CN108535344A - 一种用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器及其构建方法 - Google Patents

一种用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于电化学检测磷酸化β‑淀粉样蛋白的生物传感器及其构建方法。将金电极与巯基羧酸类化合物反应，在金电极表面修饰羧基；采用EDC/NHS混合溶液将金电极表面修饰的羧基活化，再将活化羧基与Aβ抗体进行酰胺化反应，酰胺化反应完成后，采用乙醇胺封闭金电极表面的未反应位点，即在金电极表面修饰Aβ抗体；将表面修饰Aβ抗体的金电极先与磷酸化β‑淀粉样蛋白进行抗体抗原反应，再与Ti4+‑TiP‑Cd2+信号探针纳米粒子进行螯合反应，即得直接用于电化学检测的生物传感器，该生物传感器能实现磷酸化β‑淀粉样蛋白定量检测，且检测方法简单，灵敏度高，有利于推广使用。

Description

一种用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器及其 构建方法
技术领域
本发明涉及一种生物传感器，特别涉及一种高灵敏度电化学检测磷酸化β- 淀粉样蛋白生物传感器，及其构建方法，属于生物传感技术领域。
背景技术
阿尔茨海默症已经成为二十一世纪威胁人类健康的重大疾病之一，它是一种神经系统退行性疾病，特点为认知能力逐步下降，不可逆的有害的障碍以及可观察到的记忆障碍。淀粉样β-蛋白(Aβ)是存在于阿尔茨海默病(AD)患者脑中淀粉状蛋白斑块的主要蛋白组分，淀粉状蛋白斑块的形成与淀粉样β-蛋白的逐步积累有关。而淀粉样β-蛋白聚集物中存在特别丰富的磷酸化修饰，有研究表明，细胞外的Aβ在蛋白激酶的分泌变体磷酸化。Aβ丝氨酸(Ser)8残基的磷酸化促进其聚集成寡聚体和纤维状组装体。Ser8的磷酸化也减弱了某些蛋白酶对Aβ的蛋白水解降解以及小胶质细胞的清除。研究显示，通过使用pSer8Aβ特异性单克隆抗体，早期神经元聚集在转基因小鼠和人脑中pSer8Aβ的聚集增加。这些发现突出了Aβ磷酸化在AD发病机制中的合理作用。
Aβ也可以在Ser26上进行磷酸化，从而调节其在体外的聚集。研究Ser26 磷酸化对人类AD大脑和转基因小鼠模型的聚集，毒性及其存在的影响。证明了人类和转基因小鼠大脑中Ser26磷酸化Aβ的特殊沉积，其与针对其他Aβ物种所观察到的不同。值得注意的是，Ser26上Aβ的磷酸化强烈促进了低分子量可溶性Aβ寡聚体的形成和稳定化，并且对人神经元具有增加的毒性。
目前，国内外对于Aβ磷酸化的研究主要在于其在AD发病机制中的合理作用，也就是主要致力于机理研究，而对于Aβ磷酸化的定量研究尚未成为研究热点。因此发明一种能快速检测P-Aβ的含量，且灵敏性高，易于操作，并能特异性识别P-Aβ的方法就显得尤为重要。但由于实际样本中磷酸根大背景的干扰，如果检测方法不能准确的识别P-Aβ，会使其灵敏性降低，而且使用磷酸化抗体会大大增加检测成本。所以设计一个高灵敏度，高特异性检测P-Aβ分子的方法具有显著的应用前景。
发明内容
针对现有技术中对P-Aβ的检测手段存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种抗干扰能力强、检测限低、具有特异性识别、检测灵敏度高的用于电化学方法检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器。
本发明的另一个目的是在于提供一种操作简单、低成本的构建所述生物传感器的方法。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器的构建方法，其包括以下步骤：
1)将金电极与巯基羧酸类化合物反应，在金电极表面修饰羧基；
2)采用EDC/NHS混合溶液将金电极表面修饰的羧基活化，再将活化羧基与Aβ抗体进行酰胺化反应，酰胺化反应完成后，采用乙醇胺封闭金电极表面的未反应位点，即在金电极表面修饰Aβ抗体；
3)将表面修饰Aβ抗体的金电极先与磷酸化β-淀粉样蛋白进行抗体抗原反应，再与Ti4+-TiP-Cd2+信号探针纳米粒子进行螯合反应，即得。
优选的方案，金电极浸泡在含巯基羧酸类化合物的溶液中反应12～14h，使巯基羧酸类化合物的巯基与金电极表面反应。
较优选的方案，所述巯基羧酸类化合物为含巯基端基的饱和脂肪酸，如11- 巯基十一烷酸等。
优选的方案，所述酰胺化反应是在室温条件下反应2.5～4h。
优选的方案，所述抗体抗原反应是在室温条件下反应0.5～1.5h。
优选的方案，所述Ti4+-TiP-Cd2+信号探针纳米粒子通过如下方法制备得到：将多库酯钠盐醇溶液与H3PO4溶液反应后，分离除去沉淀物，在所得反应液中滴入有机钛盐醇溶液中，超声分散，在70～90℃温度下搅拌反应1.5～2.5h，得到TiP 纳米粒子；所述TiP纳米粒子与镉盐溶液在室温下反应4～6h，得到TiP-Cd2+纳米粒子；所述TiP-Cd2+纳米粒子与钛盐溶液反应0.5～1.5h，即得。该优选的方案通过严格控制反应条件可以获得粒径大小均匀，且粒径在50纳米左右的TiP-Cd2+纳米粒子，特别适合作为用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的探针使用。较优选的方案多库酯钠盐醇溶液中多库酯钠盐的浓度为0.1～0.2g/mL。有机钛盐醇溶液中有机钛盐的浓度为0.01～0.1g/mL。镉盐溶液的浓度为5～20mM。钛盐溶液的浓度为5～20mM。
优选的方案，所述螯合反应是在室温条件下反应1～1.5h。
本发明还提供了一种用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器，其由所述的构建方法得到。
本发明的用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器的构建方法，包括以下具体步骤：
1)将金电极浸泡在含11-巯基十一烷酸(MUA)的乙醇溶液中，室温环境中反应12～14h，得到MUA修饰的金电极；
2)将MUA修饰的金电极用EDC/NHS混合溶液对MUA羧基进行活化 20～60min后与Aβ抗体在室温条件下进行酰胺化反应2.5～4h；
3)进行酰胺化反应后的金电极，采用乙醇胺盐酸盐封闭未反应位点；
4)将封闭后的电极与磷酸化β-淀粉样蛋白在室温条件下进行抗体抗原反应 0.5～1.5h，再与Ti4+-TiP-Cd2+信号探针纳米粒子在室温条件下进行螯合反应1～1.5h，即得到直接用于检测的生物传感器。
本发明的生物传感器用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的方法：
将表面修饰Aβ抗体的金电极与一系列不同浓度(1fM、10fM、100fM、1 pM、10pM、100pM、1nM、10nM、20nM)的磷酸化β-淀粉样蛋白进行抗体抗原反应，再与Ti4+-TiP-Cd2+信号探针纳米粒子进行螯合反应，螯合反应完成后，将电极置于HAc/NaAc(pH4.6，0.2M)缓冲溶液中测量方波伏安，得到一系列电化学响应值，建立磷酸化β-淀粉样蛋白浓度值对应电化学响应值的标准曲线；对待测液进行检测并依据标准曲线进行分析，即得到待测液中磷酸化β-淀粉样蛋白的浓度。
本发明的技术方案基于金属离子功能化的磷酸钛纳米球(Ti4+-TiP-Cd2+)对 P-Aβ的特异性识别，实现对固定在电极表面的P-Aβ的定量检测，其中Ti4+用于特异性螯合磷酸化Aβ，Cd2+为电化学信号分子。本发明的Ti4+-TiP-Cd2+纳米粒子的粒径为约50nm。
本发明的Ti4+-TiP-Cd2+信号探针纳米粒子的制备过程为：将2.5g多库酯钠盐(AOT)溶解在16mL乙醇中，再加入3mL H3PO4得到混浊溶液，除去沉淀物。然后将钛酸四丁酯(TBOT)与乙醇(0.875g/12.5g)的混合物快速滴入AOT /乙醇溶液中，借助超声波获得稳定的混合溶液；将混合物在80℃下搅拌2h；固体产物用乙醇和去离子水洗涤数次后干燥得到TiP纳米粒子；所述TiP纳米粒子再与Cd(NO3)2溶液反应4～6h，得到TiP-Cd2+纳米粒子；将TiP-Cd2+纳米粒子与Ti(SO4)2溶液反应1h，即得到Ti4+-TiP-Cd2+信号探针纳米粒子。
本发明的生物传感器检测固定在电极表面的磷酸化β-淀粉样蛋白，有效降低了实际样本中磷酸根大背景的干扰，具有更高的特异性和识别力，检测的灵敏度更高。
本发明的所用药品和试剂无特殊说明均直接通过购买得到，如西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
本发明采用的Ti4+-TiP-Cd2+信号探针纳米粒子中，Ti4+的作用为特异性螯合磷酸根；而Cd2+是信号分子，于HAc/NaAc(pH4.6，0.2mol/L)缓冲溶液中测量方波伏安，在-0.5V左右会有明显的氧化峰值。
本发明的构建的生物传感器的检测原理是基于金属离子功能化的磷酸钛纳米球(Ti4+-TiP-Cd2+)对P-Aβ的特异性识别，实现对固定在电极表面的P-Aβ的定量检测，其中Ti4+用于特异性螯合磷酸化Aβ，Cd2+为电化学信号分子，于HAc/NaAc(pH4.6，0.2mol/L)缓冲溶液中测量方波伏安，在-0.5V左右会有明显的氧化峰值。
相对现有技术，本发明的技术方案优点在于：
1)本发明的生物传感器的构建采用的是β-淀粉样蛋白对应的抗体，没有干扰物质，检测限低，具有特异性识别，检测灵敏度更高。
2)本发明的生物传感器将磷酸化β-淀粉样蛋白固定在金电极表面，在电化学检测过程中，有效降低了实际样本中磷酸根大背景的干扰，具有更高的特异性和识别力，检测的灵敏度更高。
3)本发明的生物传感器的构建及用于磷酸化β-淀粉样蛋白的检测过程简单、重复性好。
4)本发明的生物传感器中的Ti4+-TiP-Cd2+信号探针直接被磷酸化β-淀粉样蛋白捕捉，因此可直接用来检测标志物，且不需要使用磷酸化抗体，成本更低。
附图说明
图1为本发明检测检测磷酸化β-淀粉样蛋白的原理示意图；
图2为制备的TiP纳米粒子的透射电子显微镜图；
图3为制备的Ti4+-TiP-Cd2+纳米粒子的X射线光电子能谱分析图；
图4为检测不同浓度标志物的方波伏安SWV电化学检测曲线；
图5为通过方波伏安SWV电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白标准液建立磷酸化β-淀粉样蛋白浓度值对应电化学响应值的标准曲线；
图6为传感器的选择性。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。
实施例1
(1)Ti4+-TiP-Cd2+信号探针纳米粒子的制备
首先将2.5g多库酯钠盐(AOT)溶解于16mL乙醇中，再加入3mL H3PO4得到混浊溶液，除去沉淀物。然后将钛酸四丁酯(TBOT)与乙醇(0.875g/12.5 g)的混合物快速滴入AOT/乙醇溶液中，借助超声波获得稳定的混合溶液。将混合物在80℃下冷凝回流搅拌反应2h。固体产物用乙醇和去离子水洗涤数次后干燥得到TiP纳米粒子；将0.5mL TiP纳米球(40mg/mL)分散在15mL 的 10mMCd(NO3)2溶液中反应4～6h，得到TiP-Cd2+纳米粒子；再将TiP-Cd2+纳米粒子与10mM的Ti(SO4)2溶液反应1h，即得到粒径均匀，平均粒径约为50nm 的Ti4+-TiP-Cd2+信号探针纳米粒子。
(2)在金电极上修饰MUA
先将MUA溶解于乙醇溶液中，所得浓度为4mM，取100μL于小型离心管中，倒扣在电极上，使电极完全浸泡在MUA溶液中。室温环境下放置13.5h，使之形成Au-S键，即得到MUA修饰的金电极。
(3)Aβ抗体与电极表面的连接
分别配制0.4M的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)水溶液和0.1M的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)水溶液，将两种溶液等体积混合，取30μL于MUA修饰的金电极上活化MUA的羧基30min，活化后取10μL1μM Aβ抗体于电极上反应3h，使抗体上氨基与羧基完成羧氨反应，从而使Aβ抗体连接到电极表面。之后用50μL0.5M乙醇胺盐酸盐溶液对未反应的羧基位点进行封闭，防止非特异性结合。
(4)建立标准曲线
将不同浓度(1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、 20nM)的磷酸化β-淀粉样蛋白修饰到连接Aβ抗体且封闭后的金电极表面，分别依次与以上制备的Ti4+-TiP-Cd2+信号探针纳米粒子反应1h后，于HAc/NaAc (pH4.6，0.2M)缓冲溶液中测量方波伏安，不同浓度得到不同的电化学SWV 响应信号，从而建立标准曲线。
从图2可以看出纳米粒子是颗粒均匀的球形，分散均匀，粒径在50nm左右，说明纳米粒子制备成功。
从图3可以看出纳米粒子中存在特异性螯合磷酸根的Ti4+离子以及Cd2+信号分子。
从图4中可以看出随着修饰磷酸化β-淀粉样蛋白浓度的增加，电化学SWV 响应值逐渐增大。
从图5中可以看出在一定范围内磷酸化β-淀粉样蛋白浓度越大，其电化学 SWV响应值越大，达到某一浓度后会趋于平衡，从插图中可以看出：在低浓度范围内有很好的线性关系。
从图6中可以看出传感器选择性优异。
从表1中可以看出传感器应用于实际检测也是可行的。
表1 P-Aβ40回收率的测定(人造脑脊液中)
样品 加入浓度(nM) 实际结果(nM) RSD％(n＝3) 回收率(％)
ACSF - - - -
1 0.001 0.0009±0.0002 7.28 90
2 0.01 0.0105±0.0017 9.61 105
3 0.1 0.0987±0.0046 6.59 98.7

Claims (8)

1.一种用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将金电极与巯基羧酸类化合物反应，在金电极表面修饰羧基；
2)采用EDC/NHS混合溶液将金电极表面修饰的羧基活化，再将活化羧基与Aβ抗体进行酰胺化反应，酰胺化反应完成后，采用乙醇胺封闭金电极表面的未反应位点，即在金电极表面修饰Aβ抗体；
3)将表面修饰Aβ抗体的金电极先与磷酸化β-淀粉样蛋白进行抗体抗原反应，再与Ti4+-TiP-Cd2+信号探针纳米粒子进行螯合反应，即得。
2.根据权利要求1所述的一种用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器的构建方法，其特征在于：金电极浸泡在含巯基羧酸类化合物的溶液中反应12～14h，使巯基羧酸类化合物的巯基与金电极表面反应。
3.根据权利要求2所述的一种用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器的构建方法，其特征在于：所述巯基羧酸类化合物为含巯基端基的饱和脂肪酸。
4.根据权利要求1所述的一种用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器的构建方法，其特征在于：所述酰胺化反应是在室温条件下反应2.5～4h。
5.根据权利要求1所述的一种用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器的构建方法，其特征在于：所述抗体抗原反应是在室温条件下反应0.5～1.5h。
6.根据权利要求1所述的一种用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器的构建方法，其特征在于：所述Ti4+-TiP-Cd2+信号探针纳米粒子通过如下方法制备得到：将多库酯钠盐醇溶液与H3PO4溶液反应后，分离除去沉淀物，在所得所得反应液中滴入有机钛盐醇溶液中，超声分散，在70～90℃温度下搅拌反应1.5～2.5h，得到TiP纳米粒子；所述TiP纳米粒子与镉盐溶液在室温下反应4～6h，得到TiP-Cd2+纳米粒子；所述TiP-Cd2+纳米粒子与钛盐溶液反应0.5～1.5h，即得。
7.根据权利要求1所述的一种用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器的构建方法，其特征在于：所述螯合反应是在室温条件下反应1～1.5h。
8.一种用于电化学检测磷酸化β-淀粉样蛋白的生物传感器，其特征在于：由权利要求1～7任一项所述的构建方法得到。
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