ES2627190T3 - Inmunoensayos sensibles utilizando nanopartículas recubiertas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de determinación de la presencia o ausencia de un analito en una muestra líquida, que comprende: (a) proporcionar un dispositivo de prueba para determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra líquida, que comprende: (i) un miembro receptor de muestra; (ii) un vehículo en comunicación de fluido con el miembro receptor de muestra; (iii) un reactivo marcado que es móvil en el vehículo en presencia de la muestra líquida, comprendiendo el reactivo marcado un ligando que se une al analito y una nanopartícula recubierta que consiste en múltiples núcleos metálicos y una cubierta que tiene el ligando unido al mismo, en el que la cubierta comprende vidrio, un material cerámico tal como perovskita y ZrO2, o un polímero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartícula, y en el que la nanopartícula recubierta no incluye una molécula activa en Raman; y (iv) un reactivo de enlace efectivo para capturar el analito, cuando está presente, inmovilizado en una zona de detección definida del vehículo; (b) poner en contacto la muestra líquida con el miembro receptor de muestra del dispositivo de prueba; (c) permitir que la muestra líquida aplicada al miembro receptor de muestra movilice dicho reactivo marcado de manera que la muestra líquida y el reactivo marcado se muevan a lo largo de la longitud del vehículo para pasar a la zona de detección; (d) detectar la presencia del reactivo marcado en la zona de detección midiendo la reflectancia, en el que la detección del reactivo marcado en la zona de detección es indicativa de la presencia de analito en la muestra líquida y el fallo en detectar la presencia del reactivo marcado en la zona de detección es indicativo de la ausencia del analito en la muestra líquida.

Description

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DESCRIPCION

Inmunoensayos sensibles utilizando nanopartfculas recubiertas Campo

Se proporcionan nanopardculas recubiertas que comprenden un nucleo rodeado por una cubierta que aumenta la reflectancia de la nanopartfcula, en las que la nanopartfcula recubierta no necesita, pero opcionalmente puede incluir una molecula activa en Raman. Las nanopartfculas recubiertas aqu descritas son utiles en dispositivos de prueba y procedimientos de determinacion cuantitativa y/o cualitativa de la presencia o ausencia de un analito en una muestra kquida.

Antecedentes

La tecnolog^a de inmunoensayo proporciona un medio simple y relativamente rapido para determinar la presencia o ausencia de analitos en muestras biologicas. La informacion proporcionada por las pruebas de diagnostico por inmunoensayo es a menudo cntica para el cuidado de pacientes. Los ensayos se realizan tipicamente para detectar cualitativa o cuantitativamente la presencia de analitos particulares, por ejemplo, anticuerpos que estan presentes cuando un sujeto humano tiene una enfermedad o condicion particular. Los inmunoensayos practicados en la tecnica son numerosos, e incluyen ensayos para enfermedades, tales como infecciones causadas por bacterias o virus, o condiciones, tales como embarazo.

En la tecnica se conocen diversos tipos de inmunoensayos. Un tipo de procedimiento de inmunoensayo es el inmunoensayo de flujo lateral. Los ensayos de flujo lateral utilizan un soporte solido, tal como nitrocelulosa, plastico o vidrio, para realizar la deteccion del analito. En lugar de arrastrar la muestra a traves del vetnculo perpendicularmente, como en el caso de un ensayo de "flujo continuo", se permite que la muestra fluya lateralmente a lo largo del vetnculo por fuerzas capilares y otras desde una zona de aplicacion a una zona de reaccion en la superficie. En un ensayo de flujo lateral, los anticuerpos de captura son dispuestos en bandas sobre el vetnculo solido. Los anticuerpos de deteccion se conjugan a una molecula de deteccion, que proporciona una serial que es detectable. Se pone una muestra lfquida en contacto con los anticuerpos de deteccion y se deja que la mezcla de muestra/ anticuerpo de deteccion fluya a lo largo del vetnculo solido. Si el analito esta presente, se forma un complejo "en sandwich" en la posicion sobre el vetnculo solido donde se han dispuesto en banda los anticuerpos de captura. La serial de la molecula de deteccion localizada en la lmea de captura se detecta entonces, visualmente o con un instrumento. Puede configurarse un ensayo de flujo lateral para detectar protemas, acidos nucleicos, metabolitos, celulas, moleculas pequenas u otros analitos de interes.

Otro formato de inmunoensayo es un inmunoensayo de flujo continuo. Un inmunoensayo de flujo continuo usa generalmente un material poroso con una matriz que contiene reactivo en capas o incorporado en el mismo. La muestra de prueba se aplica a, y fluye a traves del material poroso, y el analito en la muestra reacciona con el reactivo o los reactivos para producir una senal detectable sobre el material poroso. Estos dispositivos estan generalmente encerrados en un bastidor o cubierta de plastico con calibraciones para ayudar en la deteccion del analito particular.

Se conocen en la tecnica muchos ejemplos de diferentes tipos de moleculas de deteccion utiles en inmunoensayos de flujo lateral, tales como fluoroforos, coloides de oro, partfculas de latex marcadas y nanopartfculas tales como una nanopartfcula de dispersion Raman ("SERS"). Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5,591,645 describe el uso de moleculas visibles de "trazador", tales como oro coloidal, que se pueden ver sin el uso de instrumentacion. Ademas, la Patente de Estados Unidos N° 6,514,767 de Natan describe nanopartfculas compuestas activas con SERS (SACN) que comprenden una nanopartfcula metalica que ha unido o asociado con su superficie una o mas moleculas activas en Raman y esta encapsulada por una cubierta que comprende un polfmero, vidrio, o cualquier otro material dielectrico. La Patente de Estados Unidos N° 5,714,389 describe procedimientos de inmunoensayo de flujo lateral y dispositivos de prueba usando una partfcula coloreada que puede ser un coloide metalico, preferiblemente oro. De forma similar, la Patente de Estados Unidos N° 7,109,042 describe dispositivos de inmunoensayo de flujo lateral que utilizan marcadores directos, tales como soles de oro y soles de colorantes, que permiten la produccion de un resultado analttico instantaneo sin la necesidad de anadir reactivos adicionales para desarrollar una senal detectable. El documento WO2007/090058 describe inmunoensayos de flujo lateral utilizando partfculas de metal encapsuladas, en particular nanopartfculas de SERS encapsuladas, como modalidad de deteccion. Se observo una sensibilidad mejorada del inmunoensayo de flujo lateral preparado para la lectura visual.

El SERS es uno de los procedimientos mas sensibles para realizar analisis qmmicos, permitiendo la deteccion de una sola molecula. Vease Nie, S. y S. R. Emory, " Probing Single Molecules and Single Nanoparticles by Surface Enhanced Raman Scattering", Science, 275, 1102 (1997). Un espectro Raman, similar a un espectro infrarrojo, incluye una distribucion de longitudes de onda de bandas correspondientes a vibraciones moleculares espedficas de la muestra que se analiza (el analito). En la practica de la espectroscopfa Raman, el haz de una fuente de luz, generalmente un laser, se centra en la muestra para generar de este modo una radiacion dispersada de forma no elastica, que se recoge opticamente y se dirige a un espectrometro de dispersion de longitud de onda o Fourier en el que un detector convierte la energfa de los fotones incidentes en intensidad de senal electrica.

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La muy baja conversion de la radiacion incidente en radiacion no elastica dispersa limito la espectroscop^a Raman a aplicaciones que eran diffciles de realizar por espectroscopfa infrarroja, como el analisis de soluciones acuosas. Se descubrio en 1974, sin embargo, que cuando una molecula muy proxima a un electrodo de plata rugoso se somete a una fuente de excitacion Raman, la intensidad de la senal generada se incrementa en hasta seis ordenes de magnitud. (Fleischmann, M., Hendra, PJ and McQuillan, A.J., " Raman Spectra of Pyridine Adsorbed at a Silver Electrode", Chem. Phys. Lett, 26, 123, (1974) y Weaver, M.J., Farquharson, S., Tadayyoni, M.A., " Surface- enhancement factors for Raman scattering at silver electrodes. Role of adsorbate-surface interactions and electrode structure," J. Chem. Phys., 82, 4867 4874 (1985)). En pocas palabras, los fotones laser incidentes se acoplan para liberar electrones conductores dentro del metal que, confinados por la superficie de las partfculas, hacen que la nube de electrones resuene colectivamente. El campo de plasmon de superficie resultante proporciona una via eficaz para la transferencia de energfa a los modos de vibracion molecular de una molecula dentro del campo, generando asf fotones Raman.

Las nanopartfculas de SERS se han utilizado como una molecula de deteccion en inmunoensayos de flujo lateral. Por ejemplo, Oxonica (Kidlington, Reino Unido) ha desarrollado nanopartfculas Nanoplex™ para su uso en tales ensayos. Las nanopartfculas consisten en un nucleo de nanopartfculas de oro, sobre el cual se adsorben moleculas informadoras Raman capaces de generar una senal de espectroscopfa Raman mejorada en superficie. La nanopartfcula de oro marcada con Raman esta recubierta con una capa de sflice de aproximadamente 10-50 nm de espesor. La cubierta de sflice protege a la informadora de la desorcion de la superficie, evita las interacciones plasmon-plasmon entre las partfculas de oro adyacentes, y tambien evita la generacion de senales SERS a partir de componentes en la solucion. Las nanopartfculas de SERs que tienen un revestimiento de polfmero en lugar del recubrimiento de sflice se describen en la Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2007/0165219. El documento WO00/31538 describe ensayos de flujo lateral que utilizan oro coloidal como mediciones de marcacion y reflectancia para la deteccion.

Al aprovechar la alta sensibilidad del SERS, la deteccion de la senal producida a partir de una nanopartfcula SERS requiere el uso de un instrumento capaz de detectar una senal Raman. Puede ser ventajoso en algunas circunstancias tener una nanopartfcula para uso en un inmunoensayo de flujo lateral que posea una sensibilidad aumentada tal vez comparable a la de una nanopartfcula de SERS, pero que requiere solamente una tecnologfa de lector de reflectancia relativamente simple y barata para la deteccion.

Sumario

La invencion proporciona procedimientos rapidos y precisos para determinar cualitativa o cuantitativamente la presencia o ausencia de analitos en muestras biologicas y dispositivos y reactivos para llevar a cabo dichos procedimientos.

Los inventores han descubierto que las nanopartfculas recubiertas utilizadas como molecula detectora en un inmunoensayo de flujo lateral o flujo vertical proporcionan ventajas de sensibilidad de ensayo significativas sobre moleculas detectoras tales como oro coloidal cuando el ensayo se lee con un lector de reflectancia. La invencion proporciona

(1) un procedimiento de determinacion de la presencia o ausencia de un analito en una muestra lfquida, que comprende:

(a) proporcionar un dispositivo de prueba para determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra lfquida, que comprende:

(i) un miembro receptor de muestra;

(ii) un vehnculo en comunicacion de fluido con el miembro receptor de muestra;

(iii) un reactivo marcado que es movil en el vehnculo en presencia de la muestra lfquida, comprendiendo el reactivo marcado un ligando que se une al analito y una nanopartfcula recubierta que consiste en multiples nucleos metalicos y una cubierta que tiene el ligando unido al mismo, en el que la cubierta comprende vidrio, un material ceramico tal como perovskita y ZrO2, o un polfmero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartfcula, y en donde la nanopartfcula recubierta no incluye una molecula activa en Raman; y

(iv) un reactivo de enlace efectivo para capturar el analito, cuando esta presente, inmovilizado en una zona de deteccion definida del vehnculo;

(b) poner en contacto la muestra lfquida con el miembro receptor de muestra del dispositivo de prueba;

(c) permitir que la muestra lfquida aplicada al miembro receptor de muestra movilice dicho reactivo marcado de manera que la muestra lfquida y el reactivo marcado se muevan a lo largo de la longitud del vefnculo para pasar a la zona de deteccion;

(d) detectar la presencia del reactivo marcado en la zona de deteccion midiendo la reflectancia, en el que la

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deteccion del reactivo marcado en la zona de deteccion es indicativa de la presencia de analito en la muestra ftquida y el fallo en detectar la presencia del reactivo marcado en la zona de deteccion es indicativo de la ausencia del analito en la muestra ftquida;

(2) un procedimiento de determinacion de la presencia o ausencia de un analito en una muestra ftquida, que comprende:

a) proporcionar un dispositivo de prueba que comprende: (i) un miembro receptor de muestra; (ii) un vefftculo en comunicacion de fluido con el miembro receptor de muestra; y (iii) un reactivo de enlace efectivo para capturar el analito, cuando esta presente, inmovilizado en una zona de deteccion definida del vefftculo;

b) mezclar la muestra ftquida con un reactivo marcado que comprende un ligando que se une al analito y una nanoparftcula recubierta que consiste en multiples nucleos metalicos y una cubierta que tiene el ligando unido a ella, en la que la cubierta comprende vidrio, un material ceramico tal como perovskita y ZrO2, o un poftmero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanoparftcula, donde la nanoparftcula recubierta no incluye una molecula activa en Raman;

c) poner en contacto la mezcla de b) con el miembro receptor de muestra del dispositivo de prueba;

d) permitir que la mezcla de b) aplicada al miembro receptor de muestra se mueva a lo largo de la longitud del vefftculo para pasar a la zona de deteccion;

e) detectar la presencia del reactivo marcado en la zona de deteccion midiendo la reflectancia, en el que la deteccion del reactivo marcado en la zona de deteccion es indicativa de la presencia de analito en la muestra ftquida y el fallo en detectar la presencia del reactivo marcado en la zona de deteccion es indicativo de la ausencia del analito en la muestra ftquida;

(3) un procedimiento de determinacion de la presencia o ausencia de un analito en una muestra ftquida usando un kit para realizar una prueba analftica de flujo continuo para detectar la presencia o ausencia de un analito en una muestra ftquida por reflectometna, comprendiendo dicho kit:

(i) un dispositivo de prueba que comprende una membrana porosa que comprende una superficie superior y una superficie inferior y un reactivo de enlace efectivo para capturar el analito, cuando esta presente en la muestra ftquida, unido a la superficie superior o inferior de la membrana porosa; y

(ii) un reactivo marcado que comprende un ligando que se une al analito y una nanoparftcula recubierta que consiste en multiples nucleos metalicos y una cubierta que tiene el ligando unido al mismo, en el que la cubierta comprende vidrio, un material ceramico tal como perovskita y ZrO2, o un poftmero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanoparftcula, en la que la nanoparftcula recubierta no incluye una molecula activa en Raman,

comprendiendo dicho procedimiento:

(a) poner en contacto la muestra ftquida con la superficie superior de la membrana porosa;

(b) permitir que la muestra ftquida fluya a traves de la membrana porosa de tal manera que al menos una parte del analito, cuando esta presente en la muestra ftquida, se una al reactivo de enlace;

(c) poner en contacto el reactivo marcado con la superficie superior de la membrana porosa;

(d) dejar que el reactivo marcado fluya a traves de la membrana porosa de tal manera que al menos una parte del reactivo marcado se una al analito; y

(e) detectar la presencia del reactivo marcado en la membrana porosa midiendo la reflectancia, en el que la deteccion del reactivo marcado sobre la membrana porosa es indicativa de la presencia del analito en la muestra ftquida y el fallo en detectar la presencia del reactivo marcado sobre la membrana porosa es indicativo de la ausencia del analito en la muestra ftquida;

(4) un procedimiento de determinacion de la presencia o ausencia de un analito en una muestra ftquida usando un kit para realizar una prueba analftica de flujo continuo para detectar la presencia o ausencia de un analito en una muestra ftquida por reflectometna, comprendiendo dicho kit:

(i) un dispositivo de prueba que comprende una membrana porosa que comprende una superficie superior y una superficie inferior y un reactivo de enlace efectivo para capturar el analito, cuando esta presente en la muestra ftquida, unido a la superficie superior o inferior de la membrana porosa; y

(ii) un reactivo marcado que comprende un ligando que se une al analito y una nanopartfcula recubierta que consiste en multiples nucleos metalicos y una cubierta que tiene el ligando unido al mismo, en el que la cubierta comprende vidrio, un material ceramico tal como perovskita y ZrO2, o un poftmero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y

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poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartfcula, en la que la nanopartfcula recubierta no incluye una molecula activa en Raman,

comprendiendo dicho procedimiento:

(a) mezclar la muestra lfquida con el reactivo marcado de manera que el analito, cuando esta presente en la muestra Kquida, se una al reactivo marcado;

(b) poner en contacto la mezcla de (a) con la superficie superior de la membrana porosa;

(c) permitir que la mezcla de (a) fluya a traves de la membrana porosa de tal manera que al menos una porcion del analito unido al reactivo marcado se una al reactivo de enlace; y

(d) detectar la presencia del reactivo marcado en la membrana porosa midiendo la reflectancia, en el que la deteccion del reactivo marcado en la membrana porosa es indicativa de la presencia de analito en la muestra lfquida y el fallo en detectar la presencia del reactivo marcado en la membrana porosa es indicativo de la ausencia del analito en la muestra lfquida;

(5) un sistema que comprende

(I) un dispositivo de prueba para determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra lfquida, que comprende:

(i) un miembro receptor de muestra;

(ii) un vehnculo en comunicacion de fluido con el miembro receptor de muestra;

(iii) un reactivo marcado que es movil en el vehnculo en presencia de la muestra lfquida, comprendiendo el reactivo marcado un ligando que se une al analito y una nanopartfcula recubierta que consiste en multiples nucleos metalicos y una cubierta que tiene el ligando unido al mismo, en el que la cubierta comprende vidrio, un material ceramico tal como perovskita y ZrO2, o un polfmero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartfcula, y en donde la nanopartfcula recubierta no incluye una molecula activa en Raman; y

(iv) un reactivo de enlace efectivo para capturar el analito, cuando esta presente, inmovilizado en una zona de deteccion definida del vehnculo; en el que la muestra lfquida aplicada al miembro receptor de muestra moviliza el reactivo marcado de tal manera que la muestra y el reactivo marcado se transportan a lo largo de la longitud del vehnculo para pasar a la zona de deteccion y donde la deteccion del reactivo marcado en la zona de deteccion es indicativa de la presencia de analito en la muestra lfquida, y

(II) un reflectometro adaptado para detectar la presencia del reactivo marcado en el dispositivo de prueba; y

(6) un sistema que comprende

(I) un kit para realizar una prueba analftica de flujo continuo para la deteccion de la presencia o ausencia de un analito en una muestra lfquida por reflectometna, que comprende:

(i) un dispositivo de prueba que comprende una membrana porosa que comprende una superficie superior y una superficie inferior y un reactivo de enlace efectivo para capturar el analito, cuando esta presente en la muestra lfquida, unido a la superficie superior o inferior de la membrana porosa; y

(ii) un reactivo marcado que comprende un ligando que se une al analito y una nanopartfcula recubierta que consiste en multiples nucleos de metal y una cubierta que tiene el ligando unido a la misma, en donde la cubierta comprende vidrio, un material ceramico tal como perovskita y ZrO2, o un polfmero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartfcula, donde la nanopartfcula recubierta no incluye una molecula activa en Raman, y

(II) un reflectometro adaptado para detectar la presencia del reactivo marcado en el dispositivo de prueba.

Tal nanopartfcula recubierta comprende nucleos metalicos y una cubierta que aumenta la reflectancia de la nanopartfcula, en la que la nanopartfcula recubierta no incluye una molecula activa en Raman. Los nucleos metalicos pueden presentar, por ejemplo, resonancia plasmonica tal como, por ejemplo, oro.

En algunas realizaciones, la cubierta comprende sflice, mientras que en otras realizaciones la cubierta es otro material ceramico, tal como otro oxido, y en otras realizaciones la cubierta esta formada por un polfmero. El polfmero puede ser, por ejemplo, polietilenglicol, polimetilmetacrilato o poliestireno. La cubierta puede rodear completa o parcialmente el nucleo.

Las nanopartfculas recubiertas pueden estar formadas en cualquiera de una variedad de formas que tienen dimensiones diferentes, incluyendo pero no limitandose a esferoides, barras, discos, piramides, cubos, cilindros, etc. En ciertas realizaciones, la nanopartfcula recubierta tiene al menos una dimension en el intervalo de

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aproximadamente 1 nm a aproximadamente 1000 nm. En otras realizaciones, el nucleo de la nanopartmula recubierta es esferico. En algunos casos, el diametro del nucleo es de aproximadamente 10-100 nm, mientras que en otras realizaciones el diametro del nucleo es de aproximadamente 20-60 nm. En algunas realizaciones, las nanopartmulas comprenden agregados de varios nucleos, por ejemplo pero no limitandose a, dobletes.

La cubierta de la nanopartmula se modifica para permitir la conjugacion de moleculas a la superficie de la nanopartmula. En realizaciones particulares, la modificacion introduce grupos tiol sobre la superficie de la nanopartmula recubierta. En otras realizaciones, un ligando, por ejemplo y sin limitacion, un anticuerpo, se conjuga con la cubierta de la nanopartmula recubierta a traves de los grupos tiol.

El ligando puede unirse a cualquier analito de interes que puede o no estar presente en una muestra. En ciertas realizaciones, el ligando es un anticuerpo que se une a protemas espedficas del virus de la gripe A o del virus de la gripe B.

En ciertas realizaciones, el reactivo marcado usado en el dispositivo de prueba comprende un ligando que se une al analito y una nanopartmula recubierta que consiste en nucleos metalicos y una cubierta que aumenta la reflectancia de la nanopartmula que tiene el ligando unido a ella, en el que dicho ligando esta unido a la superficie de la cubierta.

En ciertas realizaciones, el vehmulo es, por ejemplo y sin limitaciones, nitrocelulosa, plastico o vidrio. En otras realizaciones, el dispositivo de prueba comprende ademas una almohadilla absorbente y/o una zona de control en comunicacion de fluido con la zona de deteccion.

El dispositivo de prueba de la invencion puede utilizarse para detectar cualitativa o cuantitativamente la presencia o ausencia de cualquier analito de interes, tal como, y sin limitacion, una protema, acido nucleico, metabolito, molecula pequena, virus o bacteria. En ciertas realizaciones, el dispositivo de prueba puede usarse para detectar multiples analitos en una muestra lfquida con al menos dos reactivos marcados diferentes, en donde los ligandos de los reactivos marcados se unen a diferentes analitos y al menos dos zonas de deteccion para detectar cada uno de los al menos dos reactivos marcados diferentes.

En algunas realizaciones se usa un lector de reflectancia para detectar el reactivo marcado en la zona de deteccion. En algunas realizaciones, el analito se detecta cuantitativamente y en otras realizaciones, el analito se detecta cualitativamente. En realizaciones venidas, los procedimientos de la invencion pueden usarse para detectar multiples analitos en una muestra lfquida con al menos dos reactivos marcados diferentes, en donde los ligandos de los reactivos marcados se unen a diferentes analitos y al menos dos zonas de deteccion para detectar cada uno de Los al menos dos reactivos marcados diferentes.

En ciertas realizaciones, el dispositivo de prueba de los kits descritos anteriormente comprende ademas una almohadilla absorbente, en la que la superficie inferior de la membrana porosa y la almohadilla absorbente estan en contacto ffsico y en comunicacion de fluido, y en la que el reactivo de enlace esta unido a la superficie superior de la membrana porosa. En otras realizaciones, el dispositivo de prueba de los kits de la invencion comprende ademas un alojamiento para la membrana porosa.

Los kits pueden utilizarse para detectar cualitativa o cuantitativamente la presencia o ausencia de cualquier analito de interes, tal como, y sin limitacion, una protema, acido nucleico, metabolito, molecula pequena, virus o bacteria. En ciertas realizaciones, los kits pueden usarse para detectar multiples analitos en una muestra lfquida con al menos dos reactivos marcados diferentes, en donde los ligandos de los reactivos marcados se unen a diferentes analitos y al menos dos zonas de deteccion para detectar cada uno de los al menos dos reactivos marcados diferentes.

En algunas realizaciones se utiliza un lector de reflectancia para detectar el reactivo marcado en la zona de deteccion. En algunas realizaciones, el analito se detecta cuantitativamente y en otras realizaciones, el analito se detecta cualitativamente. En algunas realizaciones, los procedimientos de la invencion pueden usarse para detectar multiples analitos en una muestra lfquida con al menos dos reactivos marcados diferentes, en donde los ligandos de los reactivos marcados se unen a diferentes analitos y al menos dos zonas de deteccion para detectar cada uno de los al menos dos reactivos marcados diferentes.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra los resultados de una prueba de flujo lateral para el virus de la gripe A que compara la sensibilidad del oro coloidal y las nanopartmulas de oro recubiertas con sflice cuando se miden con un reflectometro. Como se observa en la figura, se observo una respuesta mas fuerte para las nanopartmulas de oro recubiertas con sflice en comparacion con los coloides de oro.

La figura 2 muestra los resultados de una prueba de flujo lateral para el virus de gripe A que compara la sensibilidad de un prototipo de dispositivo utilizando nanopartmulas de oro recubiertas con sflice (Panel 2A) con la sensibilidad de un producto comercial BD Directigen™ EZ A+B (Panel 2B), cuando ambos dispositivos se leen con un reflectometro. El dispositivo que utiliza las nanopartmulas de oro recubiertas con sflice es aproximadamente 7 veces mas sensible que el BD Directigen™ EZ A+B cuando se lee con un reflectometro.

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Descripcion detallada de ciertas formas de realizacion

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que comunmente entiende un experto en la tecnica. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos aqu en la practica de las reivindicaciones, se describen a continuacion procedimientos y materiales adecuados. En el caso de conflicto, la presente especificacion, incluyendo definiciones, controlara. Ademas, los materiales, procedimientos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique espedficamente lo contrario. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. En el contexto de una reivindicacion dependiente multiple, el uso de "o" hace referencia a mas de una reivindicacion independiente o dependiente precedente en la alternativa solamente. Ademas, el uso del termino "incluyendo", asf como otras formas, tales como "incluye" y "incluido", no es limitante. Ademas, terminos tales como "elemento" o "componente" abarcan elementos y componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden mas de una subunidad a menos que se indique espedficamente lo contrario.

Otras caractensticas y ventajas seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada y reivindicaciones.

Con el fin de que la presente solicitud pueda entenderse mas facilmente, se definen en primer lugar ciertos terminos. Definiciones adicionales se exponen a lo largo de la descripcion detallada.

El termino "nanopartfcula" tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a partfculas que comprenden al menos un nucleo y una cubierta que tiene una dimension en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 nanometros (“nm”). Las nanopartfculas pueden ser de cualquier forma. En ciertas realizaciones las nanopartfculas son esfericas. Las nanopartfculas descritas tfpicamente no incluyen, pero pueden incluir una molecula Raman activa. En ciertas realizaciones, las nanopartfculas pueden comprender nucleos multiples y una cubierta.

Tal como se utiliza aqrn, el termino "nucleo" se refiere a la porcion interna de las nanopartfculas. En la invencion, los nucleos metalicos son, por ejemplo, oro.

Las nanopartfculas tambien comprenden una cubierta que mejora la reflectancia de las nanopartfculas. La cubierta puede encapsular completamente el nucleo, o encapsular incompletamente el nucleo. La cubierta puede estar compuesta de cualquier material o combinacion de materiales, siempre que posea la propiedad de aumentar la reflectancia de la nanopartfcula. Por ejemplo, en algunas realizaciones la cubierta puede comprender cualquier material transparente en el intervalo espectral requerido. En ciertas realizaciones, la cubierta comprende sflice, es decir, vidrio. En otras realizaciones, la cubierta comprende otro material ceramico, por ejemplo, pero no limitado a, ceramicas transparentes con un mdice de refraccion alto, tal como perovskita y ZrO2. En otras realizaciones, la cubierta esta compuesta por un polfmero. En realizaciones particulares, el polfmero comprende polietilenglicol, polimetilmetacrilato o poliestireno. En algunas realizaciones, el material que forma la cubierta es tratado o derivado para permitir unir un ligando a la superficie de la nanopartfcula. La eleccion optima de polfmero puede depender del ligando que se inmoviliza en la superficie de la nanopartfcula.

Al referirse a la cubierta de la presente descripcion, la frase "aumenta la reflectancia de la nanopartfcula" significa que la presencia de la cubierta da como resultado una nanopartfcula que proporciona una senal o sensibilidad aumentada cuando se mide por reflectancia en, por ejemplo, inmunoensayo de flujo, en comparacion con una nanopartfcula sin la cubierta. Sin estar limitado por la teona, la presencia de la cubierta que rodea el nucleo puede hacer que la partfcula refleje mas luz. Alternativamente, o ademas, los ligandos unidos a la superficie de la cubierta pueden estar mejor orientados para participar en las reacciones de union cuando se unen al material de la cubierta en oposicion a cuando se adsorben pasivamente a la superficie del nucleo.

Tal como se usa en la presente memoria, "ligando" significa una molecula de cualquier tipo que se unira a un analito de interes. Por ejemplo y sin limitacion, en ciertas realizaciones el ligando es un anticuerpo, un antfgeno, un receptor, un acido nucleico o una enzima.

El termino "analito" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier sustancia de interes que se desee detectar usando la invencion, incluyendo, pero sin limitarse a, farmacos, incluyendo farmacos terapeuticos y farmacos de abuso; hormonas; vitaminas; protemas, incluidos anticuerpos de todas las clases; peptidos; esteroides; bacterias; hongos; virus; parasitos; componentes o productos de bacterias, hongos, virus o parasitos; alergenos de todo tipo; productos o componentes de celulas normales o malignas; etc. Como ejemplos particulares, se pueden mencionar la gonadotropina corionica humana (hCG); insulina; hormona luteinizante; organismos causantes o asociados a diversos estados patologicos, tales como Streptococcus pyogenes (grupo A), Herpes Simplex I y II, citomegalovirus, Chlamydia, anticuerpo contra la rubeola, gripe A y B; etc. En ciertas realizaciones de la invencion, la presencia o ausencia de un analito en una muestra se determina cualitativamente. En otras realizaciones, se determina una determinacion cuantitativa de la cantidad o concentracion de analito en la muestra.

El termino "muestra" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier muestra biologica que podna

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contener un analito para su deteccion. En algunas realizaciones, la muestra biologica esta en forma Ifquida, mientras que en otros se puede cambiar en una forma lfquida.

El termino "miembro de recepcion de muestra", tal como se utiliza en la presente memoria, significa la parte del dispositivo de prueba que esta en contacto directo con la muestra lfquida, es decir, recibe la muestra a ensayar para el analito de interes. El miembro receptor de muestra puede ser parte o separado del vehnculo o membrana porosa. La muestra lfquida puede entonces migrar, a traves de flujo lateral o vertical, desde el miembro receptor de muestra hacia la zona de deteccion. El miembro receptor de muestra esta en contacto de flujo de lfquido con la zona de deteccion de analito. Esto podna ser una conexion superpuesta, de arriba a abajo o una conexion de extremo a extremo. En ciertas realizaciones, el miembro receptor de muestra esta hecho de material poroso, por ejemplo y no limitado a papel.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "vetnculo", tal como se utiliza en un ensayo de flujo lateral, se refiere a cualquier sustrato capaz de proporcionar flujo de lfquido. Esto incluina, por ejemplo, sustratos tales como nitrocelulosa, mezclas de nitrocelulosa con poliester o celulosa, papel no tratado, papel poroso, rayon, fibra de vidrio, copolfmero de acrilonitrilo, plastico, vidrio o nilon. El sustrato puede ser poroso. Tfpicamente, los poros del sustrato son de tamano suficiente tal que las nanopartfculas fluyen a traves de la totalidad del vetnculo. Un experto en la tecnica sera consciente de otros materiales que permiten el flujo de lfquido. El vetnculo puede comprender uno o mas sustratos en comunicacion de fluido. Por ejemplo, la zona de reactivo y la zona de deteccion pueden estar presentes en el mismo sustrato (es decir, almohadilla) o pueden estar presentes en sustratos separados (es decir, almohadillas) dentro del vehnculo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "membrana porosa", tal como se utiliza en un ensayo de flujo continuo, se refiere a una membrana o filtro de cualquier material que se humedece facilmente con una solucion acuosa y tiene poros suficientes para permitir el paso de las nanopartfculas recubiertas. Materiales adecuados incluyen, por ejemplo, nitrocelulosa, mezclas de nitrocelulosa con poliester o celulosa, papel sin tratar, papel poroso, rayon, fibra de vidrio, copolfmero de acrilonitrilo, plastico, vidrio o nilon.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "material absorbente" se refiere a un material poroso que tiene una capacidad de absorcion suficiente para absorber sustancialmente todos los lfquidos de los reactivos de ensayo y cualquier solucion de lavado y, opcionalmente, para iniciar la accion capilar y extraer los lfquidos de ensayo a traves del dispositivo de prueba. Los materiales adecuados incluyen, por ejemplo, nitrocelulosa, mezclas de nitrocelulosa con poliester o celulosa, papel sin tratar, papel poroso, rayon, fibra de vidrio, copolfmero de acrilonitrilo, plastico, vidrio o nilon.

Como se usa aqrn, el termino “flujo lateral” se refiere al flujo de lfquido a lo largo del plano de un vehnculo. En general, los dispositivos de flujo lateral pueden comprender una tira (o varias tiras en comunicacion de fluidos) de un material capaz de transportar una solucion por accion capilar, es decir, una accion de mecha o cromatografica, en la que diferentes areas o zonas en la tira contienen ensayos reactivos ligados con difusion o sin difusion que producen una senal detectable a medida que la solucion es transportada a o a traves de dichas zonas. Tfpicamente, dichos ensayos comprenden una zona de aplicacion adaptada para recibir una muestra de lfquido, una zona de reactivo separada lateralmente de y en comunicacion de fluido con la zona de aplicacion y una zona de deteccion espaciada lateralmente de y en comunicacion de fluido con la zona de reactivo. La zona de reactivo puede comprender un compuesto que es movil en el lfquido y capaz de interactuar con un analito en la muestra y/o con una molecula unida en la zona de deteccion. La zona de deteccion puede comprender una molecula de union que esta inmovilizada sobre la tira y es capaz de interactuar con el analito y/o el compuesto reactivo para producir una senal detectable. Dichos ensayos pueden usarse para detectar un analito en una muestra a traves de ensayos directos (ensayos en sandwich) o de enlace competitivo. Ejemplos de dispositivos de flujo lateral se proporcionan en las Patentes de Estados Unidos No. 6,194,220 de Malick et al.; 5,998,221 de Malick et al.; 5,798,273 de Shuler et al.; y RE38,430 de Rosenstein.

En un ensayo de flujo lateral en sandwich, una muestra lfquida que puede contener o no un analito de interes se aplica a la zona de aplicacion y se deja pasar a la zona reactiva por accion capilar. El analito, si esta presente, interactua con un reactivo marcado en la zona reactiva y el complejo analito-reactivo se mueve por accion capilar a la zona de deteccion. El complejo analito-reactivo queda atrapado en la zona de deteccion interaccionando con una molecula de union espedfica para el analito y/o reactivo. La muestra no unida puede moverse a traves de la zona de deteccion por accion capilar a una almohadilla absorbente lateralmente yuxtapuesta y en comunicacion de fluido con la zona de deteccion. El reactivo marcado puede ser detectado entonces en la zona de deteccion por medios apropiados.

En un ensayo de flujo lateral competitivo, una muestra lfquida que puede o no contener un analito de interes se aplica a la zona de aplicacion y se deja pasar a la zona de reactivo por accion capilar. La zona de reactivo comprende un reactivo marcado, que puede ser el propio analito, un homologo o derivado del mismo, o una unidad estructural que es capaz de imitar al analito de interes cuando se une a un enlazante inmovilizado en la zona de deteccion. El reactivo marcado es movil en la fase lfquida y se mueve con la muestra lfquida a la zona de deteccion por accion capilar. El analito contenido en la muestra lfquida compite con el reactivo marcado al unirse al enlazante inmovilizado en la zona de deteccion. La muestra no unida puede moverse a traves de la zona de deteccion por

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accion capilar a una almohadilla absorbente lateralmente yuxtapuesta y en comunicacion de fluido con la zona de deteccion. El reactivo marcado puede entonces ser detectado en la zona de deteccion por medios apropiados. La presencia o ausencia del analito de interes puede determinarse mediante la inspeccion de la zona de deteccion, en la que cuanto mayor sea la cantidad de analito presente en la muestra lfquida, menor sera la cantidad de receptor marcado unido en la zona de deteccion.

Tal como se usa en la presente memoria, los terminos “flujo vertical” y “flujo continuo” se refieren al flujo de lfquido transversal al plano de un vefuculo. En general, los dispositivos de flujo pueden comprender una membrana o capas de membranas apiladas una encima de la otra que permiten el paso de lfquido a traves del dispositivo. Las capas pueden contener reactivos de ensayo unidos con difusion o sin difusion que producen una senal detectable a medida que la solucion es transportada a traves del dispositivo. Tfpicamente, el dispositivo comprende una primera capa que tiene una superficie superior e inferior, en la que dicha superficie superior esta adaptada para recibir una muestra de lfquido y una capa absorbente verticalmente yuxtapuesta y en comunicacion de fluido con la superficie inferior de la primera capa que esta adaptada para extraer el lfquido a traves de la primera capa. La primera capa puede comprender un agente enlazante unido a la superficie superior de la primera capa que es capaz de interactuar con un analito en la muestra y atrapar el analito sobre la superficie superior de la primera capa. Ejemplos de dispositivos de flujo continuo proporcionan en las Patentes de los Estados Unidos No. 4,920,046 de McFarland et al. y 7,052,831 de Fletcher et al.

En la practica, una muestra lfquida que puede o no contener un analito de interes se aplica a la superficie superior de una primera capa que comprende un agente enlazante espedfico para un analito de interes. La muestra lfquida fluye entonces a traves de la primera capa y hacia la capa absorbente. Si el analito esta presente en la muestra, interactua con el agente enlazante y queda atrapado en la superficie superior de la primera capa. La primera capa se puede tratar entonces con soluciones de lavado de acuerdo con procedimientos de inmunoensayo convencionales. La primera capa puede tratarse despues con un reactivo marcado que se une al analito atrapado por el agente enlazante. El reactivo marcado fluye a continuacion a traves de la primera capa y hacia la capa absorbente. La primera capa puede tratarse con soluciones de lavado de acuerdo con procedimientos de inmunoensayo convencionales. El reactivo marcado puede entonces detectarse por medios apropiados. Alternativamente, la muestra lfquida puede mezclarse con el reactivo marcado antes de ser aplicada a la superficie superior de la primera capa. Otras variantes adecuadas son conocidas por los expertos en la tecnica.

Los ensayos laterales y de flujo continuo pueden ser usados para detectar multiples analitos en una muestra. Por ejemplo, en un ensayo de flujo lateral, la zona de reactivo puede comprender multiples reactivos marcados, cada uno capaz de unirse a (o imitar) un analito diferente en una muestra lfquida, o un solo reactivo marcado capaz de unirse a (o imitar) multiples analitos. Alternativamente, o ademas, la zona de deteccion en un ensayo de flujo lateral puede comprender multiples moleculas de union, cada una capaz de unirse a un analito diferente en una muestra ifquida, o una unica molecula de union capaz de unirse a multiples analitos. En un ensayo de flujo continuo, la membrana porosa puede comprender multiples agentes enlazantes, cada uno capaz de unirse a un analito diferente en una muestra lfquida, o un unico agente enlazante capaz de unirse a multiples analitos. Alternativamente, o ademas, se puede usar una mezcla de reactivos marcados en un ensayo de flujo continuo, cada uno configurado para unirse a un analito diferente en una muestra lfquida, o un solo reactivo marcado configurado para enlazar multiples analitos. Si se usan multiples reactivos marcados en un ensayo lateral o de flujo, los reactivos pueden marcarse diferencialmente para distinguir diferentes tipos de analitos en una muestra lfquida.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "movil" significa unido con difusion o sin difusion, o impregnado. Los reactivos que son moviles son capaces de dispersarse con la muestra lfquida y son transportados por la muestra lfquida en el flujo lateral o vertical.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino “reactivo marcado” significa cualquier partfcula, protema o molecula que reconoce o se une al analito de interes y ha unido a el una sustancia capaz de producir una senal que es detectable por medios visuales o instrumentales, es decir, una nanopartfcula recubierta como se define aqrn. La partfcula o molecula que reconoce el analito puede ser natural o no natural. En algunas realizaciones la molecula es un anticuerpo monoclonal o policlonal.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "reactivo de enlace" significa cualquier partfcula o molecula que reconoce o se une al analito en cuestion. El reactivo de enlace es capaz de formar un complejo de union con el complejo reactivo marcado con analito. El reactivo de enlace se inmoviliza en el vefuculo en la zona de deteccion o en la superficie de la membrana porosa. El reactivo de enlace no se ve afectado por el flujo lateral o vertical de la muestra lfquida debido a la inmovilizacion del vefuculo o membrana porosa. La partfcula o molecula puede ser natural, o no natural, es decir, sintetica. Una vez que el reactivo de enlace se une al complejo de reactivo marcado con analito, impide que el complejo de reactivos marcado con analito continue con el flujo de la muestra lfquida.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "zona de deteccion" significa la porcion del vefuculo o membrana porosa que contiene el reactivo de enlace inmovilizado.

El termino “zona de control” se refiere a una parte del dispositivo de prueba que comprende una molecula de union configurada para capturar el reactivo marcado. En un ensayo de flujo lateral, la zona de control puede estar en

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contacto de flujo de Uquido con la zona de deteccion del vetuculo, de tal manera que el reactivo marcado se capture en la zona de control cuando la muestra Uquida es transportada fuera de la zona de deteccion por accion capilar. En un ensayo de flujo continuo, la zona de control puede ser una porcion separada de la membrana porosa, de manera que el reactivo marcado se aplica tanto a la porcion de aplicacion de muestra de la membrana porosa como a la zona de control. La deteccion del reactivo marcado en la zona de control confirma que el ensayo esta funcionando para la finalidad prevista.

El termino "alojamiento" se refiere a cualquier recinto adecuado para los dispositivos de prueba de la invencion. Los alojamientos ejemplares seran conocidos por los expertos en la tecnica. El alojamiento puede tener, por ejemplo, una parte de base y una porcion de tapa. La tapa puede incluir una pared superior y una pared lateral

sustancialmente vertical. Un reborde puede proyectarse hacia arriba desde la pared superior. El reborde puede

definir un rebaje que tiene en su interior un inserto con al menos dos aberturas alineadas con al menos otras dos aberturas en la tapa para formar al menos dos pozos en el alojamiento. El alojamiento puede construirse para asegurar que no hay comunicacion entre los dos o mas pozos. Un ejemplo de dicha cubierta se proporciona en la Patente de los Estados Unidos No. 7,052,831 de Fletcher et al. Otros alojamientos adecuados incluyen los utilizados en el dispositivo de ensayo de flujo lateral BD Directigen™ EZ RSV.

Tal como se usa en la presente memoria, "lector de reflectancia" o "reflectometro" se refiere a un instrumento capaz de detectar el cambio en la reflectancia causado por la presencia de la nanopartfcula recubierta en la zona de deteccion del dispositivo de ensayo. Los lectores de reflectancia o reflectometros son conocidos en la tecnica. Los instrumentos representativos adecuados para su uso en la invencion incluyen, pero no se limitan a, el

Immunochromato Reader C10066 de Hamamatsu o el ESE-Quant de ESE GmbH. La zona de deteccion es

explorada mas habitualmente por el area de deteccion del dispositivo o directamente formada por imagenes en el detector del reflectometro que conduce a un rastro de reflectividad frente a la coordenada espacial. A continuacion se utiliza un algoritmo adecuado para determinar, por ejemplo, el cambio maximo de reflectividad en la zona de deteccion.

Las nanopartfculas recubiertas para uso en procedimientos basados en SERS son conocidas en la tecnica. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,514,767 describe nanopartfculas compuestas SERS (SACN) que comprenden una nanopartfcula metalica que ha unido o asociado con su superficie una o mas moleculas activas en Raman y esta encapsulada por una cubierta que comprende un polfmero, vidrio o cualquier otro material dielectrico. Tales partfculas pueden producirse haciendo crecer o de otra manera colocando una cubierta de un encapsulante adecuado sobre un nucleo de nanopartfculas metalicas activas en Raman. Las nanopartfculas de metal del tamano deseado pueden crecer como coloides metalicos mediante una serie de tecnicas bien conocidas en la tecnica, tales como la reduccion qmmica o fotoqmmica de iones metalicos en solucion usando agentes reductores. Por ejemplo, se pueden producir partfculas de oro coloidal, que son suspensiones de partfculas submicrometrizadas de oro en fluido, en un lfquido por reduccion de acido cloroaurico. Despues de disolver el acido, la solucion se agita rapidamente mientras se anade un agente reductor. Esto hace que los iones de oro se reduzcan a atomos de oro neutros, que precipitan de la solucion sobresaturada y forman partfculas. Para evitar que las partfculas se agreguen, se puede anadir un agente estabilizante que se adhiere a la superficie de las nanopartfculas. Las nanopartfculas tambien pueden fabricarse por descarga electrica en solucion. Las partfculas pueden ser funcionalizadas con diversos ligandos organicos para crear tubridos organicos e inorganicos con funcionalidad avanzada.

Los encapsulantes adecuados incluyen vidrio, polfmeros, metales, oxidos metalicos y sulfuros metalicos. Si el encapsulante es de vidrio, los nucleos de nanopartfculas metalicas se tratan preferiblemente primero con un imprimador de vidrio. A continuacion, se hace crecer vidrio sobre la nanopartfcula metalica mediante tecnicas estandar. El espesor del encapsulante se puede variar facilmente dependiendo de las propiedades ffsicas requeridas de la partfcula. Las capas pueden ser derivadas por tecnicas estandar, permitiendo que las partfculas se conjuguen a moleculas (incluyendo biomoleculas tales como protemas y acidos nucleicos) o a soportes solidos.

Las nanopartfculas Oxonica Nanoplex™ comercialmente disponibles consisten en un nucleo de nanopartfculas de oro, sobre el cual se adsorben moleculas informadoras Raman capaces de generar una senal SERS. La nanopartfcula de oro marcada con Raman se recubre entonces con una capa de sflice de aproximadamente 10-50 nm de espesor. La cubierta de sflice protege las moleculas reporteras de la desorcion de la superficie del nucleo, evita las interacciones plasmon-plasmon entre partfculas de oro adyacentes, y tambien evita la generacion de senales SERS a partir de componentes en la solucion.

Para un ensayo de flujo lateral lefdo con un lector de reflectancia, podna esperarse que las nanopartfculas Oxonica Nanoplex™ proporcionaran una sensibilidad de ensayo comparable a la de los coloides de oro del mismo diametro que el nucleo de la nanopartfcula Oxonica Nanoplex™ y utilizadas en la misma densidad optica. En cambio, los inventores observaron ventajas inesperadas y significativas en la sensibilidad del ensayo cuando los coloides de oro fueron reemplazados por nanopartfculas Oxonica Nanoplex™ en ensayos de flujo lateral lefdos con un lector de reflectancia en lugar de un detector de senal Raman. Es importante destacar que las mejoras de sensibilidad obtenidas con las nanopartfculas Oxonica Nanoplex™ en general no se obtuvieron simplemente ajustando el diametro de los coloides de oro no recubiertos. Tambien, de manera importante, cuando se usan las nanopartfculas Oxonica Nanoplex™ como un reactivo marcado, la sensibilidad del ensayo puede ser equivalente, si la senal se lee con un reflectometro o un lector SERS.

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No se cree que las moleculas activas en Raman en las nanopartteulas Oxonica Nanoplex™ contribuyan al rendimiento del ensayo cuando se usa un reflectometro para leer la senal en lugar de un lector Raman. Esta expectativa es corroborada por experimented en los que se encontro que la nanopartteula recubierta con s^lice (sin moleculas activas en Raman) funcionaba de manera identica y se han utilizado en ensayos de flujo lateral basados en reflectometro para dar ventajas de sensibilidad significativas sobre los coloides de oro desnudo.

Aquellos de los siguientes ejemplos que no entran dentro del alcance de las reivindicaciones tienen un proposito ilustrativo.

Ejemplos

Ejemplo 1:

Este experimento comparo el rendimiento de las nanopartteulas de oro recubiertas con sflice con las de los coloides de oro en un inmunoensayo de flujo lateral para el virus de la gripe A. En este experimento, aspirados nasofarrngeos que dieron negativo para el virus de la gripe A fueron atacados con cantidades conocidas de un virus vivo de gripe A H1N1.

Los coloides de oro, obtenidos de British Biocell International ("BBInternational", "BBI"), teman 40 nm de diametro. Las nanopartteulas de oro recubiertas con sflice utilizadas en el experimento fueron nanopartteulas Oxonica Nanoplex™. Estas nanopartteulas consisten en un nucleo de oro de 60 nm recubierto con el informador Raman 4,4'- dipiridilo y una capa externa de sflice. El grosor de la cubierta de silica fue de aproximadamente 30 nm. Los anticuerpos de deteccion de la gripe A se unieron a los coloides de oro mediante adsorcion pasiva. Para las nanopartteulas Nanoplex™, los anticuerpos de deteccion de la gripe A se unieron covalentemente a grupos tiol sobre la superficie de sflice a traves de la qmmica de la maleimida. Para ambos ensayos, los anticuerpos de captura de gripe A fueron dispuestos en bandas sobre membranas de nitrocelulosa Whatman AE99. Las membranas de nitrocelulosa se ensayaron a continuacion en un formato lfquido ("tira reactiva") en el que las partteulas mas los anticuerpos de deteccion se mezclaron con las muestras nasofarmgeas que conteman niveles variables de virus. Se uso la misma densidad optica tanto para los coloides de oro como para las nanopartteulas recubiertas. Las mezclas de partteula/muestra se colocaron entonces en los pozos de una placa de 96 pozos y se coloco un extremo de una membrana de nitrocelulosa con anticuerpos de captura en cada pozo. Se dejo que la muestra impregnara la membrana de nitrocelulosa, y los pozos se llenaron entonces con un tampon de lavado que luego tambien impregno las tiras de membrana de nitrocelulosa.

La senal resultante de la lmea de captura se leyo con un reflectometro construido a medida para Becton, Dickinson and Company ("BD") por UMM Electronics (Indianapolis, IN). La figura 1 muestra un grafico de la senal del reflectometro en funcion de la concentracion de virus para pruebas de flujo lateral con coloides de oro y con nanopartteulas recubiertas. Se observo una respuesta significativamente mas fuerte para las nanopartteulas de Oxonica frente a los coloides de oro.

Ejemplo 2

En este ejemplo, la sensibilidad de las nanopartteulas de oro recubiertas con sflice se comparo con la de un producto comercial: la prueba BD Directigen™ EZ Flu A+B. Como en el Ejemplo 1, las nanopartteulas de oro recubiertas se ensayaron en un formato de tira reactiva usando nitrocelulosa Whatman AE99. La Directigen™ EZ Flu A+B se probo en su realizacion comercial (formato de cartucho). Los anticuerpos de captura y deteccion fueron los mismos para el producto comercial BD Directigen™ EZ Flu A+B y el dispositivo basado en nanopartteulas Oxonica Nanoplex™. Las muestras se prepararon como se describe en el Ejemplo 1, excepto que el virus vivo B/Lee/40 de la gripe B fue inyectado en aspirados nasofarrngeos negativos en lugar del virus de la gripe A. Como antes, las nanopartteulas de oro recubiertas con sflice usadas en el experimento eran nanopartteulas Oxonica Nanoplex™. Estas nanopartteulas consisten en un nucleo de oro de 60 nm recubierto con el informador Raman 4,4'-dipiridilo y una capa externa de sflice. El espesor de la capa de sflice era aproximadamente 30 nm. El producto comercial bD utiliza coloide de oro de 40 nm que no incluye una capa de sflice. El producto comercial BD se uso de acuerdo con el inserto del envase, solamente con la senal de la lmea de prueba lefda con un reflectometro, asf como visualmente.

Los datos se muestran en la Tabla 1, que compara el lfmite de deteccion (Lfmite de Deteccion Confiable) para las dos partteulas. El Lfmite de Deteccion Confiable (RDL) se define como la concentracion en la que el lfmite de confianza del 95% inferior es igual al lfmite superior de confianza del 95% del blanco. Los RDL, expresados en unidades arbitrarias (X) para el producto de oro coloidal BD y para las nanopartteulas recubiertas con sflice, se informan para tres experimentos separados. El mismo reflectometro construido a medida de UMM Electronics fue utilizado para leer la senal tanto de los dispositivos de tira reactiva de nanopartteulas recubiertas de sflice como de los dispositivos Directigen™ EZ Flu A+B. El factor de mejora de la sensibilidad se define como el RDL del producto sin recubrimiento de oro dividido por el RDL del producto de nanopartteulas recubiertas con sflice.

Tabla 1

BD Directigen™ EZ con Prueba de flujo lateral Factor de mejora de la

oro no recubierto (leido con nanopartteulas sensibilidad

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con un reflectometro) Oxonica (leida con un reflectometro)

Experimento 1

0,23 0,015 15

Experimento 2

0,12 0,0075 16

Experimento 3

0,26 0,028 9

Como se ve en la tabla, las nanopartfculas Oxonica Nanoplex™ dieron una sensibilidad 16 veces mejorada en comparacion con las partfculas de oro desnudo.

En experimentos separados similares a los descritos anteriormente, el diametro de las partfculas de coloide de oro se incremento de 40 nm a 60 nm y tamanos mayores. En estos experimentos solamente se observaron mejoras de sensibilidad limitadas (hasta 2 veces), lo que indica que la diferencia de tamano entre el nucleo de oro de las nanopartfculas Oxonica Nanoplex™ y el coloide de oro probablemente no es la fuente de mejoras de sensibilidad.

Ejemplo 3

Este experimento comparo la sensibilidad y especificidad de los coloides de oro frente a las nanopartfculas Oxonica Nanoplex™ en una prueba de inmunoensayo de flujo lateral de gripe B (B/ Lee/40). Se prepararon sesenta muestras clmicas. Las muestras fueron todas muestras nasofarmgeas que dieron negativo para la gripe B. Veinte de las muestras sirvieron como controles negativos. Las 40 muestras restantes fueron atacadas con virus vivo de gripe B a dos niveles para crear un conjunto de 40 muestras positivas. Veinte de estas cuarenta muestras fueron atacadas con virus vivo de gripe B a una concentracion de 0,5X (unidades arbitrarias). Las veinte muestras restantes recibieron 10 veces menos virus B de la gripe, para una concentracion de 0,05X. Todas las sesenta muestras (40 positivas y 20 controles negativos) se ensayaron a continuacion utilizando el producto comercial BD Directigen™ EZ Flu A+B en formato de cartucho y el dispositivo de tira reactiva medidora hecho usando nanopartfculas Oxonica Nanoplex™. El dispositivo de tira reactiva se preparo usando nitrocelulosa Whatman AE99. Las nanopartfculas Oxonica Nanoplex™ consistfan en un nucleo de oro de 60 nm recubierto con el informador Raman 4,4'-dipiridilo y una capa externa de sflice que tema aproximadamente 30 nm de espesor. Los anticuerpos de captura y deteccion fueron los mismos tanto para el producto comercial BD Directigen™ EZ Flu A+B como para el dispositivo Oxonica Nanoplex™ basado en nanopartfculas.

Los resultados se resumen en la Tabla 2. En la tabla, se calculo la sensibilidad como el porcentaje de las 40 muestras positivas correctamente identificadas como positivas por cada prueba. La especificidad se calculo como el porcentaje de las 20 muestras negativas correctamente identificadas como negativas por cada prueba. Cuando se usaron las lecturas de instrumento, una prueba se considero positiva si la lectura del instrumento medido era mayor que un valor de umbral establecido para cada tipo de dispositivo. El umbral se establecio para asegurar al menos una especificidad del 95% para cada dispositivo. En este ejemplo, el producto Directigen™ fue lefdo visualmente y con el reflectometro personalizado de UMM Electronics. Las nanopartfculas Oxonica Nanoplex™ se leyeron con el mismo reflectometro, y tambien con un lector Raman de investigacion construido por BD (ultima fila de la tabla). El lector Raman de investigacion utilizo un laser de 785 nm para la excitacion y un espectrometro de investigacion Acton (SpectraPro 25000i) y un detector CCD (Pixis 400) para detectar la senal Raman.

Tabla 2

Prueba

Sensibilidad Especificidad

Directigen ™ EZ, lectura visual

45% 100%

Directigen ™ EZ, lefda con reflectometro

58% 95%

Nanotags de Oxonica, lefda con reflectometro

100% 100%

Nanotags de Oxonica, lefda con Raman

100% 100%

Como puede verse, se observa una clara ventaja de sensibilidad con las nanopartfculas Oxonica Nanoplex™ comparadas con las partfculas Directigen™ EZ, sin perdida de especificidad.

Ejemplo 4

Este experimento comparo el rendimiento de las nanopartfculas de oro recubiertas con sflice, con y sin una molecula de dispersion Raman (SERS) mejorada en superficie, en un inmunoensayo de flujo lateral basado en reflectancia.

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Se obtuvieron nanopartfculas de oro Oxonica Nanoplex™ que conteman una etiqueta SERS de Oxonica. Las nanopardculas consisten en un nucleo de oro de 60 nm marcado con 4-4'-dipiridilo y recubierto con una capa de sflice de 35 nm de espesor. El diametro de las nanopardculas fue de 130 nm. Se utilizo la qmmica Sulfo-SMCC (Pierce # 22622) para unir covalentemente anticuerpos antigripe A a los grupos de tiol superficiales sobre las nanopartfculas.

Se adquirieron de BBI nanopartfculas de oro de 60 nanometros de diametro que caredan de una etiqueta SERS. Las nanopartfculas de oro se recubrieron despues con sflice mediante el siguiente procedimiento. En primer lugar se trataron 10 ml de coloide de oro de 60 nm (BBI, ~2,6x1010 pardculas/ml) con 75 pl de una solucion 100 pM de 3- mercaptopropil trietoxisilano en etanol. Despues de 3 horas, se anadieron 75 pl de una solucion acuosa al 2,7% de silicato de sodio y se dejo que la reaccion continuara durante 24 horas. En la siguiente etapa, se anadieron 40 ml de etanol a la suspension seguido de 1 ml de amomaco y 300 pl (solucion al 5% en etanol) de ortosilicato de tetraetilo. La reaccion se mantuvo bajo agitacion durante 2 dfas y finalmente se purifico mediante centrifugacion repetida. El espesor del recubrimiento de sflice producido en este procedimiento fue de 30 nm, para un diametro de partfcula total del oro recubierto con sflice de 120 nm. Se anadieron grupos tiol entonces a la superficie de las partfculas de oro recubiertas con sflice haciendo reaccionar una suspension acuosa de nanopartfculas de oro recubiertas con vidrio (10 ml, ~2,6x1010 pardculas/ml) con una solucion etanolica al 1% de mercaptopropil trimetoxisilano (MPTMS) durante 24 horas a temperatura ambiente. La cantidad de solucion de MPTMS vario de 25 pl a 100 pl, para crear niveles variables de grupos tiol tensioactivos a niveles aproximados de carga de 0,5, 1,0, 1,5 y 2,0 entre sf (por ejemplo, 2,0 es 4X mayor que 0,5) a traves de un proceso no optimizado. Despues de la reaccion, las partfculas se purificaron por centrifugacion repetida en agua. Se utilizo la qmmica Sulfo-SMCC (Pierce # 22622) para unir covalentemente anticuerpos antigripe A a los grupos de tiol superficiales sobre las nanopartfculas.

El inmunoensayo de flujo lateral se realizo en un formato de tira reactiva de la siguiente manera. Los anticuerpos de captura de Gripe A se aplicaron a tiras de nitrocelulosa Whatman AE99. Las tiras de nitrocelulosa se sumergieron en soluciones de muestra que conteman nanopartfculas ajustadas a una densidad optica de 10 y diversas concentraciones de virus H1N1 de gripe A. Se dejo que las soluciones de muestra impregnaran completamente las tiras de nitrocelulosa. A continuacion, se anadio un tampon de lavado y tambien se sometieron a agitacion las tiras de membrana de nitrocelulosa. Despues se secaron las tiras y se leyo la reflectancia usando un reflectometro Hamamatsu, modelo C10066. Los resultados se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3

Tipo de nanoparticula

LOD - Lector de Reflectancia (unidades de X, medida como RDL)

Oxonica Nanoplex™ SERS etiqueta con molecula informadora Raman 4,4'-dipiridilo - replicado 1

0,0471

Oxonica Nanoplex™ SERS etiqueta con molecula informadora Raman 4,4'-dipiridilo - replicado 2

0,0564

Oro recubierto de sflice sin molecula informadora Raman - carga de tiol "0,5"

0.0901

Oro recubierto de sflice sin molecula informadora Raman - carga de tiol "1,0"

0,135

Oro recubierto de sflice sin molecula informadora Raman - carga de tiol "1,5"

0,1063

Oro recubierto de sflice sin molecula informadora Raman - carga de tiol "2,0"

0,062

Los datos de la Tabla 3 indican que, si se optimizan, las nanopartfculas de oro recubiertas con sflice sin un reportero SERS funcionan tan bien como nanopartfculas que incluyen un reportero SERS en un inmunoensayo de flujo lateral cuando se usa un lector de reflectometro. Ademas, el rendimiento de las partfculas de oro recubiertas con sflice puede depender del grado de tiolacion.

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Ejemplo 5

Este experimento se diseno para probar el rendimiento de un prototipo de dispositivo de flujo lateral para detectar el virus H1N1 gripe A vivo en muestras clmicas usando nanopartmulas de oro recubiertas con sflice Oxonica Nanoplex™ como informadoras. Las partmulas de Oxonica teman un diametro de nucleo de oro de aproximadamente 60 nm, un informador en Raman de 4,4'-dipiridilo y una cubierta de sflice exterior de aproximadamente 35 nm de espesor. El dispositivo prototfpico basado en cartuchos uso los mismos anticuerpos de captura y deteccion que el producto comercial BD Directigen™ EZ Flu A+B y se uso de la misma manera que el producto comercial.

El dispositivo de prueba prototipo comprendfa una tira de respaldo que soporta una longitud de membrana de flujo lateral de nitrocelulosa Millipore HF135. Los anticuerpos de captura espedficos de la nucleoprotema de la gripe A (Flu A NP) fueron dispuestos en bandas a traves de esta membrana para formar una lmea de prueba. El anticuerpo antiinmunoglobulina de la especie fue dispuesto en bandas adyacente a la lmea de prueba para formar una lmea de control. Las nanopartmulas Oxonica Nanoplex™ SERS se pulverizaron sobre una almohadilla conjugada (Arista MAPDS-0399) que se habfa tratado con una solucion SEaBlOCK al 10% (Pierce 37527). Las nanopartmulas se conjugaron con un anticuerpo de deteccion de la gripe A NP. La almohadilla de conjugado fue adherida a la tira de soporte en un extremo de la membrana de flujo lateral. En el extremo opuesto de la membrana de flujo lateral, se unio una almohadilla de impregnacion absorbente (Whatman # 470). La tira de ensayo de flujo lateral resultante se monto dentro de un cartucho de poliestireno de dos partes. Este cartucho encerro completamente la tira de ensayo excepto por una ventana central que revelaba la region de la lmea de prueba y de control de la membrana LF, y una aplicacion de muestra bien centrada en la almohadilla conjugada. Esta cubierta del cartucho se utiliza en el dispositivo de ensayo de flujo lateral Directigen™ EZ RSV de BD.

De forma similar al Ejemplo 1, se sembraron muestras de aspiracion nasofarmgea pediatricas que daban negativo para el virus de la gripe A con cantidades conocidas de virus de gripe A vivo. Las concentraciones finales de virus dentro de las muestras sembradas variaron desde 0,25X (unidades arbitrarias) hasta 0,0039X por dilucion en serie de dos veces. Se incluyo una muestra marcada con un medio de dilucion libre de virus ("0X") como control. Despues de la adicion de virus vivos, la serie de muestras se proceso utilizando el protocolo de preparacion de muestras BD Directigen™ EZ Flu A+B. En resumen, se mezclo una cantidad de muestra sembrada con gripe A con el reactivo de extraccion en un tubo de muestra flexible. La muestra extrafda fue retirada entonces del tubo a traves de una punta de filtracion de fibra de vidrio y fue recolectada. Cada muestra se ensayo por triplicado aplicando 100 pl al pozo de muestra de cada uno de los tres dispositivos de prueba prototipo.

Cada dispositivo fabricado con las nanopartmulas de Oxonica Nanoplex™ SERS se leyo usando un reflectometro Hamamatsu (modelo C10066) a los 15 minutos y 30 minutos despues de la aplicacion de la muestra. Despues de la lectura a los 30 minutos, se retiro cada tira de flujo lateral de su cartucho, se separo de las almohadillas conjugadas y de impregnacion, y se seco a temperatura ambiente y humedad durante al menos 1 hora. Cada tira fue lefda de nuevo por reflectometro despues del secado. Se dibujo una curva de dosis-respuesta usando datos de cada tiempo de lectura y luego se uso para calcular la sensibilidad de cada tiempo de lectura en terminos de concentracion minima detectable (la concentracion mas baja para la cual la senal media es igual al intervalo de confianza superior del blanco; MDC) y un lfmite de deteccion confiable (RDL). Estos resultados se muestran en la Tabla 4. La Tabla 4 tambien muestra la mejora de la sensibilidad obtenida usando las partmulas de Oxonica en comparacion con la sensibilidad de Directigen™ EZ. Directigen™ EZ utiliza coloides de oro de 40 nm de diametro sin recubrimiento de sflice.

Tabla 4. Sensibilidad de un sistema de prueba de flujo lateral para gripe A basado en cartucho empleando _________________nanoparticulas activas SERS Oxonica y deteccion por reflectometria_________________

Estado del dispositivo y Tiempo de lectura

Limite de Deteccion* Gripe A lectura por Reflectometro (Particulas de Oxonica) Mejora del RDL vs. Dispositivo Gripe A Directigen™ EZ leido con un reflectometro

MDC (X)

RDL (X)

Humedo a los 15 minutos

0,0341 0,0666 3.0-veces

Humedo a los 30 minutos

0,0131 0,0264 7.6-veces

Secado post-30 minutos

0,0130 0,0242 8.3-veces

f Expresado como concentracion minima detectable (MDC) y limite de deteccion confiable (RDL)

El lfmite de deteccion (RDL) para el actual dispositivo Directigen™ EZ Gripe A es de aproximadamente 0,5X de

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concentracion de virus de Gripe A por lectura visual, y aproximadamente 0,2X por lectura con reflectometro. Como se muestra en la Tabla 4, el dispositivo de prueba basado en cartucho que utiliza nanopartfculas informadoras Oxonica Nanoplex™ proporciona un aumento marcado en la sensibilidad con respecto al dispositivo Directigen™ EZ Gripe A actual.

Ejemplo 6

En este ejemplo, se comparo la sensibilidad analttica de un prototipo de prueba Flu A de flujo lateral utilizando nanopartfculas de oro recubiertas con sflice Oxonica Nanoplex™, frente a la sensibilidad analttica del producto comercial BD Directigen™ EZ Flu A+B lefdo con un reflectometro. Las partfculas de Oxonica teman un diametro de nucleo de oro de aproximadamente 60 nm, una molecula informadora Raman 4,4'-dipiridilo unida a la superficie de oro, y un espesor de cubierta de sflice de aproximadamente 35 nm. En este ejemplo, se estimo que la cantidad de nanopartfculas de SERS por dispositivo de flujo lateral era ligeramente menor que la cantidad de partfculas de coloide de oro en el producto comercial. Los anticuerpos de captura y deteccion fueron los mismos para el producto comercial BD Directigen™ EZ Flu A+B y el dispositivo basado en nanopartfculas Oxonica Nanoplex™.

Al igual que en el ejemplo 5, las muestras de aspiracion nasofarmgea pediatricas que daban negativo para el virus de la gripe A fueron atacadas con cantidades conocidas de virus de gripe A vivo. Se ensamblaron prototipos optimizados como se describe en el ejemplo 5, y se realizo la extraccion de muestras de acuerdo con el inserto del paquete BD Directigen™ EZ Flu A. Todos los dispositivos (prototipos basados en SERS y BD Directigen™ EZ Flu A+B) se leyeron 15 minutos despues de la aplicacion de la muestra en un reflectometro Hamamatsu (modelo C10066). La figura 2 muestra la senal de reflectancia en funcion de la concentracion de virus vivo para ambos formatos de ensayo, y la Tabla 5 muestra la senal del reflectometro obtenida a la concentracion de virus de prueba mas alta (0,25X) junto con el lfmite de deteccion confiable (RDL) para los ensayos. En este experimento, los dispositivos que usan las nanopartfculas de SERS dieron sensibilidad a mejorada 7 veces y brillo mejorado 8 veces aproximadamente en comparacion con BD Directigen™ EZ Flu A+B lefdo con un reflectometro.

Tabla 5

Prototipo (usando particulas Nanoplex™ SERS) BD Directigen™ EZ A+B (usando coloide de oro)

RDL (unidades arbitrarias)

0,027x 0,185x

Intensidad de la senal de reflectancia a 0,25x (Unidades arbitrarias)

0,419 0,054

Claims (12)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de determinacion de la presencia o ausencia de un analito en una muestra Kquida, que comprende:

   (a) proporcionar un dispositivo de prueba para determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra Ifquida, que comprende:

   (i) un miembro receptor de muestra;

   (ii) un vetnculo en comunicacion de fluido con el miembro receptor de muestra;

   (iii) un reactivo marcado que es movil en el vetnculo en presencia de la muestra lfquida, comprendiendo el reactivo marcado un ligando que se une al analito y una nanopartfcula recubierta que consiste en multiples nucleos metalicos y una cubierta que tiene el ligando unido al mismo, en el que la cubierta comprende vidrio, un material ceramico tal como perovskita y ZrO2, o un polfmero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartfcula, y en el que la nanopartfcula recubierta no incluye una molecula activa en Raman; y

   (iv) un reactivo de enlace efectivo para capturar el analito, cuando esta presente, inmovilizado en una zona de deteccion definida del vetnculo;

   (b) poner en contacto la muestra lfquida con el miembro receptor de muestra del dispositivo de prueba;

   (c) permitir que la muestra lfquida aplicada al miembro receptor de muestra movilice dicho reactivo marcado de manera que la muestra lfquida y el reactivo marcado se muevan a lo largo de la longitud del vetnculo para pasar a la zona de deteccion;

   (d) detectar la presencia del reactivo marcado en la zona de deteccion midiendo la reflectancia, en el que la deteccion del reactivo marcado en la zona de deteccion es indicativa de la presencia de analito en la muestra lfquida y el fallo en detectar la presencia del reactivo marcado en la zona de deteccion es indicativo de la ausencia del analito en la muestra lfquida.
2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que

   (i) el vetnculo comprende nitrocelulosa, plastico o vidrio, preferiblemente el vetnculo comprende nitrocelulosa; o

   (ii) el analito es una protema, acido nucleico, metabolito, molecula pequena, virus o bacteria; o

   (iii) el dispositivo de prueba comprende ademas una almohadilla absorbente en comunicacion de fluido con la zona de deteccion; o

   (iv) el dispositivo de prueba comprende ademas una zona de control en comunicacion de fluido con la zona de deteccion; o

   (v) la presencia del analito en la muestra lfquida se determina cuantitativamente; o

   (vi) el dispositivo de prueba esta configurado para detectar multiples analitos, preferiblemente el dispositivo de prueba comprende ademas al menos dos reactivos marcados diferentes, en el que los ligandos de los reactivos marcados se unen a diferentes analitos, y al menos dos zonas de deteccion para detectar cada uno de los al menos dos reactivos marcados diferentes.
3. 3. Un procedimiento de determinacion de la presencia o ausencia de un analito en una muestra lfquida, que comprende:

   a) proporcionar un dispositivo de prueba que comprende: (i) un miembro receptor de muestra; (ii) un vetnculo en comunicacion de fluido con el miembro receptor de muestra; y (iii) un reactivo de enlace efectivo para capturar el analito, cuando esta presente, inmovilizado en una zona de deteccion definida del vetnculo;

   b) mezclar la muestra lfquida con un reactivo marcado que comprende un ligando que se une al analito y una nanopartfcula recubierta que consiste en multiples nucleos metalicos y una cubierta que tiene el ligando unido a la misma, en el que la cubierta comprende vidrio, un material ceramico tal como perovskita y ZrO2, o un polfmero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartfcula, en el que la nanopartfcula recubierta no incluye una molecula activa en Raman;

   c) poner en contacto la mezcla de b) con el miembro receptor de muestra del dispositivo de prueba;

   d) permitir que la mezcla de b) aplicada al miembro receptor de muestra se mueva a lo largo de la longitud del vetnculo para pasar a la zona de deteccion;

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   e) detectar la presencia del reactivo marcado en la zona de deteccion midiendo la reflectancia, en el que la deteccion del reactivo marcado en la zona de deteccion es indicativa de la presencia de analito en la muestra lfquida y el fallo en detectar la presencia del reactivo marcado en la zona de deteccion es indicativo de la ausencia del analito en la muestra lfquida.
4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 1 o 3, en el que

   (i) se usa un lector de reflectancia para detectar el reactivo marcado en la zona de deteccion; o

   (ii) la presencia de analito en la muestra lfquida se determina cuantitativamente; o

   (iii) el procedimiento detecta multiples analitos en la muestra lfquida, preferiblemente el dispositivo de prueba comprende ademas al menos dos reactivos marcados diferentes, en donde los ligandos de los reactivos marcados se unen a diferentes analitos y al menos dos zonas de deteccion para detectar cada uno de los al menos dos reactivos marcados diferentes; o

   (iv) los nucleos metalicos de la nanopartfcula son nucleos de oro.
5. 5. Un procedimiento de determinacion de la presencia o ausencia de un analito en una muestra lfquida usando un kit para realizar una prueba analttica de flujo continuo para detectar la presencia o ausencia de un analito en una muestra lfquida por reflectometna, comprendiendo dicho kit:

   (i) un dispositivo de prueba que comprende una membrana porosa que comprende una superficie superior y una superficie inferior y un reactivo de enlace efectivo para capturar el analito, cuando esta presente en la muestra lfquida, unido a la superficie superior o inferior de la membrana porosa; y

   (ii) un reactivo marcado que comprende un ligando que se une al analito y una nanopartfcula recubierta que consiste en multiples nucleos metalicos y una cubierta que tiene el ligando unido a la misma, en el que la cubierta comprende vidrio, un material ceramico tal como perovskita y ZrO2, o un polfmero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartfcula, en el que la nanopartfcula recubierta no incluye una molecula activa en Raman,

   comprendiendo dicho procedimiento:

   (a) poner en contacto la muestra lfquida con la superficie superior de la membrana porosa;

   (b) permitir que la muestra lfquida fluya a traves de la membrana porosa de tal manera que al menos una parte del analito, cuando esta presente en la muestra lfquida, se una al reactivo de enlace;

   (c) poner en contacto el reactivo marcado con la superficie superior de la membrana porosa;

   (d) dejar que el reactivo marcado fluya a traves de la membrana porosa de tal manera que al menos una parte del reactivo marcado se una al analito; y

   (e) detectar la presencia del reactivo marcado en la membrana porosa midiendo la reflectancia, en el que la deteccion del reactivo marcado sobre la membrana porosa es indicativa de la presencia del analito en la muestra lfquida y el fallo en detectar la presencia del reactivo marcado sobre la membrana porosa es indicativo de la ausencia del analito en la muestra lfquida.
6. 6. Un procedimiento de determinacion de la presencia o ausencia de un analito en una muestra lfquida usando un kit para realizar una prueba analttica de flujo continuo para detectar la presencia o ausencia de un analito en una muestra lfquida por reflectometna, comprendiendo dicho kit:

   (i) un dispositivo de prueba que comprende una membrana porosa que comprende una superficie superior y una superficie inferior y un reactivo de enlace efectivo para capturar el analito, cuando esta presente en la muestra lfquida, unido a la superficie superior o inferior de la membrana porosa; y

   (ii) un reactivo marcado que comprende un ligando que se une al analito y una nanopartfcula recubierta que consiste en multiples nucleos metalicos y una cubierta que tiene el ligando unido a la misma, en el que la cubierta comprende vidrio, un material ceramico tal como perovskita y ZrO2, o un polfmero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartfcula, en el que la nanopartfcula recubierta no incluye una molecula activa en Raman,

   comprendiendo dicho procedimiento:

   (a) mezclar la muestra lfquida con el reactivo marcado de manera que el analito, cuando esta presente en la muestra lfquida, se una al reactivo marcado;

   (b) poner en contacto la mezcla de (a) con la superficie superior de la membrana porosa;

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   (c) permitir que la mezcla de (a) fluya a traves de la membrana porosa de tal manera que al menos una porcion del analito unido al reactivo marcado se una al reactivo de enlace; y

   (d) detectar la presencia del reactivo marcado en la membrana porosa midiendo la reflectancia, en el que la deteccion del reactivo marcado en la membrana porosa es indicativa de la presencia de analito en la muestra lfquida y el fallo en detectar la presencia del reactivo marcado sobre la membrana porosa es indicativo de la ausencia del analito en la muestra lfquida.
7. 7. El procedimiento de la reivindicacion 5 o 6, en el que

   (i) se usa un lector de reflectancia para detectar el reactivo marcado en la membrana porosa; o

   (ii) la presencia de analito en la muestra lfquida se determina cuantitativamente; o

   (iii) el procedimiento detecta multiples analitos en la muestra lfquida, preferiblemente el dispositivo de prueba comprende ademas al menos dos reactivos marcados diferentes, en el que los ligandos de los reactivos marcados se unen a diferentes analitos y al menos dos zonas de deteccion para detectar cada uno de los al menos dos reactivos marcados diferentes; o

   (iv) los nucleos metalicos de la nanopartfcula son nucleos de oro.
8. 8. El procedimiento de la reivindicacion 5 o 6, en el que en el kit:

   (i) el analito es una protema, acido nucleico, metabolito, molecula pequena, virus o bacteria; o

   (ii) el dispositivo de prueba comprende ademas una almohadilla absorbente, en el que la superficie inferior de la membrana porosa y la almohadilla absorbente estan en contacto ffsico y en comunicacion de fluido y en el que el reactivo de enlace esta unido a la superficie superior de la membrana porosa; o

   (iii) el dispositivo de prueba comprende ademas un alojamiento para la membrana porosa; o

   (iv) se determina cuantitativamente la presencia de analito en la muestra lfquida; o

   v) el dispositivo de prueba esta configurado para detectar multiples analitos, preferiblemente el dispositivo de prueba comprende ademas al menos dos reactivos marcados diferentes, en el que los ligandos de los reactivos marcados se unen a diferentes analitos y al menos dos zonas de deteccion para detectar cada uno de los al menos dos reactivos marcados diferentes.
9. 9. Un sistema que comprende

   (I) un dispositivo de prueba para determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra lfquida, que comprende:

   (i) un miembro receptor de muestra;

   (ii) un vehmulo en comunicacion de fluido con el miembro receptor de muestra;

   (iii) un reactivo marcado que es movil en el vehmulo en presencia de la muestra lfquida, comprendiendo el reactivo marcado un ligando que se une al analito y una nanopartmula recubierta que consiste en multiples nucleos metalicos y una cubierta que tiene el ligando unido a la misma, en el que la cubierta comprende vidrio, un material ceramico tal como perovskita y ZrO2, o un polfmero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartmula, y en el que la nanopartmula recubierta no incluye una molecula activa en Raman; y

   (iv) un reactivo de enlace efectivo para capturar el analito, cuando esta presente, inmovilizado en una zona de deteccion definida del vehmulo; en el que la muestra lfquida aplicada al miembro receptor de muestra moviliza el reactivo marcado de tal manera que la muestra y el reactivo marcado se transportan a lo largo de la longitud del vefuculo para pasar a la zona de deteccion y en el que la deteccion del reactivo marcado en la zona de deteccion es indicativa de la presencia de analito en la muestra lfquida, y

   (II) un reflectometro adaptado para detectar la presencia del reactivo marcado en el dispositivo de prueba.
10. 10. El sistema de la reivindicacion 9, en el que en el dispositivo de prueba

    (i) el vehmulo comprende nitrocelulosa, plastico o vidrio, preferiblemente el vehmulo comprende nitrocelulosa; o

    (ii) el analito es una protema, acido nucleico, metabolito, molecula pequena, virus o bacteria; o

    (iii) el dispositivo de prueba comprende ademas una almohadilla absorbente en comunicacion de fluido con la zona de deteccion; o

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    (iv) el dispositivo de prueba comprende ademas una zona de control en comunicacion de fluido con la zona de deteccion; o

    (v) la presencia del analito en la muestra lfquida se determina cuantitativamente; o

    (vi) el dispositivo de prueba esta configurado para detectar multiples analitos, preferiblemente el dispositivo de prueba comprende ademas al menos dos reactivos marcados diferentes, en el que los ligandos de los reactivos marcados se unen a diferentes analitos, y al menos dos zonas de deteccion para detectar cada uno de los al menos dos reactivos marcados diferentes; o

    (vii) los nucleos metalicos de la nanopartfcula son nucleos de oro.
11. 11. Un sistema que comprende

    (I) un kit para realizar una prueba analftica de flujo continuo para la deteccion de la presencia o ausencia de un analito en una muestra lfquida por reflectometna, que comprende:

    (i) un dispositivo de prueba que comprende una membrana porosa que comprende una superficie superior y una superficie inferior y un reactivo de enlace efectivo para capturar el analito, cuando esta presente en la muestra lfquida, unido a la superficie superior o inferior de la membrana porosa; y

    (ii) un reactivo marcado que comprende un ligando que se une al analito y una nanopartfcula recubierta que consiste en multiples nucleos de metal y una cubierta que tiene el ligando unido a la misma, en el que la cubierta comprende vidrio, un material ceramico tal como perovskita y ZrO2, o un polfmero tal como polietilenglicol, polimetilmetacrilato y poliestireno, y aumenta la reflectancia de la nanopartfcula, en el que la nanopartfcula recubierta no incluye una molecula activa en Raman, y

    (II) un reflectometro adaptado para detectar la presencia del reactivo marcado en el dispositivo de prueba.
12. 12. El sistema de la reivindicacion 11, en el que en el kit

    (i) el analito es una protema, acido nucleico, metabolito, molecula pequena, virus o bacteria; o

    (ii) el dispositivo de prueba comprende ademas una almohadilla absorbente, en el que la superficie inferior de la membrana porosa y la almohadilla absorbente estan en contacto ffsico y en comunicacion de fluido y en la que el reactivo de enlace esta unido a la superficie superior de la membrana porosa; o

    (iii) el dispositivo de prueba comprende ademas un alojamiento para la membrana porosa; o

    (iv) se determina cuantitativamente la presencia de analito en la muestra lfquida; o

    (v) el dispositivo de prueba esta configurado para detectar multiples analitos, preferiblemente el dispositivo de prueba comprende ademas al menos dos reactivos marcados diferentes, en el que los ligandos de los reactivos marcados se unen a diferentes analitos y al menos dos zonas de deteccion para detectar cada uno de los al menos dos reactivos marcados diferentes; o

    (vii) los nucleos metalicos de la nanopartfcula son nucleos de oro.