CN102426154A - 一种比色传感器的制备方法、由该方法制备的产品及其产品的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学生物传感器技术领域,公开了一种比色传感器的制备方法、由该方法制备的产品及其产品的应用。本发明公开的比色传感器的制备方法包括以下步骤:(1)在单口瓶中,将水合氯金酸加热至沸腾,加入柠檬酸三钠,水合氯金酸与柠檬酸三钠的摩尔比为1∶1~1∶8,继续加热10~50min,停止反应;(2)将步骤(1)所得的金纳米粒子与对巯基苯硼酸和3,3′-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)混合超声1~50min,对巯基苯硼酸与3,3′-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)的体积比为20∶1~1∶20,得到比色传感器。本发明还公开了将上述的比色传感器用于脑多巴胺检测的方法。本发明方法实现了活体检测,具有双重识别功能、选择性好、检出限低和灵敏度高等优点。
Description
技术领域
本发明属于化学生物传感器技术领域,涉及一种比色传感器的制备方法、由该方法制备的产品及其产品的应用。
背景技术
神经递质是神经细胞产生的化学信号,在高等动物通讯中占有非常重要的地位,脑内多巴胺是关键的神经递质和调质,是多种认知功能和精神活动的有力调节者。因此对脑内多巴胺快速灵敏的选择性检测对帕金森、抑郁症等疾病的治疗显得尤为重要。多巴胺的传统检测有电化学方法、高效液相色谱电化学方法、毛细管电泳电化学检测(CE-ECD)法。但这些方法检测过程复杂,又易受抗坏血酸、尿酸等与多巴胺电位相近物质的干扰。所以迫切的需要开发一种简单方便准确迅速的检测方法对多巴胺进行选择性检测。
纳米技术与化学、生物学、物理学和医学等领域的结合对分析科学和生命科学领域的超灵敏检测和成像方法的发展起着越来越重要的作用(M.C.Daniel,D.Astruc,Chem.Rev.,2004,104,293-346.;N.L.Rosi,C.A.Mirkin,Chem.Rev.,2005,105,1547-1562;Z.Wang,L.Ma,Coord.Chem.Rev.,2009,253,1607-1618.)。由于AuNPs具有独特的光学性质(表面等离子体吸收和共振光散射)、易进行表面修饰以及良好的生物相容性(通常认为裸AuNPs是无生物毒性的,而修饰后的AuNPs的生物毒性由其配体决定),因此功能化AuNPs的应用领域不断被拓宽,特别是其在生物分析和生物医药等领域的应用引起了人们广泛关注(M.C.Daniel,D.Astruc,Chem.Rev.,2004,104,293~346;E.Katz,I.Willner,Angew.Chem.Int.Ed.,2004,43,6042~6108.)。
1996年美国西北大学纳米技术研究所纳米装配和分子自组装中心C.A.Mirkin教授领导的研究小组(R.Elghanian,J.J.Storhoff,R.C.Mucic,R.L.Letsinger,C.A.Mirkin,Science,1997,277,1078-1081.),基于金纳米粒子间耦合等离子共振效应,通过寡聚核苷酸修饰金纳米粒子,开发了一种DNA传感器在纳米金微粒来识别DNA方面进行了开创性的工作。以此为契机,开始了金纳米粒子比色传感的新纪元。国内外研究人员基于此技术分别开发了核酸、蛋白质、金属离子及其他小分子比色传感器。近年来,基于AuNPs的比色法已经被广泛应用于有毒重金属离子(Pb2+、Cd2+和Hg2+等)的检测(H.K.Kim,I.Rasnik,J.W.Liu,T.J.Ha,Y.Lu,Nat.Chem.Biol.,2007,3,763~768.;Z.Wang,J.H.Lee,Y.Lu,Adv.Mater.,2008,20,3263~3267.),化学小分子检测,DNA检测,蛋白质分析,细胞分析等领域。特别是Lu等发明了一种基于DNAzyme修饰的AuNPs比色传感器,可以快速、简单、实时及线性范围可调的检测重金属离子Pb2+,这种传感器对Pb2+的检出限达到3nM,远远低于美国环境保护局(EPA)对饮用水中Pb2+浓度的检出限值。Willner等发明了另一种基于DNA修饰的AuNPs探针检测Hg2+的比色方法,这种方法灵敏度更高,检出限可达1nM(0.2ppb)(D.Li,A.Wieckowska,I.Willner,Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47,3927~3931.)。2007年科学家发展了基于适配子修饰的AuNPs比色法并应用于小分子(腺苷、可卡因等)检测也引起了人们的广泛关注(J.Liu,Y.Lu,J.Am.Chem.Soc.,2007,129,8634~8643.;W.Zhao,W.Chiuman,J.C.F.Lam,S.A.McManus,Chen W.,Cui Y.,J.Am.Chem.Soc.,2008,130,3610~3618.),如Zhou等人用适配子修饰的AuNPs设计了一种“preudo”夹心反应,能够通过SPR光谱检测小分子腺苷(J.Wang,H.S.Zhou,Anal.Chem.,2008,80,7174~7178.)。AuNPs与蛋白质结合获得用于电子显微镜的AuNPs探针,在电子显微镜甚至光学显微镜水平上对抗原、抗体进行定位、定性直至定量研究,是AuNPs应用于免疫细胞和组织化学的重要里程碑(S.Gupta,S.Huda,P.K.Kilpatrick,O.D.Velev,Anal.Chem.,2007,79,3810~3820.;I.Maier,M.R.A.Morgan,W.Lindner,F.Pittner,Anal.Chem.,2008,80,2694~2703.)。尽管目前国内外研究人员对金纳米粒子的分子识别比色传感器有过诸多研究,但能够对于神经递质的进行选择性可视化的检测的传感器的研究还很少,并将其用于对神经递质的检测还未见报道。
发明内容
针对现有技术的问题,本发明的目的是提供一种比色传感器的制备方法,由该方法制备的比色传感器可应用于脑多巴胺的检测中。
本发明的另一个目的是提供一种由上述制备方法制备的比色传感器。
本发明的第三个目的是提供一种将上述比色传感器用于脑多巴胺检测的方法。
本发明的技术方案如下:
本发明提供了一种比色传感器的制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)在单口瓶中,将水合氯金酸加热至沸腾,加入柠檬酸三钠,水合氯金酸与柠檬酸三钠的摩尔比为1∶1~1∶8,继续加热10~50min,停止反应;
(2)将步骤(1)所得的金纳米粒子与对巯基苯硼酸(MBA)和3,3′-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DSP)混合超声1~50min,对巯基苯硼酸(MBA)与3,3′-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DSP)的体积比为20∶1~1∶20,得到比色传感器(MBA-DSP-AuNPs)。
本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的比色传感器,该比色传感器是通过对巯基苯硼酸(MBA)和3,3′-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DSP)双分子修饰的金纳米粒子。
所述的金纳米粒子大小为10~15nm,呈均一单分散球状。
本发明还提供了将上述比色传感器用于脑多巴胺检测的方法,该方法包括以下步骤:将含有脑多巴胺的样品进行微透析滤膜过滤,去除大分子蛋白物质;对所得样品取样进行保存;对所保存样品进行在线透析检测。
所述的保存是将透析液样本存放在一个即时分析冰浴或冷冻瓶中备用。
所述的在线透析检测是将透析液样本5μL加入MBA-DSP-AuNPs比色传感器中,在室温下培育5分钟,用紫外可见光谱进行实时观测。
本发明同现有技术相比,具有如下优点和有益效果:
1、本发明实现活体检测:首次对含多巴胺的透析取样样品进行微量实时可视化选择性检测,实现鼠脑微透析样品迅速灵敏的可视化检测。
2、本发明实现了双重识别:所述的修饰探针比色传感器为双分子或者多分子修饰,具有多重识别功能,提高了对检测物质的选择性,保证了结果的准确性;即本发明金纳米粒子MBA-DSP-AuNPs比色传感器具有多重识别功能。
3、本发明的选择性好:超声条件下选择性的进行双分子修饰,与传统的单分子修饰相比,具有多重识别功能,提高对检测物质的选择性,保证结果的准确性;即本发明金纳米粒子MBA-DSP-AuNPs比色传感器具有多重识别功能;所述的MBA-DSP-AuNPs比色传感器具有多重识别功能,进而提高了探针的选择性,保证了检测结果的准确性。
4、本发明的检出限低、灵敏度高:进一步,通过对巯基苯硼酸4-Mercaptophenyl-boronicacid(MBA)和3,3′-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)dithiobis[succinimidylpropionate](DSP)双分子修饰贵金属金纳米粒子使金纳米探针具有双重识别功能,进而提高了探针的选择性。进一步,通过探针优化降低检测限,为应用于临床研究提供可能;同时,所述MBA-DSP-AuNPs比色传感器基于金纳米粒子间耦合等离子共振效应,与传统的有机发色团相比具有极高的消光系数,因而提高检测的灵敏度,进一步扩大了检测的应用范围。
5、本发明实现了可视化直观检测:所述MBA-DSP-AuNPs比色传感器是基于金纳米粒子间耦合等离子共振效应,根据待检测物质的浓度呈现出不同的颜色变化为可视化检测提供了可能,可视化检测无需借助大型仪器。
6、本发明实现了简便快速检测:所述MBA-DSP-AuNPs比色传感器简化了神经递质多巴胺的检测程序,缩短了神经递质多巴胺的检测时间。
7、本发明构建了能够简单方便、灵敏、快速检测的传感器,金纳米粒子间耦合等离子共振效应用于神经递质多巴胺的检测,提高检测的灵敏度;金纳米粒子等离子共振效应呈现出不同的颜色变化为可视化检测提供了可能,这种可视化检测无需借助大型仪器,简化了神经递质多巴胺的检测程序,缩短了神经递质多巴胺的检测时间。
8、本发明微量MBA-DSP-AuNPs比色传感器探针的应用极大的降低了神经递质多巴胺的成本;通过MBA-DSP双分子修饰贵金属金纳米粒子使金纳米探针具有双重识别功能,进而提高了探针的选择性;金纳米粒子间耦合等离子共振效应用于神经递质多巴胺的检测提高检测的灵敏度;金纳米粒子等离子共振效应呈现出不同的颜色变化为可视化检测提供了可能,可视化检测无需借助大型仪器,简化了神经递质多巴胺的检测程序和缩短了神经递质多巴胺的检测时间,本研究能够为帕金森等重大疾病的诊断提供帮助;并且本发明的双重比色传感器从设计、合成、优化,尤其通过微透析方法对活体的检测方法有望推广到对其它物质的检测,并且有望应用于重大疾病的临床研究,具有广阔的市场应用前景。
附图说明
图1是实施例1中制备的金纳米粒子AuNPs相应的高清透射电子显微镜HR-TEM图。
图2是实施例1的MBA-DSP-AuNPs比色传感器与浓度为150nM的多巴胺(DA)相应的高清透射电子显微镜HR-TEM图。
图3是图1所示MBA-DSP-AuNPs比色传感器表面修饰前后S元素的XPS图谱(X射线光电子能谱)。
图4是图1所示MBA-DSP-AuNPs比色传感器表面修饰前后N元素的XPS图谱(X射线光电子能谱)。
图5是图1所示MBA-DSP-AuNPs比色传感器表面修饰前后B元素的XPS图谱(X射线光电子能谱)。
图6是图1所示MBA-DSP-AuNPs比色传感器中在不同浓度多巴胺的紫外可见光谱数据。
图7是图1所示MBA-DSP-AuNPs比色传感器对小白鼠微透析样品中多巴胺的紫外可见光谱数据。
具体实施方式
以下结合附图所示实施例对本发明作进一步的说明。
水合氯金酸,柠檬酸三钠,对巯基苯硼酸(MBA)和3,3′-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DSP)购买于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司,高纯水(18.2MΩcm-1)制备于Milli-Q超纯水系统美国Millipore公司。
实施例1
比色传感器制备:根据本发明方法制备的MBA-DSP-AuNPs多重识别比色传感器,包括以下步骤:
①制备过程中所使用到的所有玻璃仪器均用王水(HCl∶HNO3=3∶1)清洗,然后用高纯去离子水(18.2MΩcm-1)冲洗干净,鼓风干燥箱中风干。
②在单口瓶中,将10ml 1mmol/L HAuCl4加热至沸腾,迅速加入1ml 38.8mmol/L柠檬酸三钠。搅拌下继续加热30min至呈酒红色,停止反应,所得的金纳米粒子AuNPs通过高清透射电子显微镜HR-TEM图1观察。
图1为本实施例中制备的金纳米粒子AuNPs相应的高清透射电子显微镜HR-TEM图,从该图中,可以看出所得的金纳米粒子AuNPs呈均一的单分散球状纳米粒子,粒径均一,大小约为10~15nm。
③将步骤②所得金纳米粒子超声下与对巯基苯硼酸(MBA)和3,3′-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DSP)混合超声30min,对巯基苯硼酸(MBA)与3,3′-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DSP)的体积比为(1/3,1/2,1/1,2/1,3/1),得到比色传感器(MBA-DSP-AuNPs)。
图2是本实施例的MBA-DSP-AuNPs比色传感器与浓度为150nM的多巴胺(DA)相应的高清透射电子显微镜HR-TEM图。能够清晰地看出在DA分子诱导下MBA-DSP-AuNPs比色传感器能够发生聚集,进而影响探针的粒子间等离子共振效应,给出灵敏的选择性信号。
将优化后双分子体积比为1/2时所得的MBA-DSP-AuNPs溶液用X-射线电子能谱仪分析(XPS)光谱进行表面元素表征,所得结果如图3、图4和图5所示。图3是图1所示MBA-DSP-AuNPs比色传感器表面修饰前后S元素的XPS图谱(X射线光电子能谱)。通过图3S2p XPS光谱图可以看出,MBA与DSP分子中的S2p元素共价结合到AuNPs表面。图4是图1所示MBA-DSP-AuNPs比色传感器表面修饰前后N元素的XPS图谱(X射线光电子能谱)。通过图4N1s XPS光谱图可以看出,DSP分子中N元素共价结合到AuNPs表面。图5是图1所示MBA-DSP-AuNPs比色传感器表面修饰前后B元素的XPS图谱(X射线光电子能谱)。通过图5B1s XPS光谱图可以看出,MBA分子中B元素共价结合到AuNPs表面。综上图3,4,5分析,可以明显看出MBA与DSP均共价结合到AuNPs表面。
MBA-DSP-AuNPs溶液的吸光度用紫外可见光谱进行观测。图6是图1所示MBA-DSP-AuNPs比色传感器中在不同浓度多巴胺的紫外可见光谱数据。通过图6MBA-DSP-AuNPs传感器对不同浓度DA紫外光谱图可以看出MBA-DSP-AuNPs传感器对不同浓度DA 0nm(图6,线1),185nm(图6,线2),235nm(图6,线3),255nm(图6,线4),275nm(图6,线5),and 305nm(图6,线6)具有极高的灵敏度。
实施例2
比色传感器在脑多巴胺检测中应用:包括以下步骤:
①雄性大鼠饲养。
②雄性大鼠麻醉与固定:(250-350克)通过水合氯醛麻醉(初始剂量300毫克/公斤水合氯醛麻醉,随后逐渐加入50毫克/公斤水合氯醛麻醉来需要维持麻醉剂量)和包裹在恒温毯里。
③雄性大鼠微透析取样:大鼠被放置在一个立体框架结构在5毫米以上的双耳线设置门牙栏,并通过颅骨适当钻孔。微透析抽样程序是用微透析泵和液体开关。透析探针在大脑中植入了30分钟的时间内到以下坐标:2.5毫米至前囟,从中线外侧2.5毫米和7.0毫米以下的硬脑膜。该探针以0.5μL/min灌注至少2小时之后,将含有脑多巴胺的样品进行微透析滤膜过滤,去除大分子蛋白物质,随后进行采集样本进行分析。
④雄性大鼠微透析取样样品保存:透析液样本被存放在一个即时分析冰浴或冷冻瓶中供日后使用。
⑤在线鼠脑微透析样品检测:5μL透析液样本加入170μL优化的MBA-DSP-AuNPs比色传感器(MBA∶DSP=1∶2)试剂中,在室温下培育5分钟,同时,用紫外可见光谱进行实时观测。
从上述实施实例可以看出,将MBA-DSP-AuNPs比色传感器在神经递质检测中,可以实现对鼠脑微透析取样样品中神经递质多巴胺进行微量实时可视化选择性检测,我们随意抽取三组小白鼠的常态下的微透析样品进行检测,当微透析样品加入到MBA-DSP-AuNPs比色传感器溶液中5min内,MBA-DSP-AuNPs比色传感器呈现出较为明显的颜色变化,我们同时对其进行光谱观察,其检测结果如图7所示。图7是图1所示MBA-DSP-AuNPs比色传感器对小白鼠鼠脑在刺激状态下0min(图7,线1),10min(图7,线2),30min(图7,线3),50min(图7,线4),注射nomifensine后(图7,线5)微透析样品中多巴胺的紫外可见光谱数据,可以看出MBA-DSP-AuNPs比色传感器对复杂的微透析样品具有极好的选择性。
为了分析传感器对微透析样品检测准确性,我们同时将同组样品通过传统方法HPLC-EC检测,其检测结果如表1所示,从检测结果可以看出MBA-DSP-AuNPs比色传感器能够检测nM水平的DA分子,检测过程快速准确重现性好,并且首次实现了可视化的对神经递质多巴胺进行选择性检测。
表1
分析样品(nM) | 样品1 | 样品2 | 样品3 |
本发明方法 | 10.5 | 12.7 | 9.1 |
HPLC-EC法 | 9.3 | 12.3 | 8.8 |
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于这里的实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种比色传感器的制备方法,其特征在于:该方法包括以下步骤:
(1)在单口瓶中,将水合氯金酸加热至沸腾,加入柠檬酸三钠,水合氯金酸与柠檬酸三钠的摩尔比为1∶1~1∶8,继续加热10~50min,停止反应;
(2)将步骤(1)所得的金纳米粒子与对巯基苯硼酸和3,3′-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)混合超声1~50min,对巯基苯硼酸与3,3′-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)的体积比为20∶1~1∶20,得到比色传感器。
2.根据权利要求1所述的方法制备得到的比色传感器,其特征在于:该比色传感器是通过对巯基苯硼酸和3,3′-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)双分子修饰的金纳米粒子。
3.根据权利要求2所述的比色传感器,其特征在于:所述的金纳米粒子大小为10~15nm,呈均一单分散球状。
4.权利要求2或3所述的比色传感器用于脑多巴胺检测的方法,其特征在于:该方法包括以下步骤:将含有脑多巴胺的样品进行微透析滤膜过滤,去除大分子蛋白物质;对所得样品取样进行保存;对所保存样品进行在线透析检测。
5.根据权利要求4所述的比色传感器用于脑多巴胺检测的方法,其特征在于:所述的保存是将透析液样本存放在一个即时分析冰浴或冷冻瓶中备用。
6.根据权利要求4所述的比色传感器用于脑多巴胺检测的方法,其特征在于:所述的在线透析检测是将透析液样本5μL加入MBA-DSP-AuNPs比色传感器中,在室温下培育5分钟,用紫外可见光谱进行实时观测。
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