MX2010011176A - Inmunoanalisis sensible que utiliza nanoparticulas revestidas. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan las nanopartículas revestidas que comprenden un núcleo rodeado por una cubierta que incrementa la reflectancia de la nanopartícula, en donde la nanopartícula revestida no incluye una molécula activa Raman. Se proporcionan los dispositivos y los métodos de inmunoanálisis que utilizan las nanopartículas revestidas.

Description

UNOANÁLISIS SENSIBLE QUE UTILIZA NANOPARTÍCULAS REVESTI APLICACIONES RELACIONADAS Esta solicitud reclama la prioridad de la Solicitud Provisional de Patentes dos Unidos No. 61/071 ,035, presentada el 9 de Abril, 2008, la cual se inc Í en el presente por referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan partículas revestidas que comprenden un núcleo rodea armazón que incrementa la reflectancia de la nanopartícula, en do opartícula revestida no necesita, pero opcionalmente puede incluir una m a Raman. Las nanopartículas revestidas divulgadas en el presente son úti dispositivos de prueba y métodos para la determinación cuantitativa y/o cua a presencia o ausencia de un analito en una muestra de líquido.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN rmedades, tales como infecciones causadas por bacterias o viras cimientos, tales como el embarazo.

Varios tipos de inmunoanálisis son conocidos en la técnica. Un ti edimiento de inmunoanálisis es el flujo lateral del inmunoanálisis. Las prueb lateral utilizan un soporte sólido, tal como la nitrocelulosa, plástico, o vidri r a cabo la detección. En vez de girar la muestra a través del s endicularmente, como en el caso de una prueba de "flujo continuo", a la m permite que fluya lateralmente a lo largo del soporte mediante fuerzas capil s a partir de una zona de aplicación a una zona de reacción en la superfi prueba de flujo lateral, la captura de los anticuerpos son unidos en el s o. La detección de anticuerpos son conjugados a una detección de molécul ies proporcionan una señal que es detectable. Una muestra de líquido es co contacto con la detección de anticuerpos, y la mezcla de anticuerpos stras/detección se le permite fluir a lo lardo del soporte sólido. Si el análisi enté, un complejo en "sándwich" se forma en la ubicación en el soporte de la captura de anticuerpos ha sido unida. La señal a partir de la detecc éculas localizadas en la línea de captura es entonces detectada, y so. Estos dispositivos están generalmente encajonados en un alojamiento p bierta con calibraciones para ayudar en la detección de los analitos particula Muchos ejemplos de diferentes tipos de detección de moléculas útiles unoanálisis de flujo lateral son conocidos en la técnica, dichos fluoroforos, c dos, ligados a partículas de látex, y nanopartículas como un punto cuántic erficie de mayor dispersión Raman (SERS) nanopartículas. Por ejemplo, nte de EE.UU. N ° 5591 , 645 se describe el uso de moléculas visibles "T como el coloide dorado, que puede ser visto sin el uso de la instrumen más, la patente de los EE.UU. no. 6.514.767 de Natán describe nanopa puestas por SERS-activos (SACNs) que comprende una nanopartícula de se ha unido o asociado a su superficie una o más moléculas de Raman-ac ncapsulada por una cubierta que comprende un polímero, vidrio o cualqui eríal dieléctrico. La patente de los EE.UU. N° 5714389 describe los métod oanálisis del flujo lateral y dispositivos de prueba que utilizan una partíc r que puede ser un coloide de metal, preferentemente dorado. Del mismo m nte EE.UU. N° 7,109,042 describe los dispositivos de la inmunoanálisis d ral que utiliza etiquetas directas, tales como una dispersión coloidal dorada bandas correspondientes a las vibraciones moleculares específicas p stra que se analiza (el analito). En la práctica de la espectroscopia de Rar de una fuente de luz, generalmente un láser, se centra en la muestra de tal genera la radiación dispersa inelástica, lo que es ópticamente recogido y diri longitud de onda de dispersión o del espectrómetro de transformación de el que un detector convierte la energía de los fotones que inciden so sidad de la señal eléctrica.

La conversión muy baja de radiación incidente a la radiación dispersa ine ada espectroscopia Raman a las aplicaciones que son difíciles de realiz ectroscopia infrarroja, tales como el análisis de las soluciones acuosa ubierto en 1974, sin embargo, cuando una molécula en las proximidades trodo de plata rugosa se somete a una fuente de excitación Raman, la inte a señal generada se aumenta hasta en seis órdenes de magnitud. (Fleisch Hendra, PJ, y McQuillan, AJ, "espectros Raman de piridina adsorbida trodo de plata," Chem. Phys. Lett, 26, 123, (1974), y Weaver, Farquharson ayyoni, MA, "factores de superficie para la mejora de la dispersión Raman trodos de plata. Papel de las interacciones de la superficie de adsórbat esarrollado nanopartículas Nanoplex™ para su uso en estas determinacione opartículas consisten de una base de nanopartículas doradas, sobre el c rben las moléculas Raman indicadoras capaces de generar una superficie a señal Raman. Las nanopartículas doradas Raman-etiquetadas están rec una capa de sílice de espesor de una duración aproximada de 10 a 50. La c silicona protege la indicación de desabsorción de la superficie, imp acción de plasmones-plasmones entre las partículas doradas adyacen bién evita la generación de señales SERS de los componentes de la solució opartículas SERS que tienen una capa de polímero en lugar de la capa de sí riben en la Publicación de la Solicitud de Patente EE.UU. No. 2007/016521 Al tiempo que toma ventaja de la alta sensibilidad de SERS, la detecció l generada a partir de una nanopartícula SERS requiere el uso de un instru z de detectar una señal Raman. Puede ser ventajoso en algunas circunst r una nanopartícula para su uso en un inmunoanálisis de flujo lateral que p mayor sensibilidad tal vez comparable al de una nanopartícula SERS, pe requieren la tecnología del lector de reflectancia relativamente simple y la detección. noanálisis proporcionan importantes ventajas sobre la sensibilidad del dete lisis de moléculas tales como el oro coloidal cuando el ensayo se lee con un eflectancia.

En ciertas modalidades, la invención es una cubierta de nanopartícul prenden un núcleo y una capa que aumenta la reflectancia de las nanopart onde las nanopartículas recubiertas no incluyen una molécula Raman-acti s modalidades, las nanopartículas recubiertas incluyen una molécula R a. El núcleo puede, por ejemplo y sin limitación alguna, ser un metal, tal co al que exhibe la resonancia de plasmones, por ejemplo, el oro.

En algunas modalidades, el armazón se compone de sílice, mientras s modalidades del armazón es de otro material de cerámica, como otro de ó tras modalidades la capa está compuesta de un polímero. El polímero pue ejemplo y sin limitación, glicol de polietileno, polimetilmetacrilato, o políestir azón puede por completo o incompleto que rodean el núcleo.

Las nanopartículas revestidas de la invención pueden estar formad En ciertas modalidades, el armazón de la nanopartícula se modifica co ermitir la conjugación de las moléculas a la superficie de la nanopartícula. alidades particulares, la modificación introduce grupos de tiol sobre la sup s nanopartículas recubiertas. En otras modalidades, un ligando, por ejempl ación, un anticuerpo, es conjugado col el armazón de la nanopartícula re iante los grupos de tiol.

El ligando puede unirse a cualquier analito de interés que puede o n enté en una muestra. En ciertas modalidades, el ligando es un anticuerpo a las proteínas específicas del virus de la influenza A o virus de la influenza En ciertas otras modalidades, la invención es una cubierta de nanopart consiste esencialmente de un núcleo y una capa que aumenta la reflectanci opartícula y un ligando unido a la superficie del armazón.

En todavía otras modalidades, la invención es un dispositivo de prueb rminar la presencia o ausencia de un analito en una muestra de líquid prende: (a) una muestra que recibe a miembro, (b) un portador en la comuni uetados sean transportados a lo largo de la longitud del portador para pas de detección, y en donde la detección del reactivo etiquetado en la zo cción es indicativo de la presencia del analito en la muestra de líquido.

En ciertas modalidades, el reactivo etiquetado utilizado en el disposit ba consta de un ligando que se une al analito y una nanoparticula revesti iste esencialmente de un núcleo y un armazón que aumenta la reflectanci opartícula que tiene el ligando unido a esto, en donde el ligando se un ríicie del armazón.

En ciertas modalidades, el portador es, por ejemplo y sin limita celulosa, de plástico o de vidrio En otras modalidades, el dispositivo de más comprende una almohadilla absorbente y / o una zona de cont unicación de fluido con la zona de detección.

El dispositivo de prueba de la invención puede ser utilizado para d litativa y cuantitativamente la presencia o ausencia de analito de interés, co plo y sin limitación, una proteína, ácido nucleico, metabolito, molécula pe En ciertas modalidades, la invención es un método para determi encia o ausencia de un analito en una muestra de líquido, que comprende: a) proporcionar un dispositivo de prueba de la invención; b) contactar la muestra de líquido con el miembro receptor del ejem ositivo de prueba; c) permitir que la muestra de líquido aplicada a la muestra que re bro movilice dicho reactivo etiquetado de manera que la muestra de líqui tivo etiquetado se muevan a lo largo del portador para pasar hacia la zo cción; d) detectar la presencia del reactivo etiquetado en la zona de dét iante la medición de la reflectancia, en donde la detección del reactivo etiq a zona de detección es indicativa de la presencia del analito en la mues ido, y falla al detectar la presencia del reactivo etiquetado en la zona de dét es indicativa de la ausencia del analito en la muestra de líquido. b) mezclar la muestra de líquido con un reactivo etiquetado que compre do que se une al analito y una nanopartículas recubierta que compren leo y un armazón que aumenta la reflectancia de la nanopartícula que ti do unido a esto, en donde las nanopartículas recubiertas no incluye écula activa Raman; c) contactar la mezcla de b) con el miembro receptor de la muest ositivo de prueba; d) permitir que la mezcla de b) aplicada al miembro receptor de la mue va a lo largo de la longitud del portador para pasar hacia la zona de detecció e) detectar la presencia del reactivo etiquetado en la zona de dét iendo la reflectancia, en donde la detección del reactivo etiquetado en la z cción es indicativo de la presencia del analito en la muestra de líquido, y l detectar la presencia del reactivo etiquetado en la zona de detección es ind a ausencia del analito en la muestra de líquido. an, y un armazón que rodea el núcleo y a la molécula que tiene el ligando fij o.

En algunas modalidades un lector de reflectancia se utiliza para dete tivo etiquetado en la zona de detección, mientras que en otras modalida cción del reactivo etiquetado en la zona de detección se determina visual algunas modalidades el analito se detecta cuantitativamente y en alidades, el analito se detecta cualitativamente. En las modalidades, los m a invención pueden ser utilizados para detectar múltiples analitos en una m íquido con al menos dos diferentes reactivos etiquetados, en donde los ligan eactivos etiquetados se unen a diferentes analitos, y por lo menos a dos zo cción para detectar de por lo menos dos reactivos etiquetados diferentes.

En otras modalidades, la invención es un equipo para la realización d ba analítica de flujo continuo para detectar la presencia o ausencia de un na muestra de líquido por reflectometría, que comprende: (a) un disposit ba que comprende una membrana porosa que abarca una superficie sup superficie inferior y un reactivo de unión efectivo para capturar el ananlito, C opartícula que tiene el ligando unido a esto, en donde el ligando se un ríicie del armazón. En otras modalidades, el reactivo etiquetado utilizado ipos de la invención comprende un ligando que se une al del analito opartícula recubierta que comprende un núcleo, una molécula adherida al nú z de generar una señal por la superficie de una mayor dispersión Raman azón que rodea el núcleo y a la molécula que tiene el ligando fijado a esto.

En ciertas modalidades, el dispositivo de prueba de los equipos de la inv más comprende un cojinete absorbente, en donde la superficie inferior brana porosa y el cojinete absorbente están en contacto físico y en comuni luido, y en donde el reactivo de unión es fijado a la superficie superior brana porosa. En otras modalidades, el dispositivo de prueba de los equipo nción además comprende un alojamiento para la membrana porosa.

Los equipos de la invención pueden ser utilizados para detectar cualit itativamente, la presencia o ausencia de cualquier analítico de interés, de ue y sin limitación, una proteína, ácido nucleico, metabolitos, moléculas peq o bacterias. En ciertas modalidades, los equipos pueden ser utilizado En todavía otras modalidades, la invención es un método para determi encia o la ausencia de un analito en una muestra de líquido que utiliza un a invención, dicho método comprende: a) contactar la muestra de líquido rficie superior de la membrana propasa; b) permitir que la muestra de líquid vés de la membrana porosa de modo tal que por lo menos una porción del do esté presente en la muestra de líquido, se una al reactivo de uni actar el reactivo etiquetado con la superficie superior de la membrana pro itir que el reactivo etiquetado fluya a través de la membrana porosa de m por lo menos una porción del reactivo etiquetado se una al analito; y e) dete encia del reactivo etiquetado en la membrana porosa midiendo la reflectan de la detección del reactivo etiquetado en la membrana porosa es indicativ encia del analito en la muestra de líquido, y falla para detectar la presen tivo etiquetado en la membrana porosa es indicativa de la ausencia del ana uestra de líquido.

En otras modalidades, la invención es un método para determinar la pre usencia de un analito en una muestra de líquido que utiliza un equipo nción, dicho método comprende: a) mezclar la muestra de líquido con el r En algunas modalidades un lector de reflectancia se utiliza para dete tivo marcado en la zona de detección, mientras que en otras modalida cción del reactivo marcado en la zona de detección se determina visualmen nas modalidades el analito se detecta cuantitativamente y en otras modali alito se detecta cualitativamente. En las modalidades, los métodos de la inv den ser utilizados para detectar múltiples analitos en una muestra de líquido os dos diferentes reactivos etiquetados, en donde los ligandos de los re etados se unen a los diferentes analitos, y al menos dos zonas de detecció uno de por lo menos dos reactivos etiquetados diferentes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra los resultados de una prueba de flujo lateral para e a influenza A comparando la sensibilidad de oro coloidal y de las nanopar das revestidas de sílice cuando son medidas con un reflectómetro. Co rvó en la figura, una respuesta fuerte se observó para las nanopartículas d stidas de sílice comparadas con los coloides dorados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE CIERTAS MODALIDADES A menos que se disponga lo contrario, todos los términos técnicos y cie ados en este documento tienen el mismo significado que comúnme nde por un experto en la técnica. Aunque los métodos y materiales simil ivalentes a aquellos descritos en este documento puede ser utilizado en la p las reivindicaciones, métodos adecuados y materiales que se descri inuación. Todas las publicaciones, las solicitudes de patentes, patentes, rencias mencionadas en este documento se incorporan por referencia lidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definición rolarán. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos enden ser limitativos.

En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a meno cíficamente se estipule lo contrario. En esta aplicación, el uso de "o" signific ienos que se estipule lo contrario. En el contexto de unas reivindica endientes múltiples, el uso de "o" se refiere regresar a más de una reivindi edente independiente o dependiente en la alternativa únicamente. Además, Con el fin de que la presente aplicación puede ser más fácilmente ente os términos son primero definidos. Las definiciones adicionales son establec s de la descripción detallada.

El término "nanopartícula" es utilizado en el presente, se refiere a las par comprenden por lo menos un núcleo y un armazón que tiene una dimensió o de aproximadamente 1 a 1000 nanómetros ("nm"). Las nanopartículas nción pueden ser de cualquier forma. En ciertas modalidades las nanopar esféricas. Las nanopartículas de la invención típicamente no, pero pueden, molécula activa Raman. En ciertas modalidades, las nanopartículas p prender núcleos múltiples y un armazón.

Como se utilizó en el presente el término "núcleo" se refiere a la porción i as nanopartículas de la invención. En ciertas modalidades el núcleo es un ejemplo pero no está limitado a, oro.

Las nanopartículas de la invención también comprenden un armazó rca la reflectancia de las nanopartículas. El armazón puede completa prenden glicol de polietileno, polimetilmetacrilato, o poliestireno. En al alidades, el material que forma el armazón es tratado o derivado para permi igando a la superficie de la nanopartícula. La elección óptima del polímero ender del ligando que va a ser inmovilizado en la superficie de la nanopartícu Al referirse al armazón, la frase "aumenta la reflectancia de la nanopar ífica que la presencia del armazón resultan en una nanopartícula proporcio ncremento en la señal o en la sensibilidad cuando se mide por la reflectan ejemplo, un inmunoanálisis de flujo lateral, en comparación con una nanopa el armazón. Sin estar sujeta a la teoría, la presencia del armazón que ro eo directamente puede causar que la partícula refleje más luz. Alternativam más, los ligandos unidos a la superficie del armazón puede ser mejor orient icipar en las reacciones de unión cuando se une al material del armazón C pone cuando es adsorbido pasivamente a la superficie del núcleo.

Como se usa aquí, "ligando", significa una molécula de cualquier tipo a un analito de interés. Por ejemplo y sin limitación, en ciertas modalida do es un anticuerpo, un antígeno, un receptor, un ácido nucleico, o una enzi iados con diversos estados de enfermedad, tales como Streptococcus pyo po A), Herpes simplex I y II, citomegalovirus, Chlamydia, anticuerpos co ola, influenza A y B, etc. En ciertas modalidades de la invención, la prese ncia de un analito en una muestra se determina cualitativamente. En alidades, la determinación cuantitativa de la cantidad o concentración de muestra se determina.

El término "muestra" como se usa aquí, se refiere a cualquier muestra bi pudiera contener una sustancia analizada para su detección. En al alidades, la muestra biológica está en forma líquida, mientras que en otros cambiada a una forma líquida.

El término "miembro receptor de la muestra " como se usa aquí, signi e del dispositivo de prueba que está en contacto directo con la muestra de lí ecir, ésta recibe la muestra a analizar para el analito de interés. El mi ptor de la muestra puede ser parte de, o separado del portador o de la me sa. La muestra de líquido se puede migrar, a través de flujo lateral o vértic bro receptor de la muestra hacia la zona de detección. El miembro recepto ?, copolímero de acrilonitrilo, plástico, vidrio o nailon. El sustrato puede ser p lo general, los poros del sustrato son de tamaño suficiente para q partículas de la invención fluyan a través de todo el portador. Un experto ica se dará cuenta de otros materiales que permiten el flujo de líquido. El p e comprender uno o varios sustratos en comunicación de fluido. Por ejem de reactivos y la zona de detección puede estar presente en el mismo su decir, cojinete) o puede estar presente en los sustratos por separado (es etes) dentro del portador.

Como se utilizó en el presente, la "membrana porosa", tal como la que se un flujo a través del análisis, se refiere a una membrana o filtro de cu erial que se humedece rápidamente con una solución acuosa y tiene ientes para permitir que las nanopartículas revestidas de la invención pasen a directa.

Los materiales adecuados incluyen, por ejemplo, nitrocelulosa, mezcl celulosa con poliéster o celulosa, papen no tratado, papel poroso, rayón, fi o, copolímero de acilonitrilo, plástico, vidrio o nailon.

Como se utilizó en el presente el término "flujo lateral" se refiere a u do a lo largo del plano de un portador. En general, los dispositivos de flujo en comprender una banda (o varias bandas en comunicación de fluido) erial capaz de transportar una solución mediante la acción capilar, es dec ón de capilaridad o de cromatografía, en donde las áreas o zonas diferente a(s) contienen reactivos del ensayo ya sea difusivamente o no difusiva os para que produzca una señal detectable a medida que la soluci sportada a o a través de dichas zonas. Típicamente, dichos ensayos compr zona de aplicación adaptada para recibir una muestra de líquido, una zo tivo espaciado lateralmente a partir de y en comunicación de fluido con la z ación, y una zona de detección espaciada lateralmente a partir de unicación de fluido con la zona del reactivo. La zona del reactivo prender un compuesto que es móvil en el líquido y capaz de interactuar lito en la mezcla y/o con una molécula unida en la zona de detección. La z cción puede comprender una molécula de unión que se inmoviliza en la b apaz de interactuar con el análisis y/o el compuesto del reactivo para produ l detectable. Dichos ensayos pueden ser utilizados para detectar un ana muestra a través de una unión directa (ensayo sándwich) o competitiva. Eje a atrapado en la zona de detección mediante la interacción con una moléc n específica para el analito y / o reactivo. Una muestra no unida se puede m s de la zona de detección por la acción de capilaridad a una almo rbente lateralmente yuxtapuesta y en comunicación fluido con la zo cción. El reactivo etiquetado puede entonces ser detectado en la zo cción con los medios adecuados.

En un ensayo de flujo lateral competitivo, una muestra de líquido pued de contener un analito de interés a la zona de aplicación y permite pasar a l reactivos por la acción capilar. La zona del reactivo comprende un r etado, que puede ser el propio analito, un homólogo o derivado, o una p es capaz de imitar el analito de interés cuando se enlaza a una c vilizada en la zona de detección. El reactivo etiquetado es móvil en la fase l mueve con la muestra de líquido a la zona de detección por la acción cap lito contenido en la muestra de líquido compite con el reactivo etiquetado n al aglutinante inmovilizado en la zona de detección. Los componentes no ueden mover a través de la zona de detección por capilaridad a una almo orbente lateralmente yuxtapuestos y en comunicación de fluido con la zo das encima de otras que permiten el paso de líquido a través del dispositiv s pueden contener los reactivos del ensayo ya sea difusivamente ivamente unidas que producen una señal detectable, a medida que la soluc sportada a través del dispositivo. Normalmente, el dispositivo cuenta era capa que tiene una superficie superior e inferior, en donde la sup rior se adapta para recibir una muestra de líquido, y una capa abso apuesta verticalmente y en comunicación de fluido con la superficie inferio era capa que se adapta a señalar a la muestra de líquido a través de la p . La primera capa puede contener un agente aglutinante unido a la sup rior de la primera capa que es capaz de interactuar con un analito en la mu ura el analito en la superficie superior de la primera capa. Ejemplos de és de dispositivos se ofrecen en la patente de EE.UU. No. 4.920.046 de Mc laboradores. y 7.052.831 de Fletcher y colaboradores.

En la práctica, una muestra de líquido que puede o no contener un ana rés se aplica a la superficie superior de una primera capa que compren nte de unión específico de un analito de interés. La muestra de líquido lueg vés de la primera capa y en la capa absorbente. Si analito está present do puede ser mezclada con el reactivo etiquetado antes de ser aplicad rficie superior de la primera capa. Otras variaciones convenientes son con los expertos en la técnica.

Los ensayos laterales y de flujo pueden ser utilizados para detectar m litos en una muestra. Por ejemplo, en un ensayo de flujo lateral, la zo tivo puede abarcar múltiples reactivos etiquetados, cada uno capaz de unir r) un analito diferentes en una muestra de líquido, o un solo reactivo etiq z de unirse a (o imitar) analitos múltiples. Como alternativa, o además de, l etección en un ensayo de flujo lateral que puede abarcar múltiples molécu n, cada una capaz de unirse a un analito diferente en una muestra de líq sola molécula vinculante capaz de unirse a múltiples analitos. En un flujo a ensayo, la membrana porosa puede abarcar varios agentes de unión, ca z de unirse a un analito diferente en una muestra de líquido, o un solo ulante capaz de unirse a múltiples analitos. Como alternativa, o ademá cla de reactivos etiquetados pueden ser utilizados en un flujo a través del e a uno configurado para unirse a una de analitos diferentes en una mues ido, o a un solo reactivo etiquetado configurado para unir analitos múltiples.

Como se utilizó en el presente, el término "reactivo etiquetado" si quier partícula, proteína, o molécula la cual reconoce o une al analito de int nido a éste una sustancia capaz de producir una señal que es detectable ios visuales o instrumentales, esto es, una nanopartícula capaz de produc l que es detectable por medios visuales o instrumentales, esto es partícula como se definió en el presente. La partícula o molécula recono lito que puede ser natural o no natural. En algunas modalidades la molécula uerpo monoclonal o policlonal.

Como se utilizó en el presente, el término "reactivo de unión" significa cu ícula o molécula la cual reconoce o une el analito en cuestión. El react z de formar un complejo de unión con el complejo del reactivo etiquet lito. El reactivo de unión es inmovilizado al portador en la zona de detección rficie de la membrana porosa. El reactivo de unión no se afecta mediante al o vertical de la muestra de líquido debido a la inmovilización del portador brana porosa. La partícula o molécula puede ser natural, o no natural, e tica. Una vez que el reactivo de unión una el reactivo etiquetado-analito co previene que el complejo reactivo etiquetado- analito de continuar con el fl el flujo de líquido en la zona de detección del portador, de modo que el re etado sea capturado en la zona de control a medida que la muestra de líqu sporta fuera de la zona de detección por la acción capilar. En un flujo a trav yo, la zona de control puede ser una parte separada de la membrana poro anera que el reactivo etiquetado se aplique tanto a la porción de aplicació stra de la membrana porosa y la zona de control. La detección del r cado en la zona de control confirma que la prueba está funcionando para lo istos.

El término "alojamiento" se refiere a cualquier recinto adecuado pa ositivos de prueba de la invención. Ejemplos de alojamientos se dará a con xpertos en la técnica. El alojamiento puede tener, por ejemplo, una porción porción de la tapa. La tapa puede incluir una pared superior y una pared tancialmente vertical. Un borde puede proyectarse hacia arriba desde la erior. El borde puede definir una hendidura que tiene en esto un inserto os dos aberturas en la alineación con al menos otras dos aberturas en l formar al menos dos pocilios en el alojamiento. El alojamiento se puede co garantizar que no hay comunicación entre dos o más pocilios. Un ejemplo d mitan al lector C 10.066 Immunochromato de Hamamatsu o al ESE-Quant d H. La zona de detección es más comúnmente analizada por el área de dét dispositivo o directamente reflejada en el detector del reflectómetero que no rastro de reflexión frente a coordenadas espaciales. Un algoritmo adecu a para determinar, por ejemplo, el cambio máximo de reflectividad en la z cción.

Las nanopartículas recubiertas para su uso en métodos basados en SE cen en la técnica. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. N ° 6514767 descri opartículas de compuestos activos SERS (SACNs) que comprende opartícula de metal que se ha unido o asociado a su superficie una culas activas Raman y es encapsulada por una cubierta que compren ero, vidrio, o cualquier otro material dieléctrico. Dichas partículas pued ucidas por el crecimiento o por colocar una capa de un encapsulante ade re un núcleo de nanopartículas de metal activo Raman. Las nanopartícu al del tamaño deseado pueden crecer como coloides de metal por una s icas bien conocidas en la materia, tales como reducción química o fotoquím iones metálicos en solución con agentes reductores. Por ejemplo, las par ículas pueden ser funcionalizadas con diferentes ligandos orgánicos para idos orgánicos-inorgánicos con funcionalidad avanzada.

Los encapsulantes adecuados incluyen vidrio, polímeros, metales, licos, y los sulfuros de metal. Si el encapsulado es de cristal, los núcleos partículas de metal se tratan en primer lugar de preferencia con una aratoria de vidrio. El vidrio entonces crece sobre las nanopartículas de ?t iante técnicas estándar. El espesor del encapsulante se puede variar fácil unción de las propiedades física requeridas de las partículas. Las cubiertas p derivadas por técnicas estándar, permitiendo que las partículas se conjugue culas (incluyendo biomoléculas tales como proteínas y ácidos nuclei rtes sólidos.

Disponibles en el mercado las nanopartículas Oxonica Nanoplex™ co n núcleo de nanopartículas doradas, en las cuales se adsorben moléculas adoras capaces de generar una señal SERS. Las nanopartículas doradas R etadas están entonces cubiertas con una capa de sílice de aproximadame m de espesor. La cubierta de silicona protege a las moléculas indicado ayo cuando los coloides dorados se sustituyan por nanopartículas O oplex™ en los ensayos de flujo lateral leídos con un lector de reflectancia e n detector de la señal Raman. Es importante destacar que las mejoras obt la sensibilidad de las nanopartículas Oxonica Nanoplex™ fueron en gen nibles con sólo ajustar el diámetro de los coloides dorados sin recubrimiento También, sobre todo, cuando las nanopartículas Oxonica Nanoplex an como reactivos de etiquetado, la sensibilidad del ensayo pued ivalente, si la señal se lee con un reflectometro o un lector SERS.

Las moléculas activas Raman en las nanopartículas Oxonica Nanoplex™ que contribuyen al desempeño del ensayo cuando el reflectometro es út leer la señal en vez de un lector Raman. Esta expectación nació p rimentos en donde la nanopartícula revestida de sílice (sin las moléculas rian) se encontró para llevar a cabo idénticamente y fue utilizada en un ens lateral basado en el reflectometro para dar ventajas sensibles importantes oloides dorados escasos.

EJEMPLOS plo 1 : Este experimento comparado con el rendimiento de las nanopartículas d stidas de sílice para aquellos coloides dorados en un inmunoanálisis d al para el virus de influenza A. En este experimento, el naso-faríngeo aspi ó ser negativo para la influenza del virus A fueron ajustados con las canti cidas de un virus de influenza A H1 N1.

Los coloides dorados, obtenidos por el British Biocell lntern lnternational", "BBI"), eran de 40 nm de diámetro. Las nanopartículas d biertas de sílice utilizado en el experimento fueron nanopartículas O oplex™. Estas nanopartículas consisten en un núcleo dorado de 60 nm rec el indicador Raman 4,4 'dipiridilo y una capa de sílice exterior. El grosor de l ílice fue de aproximadamente 30 nm. Detección de anticuerpos de la grip nta a los coloides dorados por adsorción pasiva. Para las nanopartículas Na la detección de anticuerpos de la gripe A se consolidaron covalentemente os tiol en la superficie de sílice a través de la química maleimida. Para nces con un tampón de lavado, que luego también absorbe la humedad ha as de la membrana de nitrocelulosa.

La señal que resulta de la línea de captura fue leída con un reflectóme ton, Dickinson and Company ("BD") por UMM Electronics (Indianápolis, J a 1 muestra un diagrama de la señal de reflectómetro en función entración de virus para las pruebas de flujo lateral con coloides dorados partículas recubiertas. Una respuesta mucho más fuerte se observó pa partículas Oxonicas frente a los coloides dorados. plo 2: En este ejemplo, la sensibilidad de las nanopartículas doradas recubier e se comparó con la de un producto comercial: el BD Directigen™ EZ Flu pru . Como en el ejemplo 1 , las nanopartículas doradas recubiertas fueron anali n formato de tira reactiva utilizando nitrocelulosa Whatman AE99. El Directi Flu A + B fue probado en su realización comercial (formato "cartucho"). La c tección de los anticuerpos fueron los mismos tanto para el BD Directigen ucto contra la gripe A + B comerciales y el dispositivo basado en nanopar rdo con el inserto del paquete, sólo con la señal de la línea de prueba c ctómetro así como visualmente.

Los datos se muestran en la Tabla 1 , que comparan el límite de dét ite de detección fiable) para las dos partículas. El límite de detección fiable efine como la concentración donde el límite inferior de confianza del 95% e ite superior de confianza del 95% del espacio en blanco.

El RDL, expresado en unidades arbitrarias (X) para el producto dorado c y para las nanopartículas recubiertas de sílice, se informó de tres experi rados. El reflectometro mismo hecho a la medida de UMM Electronics se leer la señal tanto de los dispositivos de varilla recubiertos de nanopartícu e y la Directigen™ EZ Flu A + B. La mejora del factor de sensibilidad se o el RDL del producto sin recubrimiento basado en el oro, dividido por el R ucto de nanopartículas recubierto de sílice.

Tabla 1 BD Directigen™ EZ Lateral flow test with Factor de En experimentos separados similares a las descritas anteriormente, el di as partículas coloidales doradas se incrementaron de 40nm a 60nm y a ta grandes. En estos experimentos, sólo mejora la sensibilidad limitada (h s) fueron observados, lo que indica que la diferencia de tamaño entre el do de las nanopartículas Oxonica Nanoplex™ y el coloide dorado ablemente la fuente de las mejoras en la sensibilidad. plo 3: Este experimento compara la sensibilidad y especificidad de los c dos contra las nanopartículas Oxonica Nanoplex™ en una prue noanálisis de flujo lateral de la gripe B (B/Lee/40).

Sesenta muestras clínicas se prepararon. Las muestras fueron tod stras nasofaríngeas que presenten resultados negativos para la influe te de las muestras sirvieron como controles negativos. Las 40 muestras res on sobrecargadas con la influenza de virus vivos B en dos niveles para er unto de 40 muestras positivas. Veinte de estas cuarenta muestras ecargadas con el virus del virus de la influenza B en vivo en una concentra el BD Directigen™ EZ A+B producto contra la gripe comerciales y el disp do en nanopartículas Oxonica Nanoplex™.

Los resultados se resumen en la Tabla 2. En la tabla, la sensibilid ulada como el porcentaje de las 40 muestras positivas correctamente identifi o positivas por cada prueba. La especificidad fue calculada como el porcent 20 muestras negativas correctamente identificados como negativos por ba. Cuando las lecturas del instrumento se utilizaron, una prueba fue li tiva si la lectura del instrumento medido fue mayor que un valor umbral esta cada tipo de dispositivo. El umbral se estableció para garantizar al men cificidad del 95% para cada dispositivo. En este ejemplo, el producto Direct ee visualmente y con el reflectómetro construido a la medida de la electrón . Las nanopartículas Oxonica Nanoplex™ fueron leídas con el ctómetro, y también con un lector de investigación Raman construido p a fila de la tabla). El lector de la investigación Raman utilizó un láser de la excitación y un espectrómetro de Investigación Acton (SpectraPro 2500O ctor CCD (Pixis 400) para la detección de la señal Raman.

PLO 4 Este experimento comparó el desempeño de las nanopartículas d biertas de sílice, con y sin una superficie de mayor dispersión de molécula RS), en un inmunoanálisis de flujo lateral basado en la reflectancia.

Las nanopartículas doradas Oxonica Nanoplex™ contienen una etiqueta nida de Oxonica. Las nanopartículas consisten en un núcleo dorado de uetado con 4-4'-dipiridilo y cubierto con una capa de sílice de 35nm de espe etro de las nanopartículas fue de 130nm. Sulfo-SMCC química (Pierce # tilizó para unir covalentemente contra la influenza A anticuerpos a la superfi rupos tiol de las nanopartículas.

Sesenta nanómetros de diámetro de nanopartículas doradas carecen ueta SERS que fueron comprados por BBI. Las nanopartículas doradas biertas con sílice por el siguiente proceso. 10 mL de 60nm coloide dorado ( 1010 partículas/mL) se trató primero con 75 mL de una solución 100 oxisilano 3 mercaptopropyl en etanol. Después de 3 horas, 75 xL de una s ículas/ml) con una solución al 1 % de etanol de trimethoxysilane mercapto TMS) durante 24 horas a temperatura ambiente. La cantidad de solución M de 25 µ?_ de 100 µ!_, para crear diferentes niveles de los grupos tiol de sup a en los niveles de carga aproximada de 0.5, 1 .0, 1 .5 y 2.0 en relación el (por ejemplo, 2.0 es 4X mayores de 0,5 ) a través de un proceso no optim pués de la reacción, las partículas fueron purificadas por centrifugación repet a. Sulfa-SMCC química (Pierce # 22622) se utiliza par unir covalentemente uto-influenza A los anticuerpos a la superficie de los grupos tilo opartículas.

El inmunoanálisis de flujo lateral se realizó en un formato de tira reactiv iente manera. La Influenza A captura anticuerpos que se han aplicado a la nitrocelulosa Whatman AE99. Las tiras de nitrocelulosa se sumergier ciones de muestra que contiene nanopartículas ajustadas a una densidad 0 y varias concentraciones de virus de la influenza HINI. A las soluciones stra se les permitió que absorbiera y expulsara completamente las tir celulosa. Un tampón de lavado se añadió y también absorbió las tiras brana de nitrocelulosa. Las tiras se secaron, y la reflectancia se leyó utiliza Oro revestido con sílice sin indicador de molécula aman - 0.135 Carga de tiol " 1.0" Oro revestido con sílice sin indicador de molécula Raman - 0.1063 Carga de tiol .5" Oro revestido con sílice sin indicador de molécula Raman 0.062 Carga de tiol "2.0" Los datos de la Tabla 3 indican que, si se optimizan, las nanopar das recubiertas de sílice, sin llevar a cabo un indicador SERS así co partículas, que incluyen un indicador SERS en un inmunoanálisis de flujo do se utiliza un lector reflectómetro. Por otra parte, el rendimiento ículas doradas recubiertas de sílice puede depender de la magnitud de la tiol plo 5: Este experimento se diseñó para probar el rendimiento de un prototi ositivo de flujo lateral para la detección del virus de la influenza HINI v¡ stras clínicas con nanopartículas Oxonica Nanoplex™ doradas recubiert e, como el indicador. Las partículas Oxonica tenían un diámetro de base de ximadamente 60 nm, un indicador Raman de 4,4 '-dipiridilo, y una cubie e exterior de aproximadamente 35 nm de espesor. El prototipo de disp formar una línea de control. Las nanopartículas Oxonica Nanoplex™ SE n sobre un área del conjugado (Arista MAPDS-0399) que habían sido tr una solución al 10% SEABLOCK (Pierce 37527). Las nanopartículas ugadas con un anticuerpo de detección de la gripe A NP. La almohadi ugado se adhirió a la tira de respaldo en un extremo de la membrana d al. En el extremo opuesto de la membrana de flujo lateral, una almohad rción del absorbente (Whatman # 470) se anexó. El resultado del ensayo d al de la tira fue montado dentro de un cartucho de poliestireno de dos parte ucho encierra completamente la tira de prueba a excepción de una ventana revela la prueba y la región de control de línea de la membrana LF, ación de ejemplo bien centrada en el cojinete del conjugado. Este alojamie ucho se utiliza en la BD Directigen™ EZ RSV del dispositivo del ensayo d al.

Al igual que en el ejemplo 1 , las muestras de aspirado nasofaríngeo pedi ban ser negativas para el virus de la influenza A a las que se les idades conocidas del virus de la influenza A viva. Las concentraciones fina en las muestras sobrecargadas osciló entre 0.25X (unidades arbitrarias) Cada dispositivo hecho con nanopartículas Oxonica Nanoplex™ SER utilizando un reflectómetro Hamamatsu (modelo C 10066), tanto en 15 m o 30 minutos siguiendo la aplicación del ejemplo. Después de la lectura tos, cada tira de flujo lateral se removió de su cartucho, depurando el conju almohadillas de capilaridad, y se secan a una temperatura ambiente y hur nte al menos 1 hora. Cada tira se leyó de nuevo en el reflectómetro despu do. Una curva de dosis-respuesta se gráfico con datos de cada lectura en t spués se utilizo para calcular la sensibilidad de cada tiempo de lectura en tér oncentración mínima detectable (la concentración más baja por la cual la se l al intervalo de confianza superior del espacio en blanco, MDC) y el lím cción fiable (RDL). Estos resultados se muestran en la Tabla 4. La tabla 4 m bién la mejora de la sensibilidad obtenida utilizando las partículas Oxoni paración con la sensibilidad de Directigen™ EZ. Directigen™ EZ utiliza c dos de 40nm de diámetro, sin una capa de sílice. la 4. La sensibilidad de un Cartucho- basado en el Sistema de Prueba d ral de Gripe A Emplea Nanopartículas Activas SERS y Detecció resado como una concentración mínima detectable ( DC) y limite de de fiable (RDL) El límite de detección (RDL) para un dispositivo actual Directigen™ EZ Fl proximadamente una concentración de virus 0.5X Flu A mediante una l al, y aproximadamente 0.2X mediante una lectura del reflectometro. Co stra en la Tabla 4, el dispositivo de prueba basado en el cartucho opartículas Oxonica Nanoplex™ indicadoras que proporcionan un incre cado en la sensibilidad con respecto al dispositivo actual Directigen™ EZ Flu plo 6: En este ejemplo, la sensibilidad analítica de un prototipo de flujo lateral ba de la gripe A con nanopartículas Oxonica Nanoplex™ doradas recubier e se comparó con la sensibilidad analítica de la BD Directigen™ EZ Flu A uctos comerciales que leen con un reflectometro. Las partículas Oxonica te etro de núcleo dorado de aproximadamente 60nm, el indicador de la m an 4,4 '-dipiridilo unido a la superficie de oro, y el grosor de una cubierta d proximadamente 35nm. En este ejemplo, la cantidad de nanopartículas SE rdo con el inserto de paquetes BD Directigen™ EZ Flu A. Todos los ap ados en prototipos SERS y BD Directigen™ EZ Flu A+B) se leyeron 15 m ués de la aplicación muestra en un reflectómetro de Hamamatsu (mo 66). La figura 2 muestra la señal de reflectancia en función de la concentra vivos para los dos formatos de ensayo, y la Tabla 5 se muestra la ctómetro obtenida en la concentración más alta de virus de prueba (0.25X) el límite de detección fiable (RDL) para los ensayos. En este experimen ositivos que utilizan las nanopartículas SERS dieron aproximadamente 7 itividad mejorada y 8 veces brillo mejorada comparado con BD Directigen A + B leído con un reflectómetro.

TABLA 5 Prototipo BD Directigen™ EZ (utiliza partículas (utilizando un colo Nanoplex™ SERS) dorado) L (unidades arbitrarias) 0.027x 0.185x ensidad de la señal de 0.419 0.054 Reflectancia a 0.25x (Unidades arb)

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un dispositivo de prueba para determinar la presencia o ausencia lito en una muestra de líquido, que comprende (a) una muestra del mi ptor, (b) un portador en comunicación de fluido con el miembro recep stras, (c) un reactivo etiquetado el cual es móvil en el portador en la presen uestra de líquido, el reactivo etiquetado comprende un ligando que se lito y una nanopartícula revestida que comprende un núcleo y una cubiert menta la reflectancia de la nanopartícula que tiene el ligando fijado a es e la nanopartícula no incluye una molécula activa Raman, y (d) un react n efectivo para capturar el analito, cuando está presente, inmovilizado e de detección definida del portador; en donde la muestra de líquido aplíca stra que recibe el miembro moviliza el reactivo etiquetado de modo tal plo y el reactivo etiquetado se transporten a lo largo de la longitud del p pasar hacia la zona de detección, y en donde la detección del reactivo etiq a zona de detección es indicativo de la presencia del analito en la mues do. 5. El dispositivo de prueba de conformidad con la reivindicaci cterizado además porque comprende un cojinete absorbente en comunicac o con la zona de detección. 6. El dispositivo de prueba de conformidad con la reivindicaci cterizado porque además comprende una zona de control en comunicaci o con la zona de detección 7. El dispositivo de prueba de conformidad con la reivindicaci cterizado además porque la presencia del analito en la muestra de líqui rminada cuantitativamente. 8. El dispositivo de prueba de conformidad con la reivindicaci cterizado además porque el dispositivo de prueba es configurado para d litos múltiples. 9. El dispositivo de prueba de conformidad con la reivindicaci 1 1. Un método para determinar la presencia o ausencia de un analito e stra de líquido que comprende: a) proporcionar el dispositivo de prueba de la reivindicación 1 ; b) contactar la muestra de líquido con la muestra del miembro recept ositivo de prueba; c) permitir que la muestra de líquido aplicada al miembro receptor stra movilice dicho reactivo etiquetado de modo tal que la muestra de líqui tivo etiquetado se muevan a lo largo de la longitud del portador para pas de detección; d) detectar la presencia del reactivo etiquetado en la zona de dét endo la reflectancia, en donde la detección del reactivo etiquetado en la z cción es indicativo de la presencia del analito en la muestra de líquido, y ? detectar la presencia del reactivo etiquetado en la zona de detección es ind ausencia del analito en la muestra de líquido. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado a ue la presencia del analito en la muestra de líquido es deter itativamente. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado a ue el método detecta analitos múltiples en la muestra de líquido. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado a ue el dispositivo de prueba además comprende por lo menos dos re etados diferentes, caracterizado además porque los ligandos de los re etados se unen a diferentes analitos, y por lo menos dos zonas de detecció ctar cada uno de por lo menos dos reactivos etiquetados diferentes. 17. Un método para determinar la presencia o ausencia de un analito stra de líquido, caracterizado porque comprende: a) proporcionar un dispositivo de prueba caracterizado porque compre iembro receptor de muestras; (ii) un portador en comunicación de fluido c) contactar la mezcla de b) con el miembro receptor de muestr ositivo de prueba; d) permitir que la mezcla de b) aplicados con el miembro receptor de mu moverse a lo largo de la longitud del portador para pasar hacia la zo cción; e) detectar la presencia del reactivo etiquetado en la zona de dét endo la reflectancia, en donde la detección del reactivo etiquetado en la z cción es indicativo de la presencia del analito en la muestra de líquido, y I detectar la presencia del reactivo etiquetado en la zona de detección es ind ausencia del analito en la muestra de líquido. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado a ue un lector de reflectancia es utilizado para detectar el reactivo etiquetad de detección. 19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado a 22. El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado a ue el dispositivo además comprende por lo menos dos reactivos etiqu entes, caracterizados además porque los ligandos de los reactivos etiqueta a diferentes analitos, y por lo menos dos zonas de detección para detecta de por lo menos dos reactivos etiquetados diferentes. 23. Un dispositivo de prueba para determinar la presencia o ausencia ito en una muestra de líquido, que comprende: (a) un miembro recep stras; (b) un portador en comunicación de fluido con el miembro recep stras; (c) un reactivo etiquetado el cual es móvil en el portador en la presen uestra de líquido, el reactivo etiquetado comprende un ligando que se lito y una nanopartícula revestida que consta esencialmente de un núcleo erta que incrementa la reflectancia de la nanopartícula que tiene el ligando u , en donde dicho ligando está unido a la superficie de la cubierta; y (d) un r nión efectivo para capturar el analito, cuando está presente, inmovilizado de detección definida del portador; en donde la muestra de líquido aplic bro receptor de muestra moviliza el reactivo etiquetado de modo tal stra y el reactivo etiquetado sean transportados a lo largo de la longit 26. El dispositivo de prueba de conformidad con la reivindicació cterizado además porque el analito es una proteína, ácido nucleico, meta cula pequeña, virus, o bacteria. 27. El dispositivo de prueba de conformidad con la reivindicació cterizado porque además comprende un cojinete absorbente en comunicac o con la zona de detección. 28. El dispositivo de prueba de conformidad con la reivindicació cterizado además porque comprende una zona de control en comunicaci o con la zona de detección. 29. El dispositivo de prueba de conformidad con la reivindicació cterizado además porque la presencia del analito en la muestra de líqui rminada cuantitativamente. 30. El dispositivo de prueba de conformidad con la reivindicaci cterizado además porque el dispositivo de prueba está configurado para d 32. Un sistema que comprende el dispositivo de prueba de conformidad ndicación 23 y un reflectómetro adaptado para detectar la presencia de un re etado en el dispositivo de prueba. 33. Un método para determinar la presencia o ausencia del analito e stra de líquido, caracterizado porque comprende: a) proporcionar el dispositivo de prueba de conformidad con la reivindi b) contactar la muestra de líquido con el miembro receptor de muestr ositivo de prueba; c) permitir que la muestra de líquido aplicada al miembro receptor stra movilice dicho reactivo etiquetado de modo tal que la muestra de líqui tivo etiquetado se muevan a lo largo de la longitud del portador para pas de detección; 35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado a ue la detección del reactivo etiquetado en la zona de detección es deter almente. 36. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado a ue la presencia del analito en la muestra de líquido es deter itativamente. 37. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado a ue el método detecta analitos múltiples en la muestra líquida. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado a ue el dispositivo de prueba además comprende por lo menos dos re etados diferentes, en donde los ligandos de los reactivos etiquetados se litos diferentes, y por lo menos dos zonas de detección para detectar cada lo menos dos diferentes reactivos etiquetados. 39. Un método para determinar la presencia o ausencia de un analito b) mezclar la muestra de líquido con un reactivo etiquetado compren cialmente un núcleo y una cubierta que incrementa la reflectancia partícula, y un ligando que se unirá a un analito unido a la superficie erta; c) contactar la mezcla de b) con el miembro receptor de muestr ositivo de prueba; d) permitir que la mezcla de b) aplicados con el miembro receptor de mu moverse a lo largo de la longitud del portador para pasar hacia la zo cción; e) detectar la presencia del reactivo etiquetado en la zona de dét endo la reflectancia, en donde la detección del reactivo etiquetado en la z cción es indicativo de la presencia del analito en la muestra de líquido, y l detectar la presencia del reactivo etiquetado en la zona de detección es ind ausencia del analito en la muestra de líquido. 42. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado a ue la presencia del analito en la muestra líquida es deter itativamente. 43. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado a ue el método detecta analitos múltiples en la muestra de líquido. 44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado a ue el dispositivo de prueba además comprende por lo menos dos dife tivos etiquetados. 45. Un método para determinar la presencia o ausencia de un analito stra de líquido, caracterizado porque además comprende: a) proporcionar un dispositivo de prueba caracterizado porque a prende: (i) un miembro receptor de muestra, (ii) un portador en comunicac o con el miembro receptor de muestra, (iii) un reactivo etiquetado el cual es el portador en la presencia de la muestra de líquido, el reactivo etiq c) permitir que la muestra de líquido se aplique al miembro receptor stra para movilizar el reactivo etiquetado de modo tal que la muestra de liq activo etiquetado se mueva a lo largo de la longitud del portador para pasar na de detección; d) detectar la presencia de un reactivo etiquetado en la zona de dét iante la medición de la reflectancia, mientras la detección del reactivo etiq zona de detección es indicativo de la presencia del analito en la muestra lí lla al detectar la presencia del reactivo etiquetado en la zona de detección ativa de la ausencia del analito en la muestra de líquido. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado a ue el lector de reflectancia es utilizado para detectar el reactivo etiquetad de detección. 47. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado a ue la presencia del analito en la muestra líquida es deter mitativamente. 51. Un método para determinar la presencia o ausencia de un analito stra líquida, caracterizado porque además comprende: a) proporcionar un dispositivo de prueba caracterizado porque compren iembro receptor de muestras; (it) un portador en comunicación de fluido bro receptor de muestras; y (iii) un reactivo de unión efectivo para capt lito, cuando está presente, inmovilizado en una zona de detección defini ador; b) mezclar la muestra de líquido con un reactivo etiquetado que com igando que se une al analito y una nanopartícula revestida que compren eo, una molécula fijada al núcleo y capaz de generar una señal mediant rficie mejorada Raman dividida, y una cubierta que rodea el núcleo y la m tiene el ligando fijado a esto; c) contactar la mezcla de b) con el miembro receptor de muestr ositivo de prueba; 52. El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado a ue un lector de reflectancia es utilizado para detectar el reactivo etiquetad de detección. 53. El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado a ue la detección del reactivo etiquetado en la zona de detección es deter almente. 54. El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado a ue la presencia del analito en la muestra de líquido es deter itativamente. 55. El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado a ue el método detecta analitos múltiples en la muestra de líquido. 56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado a ue el dispositivo de prueba además comprende por lo menos dos re etados diferentes, caracterizados además porque los ligandos de los re brana porosa; y (b) un reactivo etiquetado caracterizado porque a prende un ligando que se une al analito y a una nanopartícula revestid prende un núcleo y una cubierta que incrementa la reflectancia opartícula, que incrementa la reflectancia de la nanopartícula, carácte más porque la nanopartícula revestida no incluye una molécula activa Rama 58. El equipo de la reivindicación 57, caracterizado además porque os un analito es una proteína, ácido nucleico, metabolito, molécula pequeña cteria. 59. El equipo de la reivindicación 57, caracterizado además por ositivo de prueba además comprende un cojinete absorbente, en do rficie inferior de la membrana porosa y el cojinete absorbente están en co o y en comunicación de fluido, y en donde el reactivo de unión es fijad rficie superior de la membrana porosa. 60. El equipo de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado a ue el dispositivo de prueba además comprende un alojamiento para la me 63. El equipo de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado a ue el dispositivo de prueba además comprende por lo menos dos dife tivos etiquetados, caracterizados además porque los ligandos de los re etados se unen a diferentes analitos, y por lo menos dos zonas de detecció ctar cada uno de por lo menos dos diferentes reactivos etiquetados. 64. Un sistema que comprende el dispositivo de prueba del equi ormidad con la reivindicación 57 y un reflectómetro adaptado para dete encia del reactivo etiquetado en el dispositivo de prueba. 65. Un método para determinar la presencia o ausencia de un analito stra de líquido utilizando el equipo de conformidad con la reivindicación 57, odo comprende: (a) contactar la muestra de líquido con la superficie superio brana porosa; (b) permitir que la muestra de líquido fluya a través brana porosa de manera que por lo menos una porción del analito, cuand enté en la muestra líquida, se una al reactivo de unión; (c) contactando el r uetado con la superficie superior de la membrana porosa; (d) permitiendo tivo etiquetado fluya a través de la membrana porosa de modo tal que 66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado a ue un lector de reflectancia es utilizado para detectar el reactivo etiquetad brana porosa. 67. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado a ue la detección del reactivo etiquetado en la membrana porosa es deter almente. 68. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado a ue la presencia del analito en la muestra de líquido es deter titativamente. 69. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado a ue el método detecta analitos múltiples en la muestra de líquido. 70. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado a ue el dispositivo de prueba además comprende por lo menos dos dife tivos etiquetados, en donde los ligandos de los reactivos etiquetados un o tal que por lo menos una porción del analito se una al reactivo etiquet tivo de unión; y (d) detectar la presencia de un reactivo etiquetado brana porosa midiendo la reflectancia, en donde la detección del r etado en la membrana porosa es indicativa de la presencia del analito stra de líquido, y falla al detectar la presencia del reactivo etiquetado brana porosa que es indicativa de la ausencia del analito en la muestra de lí 72. El método de conformidad con la reivindicación 71 , caracterizado a ue un lector de reflectancia es utilizado para detectar el reactivo etiquetad brana porosa. 73. El método de conformidad con la reivindicación 71 , caracterizado a ue la detección del reactivo etiquetado en la membrana porosa es deter almente. 74. El método de conformidad con la reivindicación 71 , caracterizado a ue la presencia del analito en la muestra de líquido es deter mitativamente. 77. Un equipo para llevar a cabo un prueba analítica de flujo continu ctar la presencia o ausencia de un analito de una muestra de liquid ctometría, comprendiendo (a) un dispositivo de prueba que comprend brana porosa que comprende una superficie superior y una superficie inferi tivo de unión efectivo para capturar el analito, cuando está presente en la m da, fijada a la superficie superior o inferior de la membrana porosa; y tivo etiquetado comprendiendo un ligando que se une al analito y partícula revestida que consta esencialmente de un núcleo y una cubiert menta la reflectancia de la nanopartícula, en donde dicho ligando está uni rficie de la cubierta. 78. El equipo de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado a ue el analito es una proteína, ácido nucleico, metabolito, molécula pequeña cteria. 79. El equipo de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado a ue el dispositivo de prueba además comprende un cojinete absorbente, en perficie inferior de la membrana porosa y el cojinete absorbente están en co 81. El equipo de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado a ue la presencia del analito en la muestra de líquido es deter titativamente. 82. El equipo de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado a ue el dispositivo de prueba es configurado para detectar analitos múltiples. 83. El equipo de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado a ue el dispositivo de prueba además comprende por lo menos dos re etados diferentes, en donde los ligandos de los reactivos etiquetados se iferentes analitos, y por lo menos dos zonas de detección para detectar ca or lo menos dos diferentes reactivos etiquetados. 84. Un sistema que comprende el dispositivo de prueba del equi ormidad con la reivindicación 77 y un reflectometro adaptado para dete encia del reactivo etiquetado en el dispositivo de prueba. 85. Un método para determinar la presencia o ausencia de un analito endo la reflectártela, en donde la detección del reactivo etiquetado brana porosa es indicativa de la presencia del analito en la muestra de líq al detectar la presencia del reactivo etiquetado en la membrana porosa ativa de la ausencia del analito en la muestra de líquido. 86. El método de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado a ue un lector de reflectancia es utilizado para detectar el reactivo etiquetad brana porosa. 87. El método de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado a ue la detección del reactivo etiquetado en la membrana porosa es deter almente. 88. El método de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado a ue la presencia del analito en la muestra líquida es deter titativamente. 89. El método de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado a 91. Un método para determinar la presencia o ausencia de un analito stra de líquido utilizando el equipo de la reivindicación 77, dicho prende: (a) mezclar la muestra de líquido con el reactivo etiquetado de m el analito, cuando está presente en la muestra líquida, se une al r etado; (b) contactar la mezcla de (a) con el flujo a través de la membrana odo tal que por lo menos una porción del analito unido al reactivo etiquet al reactivo de unión; y (d) detectar la presencia del reactivo etiquetado brana porosa midiendo la reflectancia, en donde la detección del re etado en la membrana porosa es indicativa de la presencia del analito stra de líquido, y falla para detectar la presencia del reactivo etiquetado brana porosa que es indicativa de la ausencia del analito en la muestra de lí 92. El método de conformidad con la reivindicación 91 , caracterizado a ue un lector de reflectancia es utilizado para detectar el reactivo etiquetad brana porosa. 93. El método de conformidad con la reivindicación 91 , caracterizado a ue la detección del reactivo etiquetado en la membrana porosa es deter 96. El método de conformidad con la reivindicación 95, caracterizado a ue el dispositivo de prueba además comprende por lo menos dos re etados diferentes, en donde los ligandos de los reactivos etiquetados se u entes analitos, y por lo menos dos zonas de detección para detectar cada lo menos dos reactivos etiquetados diferentes. 97. Un equipo para llevar a cabo una prueba analítica de flujo continu ctar la presencia o ausencia de un analito en una muestra líquid ctometría, comprendiendo: (a) un dispositivo de prueba que comprend brana prosa que comprende una superficie superior y una superficie inferi tivo de unión efectivo para capturar el analito, cuando está presente en la m íquido, fijada a la superficie superior o inferior de la membrana porosa; y tivo etiquetado que comprende un ligando que se une al analito y partícula revestida comprendiendo un núcleo, una molécula ligada al núcle z de generar una señal mediante la superficie mejorada Raman dividida, erta que rodea al núcleo y a la molécula. 98. El equipo de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado a 100. El equipo de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado a ue el dispositivo de prueba comprende además un alojamiento para la me sa. 101. El equipo de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado a ue la presencia del analito en la muestra de líquido es deter itativamente. 102. El equipo de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado a ue el dispositivo de prueba es configurado para detectar analitos múltiples. 103. El equipo de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado a ue el dispositivo de prueba además comprende por lo menos dos re etados diferentes, en donde los ligandos de los reactivos etiquetados se entes analitos, y por lo menos dos zonas de detección para detectar cada lo menos dos reactivos etiquetados. 104. Un sistema que comprende el dispositivo de prueba del equipo etado con la superficie superior de la membrana porosa; (d) permitir tivo etiquetado fluya a través de la membrana porosa de modo tal que os una porción del reactivo etiquetado se una al analito; y (e) detectar la pre reactivo etiquetado en la membrana porosa midiendo la reflectancia, en do cción del reactivo etiquetado en la membrana porosa es indicativo de la pre analito en la muestra de líquido, y falla al detectar la presencia del r etado en la membrana porosa que es indicativa de la ausencia del analito stra de líquido. 106. El método de conformidad con la reivindicación 105, carácte más porque un lector de reflectancia es utilizado para detectar el r etado en la membrana porosa. 107. El método de conformidad con la reivindicación 105, carácte imás porque la detección del reactivo etiquetado en la membrana poro rminada visualmente. 108. El método de conformidad con la reivindicación 105, carácte ? a diferentes analitos, y por lo menos dos zonas de detección para detecta de por lo menos dos diferentes reactivos etiquetados. 1 1 1 . Un método para determinar la presencia o ausencia de un analito stra de líquido que utiliza el equipo de la reivindicación 97, dicho prende: (a) mezcla de la muestra de líquido con el reactivo etiquetado de m el analito, cuando esté presente en la muestra de líquido, se una con el re etado; (b) contactar la mezcla (a) con la superficie superior de la me sa; (c) permitir que la mezcla (a) fluya de manera continua a la membrana odo tal que por lo menos una porción del analito unido a un reactivo etiq o al reactivo de unión; y (d) detectar la presencia del reactivo etiquetado brana porosa midiendo la refectancia, en donde la detección del r uetado en la membrana porosa es indicativa de la presencia del analito stra de líquido, y falla para detectar la presencia del reactivo etiquetado brana porosa que es indicativa de la ausencia del analito en la muestra de lí 1 2. El método de conformidad con la reivindicación 11 1 , carácte más porque un lector de reflectancia es utilizado para detectar el r 1 15. El método de conformidad con la reivindicación 111 , carácte más porque el método detecta los analitos múltiples en la muestra de líquido. 1 16. El método de conformidad con la reivindicación 115, carácte más porque el dispositivo de prueba además comprende por lo meno entes reactivos etiquetados, en donde los ligandos de los reactivos etiqueta n a diferentes analitos, y por lo menos dos zonas de detección para detecta de los dos reactivos etiquetados diferentes.