图2所示。

由图2A可知，PEDOT-IL薄膜呈多孔、致密的网络结构。其较大的比表面 积为UA分析提供了丰富的反应位点。由图2B可知，在PTB溶液中孵育后， PEDOT-IL表面覆盖了一层相对均匀的薄膜。

其次，利用共聚焦荧光光谱来表征PTB在PEDOT-IL电极上的成功修饰。 ThT作为一种与淀粉样蛋白结合的特殊荧光染料，被用来表征淀粉样蛋白PTB 成功形成。不同修饰电极经ThT染色后的激光共聚焦图像如图3所示。

由图3A和图3B可知，经过ThT染色后，在PEDOT-IL和BSA/PEDOT-IL修 饰电极上未检测到明显的荧光。由图3C可知，PTB修饰电极上显示出明显且 均匀分布的荧光。这些结果表明，BSA成功实现相转变并修饰在PEDOT-IL薄 膜上。

最后，通过电化学测试对电极修饰过程进行表征，对不同的修饰界面进 行循环伏安CV测试，不同工作电极在负电探针[Fe(CN)₆]^3-/4-中的CV响应曲线 如图4所示。

由图4可知，与PEDOT-IL界面相比，裸GCE具有较低的电流信号，这是 由于导电聚合物修饰表面具有良好的导电性和较大的表面积，促进了界面与 电解质之间的电子转移。在PTB进一步固定后，由于PTB涂层的绝缘性能，电 流信号略有下降。也进一步证实了PTB/PEDOT-IL修饰电极的成功制备。

2、淀粉样蛋白质PTB的表征

通过圆二色性CD光谱和荧光光谱验证了PTB的成功生成。牛血清白蛋白 和淀粉样蛋白质的圆二色谱图如图5所示。

由图5曲线a可知，天然BSA的CD光谱在208和222nm处有两个明显的峰， 表明天然BSA为α-螺旋结构。由图5曲线b可知，经过TCEP处理后，两个α-螺 旋峰消失了，在216nm出现了一个与蛋白质β-折叠结构相关的新峰，表明天然 BSA成功相转变为淀粉样蛋白质PTB。

由于ThT与β-折叠结构的蛋白结合后会在484nm处出现荧光增强现象，因 此我们测试了纯ThT、ThT-BSA混合物和ThT-PTB混合物的荧光光谱。不同物 质的荧光光谱图如图6所示，经ThT处理的淀粉样蛋白质随时间变化的荧光光 谱图如图7所示。

由图6可知，ThT-PTB溶液的混合物显示出明显的荧光信号。由图7可知， 随着反应时间的延长，ThT-PTB的荧光强度也随之增加。相反，在纯ThT和 ThT-BSA溶液中几乎没有观察到荧光信号。荧光实验结果也证实了牛血清白 蛋白BSA的成功相变。

3、对尿酸UA的电化学催化行为

用CV法研究所研制的电化学传感器对尿酸的电化学催化行为。裸GCE、 PEDOT-IL/GCE和PTB/PEDOT-IL/GCE在有无UA存在时的CV曲线如图8所 示，i-t响应曲线如图9所示。

由图8可知，在没有UA的情况下，三个界面上均没有明显的氧化还原峰。 而当UA存在时，裸GCE在0.284V处出现弱氧化峰，PEDOT-IL修饰界面在 0.240V处出现强氧化峰，对UA显示出良好的催化能力。这主要是由于导电聚 合物复合材料具有较大的表面积和优良的电子传递能力。PTB固定后，氧化峰 电流略有下降，氧化峰电位出现了小的正位移(0.003V)，这是由于PTB涂 层的导电性能较差，阻碍了UA的电子转移动力学。

由图9可知，安培电流-时间(i-t)测试记录的结果与上述一致。尽管如此， PTB修饰界面对UA仍表现出令人满意的电化学催化反应活性，可以满足UA的 检测要求。

4、实验条件优化

为了获得最佳的防污性能和UA传感性能，对几个重要的实验参数进行了 优化。BSA浓度、BSA相变反应时间和反应pH是影响PTB涂层防污性能的三 个主要因素。牛血清白蛋白浓度的优化图(修饰电极在20％人血清中的信号抑 制率)如图10所示，牛血清白蛋白相转变时间的优化图(修饰电极在20％人血 清中的信号抑制率)如图11所示，TCEP溶液pH的优化图(修饰电极在20％人 血清中的信号抑制率)如图12所示。

由图10-12可知，在20％人血清中孵育30min后，当BSA浓度为2mg·mL^-1、 反应时间为1.5h、反应pH为5.5时，UA传感器的防污性能最佳。

此外，通过i-t测试表征了不同电压下(外加电位范围为0.15～0.4V)防污 电化学传感器对UA的传感性能。不同电势下传感器对尿酸催化的安培响应图 如图13所示。

由图13可知，在0.3V时，电流响应达到最大，选择该电位作为最佳电位。

5、传感器的抗污染性能

选择具有代表性的BSA蛋白质作为干扰物，通过记录传感器在有无BSA 时的电流响应来评估修饰电极对UA的传感性能(I₀和I分别代表加入BSA前后 的电极响应电流信号)不同修饰电极在牛血清白蛋白加入前后的安培响应图 如图14所示。

由图14可知，BSA(5mg·mL^-1)加入后，裸GCE和PEDOT-IL/GCE对UA 的电流响应分别下降了约56.40％和30.86％，而PTB修饰电极的电流降低仅为 10.01％，这是由于PTB涂层具有良好的抵抗蛋白质非特异性吸附的能力。

此外，还探究了不同修饰电极在人血清中的抗污染性能。将裸GCE(A)、 PEDOT-IL/GCE(B)、PTB/PEDOT-IL/GCE(C)浸泡在20％人血清中，对因 生物分子吸附引起的电流响应的变化进行记录并对信号进行线性拟合。不同 修饰电极在人血清中抵抗非特异性吸附的抗污染测试图如图15所示，灵敏度 比如图16所示。

由图15可知，裸的GCE和PEDOT-IL修饰电极在人血清中孵育后出现明显 的电流响应变化，相比之下，PTB/PEDOT-IL修饰电极经人血清处理后对UA 的电流响应基本不变，并得到两条相似的校准曲线，这是因为PTB涂层具有良 好的抗污染能力。

由图16可知，裸GCE、PEDOT-IL/GCE和PTB/PEDOT-IL/GCE在人血清孵 育前后的灵敏度比值(参照校准曲线斜率)分别为19.8％、83.9％和95.1％，进 一步证明了PTB修饰电极在复杂介质中的抗污染能力和实际应用能力。

用荧光显微镜表征了修饰电极对蛋白质的吸附情况，蛋白质在界面吸附 量与荧光信号是成正比的，因此记录荧光强度可反映蛋白质在界面的吸附情 况。不同修饰电极在0.2mg·mL^-1的荧光蛋白质中孵育前后的激光共聚焦图如 图17所示。

由图17可知，在0.2mg·mL^-1FITC-BSA溶液中孵育0～1.5h后，在裸GCE上 观察到最强的荧光信号，其次是PEDOT-IL修饰电极。然而，PTB/PEDOT-IL 修饰电极上几乎未观察到明显的荧光信号，说明了PTB涂层具有良好的防污性 能。

6、尿酸UA的定量检测

在最优的实验条件下，通过i-t测试分析了所构建的电化学传感器对UA的 传感性能。在0.3V的工作电压下，将制备的UA传感器置于连续搅拌的PBS溶 液中并依次注入UA，记录传感器对不同浓度UA的安培响应。尿酸传感器对不 同浓度尿酸的安培响应图如图18所示。

由图18可知，该传感器在较宽的浓度范围下对UA具有良好的响应，线性 检测范围为1.53～563.2μM(R²＝0.9996)，检测限为0.077μM(S/N＝3)。

7、基于淀粉样蛋白质的抗污染传感器的选择性

人血清中共存的其他非目标物，可能会干扰目标物的检测，导致检测精 度较差。因此，选择人血清中常见的乳酸(LA)、葡萄糖(Glu)、尿素、谷 胱甘肽(GSH)、抗坏血酸(AA)和多巴胺(DA)等物质作为干扰物，测试 UA传感器的选择性。尿酸传感器对不同浓度UA、LA、Glu、Urea、GSH的安 培响应图如图19所示，尿酸传感器在含0.56mM的AA、DA和UA的PBS中的DPV信号响应图如图20所示。

由图19可知，即使干扰物浓度比UA高10倍，也未检测到明显的安培响应。

由图20可知，通过氧化峰电位的不同可以很好地区分AA、DA和UA。上 述实验结果均表明，所研制的传感器对尿酸的检测具有良好的选择性。

8、基于淀粉样蛋白质的抗污染传感器的稳定性

PTB/PEDOT-IL涂层的稳定性首先通过连续CV扫描50圈进行监测。尿 酸传感器在连续CV法测试中的稳定性曲线图如图21所示。

由图21可知，50圈CV扫描后，可以观察到几乎重叠的CV曲线，证明 PTB/PEDOT-IL涂层具有良好的稳定性。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用 本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易 见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下， 在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例， 而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种电化学传感器的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)淀粉样蛋白质溶液的制备

将牛血清白蛋白BSA溶液与三羧乙基膦TCEP溶液混合，得到淀粉样蛋白质溶液，备用；

(2)玻碳电极的预处理

首先利用氧化铝粉末对玻碳电极的界面进行抛光，然后在超声波条件下依次用水、无水乙醇、水进行清洗，得到预处理后的玻碳电极；

(3)PEDOT-IL修饰电极的制备

将预处理后的玻碳电极浸泡于3,4-乙烯二氧噻吩EDOT和离子液体IL的混合溶液中，在常温下采用循环伏安法制备PEDOT-IL修饰电极；

(4)电化学传感器的组装

将PEDOT-IL修饰电极浸泡在淀粉样蛋白质溶液中常温反应，即得所述电化学传感器。

2.根据权利要求1所述的一种电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述牛血清白蛋白BSA溶液的浓度不小于1.5mg·mL^-1；所述三羧乙基膦TCEP溶液的pH值为5.5～6.5，浓度不小于50mM；所述牛血清白蛋白BSA溶液和三羧乙基膦TCEP溶液的体积比为1:1。

3.根据权利要求1所述的一种电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述离子液体IL为1-乙基-3-甲基咪唑二(氟甲基磺酰)酰亚胺；所述3,4-乙烯二氧噻吩EDOT和1-乙基-3-甲基咪唑二(氟甲基磺酰)酰亚胺的体积比为20:1。

4.根据权利要求1或3所述的一种电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述循环伏安法的扫描电压为-0.5～1.2V，扫描圈数为2圈。

5.根据权利要求1所述的一种电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述反应的时间不小于1h。

6.根据权利要求1或5所述的一种电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，还包括：反应结束后，用去离子水冲洗PEDOT-IL修饰电极表面，除去未自组装的淀粉样蛋白质。

7.一种如权利要求1-6任一项所述制备方法制得的电化学传感器。

8.一种如权利要求1-6任一项所述制备方法制得的电化学传感器在尿酸UA定量检测中的应用。

9.根据权利要求8所述的一种电化学传感器在尿酸UA检测中的应用，其特征在于，所述定量检测具体为：将电化学传感器置于PBS缓冲液中，并施加磁力搅拌，通过i-t测试记录电流信号，待电流信号稳定后，依次加入不同浓度的目标物尿酸UA，并连续记录电化学传感器的电流响应，以实现对目标物尿酸UA的检测；

所述依次加入不同浓度的目标物尿酸UA的时间间隔为20～50s；

所述尿酸UA的线性检测范围为1.53～563.2μM，最低检测限为0.77μM(S/N＝3)。

10.一种如权利要求1-6任一项所述制备方法制得的电化学传感器在血清样品检测中的应用。

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