CN110873693A - 待测物浓度的测定方法及套组 - Google Patents

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CN110873693A CN201811009110.9A CN201811009110A CN110873693A CN 110873693 A CN110873693 A CN 110873693A CN 201811009110 A CN201811009110 A CN 201811009110A CN 110873693 A CN110873693 A CN 110873693A
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Abstract

本发明提供一种待测物浓度的测定方法，其包含：使其中包含待测物的待测溶液与其中包含多个纳米粒子的纳米粒子溶液以及光波导组件反应以形成三明治结构；以及利用光侦检器测量所述的多个纳米粒子形成三明治结构后的吸收或散射所述的光波导组件的渐逝波能量以获得第一信号，并通过所述的第一信号算出待测物浓度，其中每一个纳米粒子的表面上皆修饰有侦测辨识元，且光波导组件的表面上修饰有捕获辨识元。

Description

待测物浓度的测定方法及套组
技术领域
本发明是关于一种待测物浓度的测定方法以及套组，特别是关于利用光波导组件的一种待测物浓度的测定方法以及套组。
背景技术
生物分子检测、医药检测、食品检测、农产品检测、环境样品中的金属离子、农药的残留与有害污染物检测等各式各样的应用检测，对于检测灵敏度的要求十分高，尤其临床诊断的检测用于医生用药或判断时更是要求具有高检测灵敏度及可靠度。纳米材料由于粒径小，可提供反应的表面积大，从而被广泛地研究以期望能够提供具有较高灵敏度的传感器。
“纳米材料”广义上是被定义为三维空间中，至少有一个维度是落于纳米尺度内或者是以该尺度范围内的物质为基本结构单元所构成的超精细颗粒材料。当粒子纳米化后，光的吸收度均显著提升。现已开发出多种根据纳米粒子对于光具有高吸收度的特性，搭配纳米粒子本身表面所含有的物性、化性甚至是改质或修饰上辨识分子来对目标分析物进行检测的方法。举例而言，比色法(Colorimetry)便是一种以贵金属纳米粒子分散或聚集造成的颜色改变作为检测判断依据的检测方法。除了比色法以外，亦存在利用贵金属纳米粒子会因为吸收特定频率波长的能量而产生粒子等离子体共振(Particle plasmonresonance,PPR)或局域表面等离子体共振(Local Surface Plasmon Resonance,LSPR)的现象，结合光纤多次全内反射(multiple total internal reflections)及渐逝波特性与金纳米粒子的粒子等离子体共振性质的光纤式粒子等离子体共振检测法。
虽然相较于传统的检测法，上述利用纳米粒子的检测方法已提供了高灵敏度的检测，但仍存在有提供具有更高灵敏度的感测方法的需求。同时，粒子等离子体共振感测系统的准确性受非特异性吸附影响甚巨，所以仍存在有提供对非特异性吸附较不敏感的方法的需求。
发明内容
有鉴于上述需求，本发明的目的就是提供一种高灵敏度以及低侦测极限并对非特异性吸附较不敏感的待测物浓度的测定方法以及套组。
根据本发明的一目的，提出一种待测物浓度的测定方法，其包含：使其中包含待测物的待测溶液与其中包含纳米粒子的纳米粒子溶液以及光波导组件反应以形成三明治结构；以及利用光侦检器测量该纳米粒子形成三明治结构后的吸收或散射该光波导组件的渐逝波能量以获得第一信号，并通过该第一信号算出待测物浓度，其中纳米粒子的表面上修饰有侦测辨识元，且光波导组件的表面上通过直接修饰于光波导组件表面上的第二抗非特异性吸附自组装固定层，间接地修饰有捕获辨识元以形成一感测区，且侦测辨识元以及捕获辨识元分别与该待测物的不同位点结合。前述散射指弹性散射(Elastic scattering，亦称瑞利散射(Rayleigh scattering))。
优选地，纳米粒子可选自于由金纳米粒子、银纳米粒子、氧化铁纳米粒子、铜纳米粒子、碳纳米粒子、硒化镉纳米粒子、掺杂染料的二氧化硅纳米粒子以及掺杂染料的有机聚合物纳米粒子所组成的群组中的一种。
优选地，光波导组件可选自于由圆柱形光波导组件如光纤、平面光波导组件如平板波导(slab waveguide)、通道波导(channel waveguide)以及管状光波导组件所组成的群组中的一种。
优选地，侦测辨识元以及捕获辨识元可分别选自于由抗体、胜肽、激素受体(hormone receptor)、凝集素(lectin)、醣类(carbohydrate)、化学辨识分子、脱氧核糖核酸、核糖核酸以及核酸适体所组成的群组中的一种。
优选地，纳米粒子与侦测辨识元的间可形成有第一抗非特异性吸附自组装固定层。
优选地，利用光侦检器获得第一信号的步骤包含将单频光、窄频光或白光照射于光波导组件以产生渐逝波能量。
优选地，单频光或窄频光为固定调制频率的入射光。
优选地，利用光侦检器获得第一信号的步骤包含：将光侦检器置放于光波导组件的远程，以测量纳米粒子靠近光波导组件的渐逝波范围内的吸收变化量作为第一信号。此吸收变化量是以光侦检器置放于光波导组件远程以测量透射光强度，其中先测量光波导组件于空白溶液的透射光强度(I0)，及测量光波导组件于样品溶液的透射光强度(I)，然后经信号处理算出透光度(Transmittance,T＝I/I0)或吸收度(Absorbance,A＝-log(I/I0))以用于待测物的定量分析。
优选地，利用光侦检器获得第一信号的步骤包含：将光侦检器置放于光波导组件的侧面，以测量纳米粒子靠近光波导组件渐逝波范围内而产生的散射光强度变化量作为第一信号。其中该光波导组件可包括多个感测区。
优选地，光侦检器可选自光电二极管(photodiodes)、光敏晶体管(phototransistors)、光电管(phototubes)、光电倍增管(photomultipliers)、光电导体(photoconductors)、金属半导体金属光检测器(metal-semiconductor-metalphotodetectors)、电荷耦合装置(charged coupled devices)、互补式金属氧化物半导体组件(complementary metal oxide semiconductor devices)所组成的群组中的一种。
优选地，第二抗非特异性吸附自组装固定层可包含末端为羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基硅烷(Alkyl silane)自组装分子，如11-胺基十一烷基三乙氧基硅烷(11-Aminoundecyltriethoxysilane，AUTES)、3-胺基丙基三乙氧基硅烷(3-Triethoxysilylpropylamine，APTES)等以及选自于由末端为两性离子(zwitterionic)的烷基硅烷自组装分子，如磺基甜菜碱硅烷(Sulfobetaine silane，SBSi)、羧基甜菜碱硅烷(Carboxylbetaine silane，CBSi)、磷脂酰胆碱硅烷(Phosphatidylcholine silane，PCSi)；末端为聚乙二醇的烷基硅烷自组装分子，如聚乙二醇硅烷；及末端为氢氧基(-OH)的烷基硅烷自组装分子所组成的群组中的一种。另外优选地，第二抗非特异性吸附自组装固定层可包含葡聚糖(Dextran)。
优选地，第一抗非特异性吸附自组装固定层可包含末端为羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基硫醇自组装分子以及选自于由末端为两性离子的烷基硫醇自组装分子，如磺基甜菜碱-硫醇(Sulfobetaine thiol，SBSH)、羧基甜菜碱-硫醇(Carboxylbetaine thiol，CB-thiol)、磷脂酰胆碱-硫醇(Phosphatidylcholine thiol，PC-thiol)；末端为聚乙二醇的烷基硫醇自组装分子，如聚乙二醇硫醇(Polyethylene glycol thiol，PEG-thiol)；及末端为氢氧基(-OH)的烷基硫醇自组装分子所组成的群组中的一种。另外优选地，第一抗非特异性吸附自组装固定层可包含葡聚糖-硫醇(Dextran-thiol)。
根据本发明的另一目的，提出一种待测物浓度的测定套组，其包含：光源、包含表面修饰有侦测辨识元的纳米粒子的纳米粒子溶液、表面修饰有捕获辨识元的光波导组件、以及测量纳米粒子形成三明治结构后吸收或散射该光波导组件的渐逝波能量以获得第一信号的光侦检器。侦测辨识元以及捕获辨识元分别与待测物结合，并与待测物的不同位点结合，但侦测辨识元及捕获辨识元可以是相同分子。捕获辨识元可通过直接修饰于光波导组件表面上的第二抗非特异性吸附自组装固定层，间接地修饰于光波导组件表面上。
承上所述，依本发明的待测物浓度的测定方法以及套组较习知技艺的常规光波导式粒子等离子体共振感测系统，其可具有一或多个下述优点：
(1)图1的(a)是一常规光波导式粒子等离子体共振感测系统的示意图，其中纳米粒子21为贵金属纳米粒子。如图1的(a)所示，常规光波导式粒子等离子体共振感测系统是利用纳米粒子21上的捕获辨识元35与待测物结合前后的吸收系数或散射系数改变(Δα)来定量，吸收系数或散射系数变化量(Δα)相对整个纳米粒子的吸收系数或散射系数(α)小很多，Δα/α一般小于7％。相较之下，图1的(c)是依据本发明实施例的形成于光波导组件表面上的三明治结构的示意图。如图1的(c)所示，本发明是利用光波导上的捕获辨识元35与待测物及修饰有纳米粒子的侦测辨识元25形成三明治结构前的零吸收或散射与形成三明治结构后的吸收或散射(α)的差异来定量，因此吸收或散射变化量(α)比常规光波导式粒子等离子体共振感测是统的信号变化量(Δα)以及灵敏度至少大一个数量级以上。
(2)图1的(b)是另一常规光波导式粒子等离子体共振感测系统的示意图。如图1的(b)所示，即使常规光波导式粒子等离子体共振感测系统利用三明治法测试，纳米粒子21上的捕获辨识元35与待测物及侦测辨识元25形成三明治结构前后的吸收系数或散射系数变化量(Δα+Δα’)来定量，吸收系数或散射系数变化量(Δα+Δα’)相对整个纳米粒子的吸收系数或散射系数(α)仍小很多，因此灵敏度提升与本发明相比仍有很大的差距。
(3)常规光波导式粒子等离子体共振感测系统的准确性受非特异性吸附影响甚巨，而本发明在光波导上并没有直接俢饰纳米粒子，所以非特异性吸附发生于光波导上不会产生显著的信号变化，因此更适用于真实复杂样品的定量。
(4)本发明所使用的纳米粒子不限于贵金属纳米粒子，使用上更为多元。
承上所述，依本发明的待测物浓度的测定方法以及套组较利用光波导结合纳米粒子三明治法的荧光或拉曼散射(Raman scattering)感测系统，仍具有一或多个下述优点：
(1)侦测辨识元不需再额外标志荧光染料分子或拉曼染料分子。
(2)光学架构较简单且可使用较便宜的光电组件。
(3)荧光或拉曼散射不易充分利用光波导组件的多次全内反射特性以大幅增加测定的灵敏度。
附图说明
图1的(a)及(b)是常规光波导式粒子等离子体共振感测系统的示意图，而图1的(c)是依据本发明实施例形成的三明治结构的示意图。
图2是依据本发明实施例的待测物浓度的测定方法的流程图。
图3是依据本发明实施例的表面修饰有侦测辨识元的纳米粒子的制备示意图。
图4是依据本发明实施例对心肌肌钙蛋白I二次标准品进行浓度检测的实时侦测图。
图5是显示依据图4的结果绘制的检量线的图式。
图6是依据本发明实施例的表面修饰有HS-DNAC的光波导组件的制备示意图。
图7是依据本发明实施例的表面修饰有NH2-DNAD的纳米粒子的制备示意图。
图8是依据本发明实施例对银离子二次标准品进行多浓度检测的实时侦测图。
图9是显示依据图8的结果绘制的检量线的图式。
图10是依据本发明实施例的光波导组件的非特异性吸附测试结果图。
图11是依据本发明实施例对PCT二次标准品进行多浓度检测的实时侦测图。
图12是显示依据图11的结果绘制的检量线的图式。
图13是为显示以本发明的三明治法以及电化学发光检测法对11个前降钙素原样品间的线性相关分析结果的图式。
具体实施方式
本文中所用的“修饰”是指物理或化学的修饰技术，包含但不限于物理气相沉积法(Physical vapor deposition，PVD)、化学气相沉积法(Chemical vapor deposition，CVD)、电化学沉积法(Electrochemical deposition)、自组装(Self-assembly)与溶胶凝胶法(Sol Gel process)。
本文中所用的“自组装层”或“自组装固定层”是指其中包含自组装分子的自组装单分子层(self-assembled monolayer)。本文中所用的“自组装分子”是指不需要借助外力而可进行紧密排列的一种特殊分子，自组装分子的排列速度常因溶剂或是分子本身的范德瓦尔斯力(van der Waals Force)的作用力而造成影响，一般来说，当自组装分子的骨架愈长，则分子本身的疏水性作用力便会随着上升，进而加速自组装分子的排列。
本文中所用的“光波导组件”是指包含光波导基材以及包覆光波导基材的包层的组件，其中部份包层可为样品溶液。当入射光在光波导基材内进行全内反射时，光波从光密介质的光波导基材入射到光疏介质的包层时，发生全内反射而光疏介质一侧产生一种电磁波，也就是渐逝波(Evanescent wave)，其振幅随与分界面垂直的深度的增大而呈指数形式衰减。利用光波导组件，通过多次全内反射可以大幅增加渐逝波吸收或散射的变化量，进而大幅增加测定的灵敏度。
图2是依据本发明实施例的待测物浓度的测定方法的流程图。图3是依据本发明实施例的表面修饰有侦测辨识元的纳米粒子的制备示意图。参照图2，本发明实施例的测定待测物浓度的方法包含：使其中包含待测物的待测溶液与纳米粒子溶液以及光波导组件反应以形成三明治结构的步骤S101以及利用光侦检器测量纳米粒子形成三明治结构后的吸收或散射该光波导组件的渐逝波能量以获得第一信号，并通过第一信号算出待测物浓度的步骤S103。
步骤S101中所述的纳米粒子溶液为其中包含表面修饰有侦测辨识元的纳米粒子的溶液。所述的表面修饰有侦测辨识元的纳米粒子可以如图3所示进行制备。参照图3，首先，为防止纳米粒子21之间彼此的吸附聚集，使纳米粒子21可以稳定均匀地分布在水溶液中，不至于聚集沉淀，可先在纳米粒子21的表面修饰一层暂时性的保护层22，接着具有抗非特异性吸附特性的自组装分子可在纳米粒子21上形成第一抗非特异性吸附自组装固定层23，最后在活化第一抗非特异性吸附自组装固定层23后，于第一抗非特异性吸附自组装固定层23上形成侦测辨识元25，从而形成其表面修饰有侦测辨识元的纳米粒子。在一实施例中，可不形成暂时性的保护层22，而是直接在纳米粒子21上形成第一抗非特异性吸附自组装固定层23。在一实施例中，也可以直接在纳米粒子21上形成侦测辨识元25。
纳米粒子21可选自于由金纳米粒子、银纳米粒子、氧化铁纳米粒子、铜纳米粒子、碳纳米粒子、硒化镉纳米粒子、掺杂染料的二氧化硅纳米粒子以及掺杂染料的有机聚合物纳米粒子所组成的群组中的一种，优选地为金属纳米粒子，更佳地为贵金属纳米粒子，最佳地为金纳米粒子。纳米粒子可有不同形状，如球形、棒形、壳形、三角板形、棱镜形、星形等，亦可有不同大小。在一实施例中，纳米粒子21可为球形，且具有10～16nm的平均粒径。
第一抗非特异性吸附自组装固定层23可包含一或多种的自组装分子，优选地为具有抗非特异性吸附特性的自组装分子，且其可以自组装、物理气相沉积法、化学气相沉积法或溶胶凝胶法修饰于纳米粒子21上。具有抗非特异性吸附特性的烷基硫醇自组装分子的实例可包含但不限于磺基甜菜碱-硫醇、羧基甜菜碱-硫醇、(11-巯基十一烷基)三(乙二醇)((11-Mercaptoundecyl)tri(ethylene glycol)，EG3SH)、6-巯基己醇(6-Mercaptohexanol，MCH)、2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol，MCE)。第一抗非特异性吸附自组装固定层可包含末端为羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基硫醇自组装分子以及选自于由末端为两性离子的烷基硫醇自组装分子如磺基甜菜碱-硫醇、羧基甜菜碱-硫醇、磷脂酰胆碱-硫醇；末端为聚乙二醇的烷基硫醇自组装分子，如聚乙二醇硫醇；及末端为氢氧基(-OH)的烷基硫醇自组装分子所组成的群组中的一种。在一实施例中，第一抗非特异性吸附自组装固定层23可包含末端为羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基硫醇自组装分子以及末端为氢氧基(-OH)的烷基硫醇自组装分子。在另一实施例中，第一抗非特异性吸附自组装固定层23可包含末端为羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基硫醇自组装分子以及末端为两性离子的烷基硫醇自组装分子。末端为羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基硅烷自组装分子主要提供侦测辨识元固定化的反应点。末端为羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基硫醇自组装分子的实例可包含但不限于16-巯基十六酸(16-Mercaptohexadecanoic acid，MHDA)、11-巯基十一烷酸(11-Mercaptoundecanoic acid，MUA)、11-胺基十一烷基三乙氧基硅烷、胱胺(Cystamine)。
通过包含末端为羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基硫醇自组装分子，第一抗非特异性吸附自组装固定层23可在活化的后，以酰胺共价键(-CONH-)的方式将侦测辨识元25间接地修饰在纳米粒子21的表面上。当待测物与纳米粒子反应时，纳米粒子21可通过侦测辨识元25与待测物充分地结合。因此，根据待测物的性质，侦测辨识元25可选自于由抗体、胜肽、、激素受体、凝集素、醣类、化学辨识分子、脱氧核糖核酸、核糖核酸以及核酸适体所组成的群组中的一种。
步骤S101所述的光波导组件为表面修饰有捕获辨识元的光波导组件。图1的(c)是依据本发明实施例的形成于光波导组件表面上的三明治结构的示意图。参照图1的(c)，第二抗非特异性吸附自组装固定层33以与第一抗非特异性吸附自组装固定层23类似的方式形成于光波导组件31的表面上。第二抗非特异性吸附自组装固定层33可包含一或多种自组装分子，优选地为具有抗非特异性吸附特性的自组装分子，且其可以自组装、物理气相沉积法、化学气相沉积法或溶胶凝胶法修饰于光波导组件31上。光波导组件31可选自于由圆柱形光波导组件、平面光波导组件以及管状光波导组件所组成的群组中的一种，优选地，光波导组件31可为光纤。在一实施例中，第二抗非特异性吸附自组装固定层33可包含末端为胺基(-NH2)的烷基硅烷自组装分子如11-胺基十一烷基三乙氧基硅烷、3-胺基丙基三乙氧基硅烷以及选自于由磺基甜菜碱硅烷、羧基甜菜碱硅烷、磷脂酰胆碱硅烷、聚乙二醇硅烷(Polyethylene glycol silane，PEG-Si)及末端为氢氧基(-OH)的烷基硅烷自组装分子所组成的群组中的一种。在另一实施例中，第二抗非特异性吸附自组装固定层33可包含葡聚糖。捕获辨识元35可以与侦测辨识元25类似的方法，通过第二抗非特异性吸附自组装固定层33，间接地修饰于光波导组件31表面上。其中侦测辨识元25以及捕获辨识元35分别与待测物A结合，并与待测物的不同位点结合，但侦测辨识元25及捕获辨识元35可以是相同分子。当待测物A接触表面修饰有捕获辨识元35的光波导组件31以及表面修饰有侦测辨识元25的纳米粒子21时，侦测辨识元25及捕获辨识元35通过不同位点同时结合待测物A，将会形成光波导组件31/待测物A/纳米粒子21的三明治结构。此三明治结构的形成可先将待测溶液与纳米粒子溶液混合，使修饰于纳米粒子21表面上的侦测辨识元25与待测物A充分地结合后，再将其与表面上修饰有捕获辨识元35的光波导组件31接触以形成所述的三明治结构；或者先使待测溶液与表面上修饰有捕获辨识元35的光波导组件31接触后，再注入其中包含侦测辨识元25修饰于其表面上的纳米粒子21的纳米粒子溶液以形成所述的三明治结构。
在步骤S103中，光侦检器可测量步骤S101中所形成的三明治结构的纳米粒子21吸收或散射光波导组件31的渐逝波能量以获得第一信号，并通过第一信号算出待测物浓度。举例而言，通过在步骤S101中所形成的三明治结构，当入射光照射于光波导组件31的近端时，光波于光波导组件内进行多次全内反射并产生渐逝波，纳米粒子21可吸收或散射光波导组件31的渐逝波能量。多次全内反射可以大幅增加渐逝波吸收或散射的变化量，进而大幅增加测定的灵敏度，光侦检器可通过测量纳米粒子21的透射光强度或散射光强度的变化而获得第一信号，并通过第一信号算出待测物浓度。光侦检器直接测量光强度而不需经分光器在空间上按波长分光，换言之，不需使用光谱仪。优选地，光侦检器置放于光波导组件31远程以测量纳米粒子21的透射光强度。次佳地，光侦检器置放于光波导组件31侧面以测量纳米粒子21的散射光强度。在一实施例中，入射光可为单频光、窄频光或白光。优选地，入射光可为窄频光。在一实施例中，用于发射入射光的装置可为用以发出特定波长与固定调制频率(frequency modulated)的光信号的装置，经解调(frequency demodulated)可增加信噪比(signal-to-noise ratio)。举例而言，所述的用以发出特定波长与固定调制频率的光信号的装置，以下称为光信号输出稳定装置，其可包含稳定光源驱动模块(如定电压控制模块、加热敏电阻的定电压控制模块或定电流控制模块)、发光单元(如发光二极管或雷射光源)与光源温度稳定模块。由于发光单元易受外在环境(如温度、气流扰动)的影响，而造成光信号飘移，可使用被动式或主动式光源温度稳定模块以对该发光单元进行恒温控制，还提升光信号稳定度。
本发明还提供包含上述纳米粒子溶液、光波导组件、光源及光侦检器的套组(或感测装置)。套组可为利用粒子等离子体共振(Particle Plasmon Resonance，PPR)原理所建立的感测装置。光源可为上述的光信号输出稳定装置。感测装置可还包含光波导组件温度控制模块、样品进样温度控制模块。光波导组件温度控制模块与样品进样温度控制模块是用以确保注入的样品温度与光波导组件温度一致，以增加检测结果的可靠性。
在一实施例中，感测装置可选自于由光纤式粒子等离子体共振感测装置、平面波导式粒子等离子体共振感测装置或管状光波导式粒子等离子体共振感测装置所组成的群组中的一种。
由感测装置获得的第一信号可通过信号撷取与处理装置进行处理以算出待测物浓度。具体而言，信号撷取与处理装置可包含接收第一信号并根据第一信号的强度对应产生电信号的光侦检器、连接于光侦检器以将电信号转换成一电压信号再进行放大动作的电流/电压转换放大电路以及接收上述电压信号进行锁相放大/解调的动作的锁相放大模块。其中光侦检器可为光电二极管检测器或光敏晶体管检测器，而锁相放大模块可为模拟式锁相放大模块或数字式锁相放大模块。
下文中提供更进一步的实施例以更加详细地解释本发明。
实施例1
实施例1以心肌肌钙蛋白I(cTnI)作为待测物、以光纤作为光波导组件并以金纳米粒子作为纳米粒子。依据本发明一实施例的待测物浓度的测定方法(以下称为三明治法)，为了测定心肌肌钙蛋白I的浓度，需先将可分别以不同位置与心肌肌钙蛋白I结合的侦测辨识元以及捕获辨识元分别修饰在纳米粒子以及光纤表面上，表面修饰有捕获辨识元的光波导组件以及表面修饰有侦测辨识元的纳米粒子的制备方法详述于下。
制备表面修饰有捕获辨识元的光波导组件
1.将清洗好的空白光纤，以氧等离子体清洗20分钟后备用。
2.将5mM的11-胺基十一烷基三乙氧基硅烷及10mM的磺基甜菜碱硅烷一同配制于无水乙醇中。
3.将空白光纤浸泡11-胺基十一烷基三乙氧基硅烷/磺基甜菜碱硅烷混合溶液当中12小时，使其可以自组装固定化。
4.将修饰完后的光纤自溶液中取出，使用去离子水清洗数次并以氮气将表面吹干。
5.配制0.08M的双琥珀酰亚胺辛二酸酯(disuccinimidyl suberate，DSS)于二甲基亚砜(DMSO)中。
6.将修饰上11-胺基十一烷基三乙氧基硅烷/磺基甜菜碱硅烷的光纤浸泡于双琥珀酰亚胺辛二酸酯溶液当中12小时，以活化11-胺基十一烷基三乙氧基硅烷末端的胺基(-NH2)使其可与捕获辨识元(抗心肌肌钙蛋白I抗体，AbC)反应以使捕获辨识元固定化。
7.将修饰完后的光纤自溶液中取出，使用去离子水清洗数次并以氮气将表面吹干。
8.置入微流体芯片中，使用黏度为10000的紫外光固化胶(UV胶)点入芯片底部的两个孔洞使光纤固定，并放置紫外光灯箱中，照光15分钟。
9.待紫外光固化胶凝固后，将甲醇及去离子水注入感测区中清洗以去除槽道中的紫外光固化胶蒸气。
10.配制10-4g/mL的捕获辨识元于磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲溶液)中，将此溶液注入芯片反应修饰2小时。
11.将去离子水注入芯片中清洗，洗去多余的抗体，即完成了将捕获辨识元修饰在光波导组件上的步骤。若此感测芯片没有要马上使用，可先暂放于4℃冰箱中保存一周。
在本示例中，使用磺基甜菜碱硅烷及11-胺基十一烷基三乙氧基硅烷形成第二抗非特异性吸附自组装固定层，其中磺基甜菜碱硅烷为两性离子，在表面形成一层水分子的包覆层，可抗非特异性吸附。而11-胺基十一烷基三乙氧基硅烷的末端为-NH2基，经过双琥珀酰亚胺辛二酸酯活化后，可以使带有-NH2基的捕获辨识元直接接在空白光纤上，以便检测心肌肌钙蛋白I。
Figure BDA0001784634600000121
制备表面修饰有侦测辨识元的纳米粒子
1.配制2mg/mL的吐温20(Tween 20)于磷酸盐缓冲溶液中。
2.将2mL的纳米金溶液与2mL浓度为2mg/mL的吐温20溶液均匀混合成4mL，并静置反应1小时，使吐温20可以均匀包覆在金纳米粒子，使其不易聚集。
3.配制0.5mM的羧基甜菜碱-硫醇及0.5mM的2-巯基乙醇于磷酸盐缓冲溶液中。
4.加入100μL的羧基甜菜碱-硫醇/2-巯基乙醇溶液至已有吐温20保护的纳米金溶液当中，静置反应12小时，使其可以自组装固定化。
5.将修饰羧基甜菜碱-硫醇/2-巯基乙醇的纳米金溶液倒入浓缩离心管(30K)中，以转速6000r.p.m.离心10分钟。
6.下层液丢弃后，将上层液的金纳米粒子以溶于磷酸盐缓冲溶液的0.2mg/mL吐温20溶液回溶至4mL。
7.再将溶液以浓缩离心管(30K)，以转速6000r.p.m.再离心10分钟一次。
8.下层液丢弃，上层液的金纳米粒子以磷酸盐缓冲溶液回溶至2mL。
9.将1mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride，EDC)及1mM的N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)一同配制于磷酸盐缓冲溶液中。
10.取步骤8的纳米金溶液2mL加入1mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺100μL，反应30分钟，使官能基活化。
11.将活化完成的纳米金溶液倒入浓缩离心管(30K)中，以转速6000r.p.m.离心10分钟。
12.下层液丢弃，上层液的金纳米粒子以磷酸盐缓冲溶液回溶至2mL。
13.配制10-5g/mL的侦测辨识元(抗心肌肌钙蛋白I抗体，AbD)于磷酸盐缓冲溶液。
14.取步骤12的纳米金溶液2mL加入200μL的10-5g/mL侦测辨识元，反应12小时，使侦测辨识元可以修饰在金纳米粒子上，以便抓取心肌肌钙蛋白I。
15.将已修饰上侦测辨识元的纳米金溶液取倒入离心管中，以转速16000r.p.m.低温(4℃)离心15分钟。
16.下层液丢弃，上层液的金纳米粒子以磷酸盐缓冲溶液回溶至2mL后，即为表面修饰有侦测辨识元的纳米粒子(以下称为AuNP@AbD)。若修饰上侦测辨识元的金纳米粒子溶液没有要马上使用，可先暂放于4℃冰箱中保存一周。
在本示例中，使用羧基甜菜碱-硫醇及2-巯基乙醇形成第一抗非特异性吸附自组装固定层，其中羧基甜菜碱有抗非特异性吸附的效果。吐温20在此的用途为均匀包覆在金纳米粒子外层，可形成一暂时性的保护层使金纳米粒子较不容易聚集。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺则可活化羧基甜菜碱上的-COOH基，使带有-NH2基的侦测辨识元可接在金纳米粒子上。
以感测装置对心肌肌钙蛋白I二次标准品进行浓度检测
为了建立准确的检量线。以下为以光纤式粒子等离子体共振感测装置检测心肌肌钙蛋白I二次标准品进行浓度检测的详细步骤：
1.准备如上所述的表面修饰有捕获辨识元的光纤。若是从冰箱中拿出，须待回温至室温方可使用。
2.将光纤放于光纤式粒子等离子体共振感测芯片当中，注入磷酸盐缓冲溶液，待信号稳定方可进行实验。
3.配制待测心肌肌钙蛋白I溶液，将心肌肌钙蛋白I溶于磷酸盐缓冲溶液中配制成各个浓度(2×10-12、2×10-11、2×10-10、2×10-9、2×10-8、2×10-7g/mL)。
4.将AuNP@AbD与不同浓度的心肌肌钙蛋白I标准品，以体积比1比1均匀混合，并摇晃15分钟，使金纳米粒子上的侦测辨识元可与心肌肌钙蛋白I完全反应，形成二次标准品，此时心肌肌钙蛋白I的浓度会因为稀释了而变为1×10-12、1×10-11、1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7g/mL。
5.将步骤4已经制备完成的不同浓度心肌肌钙蛋白I的二次标准品与其上修饰有捕获辨识元的光波导组件以一个浓度一个光波导组件的方式接触直到取200秒时间其相对标准差(RSD)为0.008％以下才停止。由于平衡时间随着浓度不同而有所不同，低浓度约是需要15分钟，而高浓度则需要约60分钟。所得的结果如图4所示。
6.建立检量线并计算三明治法的侦测极限。
此检验过程中，将心肌肌钙蛋白I标准品与AuNP@AbD均匀混合，会进行第一段抗原抗体间的结合，形成二次标准品，而后再将此二次标准品与其上修饰有捕获辨识元的光纤接触。因为侦测辨识元及捕获辨识元此两者与心肌肌钙蛋白I之间的专一性键合是不同的抗原结合位，因此捕获辨识元会与心肌肌钙蛋白I进行第二阶段的抗原抗体结合，当反应进行时，金纳米粒子会逐渐靠近光纤渐逝波范围内产生粒子等离子体共振并吸收渐逝波，而置放于光波导组件远程的光侦检器因渐逝波吸收度改变可观察到明显的信号变化量。此检验过程亦得先将心肌肌钙蛋白I标准品与其上修饰有捕获辨识元的光纤接触，然后注入AuNP@AbD溶液于感测芯片中以使AuNP@AbD与心肌肌钙蛋白I结合，不经过二次标准品的制备。
图4是依据本发明实施例对心肌肌钙蛋白I二次标准品进行单一浓度检测的实时侦测图。其中，图4的(a)～(c)部分为心肌肌钙蛋白I浓度为1×10-7g/mL的二次标准品重复三次的结果；图4的(d)～(f)部分为心肌肌钙蛋白I浓度为1×10-8g/mL的二次标准品重复三次的结果；图4的(g)～(i)部分为心肌肌钙蛋白I浓度为1×10-9g/mL的二次标准品重复三次的结果；图4的(j)～(l)部分为心肌肌钙蛋白I浓度为1×10-10g/mL的二次标准品重复三次的结果；图4的(m)～(o)部分为心肌肌钙蛋白I浓度为1×10-11g/mL的二次标准品重复三次的结果；图4的(p)～(r)部分为心肌肌钙蛋白I浓度为1×10-12g/mL的二次标准品重复三次的结果。随着浓度升高，有越多与AuNP@AbD结合的心肌肌钙蛋白I逐渐靠近光纤，而其上的心肌肌钙蛋白I会与捕获辨识元进行第二阶段的抗原抗体结合，当金纳米粒子进到渐逝波内即会产生粒子等离子体共振并吸收渐逝波，造成明显的信号变化量。随着指标二次标准品上的心肌肌钙蛋白I数量越多，置放于光波导组件31远程的光侦检器因渐逝波吸收度改变而观察到信号变化量也越趋明显。
各浓度下的信号值(I)与空白溶液的信号值(I0)相减，I–I0即为delta I(ΔI)，再除以空白信号可获得ΔI/I0，后将三明治法测单一浓度心肌肌钙蛋白I二次标准品的实时侦测图中的所有信号差值ΔI/I0列出，如下表1所示。
表1
Figure BDA0001784634600000151
以ΔI/I0和取Log后的浓度，且N＝3作图，得到图5所示的检量线。图5是显示依据图4以及表1的结果绘制的检量线的图式。参照图5，在线性范围中，有良好的线性关系(R＝0.998)，经计算后可得到以三明治方法对心肌肌钙蛋白I二次标准品进行单一芯片单一浓度定量分析的侦测极限为2.45×10-14g/mL(0.0245pg/mL，1.02×10-15M)。相较于传统上利用单一捕获辨识元的光纤式粒子等离子体共振感测置对心肌肌钙蛋白I的侦测极限为1.47×10-8g/mL的侦测法，三明治法可使侦测极限提升了近6个数量级数而提供非常低的侦测极限。
实施例2
实施例2是以银离子作为待测物、以光纤作为光波导组件并以纳金米粒子作为纳米粒子。依据本发明实施例的待测物浓度的测定方法(以下称为三明治法)，为了测定银离子的浓度，需先将可分别以不同位置与银离子结合的侦测辨识元NH2-DNAD以及捕获辨识元HS-DNAC分别修饰在金纳米粒子以及光纤表面上，表面修饰有HS-DNAC的光波导组件以及表面修饰有NH2-DNAD的金纳米粒子的制备方法分别如图6以及图7所示。
图6是依据本发明实施例的表面修饰有HS-DNAC的光波导组件的制备示意图。参照图6，除了将修饰上11-胺基十一烷基三乙氧基硅烷/磺基甜菜碱硅烷的光纤浸泡于1mM的6-马来酰亚胺己酸N-琥珀酯(N-ε-malemidocaproyl-oxysuccinimide ester，EMCS)溶液当中2小时以进行活化11-胺基十一烷基三乙氧基硅烷末端的胺基(-NH2)，以及将10-6M的HS-DNAC溶液注入芯片反应修饰2小时以外，以与实施例1相同的方式制备表面修饰有HS-DNAC的光波导组件。
图7是依据本发明实施例的表面修饰有NH2-DNAD的纳米粒子的制备示意图。参照图7，表面修饰有NH2-DNAD的金纳米粒子是由以下方法制备：
1.配制2mg/mL的吐温20于磷酸盐缓冲溶液中。
2.将2mL的纳米金溶液与2mL浓度为2mg/mL的吐温20溶液均匀混合成4mL，并静置反应1小时，使吐温20可以均匀包覆在金纳米粒子，使其不易聚集。
3.配制0.5mM的16-巯基十六酸及0.5mM的磺基甜菜碱-硫醇于磷酸盐缓冲溶液中。
4.加入100μL的16-巯基十六酸/磺基甜菜碱-硫醇溶液至已有吐温20保护的纳米金溶液当中，静置反应整夜，使其可以自组装固定化。
5.将修饰有16-巯基十六酸/磺基甜菜碱-硫醇的纳米金溶液倒入浓缩离心管(30K)中，以转速14000r.p.m.离心20分钟。
6.下层液丢弃后，将上层液的金纳米粒子以溶于磷酸盐缓冲溶液的0.2mg/mL吐温20溶液回溶至4mL。
7.再将溶液以浓缩离心管(30K)，以转速14000r.p.m.再离心20分钟一次。
8.下层液丢弃，上层液的金纳米粒子以磷酸盐缓冲溶液回溶至2mL。
9.将1mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及1mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)一同配制于磷酸盐缓冲溶液中。
10.取步骤8的纳米金溶液2mL加入1mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺100μL，反应10分钟，使官能基活化。
11.将活化完成的纳米金溶液倒入浓缩离心管(30K)中，以转速10000r.p.m.离心15分钟。
12.下层液丢弃，上层液的金纳米粒子以磷酸盐缓冲溶液回溶至2mL。
13.配制10-6g/mL的NH2-DNAD于磷酸盐缓冲溶液。
14.取步骤12的纳米金溶液2mL加入200μL的10-5g/mL侦测辨识元，反应整夜，使NH2-DNAD可以修饰在金纳米粒子上，以便抓取银离子。
15.将已修饰上侦测辨识元的纳米金溶液取倒入离心管中，以转速14000r.p.m.低温(4℃)离心15分钟。
16.下层液丢弃，上层液的金纳米粒子以磷酸盐缓冲溶液回溶至2mL后，即为表面修饰有NH2-DNAD的金纳米粒子(以下称为AuNP@DNAD)。若修饰上NH2-DNAD的金纳米粒子溶液没有要马上使用，可先暂放于4℃冰箱中保存一个礼拜。
在完成表面修饰有HS-DNAC的光波导组件以及表面修饰有NH2-DNAD的金纳米粒子的制备后，参照实施例1中所述的以传感器对心肌肌钙蛋白I二次标准品进行浓度检测的步骤，建立银离子的建立检量线。因为HS-DNAC与NH2-DNAD中含有胞嘧啶-胞嘧啶错配(cytosine-cytosine(C－C)mismatch)，会与银离子作用形成胞嘧啶-银离子-胞嘧啶(cytosine-Ag+-cytosine(C－Ag+－C))碱基对，其余碱基对则彼此互补，由于大部分为互补的碱基对，当反应进行时，金纳米粒子会逐渐接近光纤并吸收渐逝波，因此置放于光波导组件远程的光侦检器因渐逝波吸收度改变可以观察到明显的信号变化量，接着再依不同银离子标准品的浓度会有不同的信号变化量。图8是依据本发明实施例对银离子二次标准品进行多浓度检测的实时侦测图。为节省时间以及成本，图8是将不同浓度的银离子二次标准品，由低浓度至高浓度(纯水①、空白②、10-12M③、10-11M④、10-10M⑤、10-9M⑥、10-8M⑦、10-7M⑧、10-6M⑨、纯水⑩)依序接触单个表面修饰有HS-DNAC的光波导组件，每一个浓度皆等待相同的时间约15分钟所得的实时侦测图。图9是显示依据图8的结果绘制的检量线的图式。由图9可以看出，本发明实施例对银离子浓度有良好的线性关系(R2＝0.999)，其侦测极限为1.788×10-13M。相较于先前的侦测方法，使用三明治法不仅使侦测极限提升了近4个数量级数，也证明了三明治法的可应用性。
实施例3
实施例3是以血症生化指标前降钙素原(Procalcitonin，PCT)作为待测物、以光纤作为光波导组件并以金纳米粒子作为纳米粒子。为避免其它基质的干扰影响侦测灵敏度与准确度，导致侦测误差。实施例3中利用两种抗非特异性吸附分子，磺基甜菜碱硅烷分子结合11-胺基十一烷基三乙氧基硅烷架桥分子来形成第二抗非特异性吸附自组装固定层，磺基甜菜碱-硫醇分子结合16-巯基十六酸架桥分子来形成第一抗非特异性吸附自组装固定层。以注入磷酸盐缓冲溶液中含侦测辨识元(Anti-PCTD)的AuNP@AbD(1.0×10-7、1.0×10– 4g/ml)进行非特异性吸附测试，其结果显示如图10。图10是依据本发明实施例的光波导组件的非特异性吸附测试结果图。由图10可以看出，当磷酸盐缓冲溶液中没有前降钙素原而只有含侦测辨识元(Anti-PCTD)的AuNP@AbD时，感测装置所测得的信号强度与背景无法区分，也就是说，第二抗非特异性吸附自组装固定层可有效地防止光波导组件上的非特异性吸附。接着以与实施例1所述相同的方式，利用双琥珀酰亚胺辛二酸酯活化11-胺基十一烷基三乙氧基硅烷后，将用于与前降钙素原结合的捕获辨识元进一步修饰于上述的光波导组件上。实施例3中所用的表面修饰有侦测辨识元的纳米粒子则是在金纳米粒子表面修饰16-巯基十六酸/磺基甜菜碱-硫醇，并利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺进行活化，之后接上侦测辨识元(以下称为AuNP@AbD)。接着将修饰好的AuNP@AbD与不同浓度的前降钙素原的前降钙素原标准品混合后，以与实施例2所述相同的方法获得对前降钙素原二次标准品进行多浓度检测的实时侦测图。图11是依据本发明实施例对前降钙素原二次标准品进行多浓度检测的实时侦测图，由低浓度至高浓度(磷酸盐缓冲溶液(1)、10-12g/ml(2)、10-11g/ml(3)、10-10g/ml(4)、10-9g/ml(5)、10-8g/ml(6)、10-7g/ml(7)、10- 6g/ml(8)、磷酸盐缓冲溶液(9))依序接触单个表面修饰有捕获辨识元的光波导组件的实时侦测图。图12是显示依据图11的结果绘制的检量线的图式。
由图11及图12可看出，对于前降钙素原，本发明的三明治法可提供从1pg/mL到100ng/mL的宽线性响应范围和为0.28pg/mL(0.021pM)的极低的检测极限(LOD)，其远较使用电化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)检测法(3.40pM)以及电化学检测法(0.5pM)的检测极限低。接着分别以本发明的三明治法以及电化学发光检测法检测11个真实血浆样品，并将所得的结果进行线性相关分析(linear correlation analysis)。图13是为显示以本发明的三明治法以及电化学发光检测法对11个前降钙素原样品间检测结果相关性的图式。由图13可以看出两种检测方法所得的结果差异不大。
以上实施例已证实本发明的待测物浓度的测定方法可提供高灵敏度以及低侦测极限，因此通过本发明的待测物浓度的测定方法可以测出以往因浓度过低而无法测得的待测物浓度，从而可满足生物分子检测、医药检测、食品检测、农产品检测、环境样品中的金属离子、农药的残留与有害污染物检测等各种应用检测中的高灵敏度以及低侦测极限的需求。
虽然本发明已参照实施例具体呈现及描述，然应为所属领域普通技术人员了解的是，可于其中进行形式与细节上的各种改变而不脱离由附随权利要求书定义的本发明的范畴与精神及等效配置。
符号说明
S101～S103：步骤
21：纳米粒子
22：保护层
23：第一抗非特异性吸附自组装固定层
25：侦测辨识元
31：光波导组件
33：第二抗非特异性吸附自组装固定层
35：捕获辨识元
A：待测物

Claims (16)

1.一种待测物浓度的测定方法，其特征在于，其包含：
使其中包含待测物的待测溶液与其中包含多个纳米粒子的纳米粒子溶液以及光波导组件反应以形成三明治结构；以及
利用光侦检器测量所述的多个纳米粒子形成所述的三明治结构后的吸收或散射所述的光波导组件的渐逝波能量以获得第一信号，并通过所述的第一信号算出所述的待测物的浓度，
其中所述的多个纳米粒子中的每一个纳米粒子的表面上皆修饰有侦测辨识元，且所述的光波导组件的表面上通过直接修饰于所述的光波导组件的表面上的第二抗非特异性吸附自组装固定层，间接地修饰有捕获辨识元，其中所述的侦测辨识元以及所述的捕获辨识元分别与所述的待测物的不同位点结合。
2.根据权利要求1所述的待测物浓度的测定方法，其特征在于，所述的纳米粒子是选自于由金纳米粒子、银纳米粒子、氧化铁纳米粒子、铜纳米粒子、碳纳米粒子、硒化镉纳米粒子、掺杂染料的二氧化硅纳米粒子以及掺杂染料的有机聚合物纳米粒子所组成的群组中的一种。
3.根据权利要求1所述的待测物浓度的测定方法，其特征在于，所述的光波导组件是选自于由圆柱形光波导组件、平面光波导组件以及管状光波导组件所组成的群组中的一种。
4.根据权利要求1所述的待测物浓度的测定方法，其特征在于，所述的侦测辨识元以及所述的捕获辨识元各独立地选自于由抗体、胜肽、激素受体、凝集素、醣类、化学辨识分子、脱氧核糖核酸、核糖核酸以及核酸适体所组成的群组中的一种。
5.根据权利要求1所述的待测物浓度的测定方法，其特征在于，还包含第一抗非特异性吸附自组装固定层于所述的纳米粒子与所述的侦测辨识元之间。
6.根据权利要求5所述的待测物浓度的测定方法，其特征在于，所述的第一抗非特异性吸附自组装固定层包含末端为羧基或胺基的烷基硫醇自组装分子以及选自于由末端为两性离子的烷基硫醇自组装分子、末端为聚乙二醇的烷基硫醇自组装分子及末端为氢氧基的烷基硫醇自组装分子所组成的群组中的一种。
7.根据权利要求6所述的待测物浓度的测定方法，其特征在于，所述的第一抗非特异性吸附自组装固定层包含葡聚糖-硫醇。
8.根据权利要求1所述的待测物浓度的测定方法，其特征在于，其中利用所述的光侦检器获得所述的第一信号的步骤包含将单频光、窄频光或白光照射于所述的光波导组件以产生渐逝波能量。
9.根据权利要求8所述的待测物浓度的测定方法，其特征在于，其中单频光或窄频光为固定调制频率的入射光。
10.根据权利要求8所述的待测物浓度测定方法，其特征在于，其中利用所述的光侦检器获得所述的第一信号的步骤包含：将所述的光侦检器置放于所述的光波导组件的远程，以测量所述的多个纳米粒子靠近所述的光波导组件的渐逝波范围内而产生的透射光强度变化量作为所述的第一信号。
11.根据权利要求8所述的待测物浓度的测定方法，其特征在于，其中利用所述的光侦检器获得所述的第一信号的步骤包含：将所述的光侦检器置放于所述的光波导组件的侧面，以测量所述的多个纳米粒子靠近所述的光波导组件渐逝波范围内而产生的散射光强度变化量作为所述的第一信号。
12.根据权利要求11所述的待测物浓度的测定方法，其特征在于，所述的光波导组件包括多个感测区。
13.根据权利要求1所述的待测物浓度的测定方法，其特征在于，所述的光侦检器选自于由光电二极管、光敏晶体管、光电管、光电倍增管、光电导体、金属半导体金属光检测器、电荷耦合装置、互补式金属氧化物半导体组件所组成的群组中的一种。
14.根据权利要求1所述的待测物浓度的测定方法，其特征在于，所述的第二抗非特异性吸附自组装固定层包含末端为羧基或胺基的烷基硅烷自组装分子以及选自于由末端为两性离子的烷基硅烷自组装分子、末端为聚乙二醇子的烷基硅烷自组装分子及末端为氢氧基的烷基硅烷自组装分子所组成的群组中的一种。
15.根据权利要求14所述的待测物浓度的测定方法，其特征在于，所述的第二抗非特异性吸附自组装固定层包含葡聚糖。
16.一种待测物浓度的测定套组，其特征在于，其包含：
光源；
纳米粒子溶液，包含多个纳米粒子，所述的多个纳米粒子的每一个表面皆修饰有侦测辨识元；
光波导组件，其表面修饰有捕获辨识元；以及
光侦检器，测量所述的纳米粒子溶液中的所述的多个纳米粒子形成三明治结构后的吸收或散射所述的光波导组件的渐逝波能量以获得第一信号，其中所述的侦测辨识元以及所述的捕获辨识元分别与所述的待测物的不同位点结合，且所述的捕获辨识元通过直接修饰于所述的光波导组件的表面上的第二抗非特异性吸附自组装固定层，间接地修饰于所述的光波导组件的表面上。
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Citations (6)

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