TWI684756B - 待測物濃度之測定方法及套組 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種待測物濃度之測定方法，其包含：使其中包含待測物的待測溶液與其中包含複數個奈米粒子之奈米粒子溶液以及光波導元件反應以形成三明治結構；以及利用光偵檢器測量該複數個奈米粒子形成三明治結構後之吸收或散射該光波導元件的漸逝波能量以獲得第一訊號，並透過該第一訊號算出待測物濃度，其中每一個奈米粒子的表面上皆修飾有偵測辨識元，且光波導元件的表面上修飾有捕獲辨識元。

Description

待測物濃度之測定方法及套組
本發明係關於一種待測物濃度之測定方法以及套組，特別是關於利用光波導元件的一種待測物濃度之測定方法以及套組。
生物分子檢測、醫藥檢測、食品檢測、農產品檢測、環境樣品中的金屬離子、農藥的殘留與有害汙染物檢測等各式各樣的應用檢測，對於檢測靈敏度的要求十分高，尤其臨床診斷之檢測對於醫生用藥或判斷時更是要求具有高檢測靈敏度及可靠度。奈米材料由於粒徑小，可提供反應之表面積大，從而被廣泛地研究以期望能夠提供具有較高靈敏度之感測器。
「奈米材料」廣義上是被定義為三維空間中，至少有一個維度是落於奈米尺度內或者是以該尺度範圍內之物質為基本結構單元所構成的超精細顆粒材料。當粒子奈米化後，光的吸收度均顯著提升。現已開發出多種根據奈米粒子對於光具有高吸收度之特性，搭配奈米粒子本身表面所含有之物性、化性甚至是改質或修飾上辨識分子來對目標分析物進行檢測之方法。舉例而言，比色法(Colorimetry)便是一種以貴金屬奈米粒子分散或聚集造成之顏色改變做為檢測判斷依據的檢測方法。除了比色法以外，亦存在利用貴金屬奈米粒子會 因為吸收特定頻率波長的能量而產生粒子電漿共振(Particle plasmon resonance,PPR)或定域化表面電漿共振(Local Surface Plasmon Resonance,LSPR)之現象，結合光纖多次全內反射(multiple total internal reflections)及漸逝波特性與金奈米粒子的粒子電漿共振性質之光纖式粒子電漿共振檢測法。
雖然相較於傳統的檢測法，上述利用奈米粒子的檢測方法已提供了高靈敏度之檢測，但仍存在有提供具有更高靈敏度之感測的需求。同時，粒子電漿共振感測系統之準確性受非特異性吸附影響甚巨，所以仍存在有提供對非特異性吸附較不敏感之方法的需求。
有鑑於上述需求，本發明之目的就是在提供一種提供高靈敏度以及低偵測極限並對非特異性吸附較不敏感之待測物濃度之測定方法以及套組。
根據本發明之一目的，提出一種待測物濃度之測定方法，其包含：使其中包含待測物的待測溶液與其中包含奈米粒子之奈米粒子溶液以及光波導元件反應以形成三明治結構；以及利用光偵檢器測量該奈米粒子形成三明治結構後之吸收或散射該光波導元件的漸逝波能量以獲得第一訊號，並透過該第一訊號算出待測物濃度，其中奈米粒子的表面上修飾有偵測辨識元，且光波導元件的表面上藉由直接修飾於光波導元件表面上的第二抗非特異性吸附自組裝固定層，間接地修飾有捕獲辨識元以形成一感測區，且偵測辨識元以及捕獲辨識元係分別與該待測物的不同位點結合。前述散射指彈性散射(Elastic scattering，亦稱瑞利散射(Rayleigh scattering))。
較佳地，奈米粒子可選自於由金奈米粒子、銀奈米粒子、氧化鐵奈米粒子、銅奈米粒子、碳奈米粒子、硒化鎘奈米粒子、摻雜染料之二氧化矽奈米粒子以及摻雜染料之有機聚合物奈米粒子所組成之群組中之其一。
較佳地，光波導元件可選自於由圓柱形光波導元件如光纖、平面光波導元件如平板波導(slab waveguide)、通道波導(channel waveguide)以及管狀光波導元件所組成之群組中之其一。
較佳地，偵測辨識元以及捕獲辨識元可分別選自於由抗體、胜肽、激素受體(hormone receptor)、凝集素(lectin)、醣類(carbohydrate)、化學辨識分子、去氧核糖核酸、核糖核酸以及核酸適體所組成之群組中之其一。
較佳地，奈米粒子與偵測辨識元之間可形成有第一抗非特異性吸附自組裝固定層。
較佳地，利用光偵檢器獲得第一訊號之步驟包含將單頻光、窄頻光或白光照射於光波導元件以產生漸逝波能量。
較佳地，單頻光或窄頻光為固定調製頻率之入射光。
較佳地，利用光偵檢器獲得第一訊號的步驟包含：將光偵檢器置放於光波導元件的遠端，以測量奈米粒子靠近光波導元件的漸逝波範圍內的吸收變化量作為第一訊號。此吸收變化量係以光偵檢器置放於光波導元件遠端以測量透射光強度，其中先測量光波導元件於空白溶液的透射光強度(I0)，及測量光波導元件於樣品溶液的透射光強度(I)，然後經訊號處理算出透光度(Transmittance,T=I/I0)或吸收度(Absorbance,A=-log(I/I0))以用於待測物的定量分析。
較佳地，利用光偵檢器獲得第一訊號的步驟包含：將光偵檢器置放於光波導元件的側面，以測量奈米粒子靠近光波導元件漸逝波範圍內而產生的散射光強度變化量作為第一訊號。其中該光波導元件可包括複數個感測區。
較佳地，光偵檢器可選自光電二極體(photodiodes)、光電晶體(phototransistors)、光電管(phototubes)、光電倍增管(photomultipliers)、光電導體(photoconductors)、金屬半導體金屬光檢測器(metal-semiconductor-metal photodetectors)、電荷耦合裝置(charged coupled devices)、互補式金屬氧化物半導體元件(complementary metal oxide semiconductor devices)所組成之群組中之其一。
較佳地，第二抗非特異性吸附自組裝固定層可包含末端為羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基矽烷(Alkyl silane)自組裝分子，如11-胺基十一烷基三乙氧基矽烷(11-Aminoundecyltriethoxysilane，AUTES)、3-胺基丙基三乙氧基矽烷(3-Triethoxysilylpropylamine，APTES)等以及選自於由末端為兩性離子(zwitterionic)的烷基矽烷自組裝分子，如磺基甜菜鹼矽烷(Sulfobetaine silane，SBSi)、羧基甜菜鹼矽烷(Carboxylbetaine silane，CBSi)、磷脂醯膽鹼矽烷(Phosphatidylcholine silane，PCSi)；末端為聚乙二醇的烷基矽烷自組裝分子，如聚乙二醇矽烷；及末端為氫氧基(-OH)的烷基矽烷自組裝分子所組成之群組中之其一。另外較佳地，第二抗非特異性吸附自組裝固定層可包含聚葡萄糖(Dextran)。
較佳地，第一抗非特異性吸附自組裝固定層可包含末端為羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基硫醇自組裝分子以及選自於由末端為 兩性離子的烷基硫醇自組裝分子，如磺基甜菜鹼-硫醇(Sulfobetaine thiol，SBSH)、羧基甜菜鹼-硫醇(Carboxylbetaine thiol，CB-thiol)、磷脂醯膽鹼-硫醇(Phosphatidylcholine thiol，PC-thiol)；末端為聚乙二醇的烷基硫醇自組裝分子，如聚乙二醇硫醇(Polyethylene glycol thiol，PEG-thiol)；及末端為氫氧基(-OH)的烷基硫醇自組裝分子所組成之群組中之其一。另外較佳地，第一抗非特異性吸附自組裝固定層可包含聚葡萄糖-硫醇(Dextran-thiol)。
根據本發明之另一目的，提出一種待測物濃度之測定套組，其包含：光源、包含表面修飾有偵測辨識元之奈米粒子的奈米粒子溶液、表面修飾有捕獲辨識元之光波導元件、以及測量奈米粒子形成三明治結構後吸收或散射該光波導元件的漸逝波能量以獲得第一訊號之光偵檢器。偵測辨識元以及捕獲辨識元係分別與待測物結合，並於待測物的不同位點結合，但偵測辨識元及捕獲辨識元可以是相同分子。捕獲辨識元可藉由直接修飾於光波導元件表面上的第二抗非特異性吸附自組裝固定層，間接地修飾於光波導元件表面上。
承上所述，依本發明之待測物濃度之測定方法以及套組較習知技藝之常規光波導式粒子電漿共振感測系統，其可具有一或多個下述優點：
(1)第1圖(a)係一常規光波導式粒子電漿共振感測系統的示意圖，其中奈米粒子21為貴金屬奈米粒子。如第1圖(a)所示，常規光波導式粒子電漿共振感測系統係利用奈米粒子21上之捕獲辨識元35與待測物結合前後的吸收係數或散射係數改變(△α)來定量，吸收係數或 散射係數變化量(△α)相對整個奈米粒子的吸收係數或散射係數(α)小很多，△α/α一般小於7%。相較之下，第1圖(c)係依據本發明實施例之形成於光波導元件表面上的三明治結構的示意圖。如第1圖(c)所示，本發明係利用光波導上之捕獲辨識元35與待測物及修飾有奈米粒子之偵測辨識元25形成三明治結構前的零吸收或散射與形成三明治結構後的吸收或散射(α)之差異來定量，因此吸收或散射變化量(α)比常規光波導式粒子電漿共振感測系統的訊號變化量(△α)以及靈敏度至少大一個數量級以上。
(2)第1圖(b)係另一常規光波導式粒子電漿共振感測系統的示意圖。如第1圖(b)所示，即使常規光波導式粒子電漿共振感測系統利用三明治法測試，奈米粒子21上之捕獲辨識元35與待測物及偵測辨識元25形成三明治結構前後的吸收係數或散射係數變化量(△α+△α’)來定量，吸收係數或散射係數變化量(△α+△α’)相對整個奈米粒子的吸收係數或散射係數(α)仍小很多，因此靈敏度提升與本發明相比仍有很大的差距。
(3)常規光波導式粒子電漿共振感測系統之準確性受非特異性吸附影響甚巨，而本發明在光波導上並沒有直接修飾奈米粒子，所以非特異性吸附發生於光波導上不會產生顯著的訊號變化，因此更適用於真實複雜樣品的定量。
(4)本發明所使用之奈米粒子不限於貴金屬奈米粒子，使用上更為多元。
承上所述，依本發明之待測物濃度之測定方法以及套組較利用光波導結合奈米粒子三明治法之螢光或拉曼散射(Raman scattering)感測系統，仍具有一或多個下述優點：
(1)偵測辨識元不需再額外標誌螢光染料分子或拉曼染料分子。
(2)光學架構較簡單且可使用較便宜的光電元件。
(3)螢光或拉曼散射不易充份利用光波導元件之多次全內反射特性以大幅增加測定之靈敏度。
S101~S103‧‧‧步驟
21‧‧‧奈米粒子
22‧‧‧保護層
23‧‧‧第一抗非特異性吸附自組裝固定層
25‧‧‧偵測辨識元
31‧‧‧光波導元件
33‧‧‧第二抗非特異性吸附自組裝固定層
35‧‧‧捕獲辨識元
A‧‧‧待測物
第1圖(a)及(b)係常規光波導式粒子電漿共振感測系統的示意圖，而第1圖(c)係依據本發明實施例形成之三明治結構的示意圖。
第2圖係依據本發明實施例之待測物濃度之測定方法的流程圖。
第3圖係依據本發明實施例之表面修飾有偵測辨識元之奈米粒子的製備示意圖。
第4圖係依據本發明實施例對cTnI二次標準品進行濃度檢測之即時偵測圖。
第5圖係顯示依據第4圖之結果繪製的檢量線的圖式。
第6圖係依據本發明實施例之表面修飾有HS-DNAC的光波導元件的製備示意圖。
第7圖係依據本發明實施例之表面修飾有NH2-DNAD的奈米粒子的製備示意圖。
第8圖係依據本發明實施例對銀離子二次標準品進行多濃度檢測之即時偵測圖。
第9圖係顯示依據第8圖之結果繪製的檢量線的圖式。
第10圖係依據本發明實施例之光波導元件的非特異性吸附測試結果圖。
第11圖係依據本發明實施例對PCT二次標準品進行多濃度檢測之即時偵測圖。
第12圖係顯示依據第11圖之結果繪製的檢量線的圖式。
第13圖係為顯示以本發明之三明治法以及ECL檢測法對11個PCT樣品間之線性相關分析結果的圖式。
本文中所用之「修飾」係指物理或化學的修飾技術，包含但不限於物理氣相沉積法(Physical vapor deposition，PVD)、化學氣相沉積法(Chemical vapor deposition，CVD)、電化學沉積法(Electrochemical deposition)、自組裝(Self-assembly)與溶膠凝膠法(Sol Gel process)。
本文中所用之「自組裝層」或「自組裝固定層」係指其中包含自組裝分子之自組裝單分子層(self-assembled monolayer)。本文中所用之「自組裝分子」係指不需要借助外力而可進行緊密排列的一種特殊分子，自組裝分子的排列速度常因溶劑或是分子本身的凡德瓦力(van der Waals Force)的作用力而造成影響，一般來說，當自組裝分子的骨架愈長，則分子本身的疏水性作用力便會隨著上升，進而加速自組裝分子的排列。
本文中所用之「光波導元件」係指包含光波導基材以及包覆光波導基材之包層的元件，其中部份包層可為樣品溶液。當入射光在光波導基材內進行全內反射時，光波從光密介質的光波導基材入射到光疏介質的包層時，發生全內反射而光疏介質一側產生一種電磁波，也就是漸逝波(Evanescent wave)，其振幅隨與分界面垂直的深度的增大而呈指數形式衰減。利用光波導元件，通過多次全內反射可以大幅增加漸逝波吸收或散射的變化量，進而大幅增加測定之靈敏度。
第2圖係依據本發明實施例之待測物濃度之測定方法的流程圖。第3圖係依據本發明實施例之表面修飾有偵測辨識元之奈米粒子的製備示意圖。參照第2圖，本發明實施例之測定待測物濃度之方法包含：使其中包含待測物的待測溶液與奈米粒子溶液以及光波導元件反應以形成三明治結構之步驟S101以及利用光偵檢器測量奈米粒子形成三明治結構後之吸收或散射該光波導元件的漸逝波能量以獲得第一訊號，並透過第一訊號算出待測物濃度之步驟S103。
步驟S101中所述之奈米粒子溶液為其中包含表面修飾有偵測辨識元之奈米粒子之溶液。所述之表面修飾有偵測辨識元之奈米粒子可以如第3圖所示地製備。參照第3圖，首先，為防止奈米粒子21之間彼此的吸附聚集，使奈米粒子21可以穩定均勻地分布在水溶液中，不至於聚集沉澱，可先在奈米粒子21的表面修飾一層暫時性的保護層22，接著具有抗非特異性吸附特性之自組裝分子可在奈米粒子21上形成第一抗非特異性吸附自組裝固定層23，最後在活化第一抗非特異性吸附自組裝固定層23後，於第一抗非特異性吸附自組裝固定層23上形成偵測辨識元25，從而形成其表面修飾有偵測辨識元之奈米粒子。在一 實施例中，可不形成暫時性的保護層22，而是直接在奈米粒子21上形成第一抗非特異性吸附自組裝固定層23。在一實施例中，亦得直接在奈米粒子21上形成偵測辨識元25。
奈米粒子21可選自於由金奈米粒子、銀奈米粒子、氧化鐵奈米粒子、銅奈米粒子、碳奈米粒子、硒化鎘奈米粒子、摻雜染料之二氧化矽奈米粒子以及摻雜染料之有機聚合物奈米粒子所組成之群組中之其一，較佳地為金屬奈米粒子，更佳地為貴金屬奈米粒子，最佳地為金奈米粒子。奈米粒子可有不同形狀，如球形、棒形、殼形、三角板形、棱鏡形、星形等，亦可有不同大小。在一實施例中，奈米粒子21可為球形，且具有10~16nm的平均粒徑。
第一抗非特異性吸附自組裝固定層23可包含一或多種之自組裝分子，較佳地為具有抗非特異性吸附特性的自組裝分子，且其可以自組裝、物理氣相沉積法、化學氣相沉積法或溶膠凝膠法修飾於奈米粒子21上。具有抗非特異性吸附特性的烷基硫醇自組裝分子的實例可包含但不限於磺基甜菜鹼-硫醇、羧基甜菜鹼-硫醇、(11-巰基十一烷基)三(乙二醇)((11-Mercaptoundecyl)tri(ethylene glycol)，EG3SH)、6-巰基己醇(6-Mercaptohexanol，MCH)、2-巰基乙醇(2-Mercaptoethanol，MCE)。第一抗非特異性吸附自組裝固定層可包含末端為羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基硫醇自組裝分子以及選自於由末端為兩性離子的烷基硫醇自組裝分子如磺基甜菜鹼-硫醇、羧基甜菜鹼-硫醇、磷脂醯膽鹼-硫醇；末端為聚乙二醇的烷基硫醇自組裝分子，如聚乙二醇硫醇；及末端為氫氧基(-OH)的烷基硫醇自組裝分子所組成之群組中之其一。在一實施例中，第一抗非特異性吸附自組裝固定層23可包含末端為羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基硫醇自組裝分子以及末 端為氫氧基(-OH)的烷基硫醇自組裝分子。在另一實施例中，第一抗非特異性吸附自組裝固定層23可包含末端為羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基硫醇自組裝分子以及末端為兩性離子的烷基硫醇自組裝分子。末端為羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基矽烷自組裝分子主要提供偵測辨識元固定化的反應點。末端為羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基硫醇自組裝分子的實例可包含但不限於16-巰基十六酸(16-Mercaptohexadecanoic acid，MHDA)、11-巰基十一烷酸(11-Mercaptoundecanoic acid，MUA)、AUTES、胱胺(Cystamine)。
藉由包含末端為羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基硫醇自組裝分子，第一抗非特異性吸附自組裝固定層23可在活化之後，以醯胺共價鍵(-CONH-)的方式將偵測辨識元25間接地修飾在奈米粒子21的表面上。當待測物與奈米粒子反應時，奈米粒子21可透過偵測辨識元25與待測物充分地結合。因此，根據待測物的性質，偵測辨識元25可選自於由抗體、胜肽、激素受體、凝集素、醣類、化學辨識分子、去氧核糖核酸、核糖核酸以及核酸適體所組成之群組中之其一。
步驟S101所述之光波導元件為表面修飾有捕獲辨識元之光波導元件。第1圖(c)係依據本發明實施例之形成於光波導元件表面上的三明治結構的示意圖。參照第1圖(c)，第二抗非特異性吸附自組裝固定層33以與第一抗非特異性吸附自組裝固定層23類似之方式形成於光波導元件31的表面上。第二抗非特異性吸附自組裝固定層33可包含一或多種自組裝分子，較佳地為具有抗非特異性吸附特性的自組裝分子，且其可以自組裝、物理氣相沉積法、化學氣相沉積法或溶膠凝膠法修飾於光波導元件31上。光波導元件31可選自於由圓柱形光波 導元件、平面光波導元件以及管狀光波導元件所組成之群組中之其一，較佳地，光波導元件31可為光纖。在一實施例中，第二抗非特異性吸附自組裝固定層33可包含末端為胺基(-NH2)的烷基矽烷自組裝分子如AUTES、APTES以及選自於由磺基甜菜鹼矽烷、羧基甜菜鹼矽烷、磷脂醯膽鹼矽烷、聚乙二醇矽烷(Polyethylene glycol silane，PEG-Si)及末端為氫氧基(-OH)的烷基矽烷自組裝分子所組成之群組中之其一。在另一實施例中，第二抗非特異性吸附自組裝固定層33可包含聚葡萄糖。捕獲辨識元35可以與偵測辨識元25類似的方法，透過第二抗非特異性吸附自組裝固定層33，間接地修飾於光波導元件31表面上。其中偵測辨識元25以及捕獲辨識元35係分別與待測物A結合，並於待測物的不同位點結合，但偵測辨識元25及捕獲辨識元35可以是相同分子。當待測物A接觸表面修飾有捕獲辨識元35之光波導元件31以及表面修飾有偵測辨識元25之奈米粒子21時，偵測辨識元25及捕獲辨識元35透過以不同位點同時結合待測物A，將會形成光波導元件31/待測物A/奈米粒子21的三明治結構。此三明治結構的形成可先將待測溶液與奈米粒子溶液混合，使修飾於奈米粒子21表面上之偵測辨識元25與待測物A充分地結合後，再將其與表面上修飾有捕獲辨識元35的光波導元件31接觸以形成所述之三明治結構；或者先使待測溶液與表面上修飾有捕獲辨識元35的光波導元件31接觸後，再注入其中包含偵測辨識元25修飾於其表面上之奈米粒子21之奈米粒子溶液以形成所述之三明治結構。
在步驟S103中，光偵檢器可測量步驟S101中所形成之三明治結構的奈米粒子21吸收或散射光波導元件31的漸逝波能量以獲得第一訊號，並透過第一訊號算出待測物濃度。舉例而言，透過在步驟S101中所形成之三明治結構， 當入射光照射於光波導元件31之近端時，光波於光波導元件內進行多次全內反射並產生漸逝波，奈米粒子21可吸收或散射光波導元件31的漸逝波能量。多次全內反射可以大幅增加漸逝波吸收或散射之變化量，進而大幅增加測定之靈敏度，光偵檢器可透過測量奈米粒子21的透射光強度或散射光強度之變化而獲得第一訊號，並透過第一訊號算出待測物濃度。光偵檢器直接量測光強度而不需經分光器在空間上按波長分光，換言之，不需使用光譜儀。較佳地，光偵檢器置放於光波導元件31遠端以測量奈米粒子21的透射光強度。次佳地，光偵檢器置放於光波導元件31側面以測量奈米粒子21的散射光強度。在一實施例中，入射光可為單頻光、窄頻光或白光。較佳地，入射光可為窄頻光。在一實施例中，用於發射入射光之裝置可為用以發出特定波長與固定調製頻率(frequency modulated)之光訊號之裝置，經解調(frequency demodulated)可增加訊雜比(signal-to-noise ratio)。舉例而言，所述之用以發出特定波長與固定調製頻率之光訊號之裝置，以下稱為光訊號輸出穩定裝置，其可包含穩定光源驅動模組(如定電壓控制模組、加熱敏電阻之定電壓控制模組或定電流控制模組)、發光單元(如發光二極體或雷射光源)與光源溫度穩定模組。由於發光單元易受外在環境(如溫度、氣流擾動)之影響，而造成光訊號飄移，可使用被動式或主動式光源溫度穩定模組以對該發光單元進行恆溫控制，進一步提升光訊號穩定度。
本發明進一步提供包含上述奈米粒子溶液、光波導元件、光源及光偵檢器之套組(或感測裝置)。套組可為利用粒子電漿共振(Particle Plasmon Resonance，PPR)原理所建立之感測裝置。光源可為上述之光訊號輸出穩定裝置。感測裝置可進一步包含光波導元件溫度控制模組、樣品進樣溫度 控制模組。光波導元件溫度控制模組與樣品進樣溫度控制模組係用以確保注入之樣品溫度與光波導元件溫度一致，以增加檢測結果之可靠性。
在一實施例中，感測裝置可選自於由光纖式粒子電漿共振感測裝置、平面波導式粒子電漿共振感測裝置或管狀光波導式粒子電漿共振感測裝置所組成之群組中之其一。
由感測裝置獲得之第一訊號可透過訊號擷取與處理裝置進行處理以算出待測物濃度。具體而言，訊號擷取與處理裝置可包含接收第一訊號並根據第一訊號之強度對應產生電訊號之光偵檢器、連接於光偵檢器以將電訊號轉換成一電壓訊號再進行放大動作之電流/電壓轉換放大電路以及接收上述電壓訊號進行鎖相放大/解調之動作之鎖相放大模組。其中光偵檢器可為光電二極體檢測器或光電晶體檢測器，而鎖相放大模組可為類比式鎖相放大模組或數位式鎖相放大模組。
下文中提供更進一步的實例以更加詳細地解釋本發明。
實例1
實例1係以心肌肌鈣蛋白I(cTnI)作為待測物、以光纖作為光波導元件並以金奈米粒子作為奈米粒子。依據本發明一實施例之待測物濃度之測定方法(以下稱為三明治法)，為了測定cTnI的濃度，需先將可分別以不同位置與cTnI結合之偵測辨識元以及捕獲辨識元分別修飾在奈米粒子以及光纖表面上，表面修飾有捕獲辨識元的光波導元件以及表面修飾有偵測辨識元的奈米粒子的製備方法詳述於下。
製備表面修飾有捕獲辨識元的光波導元件
1.將清洗好的空白光纖，以氧電漿清洗20分鐘後備用。
2.將5mM的AUTES及10mM的SBSi一同配製於無水乙醇中。
3.將空白光纖浸泡AUTES/SBSi混合溶液當中12小時，使其可以自組裝固定化。
4.將修飾完後的光纖自溶液中取出，使用去離子水清洗數次並以氮氣將表面吹乾。
5.配製0.08M之雙琥珀醯亞胺辛二酸酯(disuccinimidyl suberate，DSS)於二甲基亞碸(DMSO)中。
6.將修飾上AUTES/SBSi的光纖浸泡於DSS溶液當中12小時，以活化AUTES末端之胺基(-NH2)使其可與捕獲辨識元(抗cTnI抗體，AbC)反應以使捕獲辨識元固定化。
7.將修飾完後的光纖自溶液中取出，使用去離子水清洗數次並以氮氣將表面吹乾。
8.置入微流體晶片中，使用黏度為10000的UV膠點入晶片底部的兩個孔洞使光纖固定，並放置UV燈箱中，照光15分鐘。
9.待UV膠凝固後，將甲醇及去離子水注入感測區中清洗以去除槽道中的UV膠蒸氣。
10.配製10-4g/mL的捕獲辨識元於PBS緩衝溶液中，將此溶液注入晶片反應修飾2小時。
11.將去離子水注入晶片中清洗，洗去多餘的抗體，即完成了將捕獲辨識元修飾在光波導元件上的步驟。若此感測晶片沒有要馬上使用，可先暫放於4℃冰箱中保存一週。
在本示例中，使用SBSi及AUTES形成第二抗非特異性吸附自組裝固定層，其中SBSi為兩性離子，在表面形成一層水分子的包覆層，可抗非特異 性吸附。而AUTES的末端為-NH2基，經過DSS活化後，可以使帶有-NH2基的捕獲辨識元直接接在空白光纖上，以便檢測cTnI。
Figure 107130488-A0305-02-0018-1
製備表面修飾有偵測辨識元的奈米粒子
1.配製2mg/mL的Tween 20於PBS緩衝溶液中。
2.將2mL的奈米金溶液與2mL濃度為2mg/mL的Tween 20溶液均勻混合成4mL，並靜置反應1小時，使Tween 20可以均勻包覆在金奈米粒子，使其不易聚集。
3.配製0.5mM的CB及0.5mM的MCE於PBS緩衝溶液中。
4.加入100μL的CB-thiol/MCE溶液至已有Tween 20保護的奈米金溶液當中，靜置反應12小時，使其可以自組裝固定化。
5.將修飾CB-thiol/MCE的奈米金溶液倒入濃縮離心管(30K)中，以轉速6000r.p.m.離心10分鐘。
6.下層液丟棄後，將上層液的金奈米粒子以溶於PBS緩衝溶液的0.2mg/mL Tween 20溶液回溶至4mL。
7.再將溶液以濃縮離心管(30K)，以轉速6000r.p.m.再離心10分鐘一次。
8.下層液丟棄，上層液的金奈米粒子以PBS緩衝溶液回溶至2mL。
9.將1mM的1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride，EDC)及1mM的N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)一同配製於PBS緩衝溶液中。
10.取步驟8的奈米金溶液2mL加入1mM的EDC/NHS100μL，反應30分鐘，使官能基活化。
11.將活化完成的奈米金溶液倒入濃縮離心管(30K)中，以轉速6000r.p.m.離心10分鐘。
12.下層液丟棄，上層液的金奈米粒子以PBS緩衝溶液回溶至2mL。
13.配製10-5g/mL的偵測辨識元(抗cTnI抗體，AbD)於PBS緩衝溶液。
14.取步驟12的奈米金溶液2mL加入200μL之10-5g/mL偵測辨識元，反應12小時，使偵測辨識元可以修飾在金奈米粒子上，以便抓取cTnI。
15.將已修飾上偵測辨識元的奈米金溶液取倒入離心管中，以轉速16000r.p.m.低溫(4℃)離心15分鐘。
16.下層液丟棄，上層液的金奈米粒子以PBS緩衝溶液回溶至2mL後，即為表面修飾有偵測辨識元的奈米粒子(以下稱為AuNP@AbD)。若修飾上偵測辨識元的金奈米粒子溶液沒有要馬上使用，可先暫放於4℃冰箱中保存一週。
在本示例中，使用CB-thiol及MCE形成第一抗非特異性吸附自組裝固定層，其中CB有抗非特異性吸附的效果。Tween 20在此的用途為均勻包覆在金奈米粒子外層，可形成一暫時性的保護層使金奈米粒子較不容易聚集。EDC和NHS則可活化CB上之-COOH基，使帶有-NH2基的偵測辨識元可接在金奈米粒子上。
以感測裝置對cTnI二次標準品進行濃度檢測
為了建立準確之檢量線。以下為以光纖式粒子電漿共振感測裝置檢測cTnI二次標準品進行濃度檢測之詳細步驟：
1.準備如上所述之表面修飾有捕獲辨識元的光纖。若是從冰箱中拿出，須待回溫至室溫方可使用。
2.將光纖放於光纖式粒子電漿共振感測晶片當中，注入PBS緩衝溶液，待訊號穩定方可進行實驗。
3.配製待測物cTnI溶液，將cTnI溶於PBS緩衝溶液中配製成各個濃度(2×10-12、2×10-11、2×10-10、2×10-9、2×10-8、2×10-7g/mL)。
4.將AuNP@AbD與不同濃度的cTnI標準品，以體積比1比1均勻混合，並搖晃15分鐘，使金奈米粒子上的偵測辨識元可與cTnI完全反應，形成二次標準品，此時cTnI的濃度會因為稀釋了而變為1×10-12、1×10-11、1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7g/mL。
5.將步驟4已經製備完成的不同濃度cTnI的二次標準品與其上修飾有捕獲辨識元的光波導元件以一個濃度一個光波導元件的方式接觸直到取200秒時間其RSD為0.008%以下才停止。由於平衡時間隨著濃度不同而有所不同，低濃度約是需要15分鐘，而高濃度則需要約60分鐘。所得之結果如第4圖所示。
6.建立檢量線並計算三明治法之偵測極限。
此檢驗過程中，將cTnI標準品與AuNP@AbD均勻混合，會進行第一段抗原抗體間的結合，形成二次標準品，而後再將此二次標準品與其上修飾有捕獲辨識元的光纖接觸。因為偵測辨識元及捕獲辨識元此兩者與cTnI之間的專一性鍵合是不同的抗原結合位，因此捕獲辨識元會與cTnI進行第二階段的抗原抗體結合，當反應進行時，金奈米粒子會逐漸靠近光纖漸逝波範圍內產生粒子電漿共振並吸收漸逝波，而置放於光波導元件遠端的光偵檢器因漸逝波吸收度改變可觀察到明顯的訊號變化量。此檢驗過程亦得先將cTnI標準品與其上修飾有捕獲辨識元的光纖接觸，然後注入AuNP@AbD溶液於感測晶片中以使AuNP@AbD與cTnI結合，不經過二次標準品的製備。
第4圖係依據本發明實施例對cTnI二次標準品進行單一濃度檢測之即時偵測圖。其中，第4圖的(a)~(c)部分為cTnI濃度為1×10-7g/mL的二次標準品重複三次的結果；第4圖的(d)~(f)部分為cTnI濃度為1×10-8g/mL的二次標準品重複三次的結果；第4圖的(g)~(i)部分為cTnI濃度為1×10-9g/mL的二次標準品重複三次的結果；第4圖的(j)~(l)部分為cTnI濃度為1×10-10g/mL的二次標準品重複三次的結果；第4圖的(m)~(o)部分為cTnI濃度為1×10-11g/mL的二次標準品重複三次的結果；第4圖的(p)~(r)部分為cTnI濃度為1×10-12g/mL的二次標準品重複三次的結果。隨著濃度升高，有越多與AuNP@AbD結合的cTnI逐漸靠近光纖，而其上的cTnI會與捕獲辨識元進行第二階段的抗原抗體結合，當金奈米粒子進到漸逝波內即會產生粒子電漿共振並吸收漸逝波，造成明顯的訊號變化量。隨著指標二次標準品上的cTnI數量越多，置放於光波導元件31遠端的光偵檢器因漸逝波吸收度改變而觀察到訊號變化量也越趨明顯。
各濃度下的訊號值(I)與空白溶液的訊號值(I0)相減，I-I0即為delta I(△I)，再除以空白訊號可獲得△I/I0，後將三明治法測單一濃度cTnI二次標準品之即時偵測圖中的所有訊號差值△I/I0列出，如下表1所示。
Figure 107130488-A0305-02-0022-2
以△I/I0和取Log後的濃度，且N=3作圖，得到第5圖所示之檢量線。第5圖係顯示依據第4圖以及表1之結果繪製的檢量線的圖式。參照第5圖，在線性範圍中，有良好的線性關係(R=0.998)，經計算後可得到以三明治方法對cTnI二次標準品進行單一晶片單一濃度定量分析的偵測極限為2.45×10-14g/mL(0.0245pg/mL，1.02×10-15M)。相較於傳統上利用單一捕獲辨識元的光纖式粒子電漿共振感測置對cTnI的偵測極限為1.47×10-8g/mL之偵測法，三明治法可使偵測極限提升了近6個數量級數而提供非常低的偵測極限。
實例2
實例2係以銀離子作為待測物、以光纖作為光波導元件並以奈米金粒子作為奈米粒子。依據本發明實施例之待測物濃度之測定方法(以下稱為三明治法)，為了測定銀離子的濃度，需先將可分別以不同位置與銀離子結合之偵測辨識元NH2-DNAD以及捕獲辨識元HS-DNAC分別修飾在金奈米粒子以及光纖表面上，表面修飾有HS-DNAC的光波導元件以及表面修飾有NH2-DNAD的金奈米粒子的製備方法分別如第6圖以及第7圖所示。
第6圖係依據本發明實施例之表面修飾有HS-DNAC的光波導元件的製備示意圖。參照第6圖，除了將修飾上AUTES/SBSi的光纖浸泡於1mM的6-馬來醯亞胺己酸N-琥珀酯(N-ε-malemidocaproyl-oxysuccinimide ester，EMCS)溶液當中2小時以進行活化AUTES末端之胺基(-NH2)，以及將10-6M的HS-DNAC溶液注入晶片反應修飾2小時以外，以與實例1相同之方式製備表面修飾有HS-DNAC的光波導元件。
第7圖係依據本發明實施例之表面修飾有NH2-DNAD的奈米粒子的製備示意圖。參照第7圖，表面修飾有NH2-DNAD的金奈米粒子係由以下方法製備：
1.配製2mg/mL的Tween 20於PBS緩衝溶液中。
2.將2mL的奈米金溶液與2mL濃度為2mg/mL的Tween 20溶液均勻混合成4mL，並靜置反應1小時，使Tween 20可以均勻包覆在金奈米粒子，使其不易聚集。
3.配製0.5mM的MHDA及0.5mM的SBSH於PBS緩衝溶液中。
4.加入100μL的MHDA/SBSH溶液至已有Tween 20保護的奈米金溶液當中，靜置反應整夜，使其可以自組裝固定化。
5.將修飾有MHDA/SBSH的奈米金溶液倒入濃縮離心管(30K)中，以轉速14000r.p.m.離心20分鐘。
6.下層液丟棄後，將上層液的金奈米粒子以溶於PBS緩衝溶液的0.2mg/mL Tween 20溶液回溶至4mL。
7.再將溶液以濃縮離心管(30K)，以轉速14000r.p.m.再離心20分鐘一次。
8.下層液丟棄，上層液的金奈米粒子以PBS緩衝溶液回溶至2mL。
9.將1mM的1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及1mM的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)一同配製於PBS緩衝溶液中。
10.取步驟8的奈米金溶液2mL加入1nM的EDC/NHS100μL，反應10分鐘，使官能基活化。
11.將活化完成的奈米金溶液倒入濃縮離心管(30K)中，以轉速10000r.p.m.離心15分鐘。
12.下層液丟棄，上層液的金奈米粒子以PBS緩衝溶液回溶至2mL。
13.配製10-6g/mL的NH2-DNAD於PBS緩衝溶液。
14.取步驟12的奈米金溶液2mL加入200μL之10-5g/mL偵測辨識元，反應整夜，使NH2-DNAD可以修飾在金奈米粒子上，以便抓取銀離子。
15.將已修飾上偵測辨識元的奈米金溶液取倒入離心管中，以轉速14000r.p.m.低溫(4℃)離心15分鐘。
16.下層液丟棄，上層液的金奈米粒子以PBS緩衝溶液回溶至2mL後，即為表面修飾有NH2-DNAD的金奈米粒子(以下稱為AuNP@DNAD)。若修飾上NH2-DNAD的金奈米粒子溶液沒有要馬上使用，可先暫放於4℃冰箱中保存一個禮拜。
在完成表面修飾有HS-DNAC的光波導元件以及表面修飾有NH2-DNAD的金奈米粒子的製備後，參照實例1中所述之以感測器對cTnI二次標準品進行濃度檢測的步驟，建立銀離子的建立檢量線。因為HS-DNAC與NH2-DNAD中含有cytosine-cytosine(C-C)mismatch，會與銀離子作用形成cytosine-Ag+-cytosine(C-Ag+-C)鹼基對，其餘鹼基對則彼此互補，由於大部分為互補的鹼基對，當反應進行時，金奈米粒子會逐漸接近光纖並吸收漸逝波，因此置放於光波導元件遠端的光偵檢器因漸逝波吸收度改變可以觀察到明顯 的訊號變化量，接著再依不同銀離子標準品的濃度會有不同的訊號變化量。第8圖係依據本發明實施例對銀離子二次標準品進行多濃度檢測之即時偵測圖。為節省時間以及成本，第8圖係將不同濃度之銀離子二次標準品，由低濃度至高濃度(純水
Figure 107130488-A0305-02-0025-19
、空白
Figure 107130488-A0305-02-0025-30
、10-12M
Figure 107130488-A0305-02-0025-21
、10-11M
Figure 107130488-A0305-02-0025-22
、10-10M
Figure 107130488-A0305-02-0025-23
、10-9M
Figure 107130488-A0305-02-0025-24
、10-8M
Figure 107130488-A0305-02-0025-25
、10-7M
Figure 107130488-A0305-02-0025-26
、10-6M
Figure 107130488-A0305-02-0025-27
、純水
Figure 107130488-A0305-02-0025-31
)依序接觸單個表面修飾有HS-DNAC的光波導元件，每一個濃度皆等待相同的時間約15分鐘所得之即時偵測圖。第9圖係顯示依據第8圖之結果繪製的檢量線的圖式。由第9圖可以看出，本發明實施例對銀離子濃度有良好的線性關係(R2=0.999)，其偵測極限為1.788×10-13M。相較於先前的偵測方法，使用三明治法不僅使偵測極限提升了近4個數量級數，也證明了三明治法的可應用性。
實例3
實例3係以血症生化指標前降鈣素原(Procalcitonin，PCT)作為待測物、以光纖作為光波導元件並以奈米金粒子作為奈米粒子。為避免其它基質之干擾影響偵測靈敏度與準確度，導致偵測誤差。實例3中利用兩種抗非特異性吸附分子，磺基甜菜鹼矽烷分子結合AUTES架橋分子來形成第二抗非特異性吸附自組裝固定層，磺基甜菜鹼-硫醇分子結合MHDA架橋分子來形成第一抗非特異性吸附自組裝固定層。以注入PBS緩衝液中含偵測辨識元(Anti-PCTD)之AuNP@AbD(1.0×10-7、1.0×10-4g/ml)進行非特異性吸附測試，其結果顯示如第10圖。第10圖係依據本發明實施例之光波導元件的非特異性吸附測試結果圖。由第10圖可以看出，當PBS緩衝液中沒有PCT而只有含偵測辨識元(Anti-PCTD)之AuNP@AbD時，感測裝置所測得之訊號強度與背景無法區分，也就是說，第二抗非特異性吸附自組裝固定層可有效地防止光波導元件上的非特異性吸附。接著以與實例1所述相同之方式，利用DSS活化AUTES後，將用於與PCT結合之捕獲辨識元進一步修飾於上述之光波導元件上。實例3中所用之表面修飾有偵測 辨識元的奈米粒子則是在金奈米粒子表面修飾MHDA/SBSH，並在利用EDC/NHS進行活化，之後接上偵測辨識元(以下稱為AuNP@AbD)。接著將修飾好的AuNP@AbD與PCT不同濃度的PCT標準品混合後，以與實例2所述相同之方法獲得對PCT二次標準品進行多濃度檢測之即時偵測圖。第11圖係依據本發明實施例對PCT二次標準品進行多濃度檢測之即時偵測圖，由低濃度至高濃度(PBS(1)、10-12g/ml(2)、10-11g/ml(3)、10-10g/ml(4)、10-9g/ml(5)、10-8g/ml(6)、10-7g/ml(7)、10-6g/ml(8)、PBS(9))依序接觸單個表面修飾有捕獲辨識元的光波導元件之即時偵測圖。第12圖係顯示依據第11圖之結果繪製的檢量線的圖式。
由第11圖及第12圖可看出，對於PCT，本發明之三明治法可提供從1pg/mL到100ng/mL的寬線性響應範圍和為0.28pg/mL(0.021pM)之極低的檢測極限(LOD)，其遠較使用電化學發光(Electrochemiluminescence,ECL)檢測法(3.40pM)以及電化學檢測法(0.5pM)的檢測極限低。接著分別以本發明之三明治法以及ECL檢測法檢測11個真實血漿樣品，並將所得之結果進行線性相關分析(linear correlation analysis)。第13圖係為顯示以本發明之三明治法以及ECL檢測法對11個PCT樣品間檢測結果相關性的圖式。由第13圖可以看出兩種檢測方法所得之結果差異不大。
以上實例已證實本發明之待測物濃度之測定方法可提供高靈敏度以及低偵測極限，因此透過本發明之待測物濃度之測定方法可以測出以往因濃度過低而無法測得之待測物濃度，從而可滿足生物分子檢測、醫藥檢測、食品檢測、農產品檢測、環境樣品中的金屬離子、農藥的殘留與有害汙染物檢測等各種應用檢測中之高靈敏度以及低偵測極限之需求。
雖然本發明已參照實例具體呈現及描述，然應為所屬領域中具有通常技術者了解的是，可於其中進行形式與細節上之各種改變而不脫離由附隨申請專利範圍定義之本發明之範疇與精神及等效配置。
S101~S103‧‧‧步驟

Claims (15)

  1. 一種不需使用光譜儀的待測物濃度測定方法，其包含：使其中包含一待測物的一待測溶液與其中包含複數個奈米粒子之一奈米粒子溶液以及一光波導元件反應以形成一三明治結構；以及利用一光偵檢器測量該複數個奈米粒子形成該三明治結構後之吸收或散射該光波導元件的漸逝波能量以獲得一第一訊號，並透過該第一訊號算出該待測物濃度，其中該複數個奈米粒子中的每一個奈米粒子的表面上皆修飾有一偵測辨識元，且該光波導元件的表面上藉由直接修飾於該光波導元件的表面上的一第二抗非特異性吸附自組裝固定層，間接地修飾有一捕獲辨識元，其中該偵測辨識元以及該捕獲辨識元係分別與該待測物的不同位點結合，其中利用該光偵檢器獲得該第一訊號之步驟包含將單頻光或窄頻光作為入射光照射於該光波導元件以產生漸逝波能量。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之待測物濃度測定方法，其中該奈米粒子係選自於由金奈米粒子、銀奈米粒子、氧化鐵奈米粒子、銅奈米粒子、碳奈米粒子、硒化鎘奈米粒子、摻雜染料之二氧化矽奈米粒子以及摻雜染料之有機聚合物奈米粒子所組成之群組中之其一。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之待測物濃度測定方法，其中該光波導元件係選自於由圓柱形光波導元件、平面光波導元件以及管狀光波導元件所組成之群組中之其一。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之待測物濃度測定方法，其中該偵測辨識元以及該捕獲辨識元各獨立地選自於由抗體、胜肽、激素受體、凝集素、醣類、化學辨識分子、去氧核糖核酸、核糖核酸以及核酸適體所組成之群組中之其一。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之待測物濃度測定方法，其進一步包含一第一抗非特異性吸附自組裝固定層於該奈米粒子與該偵測辨識元之間。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之待測物濃度測定方法，其中該第一抗非特異性吸附自組裝固定層包含末端為羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基硫醇自組裝分子以及選自於由末端為兩性離子的烷基硫醇自組裝分子、末端為聚乙二醇的烷基硫醇自組裝分子及末端為氫氧基(-OH)的烷基硫醇自組裝分子所組成之群組中之其一。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之待測物濃度測定方法，其中該第一抗非特異性吸附自組裝固定層包含聚葡萄糖-硫醇。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之待測物濃度測定方法，其中單頻光或窄頻光為固定調製頻率之入射光。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之待測物濃度測定方法，其中利用該光偵檢器獲得該第一訊號的步驟包含：將該光偵檢器置放於該光波導元件的遠端，以測量該複數個奈米粒子靠近該光波導元件的漸逝波範圍內而產生的透射光強度變化量作為該第一訊號。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之待測物濃度測定方法，其中利用該光偵檢器獲得該第一訊號的步驟包含：將該光偵檢器置放於該光波導元件的側面，以測量該複數個奈米粒子靠近該光波導元 件漸逝波範圍內而產生的散射光強度變化量作為該第一訊號。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之待測物濃度測定方法，其中該光波導元件包括複數個感測區。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之待測物濃度測定方法，其中該光偵檢器選自於由光電二極體、光電晶體、光電管、光電倍增管、光電導體、金屬半導體金屬光檢測器、電荷耦合裝置、互補式金屬氧化物半導體元件所組成之群組中之其一。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之待測物濃度測定方法，其中該第二抗非特異性吸附自組裝固定層包含末端為羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的烷基矽烷自組裝分子以及選自於由末端為兩性離子的烷基矽烷自組裝分子、末端為聚乙二醇的烷基矽烷自組裝分子及末端為氫氧基(-OH)的烷基矽烷自組裝分子所組成之群組中之其一。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之待測物濃度測定方法，其中該第二抗非特異性吸附自組裝固定層包含聚葡萄糖。
  15. 一種待測物濃度之測定套組，其包含：一光源；一奈米粒子溶液，包含複數個奈米粒子，該複數個奈米粒子的每一個表面皆修飾有一偵測辨識元；一光波導元件，其表面修飾有一捕獲辨識元；以及一光偵檢器，測量該奈米粒子溶液中之該複數個奈米粒子形成一三明治結構後之吸收或散射該光波導元件的漸逝波能量以獲得一第一訊號， 其中該偵測辨識元以及該捕獲辨識元係分別與該待測物的不同位點結合，且該捕獲辨識元係藉由直接修飾於該光波導元件的表面上的一第二抗非特異性吸附自組裝固定層，間接地修飾於該光波導元件的表面上，其中利用該光偵檢器獲得該第一訊號之步驟包含將單頻光或窄頻光作為入射光照射於該光波導元件以產生漸逝波能量。
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