CN102016585A - 使用包被的纳米颗粒的灵敏的免疫测定 - Google Patents

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Abstract

提供了包含由增加纳米颗粒的反射率的壳包围的核心的包被的纳米颗粒，其中包被的纳米颗粒不包含拉曼活性分子。提供了利用包被的纳米颗粒的测试装置和免疫测定方法。

Description

使用包被的纳米颗粒的灵敏的免疫测定
相关申请
本申请要求对2008年4月9日提交的美国临时申请案61/071,035的优先权，所述临时申请案通过引用合并入本文。
领域
提供了包被的纳米颗粒，其包含由增加纳米颗粒的反射率的壳包围的核心，其中包被的纳米颗粒不必，但任选地可包含拉曼活性分子(Raman-active molecule)。本文中公开的包被的纳米颗粒可用于定量和/或定性测定液体样品中分析物的存在或不存在的测试装置和方法。
背景
免疫测定技术提供了用于确定分析物在生物学样品中的存在或不存在的简单和相对快速的方法。免疫测定诊断测试提供的信息对于病人的医疗护理通常是至关重要的。通常进行测定以定性或定量检测特定分析物(例如当人受试者具有特定疾病或状况时存在的抗体)的存在。本领域内实施的免疫测定非常多，包括用于疾病(例如由细菌或病毒引起的感染)或状况(例如怀孕)的测定。
各种类型的免疫测定在本领域内是已知的。免疫测定法的一个类型是侧流免疫测定(lateral flow immunoassay)。侧流免疫测定利用固体支持物例如硝酸纤维素、塑料或玻璃进行分析物的检测。不同于使样品垂直通过支持物(如在“流动通过(flow-through)”测定的情况下)，通过毛细管作用和其他力，允许样品沿着支持物在表面上从加样区(application zone)侧流至反应区。在侧流测定中，捕获抗体以条带的形式分布在固体支持物上。将检测抗体缀合至提供可检测的信号的检测分子。将液体样品与检测抗体接触，让样品/检测抗体混合物沿着固体支持物流动。如果分析物存在，则在固体支持物上在捕获抗体分布的位置上形成“夹心”复合物。然后通过目视或使用仪器检测来自定位在捕获线上的检测分子的信号。侧流测定可设计用于检测目的蛋白质、核酸、代谢物、细胞、小分子或其他分析物。
另一个免疫测定形式是流动通过免疫测定。流动通过免疫测定通常使用其上覆有或其中已整合了包含试剂的基质的多孔材料。将测试样品施加于并且流动通过多孔材料，样品中的分析物与试剂反应，从而在多孔材料上产生可检测的信号。通常将此类装置封装在具有刻度的塑料壳(plastic housing)或塑料盒(plastic casing)中以帮助检测特定分析物。
可用于侧流免疫测定的不同类型的检测分子的许多实例在本领域中是已知的，例如荧光团、胶体金、标记胶乳颗粒和纳米颗粒例如量子点或表面增强拉曼散射(“SERS”)纳米颗粒。例如，美国专利5,591,645描述了在不使用仪器的情况下可看到的可见“示踪”分子例如胶体金的用途。此外，属于Natan的美国专利6,514,767公开了SERS活性复合纳米颗粒(SACN)，其包括表面附着或结合了一个或多个拉曼活性分子并且被包括聚合物、玻璃或任何其他绝缘体材料的壳包裹的金属纳米颗粒。美国专利5,714,389描述了侧流免疫测定法和使用有色颗粒(其可以是金属胶体，优选胶体金)的测试装置。类似地，美国专利7,109,042描述了使用直接标记例如金溶胶和染料溶胶的侧流免疫测定装置，所述直接标记允许产生即时分析结果而无需加入另外的试剂来产生可检测的信号。
SERS是用于进行化学分析，允许检测单个分子的最灵敏的方法之一。参见Nie，S.和S.R.Emory，″Probing Single Molecules and Single Nanoparticles by Surface Enhanced Raman Scattering″，Science，275，1102(1997)。拉曼光谱，与红外光谱相似，包括相应于分子振动(其对于被分析的样品(分析物)是特异的)的波段的波长分布。在拉曼光谱法的实践中，来自光源(通常激光器)的光束聚焦在样品上，从而产生非弹性散射辐射，其可通常光学方法收集并且被导入其中检测器将碰撞光子的能量转化成电信号强度的波长色散光谱仪(wavelength-dispersive spectrometer)或傅里叶变换分光仪(Fourier transform spectrometer)。
入射辐射至非弹性散射辐射的极低的转化使拉曼光谱法限制于难以通过红外光谱法进行的应用，例如水溶液的分析。然而，在1974年发现，当将与粗糙的银电极紧邻的分子经历拉曼激发源时，产生的信号的强度增加多达6个数量级。(Fleischmann，M.，Hendra，P.J.，和McQuillan，A.J.，″Raman Spectra of Pyridine Adsorbed at aSilver Electrode，″Chem.Phys.Lett，26，123，(1974)，和Weaver，M.J.，Farquharson，S.，Tadayyoni，M.A.，″Surface-enhancementfactors for Raman scattering at silver electrodes.Role ofadsorbate-surface interactions and electrode structure，″J.Chem.Phys.，82，48674874(1985))。简而言之，入射激光光子与被颗粒表面限制的金属内的游离导电电子耦合，共同引起电子云共振。所得的表面等离子体场为能量转移至场内分子的分子振动模提供了有效途径，从而产生拉曼光子。
SERS纳米颗粒已在侧流免疫测定中被用作检测分子。例如，Oxonica(Kidlington，UK)已开发了用于此类测定的NanoplexTM纳米颗粒。纳米颗粒包含其上吸附了能够产生表面增强拉曼光谱信号的拉曼报道分子的金纳米颗粒核心。用大约10至50nm厚的二氧化硅壳包被拉曼标记的金纳米颗粒。二氧化硅壳保护报道分子免于从表面解吸附，防止相邻金颗粒之间的等离子体-等离子体相互作用，并且也防止从溶液的成分产生SERS信号。在美国专利申请公开案2007/0165219中描述了用聚合物涂层替代二氧化硅涂层的SERS纳米颗粒。
虽然利用了SERS的高灵敏度，但检测从SERS纳米颗粒产生的信号需要使用能够检测拉曼信号的仪器。在一些情况下将这样的纳米颗粒用于侧流免疫测定可能是有利的，所述纳米颗粒具有可能与SERS纳米颗粒相当的增加的灵敏度，但只需要相对简单和便宜的反射率(reflectance)读数器技术来进行检测。
概述
本发明提供了用于定性或定量测定分析物在生物学样品中的存在或不存在的快速且精确的方法和进行此类方法的装置和试剂。
本发明者已发现，在侧流或垂直流动通过免疫测定中用作检测分子的包被的纳米颗粒，当使用反射率读数器测读测定时，提供了优于检测分子例如胶体金的显著测定灵敏度。
在某些实施方案中，本发明是包含核心和增加纳米颗粒的反射率的壳的包被的纳米颗粒，其中包被的纳米颗粒不包含拉曼活性分子。在其他实施方案中，包被的纳米颗粒包含拉曼活性分子。核心可以是，例如但不限于金属，例如展示等离子体共振的金属，例如金。
在一些实施方案中，壳包含二氧化硅，然而在其他实施方案中，壳是另一种陶瓷材料，例如另一种氧化物，并且在另外的实施方案中壳包含聚合物。聚合物可以是，例如但不限于聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯或聚苯乙烯。壳可以完全或不完全地包围核心。
可以以许多种具有不同尺寸的形状(包括但不限于球状体、杆状体、圆盘、锥体、立方体、圆柱体等)中的任一种形成本发明的包被的纳米颗粒。在某些实施方案中，包被的纳米颗粒具有至少一个在大约1nm至大约1000nm的范围内的尺寸。在其他实施方案中，包被的纳米颗粒的核心是球形。在一些情况下，核心的直径为大约10至100nm，然而在其他实施方案中，核心的直径为大约20至60nm。在一些实施方案中，纳米颗粒包括多核聚集体(multi-core aggregate)，例如但不限于双联体(doublet)。
在某些实施方案中，修饰纳米颗粒的壳以允许分子缀合至纳米颗粒的表面。在特定的实施方案中，修饰将巯基引入至包被的纳米颗粒的表面上。在其他实施方案中，通过巯基将配体(例如但不限于抗体)缀合至包被的纳米颗粒的壳。
配体可结合可能存在于或可能不存在于样品中的任何目的分析物。在某些实施方案中，配体是结合对于甲型流感病毒或乙型流感病毒是特异的蛋白质的抗体。
在某些其他实施方案中，本发明是基本上由核心和壳(所述壳增加纳米颗粒的反射率)以及结合至壳的表面的配体组成的包被的纳米颗粒。
在其他实施方案中，本发明是用于确定分析物在液体样品中存在或不存在的测试装置，其包括：(a)样品接受部件；(b)与样品接受部件流体连通的载体；(c)在液体样品存在的情况下可在载体中流动的标记试剂，该标记试剂包含结合分析物的配体和包被的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含核心和增加其上附着配体的纳米颗粒的反射率的壳，其中包被的纳米颗粒不包含拉曼活性分子；和(d)固定在载体的确定的检测区中的有效地捕获分析物(当存在时)的结合剂；其中施加至样品接受部件的液体样品使标记试剂移动以便样品和标记试剂沿着载体的长度方向进入检测区，并且其中在检测区中检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中。
在某些实施方案中，用于测试装置的标记试剂包含结合分析物的配体和基本上由核心和壳组成的包被的纳米颗粒，所述壳增加其上附着配体的纳米颗粒的反射率，其中所述配体结合至壳的表面。
在某些实施方案中，载体是，例如但不限于硝酸纤维素、塑料或玻璃。在其他实施方案中，测试装置还包括吸收垫(absorbent pad)和/或与检测区流体连通的对照区(control zone)。
本发明的测试装置可用于定性或定量检测任何目的分析物(例如但不限于蛋白质、核酸、代谢物、小分子、病毒或细菌)的存在或不存在。在某些实施方案中，测试装置可用于利用至少两种不同的标记试剂和至少两个检测区(其用于检测至少两种不同的标记试剂的每一种)检测液体样品中的多种分析物，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
在某些实施方案中，本发明是包括本发明的测试装置和适合于检测标记试剂在测试装置中的存在的反射计的系统。
在某些实施方案中，本发明是确定分析物在液体样品存在或不存在的方法，其包括：
a)提供本发明的测试装置；
b)将液体样品与测试装置的样品接受部件接触；
c)让施加至样品接受部件的液体样品使所述标记试剂移动以便液体样品与标记试剂沿着载体的长度方向移动进入检测区；
d)通过测量反射率检测标记试剂在检测区中的存在，其中在检测区中检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中，在检测区中未能检测到标记试剂的存在表示分析物不存在于液体样品中。
在其他实施方案中，本发明是用于确定分析物在液体样品中存在或不存在的方法，其包括：
a)提供测试装置，其包括：(i)样品接受部件；(ii)与样品接受部件流体连通的载体；和(iii)固定在载体的确定的检测区中的有效地捕获分析物(当存在时)的结合剂；
b)将液体样品与包含结合分析物的配体和包被的纳米颗粒的标记试剂混合，所述纳米颗粒包含核心和增加其上附着配体的纳米颗粒的反射率的壳，其中包被的纳米颗粒不包含拉曼活性分子；
c)将b)的混合物与测试装置的样品接受部件接触；
d)让施加至样品接受部件的b)的混合物沿着载体的长度方向移动进入检测区；
e)通过测量反射率检测标记试剂在检测区中的存在，其中在检测区中检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中，并且在检测区中未能检测到标记试剂的存在表示分析物不存在于液体样品中。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的标记试剂包含结合分析物的配体和包被的纳米颗粒，所述纳米颗粒基本上由核心和增加其上附着配体的纳米颗粒的反射率的壳组成，其中所述配体结合至壳的表面。在其他实施方案，用于本发明的方法的标记试剂包含结合分析物的配体和包被的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含核心、附着至核心并且能够通过表面增强拉曼散射产生信号的分子以及包围核心和其上附着配体的分子的壳。
在一些实施方案中，将反射率读数器用于检测检测区中的标记试剂，在其他实施方案种，通过目视确定检测区中标记试剂的检测。在一些实施方案中，定量检测分析物，在其他实施方案中，定性检测分析物。在一些实施方案中，本发明的方法可用于利用至少两种不同的标记试剂和至少两个检测区(其用于检测至少两种不同的标记试剂的每一种)检测液体样品中的多个分析物，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
在其他实施方案中，本发明是用于进行流动通过分析测试的试剂盒，所述测试通过反射计法检测分析物在液体样品中的存在或不存在，所述试剂盒包括：(a)包括多孔膜(其包括上表面和下表面)和附着至多孔膜的上表面或下表面的有效地捕获分析物(当存在于液体样品中时)的结合剂的测试装置；和(b)标记试剂，其包含结合分析物的配体和包被的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含核心和增加纳米颗粒的反射率的壳，其中包被的纳米颗粒不包含拉曼活性分子。
在某些实施方案中，用于本发明的试剂盒的标记试剂包含结合分析物的配体和包被的纳米颗粒，所述纳米颗粒基本上由核心和增加其上附着配体的纳米颗粒的反射率的壳组成，其中所述配体结合至壳的表面。在其他实施方案中，用于本发明的试剂盒的标记试剂包含结合分析物的配体和包被的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含核心、附着至核心并且能够通过表面增强拉曼散射产生信号的分子以及包围核心和其上附着配体的分子的壳。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的测试装置还包括吸收垫，其中多孔膜的下表面和吸收垫物理接触并且流体连通，其中结合剂附着至多孔膜的上表面。在其他实施方案中，本发明的试剂盒的测试装置还包括用于多孔膜的外壳。
本发明的试剂盒可用于定性或定量检测任何目的分析物例如但不限于蛋白质、核酸、代谢物、小分子、病毒或细菌的存在或不存在。在某些实施方案中，试剂盒可用于利用至少两种不同的标记试剂和至少两个检测区(用于检测至少两种不同的标记试剂的每一种)检测液体样品中的多个分析物，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
在某些实施方案中，本发明是包括本发明的试剂盒的测试装置和适合于检测标记试剂在测试装置中的存在的反射计的系统
在其他实施方案中，本发明是使用本发明的试剂盒确定分析物在液体样品中的存在或不存在的方法，所述方法包括：(a)将液体样品与多孔膜的上表面接触；(b)让液体样品流动通过多孔膜以便至少一部分分析物(当存在于液体样品中时)与结合剂结合；(c)将标记试剂与多孔膜的上表面接触；(d)让标记试剂流动通过多孔膜以便至少一部分标记试剂结合分析物；和(e)通过测量反射率检测标记试剂在多孔膜上的存在，其中在多孔膜上检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中，在多孔膜上未能检测到标记试剂的存在表示分析物不存在于液体样品中。
在其他实施方案中，本发明是使用本发明的试剂盒确定分析物在液体样品中的存在或不存在的方法，所述方法包括：(a)将液体样品与标记试剂混合以便分析物(当存在于液体样品中时)结合标记试剂；(b)将(a)的混合物与多孔膜的上表面接触；(c)让(a)的混合物流动通过多孔膜以便至少一部分与标记试剂结合的分析物与结合剂结合；和(d)通过测量反射率检测标记试剂在多孔膜上的存在，其中在多孔膜上检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中，在多孔膜上未能检测到标记试剂的存在表示分析物不存在于液体样品中。
在一些实施方案中，将反射率读数器用于检测检测区中的标记试剂，然而在其他实施方案中，通过目视确定检测区中标记试剂的检测。在一些实施方案中，定量检测分析，在其他实施方案中，定性检测分析物。在一些实施方案中，本发明的方法可用于利用至少两种不同的标记试剂和至少两个检测区(用于检测至少两种不同的标记试剂的每一种)检测液体样品中的多个分析物，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
附图概述
图1显示当使用反射计测量时甲型流感病毒的侧流测试的结果，所述测试比较胶体金与二氧化硅包被的金纳米颗粒的灵敏度。如图中所看到的，与胶体金相比较，对于二氧化硅包被的金纳米颗粒观察到更强的响应。
图2显示甲型流感病毒的侧流测试的结果，所述测试用于比较当使用反射计测读两个装置时，使用二氧化硅包被的金纳米颗粒的原型(prototype)装置的灵敏度(图2A)与商业产品BD DirectigenTMEZA+B的灵敏度(图2B)。当使用反射计测读时，使用二氧化硅包被的金纳米颗粒的装置比BD DirectigenTMEZ A+B灵敏大约6倍。
某些实施方案的详述
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的意义相同的意义。虽然可在权利要求的实施中使用与本文中描述的方法和材料相似或等价的方法和材料，但合适的方法和材料描述于下文中。本文中提及的所有公开案、专利申请、专利和其他参考资料以它们的全文通过引用合并入本文。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例只是举例说明性的而不意欲是限定性的。
在本申请中，除非另外明确地指出，否则使用的单数包括复数。在本申请中，除非另外指出，否则使用的“或”意指“和/或”。在多项从属权利要求的情况下，使用的“或”指择一地引用多于一个的在前的独立权利要求或从属权利要求要求。此外，使用的术语“包括”以及其他形式例如“包含”和“含有”不是限定性的。同样地，除非另外明确地声明，否则术语例如“元素”或“成分”包括包含1个单位的元素和成分以及包含多于一个亚单位的元素和成分。
根据下列详细描述和权利要求，其他特征和有利方面将变得显然。
为了可更易于理解本申请，首先定义某些术语。另外的定义示于整个详细的说明书中。
术语“纳米颗粒”，如本文中所使用的，是指包含至少一个核心和具有一个在大约1至大约1000纳米(“nm”)的范围内的尺寸的壳的颗粒。本发明的纳米颗粒可以是任何形状。在某些实施方案中，纳米颗粒是球状的。本发明的纳米颗粒通常不包含，但可包含拉曼活性分子，在某些实施方案中，纳米颗粒可包含多个核心和一个壳。
如本文中所使用的，术语“核心”是指本发明的纳米颗粒的内部部分。在某些实施方案中，核心是金属，例如但不限于金。
本发明的纳米颗粒还包含增强纳米颗粒的反射率的壳。壳可完全封闭核心或不完全封闭核心。壳可由任何材料或材料的组合组成，只要其具有增强纳米颗粒的反射率的性质。例如，在一些实施方案中，壳可包含在需要的光谱范围内是透明的任何材料。在某些实施方案中，壳包含二氧化硅，即，玻璃。在其他实施方案中，壳包含另一种陶瓷材料，例如但不限于，具有高折射率(refractive index)的透明陶瓷，例如钙钛矿和ZrO2。在其他实施方案中，壳由聚合物组成。在特定的实施方案中，聚合物包括聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯或聚苯乙烯。在一些实施方案中，处理或衍生形成壳的材料以允许将配体附着至纳米颗粒的表面。聚合物的最佳选择可取决于将被固定在纳米颗粒的表面上的配体。
当提及壳时，短语“增加纳米颗粒的反射率”意指当在例如侧流免疫测定中通过反射计测量时，与无壳的纳米颗粒相比较，壳的存在导致纳米颗粒提供增加的信号或灵敏度。不受理论束缚，包围核心的壳的存在可直接导致颗粒反射更多的光。备选地，或此外，与被动地吸附至核心的表面上相比，当结合至壳材料时，结合至壳表面的配体可更好地被定向以参与结合反应。
如本文中所使用的，“配体”意指可结合目的分析物的任何类型的分子。例如但不限于，在某些实施方案中配体是抗体、抗原、受体、核酸或酶。
本文中使用的术语“分析物”是指人们可能想要使用本发明进行检测的任何目的物质，包括但不限于药物，包括治疗性药物和滥用药；激素；维生素；蛋白质，包括所有种类的抗体；肽；类固醇；细菌；真菌；病毒；寄生虫；细菌、真菌、病毒或寄生虫的组分或产物；所有类型的变应原；正常或恶性细胞的产物或组分等。作为具体的实例，可提及人绒毛膜促性腺激素(hCG)；胰岛素；促黄体激素；引起各种疾病状态或与所述疾病状态相关的生物，例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A型)、单纯疱疹(Herpes Simplex)I和II型、巨细胞病毒、衣原体(Chlamydia)、风疹抗体、甲型和乙型流感等。在本发明的某些实施方案中，定性确定样品中分析物的存在或不存在。在其他实施方案中，定量测定样品中分析物的量或浓度。
本文中使用的术语“样品”是指可包含待检测的分析物的任何生物学样品。在一些实施方案中，生物学样品以液体形式存在，然而在其他实施方案中，其可被改变成液体形式。
本文中使用的术语“样品接受部件”意指与液体样品直接接触的测试装置的部分，即，其接受待就目的分析物进行检测的样品。样品接受部件可以是载体或多孔膜的部分或与载体或多孔膜分开。然后，液体样品可通过侧流或垂直流动从样品接受部件向检测区迁移。样品接受部件与分析物检测区通过液流接触。这可以是重叠连接、从上至下连接或首尾连接。在某些实施方案中，样品接受部件由多孔材料例如但不限于纸制成。
如本文中使用的，术语“载体”，例如用于侧流测定中的，是指能够提供液流的任何基质。这可包括例如，基质例如硝酸纤维素、硝酸纤维素与聚酯或纤维素的混合物、未经处理的纸、多孔纸、人造丝(rayon)、玻璃纤维、丙烯腈共聚物、塑料、玻璃或尼龙。基质可以是多孔的。通常，基质的孔具有足够的大小以便本发明的纳米颗粒流动通过整个载体。本领域技术人员知道允许液体流动的其他材料。载体可包含流体连通的一个或多个基质。例如，试剂区(reagent zone)和检测区可存在于相同基质(即，垫子)上或可存在于载体内分开的基质(即，垫子)上。
如本文中所使用的，“多孔膜”，例如流动通过测定中使用的，是指易于用水溶液湿润的并且具有足以允许本发明的包被的纳米颗粒通过的孔的任何材料的膜或滤器。合适的材料包括例如硝酸纤维素、硝酸纤维素与聚酯或纤维素的混合物、未经处理的纸、多孔纸、人造丝、玻璃纤维、丙烯腈共聚物、塑料、玻璃或尼龙。
如本文中所使用的，“吸收性材料”是指具有足以吸收基本上所有测定试剂液体和任何清洗溶液并且任选地起始毛细管作用和使测定液体通过测试装置的吸收能力的多孔材料。合适的材料包括例如硝酸纤维素、硝酸纤维素与聚酯或纤维素的混合物、未经处理的纸、多孔纸、人造丝、玻璃纤维、丙烯腈共聚物、塑料、玻璃或尼龙。
如本文中使用的，术语“侧流”是指沿着载体的平面的液流。一般地，侧流装置可包括能够通过毛细管作用即芯吸或层析作用运输溶液的材料的条带(或流体连通的几个条带)，其中条带中的不同区域或区包含扩散性或非扩散性结合的测定试剂(当溶液被运输至或通过此类区域时，所述测定试剂可产生可检测信号)。通常，此类测定包括适合于接受液体样品的加样区(application zone)、与加样区侧面相隔并且流体连通的试剂区以及与试剂区侧面相隔并且流体连通的检测区。试剂区可包含在液体中可移动的(mobile)并且能够与样品中的分析物和/或与检测区中结合的分子相互作用的化合物。检测区可包含固定在条带上的并且能够与分析物和/或试剂化合物相互作用以产生可检测信号的结合分子。此类测定可用于通过直接(夹心测定)或竞争性结合检测样品中的分析物。在属于Malick等人的美国专利6,194,220，属于Malick等人的5,998,221，属于Shuler等人的5,798,273和属于Rosenstein的RE 38,430中提供了侧流装置的实例。
在夹心侧流测定中，将可能包含或可能不包含目的分析物的液体样品施加至加样区并且通过毛细管作用让其进入试剂区。分析物(如果存在)与试剂区中的标记试剂相互作用，然后分析物-试剂复合物通过毛细管作用移动至检测区。分析物-试剂复合物通过与特异于分析物和/或试剂的结合分子相互作用而被捕获于检测区中。未结合的样品可通过毛细管作用移动通过检测区至与检测区侧面并排并且流体连通的吸收垫。然后可通过适当的方法在检测区中检测标记试剂。
在竞争性侧流测定中，将可能包含或可能不包含目的分析物的液体样品施加至加样区并且通过毛细管作用让其进入试剂区。试剂区包含标记试剂，其可以是分析物本身、其同源物或衍生物或当与检测区中固定的结合剂结合时能够模拟目的分析物的部分。标记试剂在液相中是可移动的并且通过毛细管作用与液体样品一起移动至检测区。液体样品中包含的分析物与标记试剂竞争对检测区中固定的结合剂的结合。未结合的样品可通过毛细管作用移动通过检测区至与检测区侧面并排并且流体连通的吸收垫。然后可通过合适的方法在检测区中检测标记试剂。可通过观察检测区来确定目的分析物的存在或不存在，其中存在于液体样品中的分析物的量越大，则检测区中结合的标记受体的量越少。
如本文中所使用的，术语“垂直流”和“流动通过”是指与载体的平面横切的液流。通常，流动通过装置可包括允许液体通过装置的膜或彼此相邻堆叠的膜层。层可包含扩散性或非扩散性结合的测定试剂，当溶液被运送穿过装置时所述测定试剂产生可检测信号。一般地，装置包含具有上表面和下表面的第一层(其中所述上表面适合于接受液体样品)和与第一层的下表面垂直并排并且流体连通的吸收层(其适合于吸引液体样品通过第一层)。第一层可包含附着至第一层的上表面的结合剂，其能够与样品中的分析物相互作用并且将分析物捕获在第一层的上表面上。在属于McFarland等人的美国专利4,920,046和属于Fletcher等人的7,052,831中提供了流动通过装置的实例。
在实施时，将可能包含或可能不包含目的分析物的液体样品施加至包含特异于目的分析物的结合剂的第一层的上表面。然后液体样品流过通过第一层并且进入吸收层。如果分析物存在于样品中，则其与结合剂相互作用，从而被捕获在第一层的上表面上。然后可按照常规免疫测定法用清洗溶液处理第一层。然后可用结合被结合剂捕获的分析物的标记试剂处理第一层。然后标记试剂流动通过第一层并且进入吸收层。可按照常规免疫测定法使用清洗溶液处理第一层。然后可通过适当的方法检测标记试剂。备选地，可在施加至第一层的上表面之前将液体样品与标记试剂混合。其他合适的变型对于本领域技术人员来说是已知的。
侧流测定和流动通过测定可用于检测样品中的多种分析物。例如，在侧流测定中，试剂区可包含多种标记试剂(每一种试剂能够结合(或模拟)液体样品中的不同分析物)，或能够结合(或模拟)多种分析物的单一标记试剂。备选地或此外，侧流测定中的检测区可包含多种结合分子(每一种结合分子能够结合液体样品中的不同分析物)或能够结合多种分析物的单一结合分子。在流动通过测定中，多孔膜可包含多种结合剂(每一种结合剂能够结合液体样品中的不同分析物)或能够结合多种分析物的单一结合剂。备选地，或此外，标记试剂的混合物可用于流动通过测定，每一种标记试剂设计用于结合液体样品中的不同分析物，或单一标记试剂设计用于结合多种分析物。如果多种标记试剂用于侧流或流动通过测定中，则可差异地标记试剂以区分液体样品中不同类型的分析物。
如本文中所使用的，术语“可移动的”意指扩散性或非扩散性地附着的或充满的(impregnated)。可移动的试剂能够随液体样品一起扩散并且在侧流或垂直流中由液体样品运载。
如本文中所使用的，术语“标记试剂”意指识别或结合目的分析物并且已将能够产生可通过目视或仪器装置检测的信号的物质附着至其的任何颗粒、蛋白质或分子，即本文中定义的包被的纳米颗粒。识别分析物的颗粒或分子可以是天然的或非天然的。在一些实施方案中，分子是单克隆或多克隆抗体。
如本文中所使用的，术语“结合剂”是指识别或结合所探询的分析物的任何颗粒或分子。结合剂能够与分析物-标记试剂复合物形成结合复合物。将结合剂固定至检测区中的载体或多孔膜的表面。由于被固定至载体或多孔膜，结合剂不受液体样品的侧流或垂直流的影响。颗粒或分子可以是天然的或非天然的(即合成的)。当结合剂结合分析物-标记试剂复合物时，其阻止分析物-标记试剂复合物继续跟随液体样品流动。
如本文中所使用的，“检测区”意指包含固定的结合剂的载体或多孔膜的部分。
术语“对照区”是指包括设计用于捕获标记试剂的结合分子的测试装置的一部分。在侧流测定中，对照区可以通过液流与载体的检测区接触，以便当液体样品通过毛细管作用被运输出检测区时将标记试剂捕获在对照区中。在流动通过测定中，对照区可以是多孔膜的分开的部分，这样可将标记试剂施加至多孔膜的加样部分和对照区。在对照区中检测到标记试剂确认测定对于其期望的目的是起作用的。
术语“外壳(housing)”是指用于本发明的测试装置的任何合适的外罩。示例性外壳对于本领域技术人员来说将是已知的。外壳可具有例如底座部分和盖子部分。盖子可包括顶壁和大体上垂直的侧壁。边缘可从顶壁向上突出。边缘可构造出凹陷轮廓，其中具有插入物，该插入物拥有至少两个与盖子上的至少两个其他开口对齐的开口，从而在外壳中形成至少两个孔。可构造外壳以确保两个或多个孔之间不存在连通。在属于Fletcher等人的美国专利7,052,831中提供了这样的外壳的实例。其他合适的外壳包括BD DirectigenTMEZ RSV侧流测定装置中使用的外壳。
如本文中所使用的，“反射率读数器”或“反射计”是指能够检测因包被的纳米颗粒存在于测试装置的检测区中而引起的反射率的变化的仪器。反射率读数器或反射计在本领域内是已知的。适合用于本发明的代表性仪器包括但不限于来自Hamamatsu的Immunochromato Reader C10066或来自ESE GmbH的ESE-Quant。最常见地利用装置的检测区域扫描检测区或在反射计的检测器上对其进行直接成像，从而产生反射率对空间坐标的描迹(trace)。然后使用合适的算法测定例如检测区中反射率的最大变化。
用于基于SERS的方法的包被的纳米颗粒在本领域内是已知的。例如，美国专利6,514,767描述了SERS活性复合纳米颗粒(SACN)，其包括表面附着或结合了一个或多个拉曼活性分子并且被包括聚合物、玻璃或任何其他绝缘体材料的壳包裹的金属纳米颗粒。可通过在拉曼活性金属纳米颗粒核心上生长或另外放置一层合适的密封剂(encapsulant)来产生此类颗粒。可通过本领域内熟知的许多技术(例如使用还原剂在溶液中化学或光化学还原金属离子)将期望大小的金属纳米颗粒生长为金属胶体。例如，可通过还原氯金酸在液体中产生胶体金颗粒，其为亚微米大小的金颗粒在液体中的悬浮物。在溶解酸后，快速搅拌溶液，同时加入还原剂。这导致金离子被还原成中性金原子，其从过饱和溶液中沉淀并且形成颗粒。为了防止颗粒聚集，可加入粘附至纳米颗粒表面的稳定剂。还可通过在溶液中放电来制备纳米颗粒。可用各种有机配体官能化颗粒以产生具有高级功能性的有机-无机杂合体(hybrid)。
合适的密封剂包括玻璃、聚合物、金属、金属氧化物和金属硫化物。如果密封剂是玻璃，则优选首先用玻璃底涂剂(glass primer)处理金属纳米颗粒核心。然后利用标准技术在金属纳米颗粒上生长玻璃。取决于所需的颗粒的物理性质，可容易地改变密封剂的厚度。可通过标准技术衍生壳，从而使颗粒能够缀合至分子(包括生物分子例如蛋白质和核酸)或固体支持物。
可商购获得的Oxonica NanoplexTM纳米颗粒由其上吸附有能够产生SERS信号的拉曼报道分子的金纳米颗粒核心组成。然后用大约10-50nm厚的二氧化硅壳包被拉曼标记的金纳米颗粒。二氧化硅壳保护报道分子免于从核心的表面解吸附，防止相邻金颗粒之间的等离子体-等离子体相互作用，而且还防止从溶液的组分产生SERS信号。
对于使用反射率读数器测读的侧流测定，可能期望Oxonica NanoplexTM纳米颗粒提供与胶体金(其具有与Oxonica NanoplexTM纳米颗粒核心相同的直径并且在相同光密度下使用)的测定灵敏度相当的测定灵敏度。然而，当在使用反射率读数器而非拉曼信号检测器进行测读的侧流测定中用Oxonica NanoplexTM纳米颗粒替代胶体金时，本发明者在测定灵敏度上观察到出乎意料并且显著的优势。重要地，只通过调整未包被的胶体金的直径通常不能获得用Oxonica NanoplexTM纳米颗粒获得的灵敏度的提高。此外，重要地，当将Oxonica NanoplexTM纳米颗粒用作标记试剂时，无论使用反射计还是使用SERS读数器测读信号，测定的灵敏度都可能是相等的。
当使用反射计而非拉曼读数器测读信号时，Oxonica NanoplexTM纳米颗粒中的拉曼活性分子据信对测定性能没有贡献。该预期得到实验支持，在所述实验中，发现二氧化硅包被的纳米颗粒(无拉曼活性分子)性能相同，并且其已用于基于反射计的侧流测定以提供优于裸露的胶体金的显著的灵敏度优点。
实施例
实施例1：
本实验比较二氧化硅包被的金纳米颗粒与胶体金在甲型流感病毒的侧流免疫测定中的性能。在本实验中，将已知量的活H1N1甲型流感病毒搀入(spike)经检测为甲型流感病毒阴性的鼻咽吸出物。
获自British Biocell International(“BB International”；“BBI”)的胶体金直径为40nm。用于本实验的二氧化硅包被的金纳米颗粒是Oxonica NanoplexTM纳米颗粒。此类纳米颗粒由用拉曼报道分子4，4′-联吡啶包被的60nm金核心和外部二氧化硅壳组成。二氧化硅壳厚度为大约30nm。通过被动吸附将甲型流感检测抗体附着至胶体金。对于NanoplexTM纳米颗粒，通过马来酰亚胺化学试剂将甲型流感检测抗体共价连接至二氧化硅表面上的巯基。对于两个测定，将甲型流感捕获抗体以条带的形式置于Whatman AE99硝酸纤维素膜上。然后以液体(“浸渍片(dipstick)”)形式(其中将颗粒和检测抗体与含有不同水平的病毒的鼻咽样品混合)测定硝酸纤维素膜。对于胶体金和包被的纳米颗粒使用相同的光学密度。然后将颗粒/样品混合物置于96孔板的孔中，将具有捕获抗体的硝酸纤维素膜的一端置于各孔中。让样品芯吸至硝酸纤维素膜上，然后用清洗缓冲液充满孔，所述清洗缓冲液之后也芯吸至硝酸纤维素膜的条带上。
使用由UMM Electronics(Indianapolis，JN)为Becton，Dickinson and Company(″BD″)定制的反射计测读来自捕获线的所得的信号。图1显示在使用胶体金和使用包被的纳米颗粒的侧流测试中，反射计信号作为病毒浓度的函数的曲线。相对于胶体金，对于Oxonica纳米颗粒观察到显著更强的响应。
实施例2：
在本实施例中，将二氧化硅包被的金纳米颗粒的灵敏度与商售产品BD DirectigenTMEZ Flu A+B测试的灵敏度相比较。如实施例1中的一样，使用Whatman AE99硝酸纤维素，以浸渍片的形式测定包被的金纳米颗粒。在其商业实施方案(“柱(cartridge)”形式)中测试DirectigenTMEZ Flu A+B。对于BD DirectigenTM EZ Flu A+B商售产品和基于Oxonica NanoplexTM纳米颗粒的装置，捕获抗体和检测抗体都相同。除了将活B/Lee/40乙型流感病毒而非甲型流感病毒搀入阴性鼻咽吸出物外，如实施例1中所述制备样品。如之前一样，用于实验的二氧化硅包被的金纳米颗粒是Oxonica NanoplexTM纳米颗粒。此类纳米颗粒由用拉曼报道分子4，4′-联吡啶包被的60nm金核心和外部二氧化硅壳组成。二氧化硅壳厚度为大约30nm。BD商售产品使用不包含二氧化硅壳的40nm胶体金。按照包装说明书使用BD商售产品，然而使用反射计以及通过目视来测读测试线信号。
比较2种颗粒的检测极限(可靠检出限)的数据示于表1中。可靠检出限(RDL)定义为当95％的置信下限等于空白对照的95％的置信上限时的浓度。
报导来自3个分开的实验的BD胶体金产品和二氧化硅包被的纳米颗粒的RDL(以任意单位(X)表示)。将相同的来自UMM Electronics的定制反射计用于测读来自二氧化硅包被的纳米颗粒浸渍片装置和DirectigenTMEZ Flu A+B装置的信号。灵敏度提高系数(sensitivity improvement factor)定义为基于未包被的金的产品的RDL除以二氧化硅包被的纳米颗粒产品的RDL。
表1
Figure BPA00001252557700191
如从表中所看到的，与裸露的金颗粒相比较，Oxonica NanoplexTM纳米颗粒提供直至16倍的提高的灵敏度。
在与上述实验相似的分开的实验中，将胶体金颗粒的直径从40nm增加至60nm和更大的尺寸。在这些实验中，只观察到有限的灵敏度提高(达到2倍)，这表明Oxonica NanoplexTM纳米颗粒的金核心与胶体金之间的大小差异可能不是灵敏度提高的根源。
实施例3：
本实验比较乙型流感(B/Lee/40)侧流免疫测定测试中胶体金与Oxonica NanoplexTM纳米颗粒的灵敏度和特异性。制备60个临床样品。样品全部是经测试为乙型流感阴性的鼻咽样品。将其中的20个样品用作阴性对照。以2个水平将活乙型流感病毒搀入剩余的40个样品以产生一组40个阳性样品。以0.5X的浓度(任意单位)将活乙型流感病毒搀入这40个样品中的20个样品。剩余的20个样品接受十分之一的乙型流感病毒(0.05X的浓度)。然后使用柱形式的BD DirectigenTM EZFlu A+B商品和用Oxonica NanoplexTM纳米颗粒制造的浸渍片装置测试所有60个样品(40个阳性和20个阴性对照)。使用Whatman AE99硝酸纤维素制备浸渍片装置。Oxonica NanoplexTM纳米颗粒由用拉曼报道分子4，4′-联吡啶包被的60nm金核心和大约30nm厚的外部二氧化硅壳组成。用于BD DirectigenTMEZ Flu A+B商品和基于Oxonica NanoplexTM纳米颗粒的装置的捕获抗体和检测抗体都是相同的。
结果概述于表2中。在表中，灵敏度计算为各测试将40个阳性样品正确鉴定为阳性的百分比。特异性计算为各测试将20个阴性样品正确鉴定为阴性的百分比。当使用仪器测读时，如果测量的仪器读数比对于各类型的装置所确定的阈值更大，则测试被认为是阳性的。确定阈值以确保对于各装置至少95％的特异性。在本实施例中，通过目视和使用来自UMM Electronics的定制反射计对DirectigenTM产品进行测读。用相同的反射计以及用BD制造的研究拉曼读数器(表的最后一行)测读Oxonica NanoplexTM纳米颗粒。研究拉曼读数器使用785nm激光进行激发且使用Acton Research Spectrometer(SpectraPro25000i)和CCD检测器(Pixis 400)检测拉曼信号。
表2
  测试   灵敏度   特异性
  DirectigenTMEZ，目视读数   45％   100％
  DirectigenTMEZ，反射计读数   58％   95％
  Oxonica纳米标记，反射计读数   100％   100％
  Oxonica纳米标记，拉曼读数   100％   100％
如可看到的，与DirectigenTMEZ颗粒相比较，对于Oxonica NanoplexTM纳米颗粒观察到明确的灵敏度优点，而无特异性的损失。
实施例4：
本实验比较具有与不具有表面增强拉曼散射(SERS)分子的二氧化硅包被的金纳米颗粒在基于反射率的侧流免疫测定中的性能。
从Oxonica获得含有SERS标签的Oxonica NanoplexTM金纳米颗粒。纳米颗粒由用4-4′-联吡啶标记并且用35nm厚的二氧化硅壳包被的60nm金核心组成。纳米颗粒的直径为130nm。使用Sulfo-SMCC化学试剂(Pierce#22622)将抗甲型流感抗体共价连接至纳米颗粒上的表面巯基。
缺少SERS标签的60纳米直径的金纳米颗粒购自BBI。然后通过下列方法用二氧化硅包被金纳米颗粒。首先用75μL 100μM的于乙醇中的3-巯丙基三乙氧基硅烷溶液处理10mL的60nm胶体金(BBI，大约2.6×1010个颗粒/mL)。在3个小时后，加入75μL 2.7％的硅酸钠水溶液，然后让反应继续24小时。在下一步中，向悬浮液中加入40mL乙醇，然后加入1mL氨水和300μL(5％的在乙醇中的溶液)原硅酸四乙酯。将反应在搅拌的情况下保持2天，最后通过重复离心进行纯化。该方法中产生的二氧化硅涂层的厚度为30nm，从而二氧化硅包被的金的总颗粒直径为120nm。然后通过将玻璃包被的金颗粒的水性悬浮液(10mL，大约2.6×1010个颗粒/mL)与1％的巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)的乙醇溶液在室温下反应24小时来将巯基加至二氧化硅包被的金颗粒的表面。MPTMS溶液的量在25μL至100μL间变化，从而通过非最优化的方法以彼此相对大约0.5、1.0、1.5和2.0的装载水平(例如，2.0是0.5的4倍)产生不同水平的表面活性巯基。在反应后，通过在水中重复离心来纯化颗粒。使用Sulfo-SMCC化学试剂(Pierce#22622)将抗甲型流感抗体共价连接至纳米颗粒上的表面巯基。
如下以浸渍片形式进行侧流免疫测定。将甲型流感捕获抗体施加至Whatman AE99硝酸纤维素条。将硝酸纤维素条浸入含有调整至光密度为10的纳米颗粒和不同浓度的H1N1甲型流感病毒的样品溶液中。让样品溶液完全吸至硝酸纤维素条上。然后加入清洗缓冲液并且也让其吸至硝酸纤维素膜的条上。然后干燥条，使用C10066型Hamamatsu反射计测读反射率。结果概述于表3中。
表3
Figure BPA00001252557700221
表3中的数据显示，当使用反射计读数器时，如果经最优化，在侧流免疫测定中不具有SERS报道分子的二氧硅包被的金纳米颗粒与包含SERS报道分子的纳米颗粒性能一样好。此外，二氧化硅包被的金颗粒的性能可取决于巯基化作用的程度。
实施例5：
本实验设计用于测试原型侧流装置检测临床样品中的活H1N1甲型流感病毒的性能(使用Oxonica NanoplexTM二氧化硅包被的金纳米颗粒作为报道分子)。Oxonica颗粒具有直径为大约60nm的金核心、4，4′-联吡啶拉曼报道分子和大约35nm厚的外部二氧化硅壳。基于柱体的原型装置使用与BD DirectigenTM EZ Flu A+B商品相同的捕获和检测抗体，并且以与该商品相同的方式进行使用。
原型测试装置包括支持一条Millipore HF135硝酸纤维素侧流膜的背衬条(backer strip)。将特异于甲型流感核蛋白(Flu A NP)的捕获抗体以条带形式置于该膜上以形成测试线。将抗物种免疫球蛋白抗体以条带形式置于测试线邻近以形成对照线。将Oxonica NanoplexTMSERS纳米颗粒喷射至已用10％SEABLOCK溶液(Pierce 37527)处理的缀合垫(conjugate pad)(Arista MAPDS-0399)上。用抗Flu A NP的检测抗体缀合纳米颗粒。将缀合垫在侧流膜的一端粘附至背衬条。在侧流膜的相对末端上，粘附吸收垫(absorbent wicking pad)(Whatman#470)。将所得的侧流测定条封装在两部分聚苯乙烯柱内。除了显示LF膜的测试线和对照线区域的中央窗口和位于缀合垫的中央的加样孔外，该柱完全封住测试条。将该柱式外壳用于BD DirectigenTMEZ RSV侧流测定装置。
与实施例1相似，将已知量的活甲型流感病毒搀入经检测为甲型流感病毒阴性的儿科鼻咽吸出物样品。搀杂的样品中的最终病毒浓度范围在0.25X(任意单位)至0.0039X之间(通过2倍系列稀释)。将搀入不含病毒的稀释介质的样品(“0X”)用作对照。在加入活病毒后，使用BD DirectigenTMEZ Flu A+B样品制备方案处理样品系列。简而言之，将一定量的甲型流感病毒搀杂的样品与提取试剂于弹性样品管中混合。然后将提取的样品从管通过玻璃纤维过滤尖头挤出并且收集样品。通过将100μL施加至三个原型测试装置的每一个装置的样品孔以一式三份测试各样品。
在加样后15分钟和30分钟，使用Hamamatsu反射计(C10066型)测读用Oxonica NanoplexTM SERS纳米颗粒制造的各装置。在30分钟测读后，从柱中取出各侧流条，除去缀合垫和吸收垫，然后在环境温度和湿度下干燥至少1小时。在干燥后使用反射计再次测读各测试条。使用来自各测读时间的数据绘制剂量-响应曲线，然后依据最小检测浓度(其平均信号等于空白对照的置信区间上限的最低浓度；MDC)和可靠检出限(RDL)将其用于计算各测读时间的灵敏度。这些结果示于表4中。表4还显示与DirectigenTMEZ的灵敏度相比较，使用Oxonica颗粒获得的灵敏度的提高。DirectigenTMEZ使用无二氧化硅涂层的40nm-直径的胶体金。
表4.使用Oxonica SERS-活性纳米颗粒的基于柱的甲型流感侧流测试系统和使用反射计进行的检测的灵敏度
Figure BPA00001252557700241
通过目视测读的现有DirectigenTM EZ Flu A装置的检测极限(RDL)是大约0.5X甲型流感病毒浓度，以及通过反射计测读的是大约0.2X。如表4中所显示的，相对于现有DirectigenTM EZ Flu A装置，使用Oxonica NanoplexTM报道纳米颗粒的基于柱的测试装置提供了显著增加的灵敏度。
实施例6：
在本实施例中，将使用Oxonica NanoplexTM二氧化硅包被的金纳米颗粒的原型侧流甲型流感测试的分析灵敏度与使用反射计测读的BD DirectigenTMEZ Flu A+B商品的分析灵敏度相比较。Oxonica颗粒具有直径大约60nm的金核心、附着至金表面的拉曼报道分子4，4′-联吡啶和厚度大约35nm的二氧化硅壳。在本实施例中，每侧流装置的SERS纳米颗粒的量据估计略微少于商业产品中胶体金颗粒的量。对于BD DirectigenTMEZ Flu A+B商品和基于Oxonica NanoplexTM纳米颗粒的装置，捕获和检测抗体都相同。
如实施例5中一样，将已知量的活甲型流感病毒搀入经检测为甲型流感病毒阴性的儿科鼻咽吸出物样品。如实施例5中所述组装最优化的原型装置，按照BD DirectigenTM EZ Flu A包装说明书进行样品提取。在加样后15分钟，在Hamamatsu反射计(C10066型)中测读所有装置(基于SERS的原型和BD DirectigenTM EZ Flu A+B)。图2显示两个测定形式的反射率信号(作为活病毒浓度的函数)，并且表5显示在最高测试病毒浓度(0.25X)和测定的可靠检出限(RDL)上获得的反射计信号。在本实验中，与使用反射计测读的BD DirectigenTM EZ FluA+B相比较，使用SERS纳米颗粒的装置产生大约7倍高的灵敏度和8倍高的亮度。
表5
Figure BPA00001252557700251
等价物
本领域技术人员将认识到，或通过只使用常规试验能够确定本文中描述的特定实施方案的许多等价物。此类等价物由下列权利要求包括。

Claims (116)

1.用于确定分析物在液体样品中存在或不存在的测试装置，其包括：
(a)样品接受部件；
(b)与样品接受部件流体连通的载体；
(c)在液体样品存在的情况下在载体中可移动的标记试剂，该标记试剂包含结合分析物的配体和包被的纳米颗粒，所述纳米颗粒包括核心和增加在其上附着配体的纳米颗粒的反射率的壳，其中包被的纳米颗粒不包含拉曼活性分子；和
(d)固定在载体的确定的检测区中的结合剂，当分析物存在时，所述结合剂有效地捕获分析物；
其中施加至样品接受部件的液体样品使标记试剂移动以便样品和标记试剂沿着载体的长度方向被运输进入检测区，并且其中在检测区中检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中。
2.权利要求1的测试装置，其中所述载体包含硝酸纤维素、塑料或玻璃。
3.权利要求2的测试装置，其中所述载体包含硝酸纤维素。
4.权利要求1的测试装置，其中所述分析物是蛋白质、核酸、代谢物、小分子、病毒或细菌。
5.权利要求1的测试装置，其还包括与检测区流体连通的吸收垫。
6.权利要求1的测试装置，其还包括与检测区流体连通的对照区。
7.权利要求1的测试装置，其中定量测定分析物在液体样品中的存在。
8.权利要求1的测试装置，其中所述测试装置经设计用于检测多种分析物。
9.权利要求8的测试装置，其还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
10.包括权利要求1的测试装置和适合于检测标记试剂在测试装置中的存在的反射计的系统。
11.用于确定分析物在液体样品中存在或不存在的方法，其包括：
a)提供权利要求1的测试装置；
b)将液体样品与测试装置的样品接受部件接触；
c)让施加至样品接受部件的液体样品使所述标记试剂移动以便液体样品与标记试剂沿着载体的长度方向移动进入检测区；
d)通过测量反射率检测标记试剂在检测区中的存在，其中在检测区中检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中，以及在检测区中未能检测到标记试剂的存在表示分析物不存在于液体样品中。
12.权利要求11的方法，其中使用反射率读数器检测检测区中的标记试剂。
13.权利要求11的方法，其中通过目视确定检测区中标记试剂的检测。
14.权利要求11的方法，其中定量测定液体样品中分析物的存在。
15.权利要求11的方法，其中所述方法检测液体样品中的多种分析物。
16.权利要求15的方法，其中所述测试装置还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
17.用于确定分析物在液体样品中存在或不存在的方法，其包括：
a)提供测试装置，其包括：(i)样品接受部件；(ii)与样品接受部件流体连通的载体；和(iii)固定在载体的确定的检测区中的结合剂，当分析物存在时，所述结合剂有效地捕获分析物；
b)将液体样品与包含结合分析物的配体和包被的纳米颗粒的标记试剂混合，所述纳米颗粒包括核心和增加其上附着配体的纳米颗粒的反射率的壳，其中包被的纳米颗粒不包含拉曼活性分子；
c)将b)的混合物与测试装置的样品接受部件接触；
d)让施加至样品接受部件的b)的混合物沿着载体的长度方向移动进入检测区；
e)通过测量反射率检测标记试剂在检测区中的存在，其中在检测区中检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中，并且在检测区中未能检测到标记试剂的存在表示分析物不存在于液体样品中。
18.权利要求17的方法，其中使用反射率读数器检测检测区中的标记试剂。
19.权利要求17的方法，其中通过目视确定检测区中标记试剂的检测。
20.权利要求17的方法，其中定量测定液体样品中分析物的存在。
21.权利要求17的方法，其中所述方法检测液体样品中的多种分析物。
22.权利要求21的方法，其中所述测试装置还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
23.用于确定分析物在液体样品中存在或不存在的测试装置，其包括：
(a)样品接受部件；
(b)与样品接受部件流体连通的载体；
(c)在液体样品存在的情况下在载体中可移动的标记试剂，该标记试剂包含结合分析物的配体和包被的纳米颗粒，所述纳米颗粒基本上由核心和增加其上附着配体的纳米颗粒的反射率的壳组成，其中所述配体结合至壳的表面；和
(d)固定在载体的确定的检测区中的结合剂，当分析物存在时，所述结合剂有效地捕获分析物；
其中施加至样品接受部件的液体样品使标记试剂移动以便样品和标记试剂沿着载体的长度方向被运输进入检测区，并且其中在检测区中检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中。
24.权利要求23的测定装置，其中所述载体包括硝酸纤维素、塑料或玻璃。
25.权利要求24的测定装置，其中所述载体包括硝酸纤维素。
26.权利要求23的测定装置，其中所述分析物是蛋白质、核酸、代谢物、小分子、病毒或细菌。
27.权利要求23的测试装置，其还包括与检测区流体连通的吸收垫。
28.权利要求23的测试装置，其还包括与检测区流体连通的对照区。
29.权利要求23的测试装置，其中定量测定液体样品中分析物的存在。
30.权利要求23的测试装置，其中所述测试装置经设计用于检测多种分析物。
31.权利要求30的测试装置，其还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
32.包括权利要求23的测试装置和适合于检测标记试剂在测试装置中的存在的反射计的系统。
33.用于确定分析物在液体样品中存在或不存在的方法，其包括：
a)提供权利要求23的测试装置；
b)将液体样品与测试装置的样品接受部件接触；
c)让施加至样品接受部件的液体样品使标记试剂移动以便液体样品和标记试剂沿着载体的长度方向移动进入检测区；
d)通过测量反射率检测标记试剂在检测区中的存在，其中在检测区中检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中，并且在检测区中未能检测到标记试剂的存在表示分析物不存在于液体样品中。
34.权利要求33的方法，其中使用反射率读数器检测检测区中的标记试剂。
35.权利要求33的方法，其中通过目视确定检测区中标记试剂的检测。
36.权利要求33的方法，其中定量测定液体样品中分析物的存在。
37.权利要求33的方法，其中所述方法检测液体样品中的多种分析物。
38.权利要求37的方法，其中所述测试装置还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
39.用于确定分析物在液体样品中存在或不存在的方法，其包括：
a)提供测试装置，其包括：(i)样品接受部件；(ii)与样品接受部件流体连通的载体；和(iii)固定在载体的确定的检测区中的结合剂，当分析物存在时，所述结合剂有效地捕获分析物；
b)将液体样品与标记试剂混合，所述标记试剂基本上由核心和增加纳米颗粒的反射率的壳以及结合至壳的表面的与分析物结合的配体组成；
c)将b)的混合物与测试装置的样品接受部件接触；
d)让施加至样品接受部件的b)的混合物沿着载体的长度方向移动进入检测区；
e)通过测量反射率检测标记试剂在检测区中的存在，其中在检测区中检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中，并且在检测区中未能检测到标记试剂的存在表示分析物不存在于液体样品中。
40.权利要求39的方法，其中使用反射率读数器检测检测区中的标记试剂。
41.权利要求39的方法，其中通过目视确定检测区中标记试剂的检测。
42.权利要求39的方法，其中定量测定液体样品中分析物的存在。
43.权利要求39的方法，其中所述方法检测液体样品中的多种分析物。
44.权利要求43的方法，其中所述测试装置还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
45.用于确定分析物在液体样品中存在或不存在的方法，其包括：
a)提供测试装置，其包括：(i)样品接受部件；(ii)与样品接受部件流体连通的载体；和(iii)在液体样品存在的情况下在载体中可移动的标记试剂，该标记试剂包含结合分析物的配体和包被的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含核心、附着至核心并且能够通过表面增强拉曼散射产生信号的分子以及包围核心和其上附着配体的分子的壳；和(iv)固定在载体的确定的检测区中的结合剂，当分析物存在时，所述结合剂有效地捕获分析物；
b)将液体样品与测试装置的样品接受部件接触；
c)让施加至样品接受部件的液体样品使标记试剂移动以便液体样品和标记试剂沿着载体的长度方向移动进入检测区；
d)通过测量反射率检测标记试剂在检测区中的存在，其中在检测区中检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中，并且在检测区中未能检测到标记试剂的存在表示分析物不存在于液体样品中。
46.权利要求45的方法，其中使用反射率读数器检测检测区中的标记试剂。
47.权利要求45的方法，其中通过目视确定检测区中标记试剂的检测。
48.权利要求45的方法，其中定量测定液体样品中分析物的存在。
49.权利要求45的方法，其中所述方法检测液体样品中的多种分析物。
50.权利要求49的方法，其中所述测试装置还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
51.用于确定分析物在液体样品中存在或不存在的方法，其包括：
a)提供测试装置，其包括：(i)样品接受部件；(ii)与样品接受部件流体连通的载体；和(iii)固定在载体的确定的检测区中的结合剂，当分析物存在时，所述结合剂有效地捕获分析物；
b)将液体样品与标记试剂混合，所述标记试剂包含结合分析物的配体和包被的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含核心、附着至核心并且能够通过表面增强拉曼散射产生信号的分子以及包围核心和其上附着配体的分子的壳；
c)将b)的混合物与测试装置的样品接受部件接触；
d)让施加至样品接受部件的b)的混合物沿着载体的长度方向移动进入检测区；
e)通过测量反射率检测标记试剂在检测区中的存在，其中在检测区中检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中，并且在检测区中未能检测到标记试剂的存在表示分析物不存在于液体样品中。
52.权利要求51的方法，其中使用反射率读数器检测检测区中的标记试剂。
53.权利要求51的方法，其中通过目视确定检测区中标记试剂的检测。
54.权利要求51的方法，其中定量测定液体样品中分析物的存在。
55.权利要求51的方法，其中所述方法检测液体样品中的多种分析物。
56.权利要求55的方法，其中所述测试装置还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
57.用于进行流动通过分析测试的试剂盒，所述测试通过反射计法检测分析物在液体样品中的存在或不存在，所述试剂盒包括：(a)包括包含上表面和下表面的多孔膜和附着至多孔膜的上表面或下表面的结合剂的测试装置，当分析物存在于液体样品中时，所述结合剂有效地捕获分析物；和(b)标记试剂，其包含结合分析物的配体和包被的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含核心和增加纳米颗粒的反射率的壳，其中包被的纳米颗粒不包含拉曼活性分子。
58.权利要求57的试剂盒，其中至少一种分析物是蛋白质、核酸、代谢物、小分子、病毒或细菌。
59.权利要求57的试剂盒，其中所述测试装置还包括吸收垫，其中多孔膜的下表面与吸收垫物理接触并且流体连通，并且其中结合剂附着至多孔膜的上表面。
60.权利要求57的试剂盒，其中所述测试装置还包括用于多孔膜的外壳。
61.权利要求57的试剂盒，其中定量测定液体样品中分析物的存在。
62.权利要求57的试剂盒，其中所述测试装置经设计用于检测多种分析物。
63.权利要求62的试剂盒，其中所述测试装置还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
64.包括权利要求57的试剂盒的测试装置和适合于检测标记试剂在测试装置中的存在的反射计的系统。
65.使用权利要求57的试剂盒确定分析物在液体样品中的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)将液体样品与多孔膜的上表面接触；
(b)让液体样品流动通过多孔膜以便当分析物存在于液体样品中时，至少一部分分析物与结合剂结合；
(c)将标记试剂与多孔膜的上表面接触；
(d)让标记试剂流动通过多孔膜以便至少一部分标记试剂结合分析物；和
(e)通过测量反射率检测标记试剂在多孔膜上的存在，其中在多孔膜上检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中，并且在多孔膜上未能检测到标记试剂的存在表示分析物不存在于液体样品中。
66.权利要求65的方法，其中使用反射率读数器检测多孔膜上的标记试剂。
67.权利要求65的方法，其中通过目视确定多孔膜上标记试剂的检测。
68.权利要求65的方法，其中定量测定液体样品中分析物的存在。
69.权利要求65的方法，其中所述方法检测液体样品中的多种分析物。
70.权利要求69的方法，其中所述测试装置还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
71.使用权利要求57的试剂盒确定分析物在液体样品中的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)将液体样品与标记试剂混合以便当分析物存在于液体样品中时，分析物结合标记试剂；
(b)将(a)的混合物与多孔膜的上表面接触；
(c)让(a)的混合物流动通过多孔膜以便至少一部分与标记试剂结合的分析物与结合剂结合；和
(d)通过测量反射率检测标记试剂在多孔膜上的存在，其中在多孔膜上检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中，并且在多孔膜上未能检测到标记试剂的存在表示分析物不存在于液体样品中。
72.权利要求71的方法，其中使用反射率读数器检测多孔膜上的标记试剂。
73.权利要求71的方法，其中通过目视确定多孔膜上标记试剂的检测。
74.权利要求71的方法，其中定量测定液体样品中分析物的存在。
75.权利要求71的方法，其中所述方法检测液体样品中的多种分析物。
76.权利要求75的方法，其中所述测试装置还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
77.用于进行流动通过分析测试的试剂盒，所述测试通过反射计法检测分析物在液体样品中的存在或不存在，所述试剂盒包括：(a)包括包含上表面和下表面的多孔膜和附着至多孔膜的上表面或下表面的结合剂的测试装置，当分析物存在于液体样品中时，所述结合剂有效地捕获分析物；和(b)标记试剂，其包含结合分析物的配体和包被的纳米颗粒，所述纳米颗粒基本上由核心和增加纳米颗粒的反射率的壳组成，其中所述配体结合至壳的表面。
78.权利要求77的试剂盒，其中所述分析物是蛋白质、核酸、代谢物、小分子、病毒或细菌。
79.权利要求77的试剂盒，其中所述测试装置还包括吸收垫，其中多孔膜的下表面与吸收垫物理接触并且流体连通，并且其中结合剂附着至多孔膜的上表面。
80.权利要求77的试剂盒，其中所述测试装置还包括用于多孔膜的外壳。
81.权利要求77的试剂盒，其中定量测定液体样品中分析物的存在。
82.权利要求77的试剂盒，其中所述测试装置经设计用于检测多种分析物。
83.权利要求82的试剂盒，其中所述测试装置还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
84.包括权利要求77的试剂盒的测试装置和适合于检测标记试剂在测试装置中的存在的反射计的系统。
85.使用权利要求77的试剂盒确定分析物在液体样品中的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)将液体样品与多孔膜的上表面接触；
(b)让液体样品流动通过多孔膜并且进入吸收材料以便当分析物存在于液体样品中时，至少一部分分析物与结合剂结合；
(c)将标记试剂与多孔膜的上表面接触；
(d)让标记试剂流动通过多孔膜并且进入吸收材料以便至少一部分标记试剂结合分析物；和
(e)通过测量反射率来检测标记试剂在多孔膜上的存在，其中在多孔膜上检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中，并且在多孔膜上未能检测到标记试剂的存在表示分析物不存在于液体样品中。
86.权利要求85的方法，其中使用反射率读数器检测多孔膜上的标记试剂。
87.权利要求85的方法，其中通过目视确定多孔膜上标记试剂的检测。
88.权利要求85的方法，其中定量测定液体样品中分析物的存在。
89.权利要求85的方法，其中所述方法检测液体样品中的多种分析物。
90.权利要求89的方法，其中所述测试装置还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
91.使用权利要求77的试剂盒确定分析物在液体样品中的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)将液体样品与标记试剂混合以便当分析物存在于液体样品中时，分析物结合标记试剂；
(b)将(a)的混合物与多孔膜的上表面接触；
(c)让(a)的混合物流动通过多孔膜以便至少一部分与标记试剂结合的分析物与结合剂结合；和
(d)通过测量反射率检测标记试剂在多孔膜上的存在，其中在多孔膜上检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中，并且在多孔膜上未能检测到标记试剂的存在表示分析物不存在于液体样品中。
92.权利要求91的方法，其中使用反射率读数器检测多孔膜上的标记试剂。
93.权利要求91的方法，其中通过目视确定多孔膜上标记试剂的检测。
94.权利要求91的方法，其中定量测定液体样品中分析物的存在。
95.权利要求91的方法，其中所述方法检测液体样品中的多种分析物。
96.权利要求95的方法，其中所述测试装置还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
97.用于进行流动通过分析测试的试剂盒，所述测试通过反射计法检测分析物在液体样品中的存在或不存在，所述试剂盒包括：(a)包括包含上表面和下表面的多孔膜和附着至多孔膜的上表面或下表面的结合剂的测试装置，当分析物存在于液体样品中时，所述结合剂有效地捕获分析物；和(b)标记试剂，其包含结合分析物的配体和包被的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含核心、连接至核心并且能够通过表面增强拉曼散射产生信号的分子以及包围所述核心和所述分子的壳。
98.权利要求97的试剂盒，其中所述分析物是蛋白质、核酸、代谢物、小分子、病毒或细菌。
99.权利要求97的试剂盒，其中所述测试装置还包括吸收垫，其中多孔膜的下表面与吸收垫物理接触并且流体连通，并且其中结合剂附着至多孔膜的上表面。
100.权利要求97的试剂盒，其中所述测试装置还包括用于多孔膜的外壳。
101.权利要求97的试剂盒，其中定量测定液体样品中分析物的存在。
102.权利要求97的试剂盒，其中所述测试装置经设计用于检测多种分析物。
103.权利要求102的试剂盒，其中所述测试装置还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
104.包括权利要求97的试剂盒的测试装置和适合于检测标记试剂在测试装置中的存在的反射计的系统。
105.使用权利要求97的试剂盒确定分析物在液体样品中的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)将液体样品与多孔膜的上表面接触；
(b)让液体样品流动通过多孔膜并且进入吸收材料以便当分析物存在于液体样品中时，至少一部分分析物与结合剂结合；
(c)将标记试剂与多孔膜的上表面接触；
(d)让标记试剂流动通过多孔膜并且进入吸收材料以便至少一部分标记试剂结合分析物；和
(e)通过测量反射率来检测标记试剂在多孔膜上的存在，其中在多孔膜上检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中，并且在多孔膜上未能检测到标记试剂的存在表示分析物不存在于液体样品中。
106.权利要求105的方法，其中使用反射率读数器检测多孔膜上的标记试剂。
107.权利要求105的方法，其中通过目视确定多孔膜上标记试剂的检测。
108.权利要求105的方法，其中定量测定液体样品中分析物的存在。
109.权利要求105的方法，其中所述方法检测液体样品中的多种分析物。
110.权利要求109的方法，其中所述测试装置还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
111.使用权利要求97的试剂盒确定分析物在液体样品中的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)将液体样品与标记试剂混合以便当分析物存在于液体样品中时，分析物结合标记试剂；
(b)将(a)的混合物与多孔膜的上表面接触；
(c)让(a)的混合物流动通过多孔膜以便至少一部分与标记试剂结合的分析物与结合剂结合；和
(d)通过测量反射率检测标记试剂在多孔膜上的存在，其中在多孔膜上检测到标记试剂表示分析物存在于液体样品中，并且在多孔膜上未能检测到标记试剂的存在表示分析物不存在于液体样品中。
112.权利要求111的方法，其中使用反射率读数器检测多孔膜上的标记试剂。
113.权利要求111的方法，其中通过目视确定多孔膜上的标记试剂的检测。
114.权利要求111的方法，其中定量测定液体样品中分析物的存在。
115.权利要求111的方法，其中所述方法检测液体样品中的多种分析物。
116.权利要求115的方法，其中所述测试装置还包括至少2种不同的标记试剂和用于检测所述至少2种不同的标记试剂的每一种的至少2个检测区，其中标记试剂的配体结合不同的分析物。
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