KR20170075221A - 바이오 센서용 광학 표지자, 이를 포함하는 광학 바이오센서 및 상기 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법 - Google Patents

바이오 센서용 광학 표지자, 이를 포함하는 광학 바이오센서 및 상기 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법 Download PDF

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Abstract

목적 생체물질과 선택적으로 결합하고, 입사광을 재귀반사시키는 바이오 센서용 광학 표지자가 개시된다. 광학 표지자는 투명한 코어 입자, 코어 입자 표면의 일부를 피복하고 코어 입자보다 굴절률이 작은 물질로 형성된 전반사 유도층, 전반사 유도층 상에 형성된 수식층 및 수식층에 결합되고 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 생체인지물질을 구비한다. 이러한 광학 표지자는 비분광 광원 및 분광 광원 모두에 대해서 우수한 광학 표지자로서 기능할 수 있다.

Description

바이오 센서용 광학 표지자, 이를 포함하는 광학 바이오센서 및 상기 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법{OPTICAL PROBE FOR THE BIOSENSOR, OPTICAL BIOSENSOR HAVING THE OPTICAL PROBE, AND METHOD OF MANUFACTURING OPTICAL MARKER FOR THE BIOSENSOR}
본 발명은 목적 생체물질의 유무, 농도 등을 광학적으로 감지할 수 있는 바이오 센서용 광학 표지자, 이를 포함하는 광학 바이오센서 및 상기 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법에 관한 것이다.
바이오센서 및 랩온어칩(Lab-on-A-Chip) 개념은 질병진단 기술의 핵심기술로 부상했지만 세계적으로도 현재까지 혈당센서, 감염증에 대한 래피드 킷 외에는 시장에서 뚜렷한 성공을 이루어내지 못하고 있는 실정이다. 특히 지금까지 개발된 광학식 바이오센서는 검출하고자 하는 생체물질(target analyte)과 선택적으로 반응 및 결합할 수 있는 생체감지층(bioreceptor)에서의 반응 및 결합여부를 확인하기 위해 광학신호 표지자(optical probe)를 사용하며, 대표적인 광학신호 표지자로는 효소, 발색염료, 금속나노입자, 유기형광염료, 무기형광나노입자 등이 있다. 이들 광학 표지자는 그 종류에 따라 발색에 의한 흡광스펙트럼(absorption spectrum)의 강도변화, 흡광스펙트럼의 적색편이(spectral shifting), 여기광(excitation light) 존재 하에서의 형광발광(fluorescence) 강도 변화 등의 분광학적 광학신호를 제공하는데, 이러한 분광학적 광학신호는 바이오센서의 신호민감도에 매우 긍정적으로 작용하나, 이들 분광학적 광학신호들을 검출하기 위해서는 1)고출력 단파장 레이저 광원 혹은 할로겐족 램프와 모노크로메이터(monochromator)가 조합된 광원, 2)해당 분광신호 특성에 맞는 분광 필터(excitation/emission filter) 3)광전증배관(photomultiplier tube, PMT) 등과 같은 고민감도의 수광 소자 등의 사용이 필수적이다. 이들 분광학적 광원 및 광학부품들은 고가이며 높은 복잡성과 고전력 요구 등의 단점을 가지고 있으므로, 제한된 분석환경(resource-limited condition)에서 운용이 되는 현장 진단형(point-of-care-testing, POCT) 광학 바이오센서로서 적용되기 어려운 문제점이 있다.
따라서 직관적이고 상용화 가능성이 높은 현장 진단형 광학 바이오센서의 구현을 위해서는 비분광 분석에 의한 새로운 광학신호 검출, 변환, 분석 방법론 등의 개발이 필수적이다. 새로운 광학분석방법론은 백색 혼합광과 같이 분광되지 않은 일반광원으로부터 광학신호를 유도할 수 있어야 하며, 해당 신호는 별도의 분광 필터나 고가의 수광 소자의 도움 없이 저배율의 광학현미경 또는 스마트폰 카메라 등 최소한의 광학계만을 이용하여 변환, 분석이 가능해야 하는 등의 조건을 만족시켜야 한다.
본 발명의 일 목적은 입사 광에 대해 강한 재귀반사 신호를 생성할 수 있어서 비분광식 바이오센서에 적용할 수 있는 바이오 센서용 광학 표지자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 광학 표지자를 구비하여 비분광 방식으로 목적 생체물질의 유무, 농도 등을 감지할 수 있는 바이오 센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 광학 표지자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서용 광학 표지자는 목적 생체물질과 선택적으로 결합하고, 입사광을 재귀반사시킬 수 있고, 투명한 코어 입자; 상기 코어 입자 표면의 일부를 피복하고, 상기 코어 입자보다 굴절률이 작은 물질로 형성된 전반사 유도층; 상기 전반사 유도층 상에 형성된 수식층; 및 상기 수식층에 결합되고, 상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 생체인지물질을 포함한다.
일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자는 구형의 형상을 갖고, 투명한 산화물 또는 투명한 고분자 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 코어 입자는 실리카(silica), 글라스(glass), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methyl methacrylate)) 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 물질로 형성될 수 있다. 한편, 상기 코어 입자는 700nm 이상 5㎛ 이하의 평균 직경을 가질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 전반사 유도층은 상기 코어 입자의 표면 중 약 30% 이상 70% 이하의 면적을 피복할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자는 1.4 이상의 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있고, 상기 전반사 유도층은 1.2 이하의 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 전반사 유도층은 알루미늄(Al), 구리(Cu), 금(Au), 은(Ag), 아연(Zn) 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질로 형성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 전반사 유도층은 10 내지 100nm의 두께를 가질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 수식층은 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag) 등으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 물질로 형성될 수 있다. 한편, 상기 수식층은 10 내지 100 nm의 두께를 가질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 생체인지물질은 단백질, 핵산, 리간드 등으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 목적 생체물질이 항원 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 항원 물질과 특이적으로 반응하는 항체 물질일 수 있고, 상기 목적 생체물질이 유전자 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 유전자 물질과 상보적인 결합이 가능한 핵산 물질일 수 있으며, 상기 목적 생체물질이 세포신호 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 세포신호 물질과 선택적으로 결합하는 화학적 리간드 물질일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 광학 표지자는 상기 전반사 유도층과 상기 수식층 사이에 배치되고, 자성 물질로 형성된 자성층을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서는 목적 생체물질을 고정하는 생체물질 고정부; 상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하고, 조사된 광을 재귀반사시킬 수 있는 광학 표지부; 상기 광학 표지부에 광을 조사하는 광원부; 및 상기 광학 표지부에 의해 재귀반사된 광을 수용하는 수광부를 포함한다.
일 실시예에 있어서, 상기 광학 표지부는 구형의 투명한 코어 입자; 상기 코어 입자 표면의 일부를 피복하고, 상기 코어 입자보다 굴절률이 작은 물질로 형성된 전반사 유도층; 상기 전반사 유도층 상에 형성된 수식층; 및 상기 수식층에 결합되고, 상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 생체인지물질을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 생체물질 고정부는 기판; 및 상기 기판 상에 배치되고 상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 고정 물질을 포함할 수 있고, 상기 광원은 상기 기판 표면의 법선에 대해 5 내지 60ㅀ 경사진 방향으로 광을 조사할 수 있다. 한편, 상기 수광부는 상기 광학 표지부에 입사하는 입사광과 상기 광학 표지부로부터 재귀반사된 광을 분할하는 광분할부; 상기 광분할부에 의해 분할된 재귀반사 광 신호를 수신하여 이미지화하는 화상 생성부; 및 상기 화상 생성부에 의해 생성된 화상 정보를 분석하는 화상 분석부를 포함할 수 있고, 이 경우, 상기 광분할부는 상기 기판 표면의 법선에 대해 상기 광원과 동일한 방향으로 0 내지 60ㅀ 경사지게 설치될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법은 투명한 코어 입자들을 제조하는 단계; 기판의 표면 상에 상기 코어 입자들을 단층으로 배열시키는 단계; 상기 코어 입자들이 배열된 상기 기판 상에서 제1 금속의 증착 공정 및 제2 금속의 증착 공정을 순차적으로 수행하여 상기 코어 입자들의 표면 일부를 피복하도록 적층된 전반사 유도층 및 수식층을 각각 형성하는 단계; 상기 수식층에 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 생체인지물질을 결합시키는 단계; 및 상기 코어 입자, 상기 전반사 유도층, 상기 수식층 및 상기 생체인지물질을 포함하는 광학 표지자를 상기 기판으로부터 분리하는 단계를 포함한다.
일 실시예에 있어서, 상기 투명한 코어 입자들은 TEOS(Tetraethylorthosilicate)를 이용한 스토버 방법(Stㆆber method)에 의해 제조된 실리카 코어 입자들을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 기판의 표면 상에 상기 코어 입자들을 단층으로 배열시키는 단계는, 상기 코어 입자들의 표면을 소수성으로 개질한 후 이들을 물 및 공기의 계면에 단층으로 배열시키는 단계; 및 상기 기판을 상기 물의 내부에서 상기 공기 방향으로 인출하여 상기 코어 입자들을 상기 기판의 표면에 부착시키는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 금속 및 상기 제2 금속은 각각 화학적 기상 증착법(chemical vapor deposition, CVD) 또는 물리적 기상 증착법(physical vaopr deposition, PVD)의 방법으로 상기 기판 상에 증착되고, 상기 제1 금속은 알루미늄(Al), 구리(Cu), 금(Au) 및 은(Ag)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함하며, 상기 제2 금속은 백금(Pt), 금(Au) 및 은(Ag)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 전반사 유도층이 상기 코어 입자 표면의 30 내지 70%를 피복하도록 상기 제1 금속이 증착될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 목적 생체물질이 항원 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 항원 물질과 특이적으로 반응하는 항체 단백질 또는 압타머(Aptamer) 물질일 수 있고, 상기 목적 생체물질이 유전자 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 유전자 물질과 상보적인 결합이 가능한 핵산 물질일 수 있으며, 상기 목적 생체물질이 세포신호 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 세포신호 물질과 선택적으로 결합하는 화학적 리간드 물질일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 생체인지물질이 상기 항체 단백질 물질인 경우, 상기 수식층에 상기 생체인지물질을 결합시키는 단계는, 한쪽 말단 혹은 분자구조 내에 다이설파이드기를 구비하고 이와 다른 말단 또는 분자 구조 내에 숙신이미드기를 구비하는 자기조립단분자막(SAM)을 상기 수식층의 표면에 결합시키는 단계; 상기 자기조립단분자막에 아민 말단의 PAMAM 덴드리머를 결합시키는 단계; sulfo-NHS기(N-hydroxysulfosuccinimide group) 및 디아지린기(diazirine group)를 구비하는 가교제(cross-linker)를 상기 PAMAM 덴드리머에 결합시키는 단계; 자외선을 조사하여 상기 항체 단백질의 아민기과 상기 가교제의 디아지린기(diazirine group) 사이의 광가교(photo-crosslinking) 시키는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법은 상기 목적 생체물질과의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 상기 코어 입자의 노출된 표면에 보호막을 형성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 광학 표지자가 투명한 코어 입자 표면의 일부를 피복하는 전반사 유도층을 구비하므로 백색 혼합광과 같이 분광되지 않은 일반광원을 이용하더라도 매우 강한 재귀반사 신호를 생성할 수 있다. 그리고 상기 생체인지물질이 광학 표지자의 표면 중 수식층에만 형성되어 목적 생체물질과 상기 광학 표지자를 결합시킨 경우 상기 코어 입자의 노출면이 광원을 향하도록 배열되므로 보다 강한 재귀반사 신호를 생성할 수 있다. 또한, 전반사 유도층과 수식층 사이에 자성층을 형성하는 경우, 외부에서 자기장을 인가함으로써 상기 광학 표지부(110)의 배향 방향을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 외부 자기장을 이용하여 혼합물 내에서 상기 광학 표지부만을 용이하게 분리할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서를 설명하기 위한 모식도이다.
도 2a 및 도 2b는 도 1에 도시된 광학 표지부의 실시예를 설명하기 위한 단면도들이다.
도 3는 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법을 설명하기 위한 순서도이다.
도 4는 투명 산화물 코어 입자를 제조하는 방법의 일 실시예를 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 기판의 표면 상에 상기 코어 입자들을 단층으로 배열시키는 방법의 일 실시예를 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 핵산 물질인 생체인지물질을 수식층에 수식하는 방법의 일 실시예를 설명하기 위한 도면이다.
도 7은 비오틴(Biotin) 생체인지물질을 수식층에 수식하는 방법의 일 실시예를 설명하기 위한 도면이다.
도 8은 항체 단백질 물질인 생체인지물질을 수식층에 수식하는 방법의 일 실시예를 설명하기 위한 도면이다.
도 9는 실험을 위해 본 발명에 따라 제작된 바이오 센서를 설명하기 위한 모식도이다.
도면 10은 광원으로 상기 3종류의 다이오드 레이저들을 사용한 경우의 상기 시료들에 대한 재귀반사 광의 분석 결과이다.
도면 11은 광원으로 백색 LED를 사용한 경우의 상기 시료들에 대한 재귀반사 광의 분석 결과이다.
도면 12는 항체단백질(mouse IgG)이 자기조립단분자막(SAM), 덴드리머(dendrimer) 그리고 광 가교(photo-crosslinking) 기법을 통해 수식된 광학 표지자(상단) 및 광 가교(photo-crosslinking) 기법의 사용 없이 자기조립단분자막(SAM)만을 이용하여 수식된 광학 표지자(하단)에 대해 형광이 표지된 anti-mouse IgG를 처리한 후의 형광현미경 사진들이다.
도 13a 및 도 13b는 실시예 3의 실험에 대한 실험 결과를 나타내는 이미지들과 그래프이다.
이하, 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서를 설명하기 위한 모식도이고, 도 2a 및 도 2b는 도 1에 도시된 광학 표지부의 실시예를 설명하기 위한 단면도들이다.
먼저 도 1 및 도 2a를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서(100)는 광학적 방식을 통해 목적 생체물질(10)의 유무, 농도 등을 감지할 수 있다. 상기 목적 생체물질(10)은 특별히 제한되지 않으며, 세균, 바이러스 등의 미생물이나 적혈구, 세포, 유전자 물질 등과 같이 단백질, 다당류, 지질 등으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 함유하는 생체물질을 포함할 수 있다.
상기 바이오 센서(100)는 광학 표지부(110), 생체물질 고정부(120), 광원부(130) 및 수광부(140)를 포함할 수 있다. 일 실시예로, 상기 바이오 센서(100)는 목적 생체물질(10)을 상기 생체물질 고정부(120)에 고정한 후 상기 광학 표지부(110)를 상기 목적 생체물질(10)에 선택적으로 결합시키고, 이어서 상기 목적 생체물질(10)에 결합된 상기 광학 표지부(110)에 상기 광원부(130)에서 생성된 광을 조사한 후 상기 수광부(140)에서 상기 광학 표지부(110)에서 재귀반사된 광을 수신하여 이를 분석함으로써 상기 목적 생체물질(10)의 유무, 농도 등을 감지할 수 있다. 이와 달리, 다른 실시예로, 상기 바이오 센서(100)는 상기 목적 생체물질(10)에 상기 광학 표지부(110)를 먼저 결합시킨 후 이를 상기 생체물질 고정부(120)에 결합시키고, 이어서 상기 목적 생체물질(10)에 결합된 상기 광학 표지부(110)에 상기 광원부(130)에서 생성된 광을 조사한 후 상기 수광부(140)에서 상기 광학 표지부(110)에서 재귀반사된 광을 수신하여 이를 분석함으로써 상기 목적 생체물질(10)의 유무, 농도 등을 감지할 수도 있다.
상기 광학 표지부(110)는 상기 광원부(130)로부터 조사된 광을 상기 광원부(130)의 방향으로 재귀반사시킬 수 있고, 상기 목적 생체물질(10)과 선택적으로 결합할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 광학 표지부(110)는 투명한 코어 입자(111), 상기 코어 입자(111)의 일부를 피복하는 전반사 유도층(112), 상기 전반사 유도층(112) 상에 형성된 수식층(113) 및 상기 수식층(113)에 직접 또는 간접적으로 결합된 생체인지물질(115)을 포함할 수 있다.
상기 코어 입자(111)는 구형의 형상을 가질 수 있다. 본 발명에 있어서 '구형'이라 함은 중심으로부터 표면의 모든 지점까지의 반지름들이 동일한 완벽한 구형뿐만 아니라 최대 반지름과 최소 반지름의 차이가 약 10% 미만인 실질적인 구형체도 포함하는 것으로 정의된다.
일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자(111)는 상기 목적 생체물질(10)과의 결합 특성이나 상기 광원으로부터 조사되는 광의 파장과의 관계 등을 고려하여, 약 700nm 이상 5㎛ 이하의 평균 직경을 가질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자(111)는 입사광을 투과시킬 수 있는 투명 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 코어 입자(111)는 투명 산화물이나 투명 고분자 물질 등으로 형성될 수 있다. 상기 투명 산화물은, 예를 들면, 실리카(silica), 글라스(glass) 등을 포함할 수 있고, 상기 투명 고분자 물질은, 예를 들면, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methyl methacrylate)) 등을 포함할 수 있다.
상기 전반사 유도층(112)은 상기 코어 입자(111)의 표면 중 일부를 피복하도록 형성되고, 상기 코어 입자(111) 내부를 진행하는 광의 적어도 일부를 전반사시켜 상기 광원의 방향으로 재귀반사되는 광량을 증가시킬 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 전반사 유도층(112)은 상기 코어 입자(111)의 표면 중 약 30% 이상 70% 이하의 면적을 피복하도록 상기 코어 입자(111)의 표면 상에 형성될 수 있다. 상기 전반사 유도층(112)이 상기 코어 입자(111) 표면의 30% 미만을 피복하는 경우, 상기 코어 입자(111) 내부에 입사된 광 중 재귀반사되지 않고 누설되는 광량이 많아 상기 바이오 센서(100)의 감도가 저하되는 문제점이 있다. 그리고 상기 전반사 유도층(112)이 상기 코어 입자(111) 표면을 70% 초과하여 피복하는 경우, 상기 코어 입자(111) 내부로 입사되는 광량이 감소하여 상기 바이오 센서(100)의 감도가 저하되는 문제점이 있다. 일 예로, 상기 전반사 유도층(112)은 상기 코어 입자(111) 표면의 약 40% 이상 60% 이하를 피복하도록 상기 코어 입자(111)의 표면 상에 형성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자(111) 내부를 진행하는 광의 적어도 일부를 전반사시켜 상기 광원부(130)의 방향으로 재귀반사되는 광량을 증가시키기 위해, 상기 전반사 유도층(112)은 상기 코어 입자(111)보다 굴절률이 작은 물질로 형성될 수 있다. 일 실시예로, 상기 코어 입자(111)는 적어도 360nm 내지 820 nm의 가시광선 파장 영역에서 약 1.4 이상의 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있고, 상기 전반사 유도층(112)은 코어 입자 (111)보다 작은 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있다.
구체적으로, 상기 코어 입자(111)가 가시광선 영역에서 약 1.4 이상의 굴절률을 갖는 투명 산화물 또는 투명 고분자 물질로 형성된 경우, 상기 전반사 유도층(112)은 그보다 작은 굴절률을 갖는 금속 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 전반사 유도층(112)은 532nm 파장의 광에 대해 약 0.22의 굴절률을 갖는 금(Au), 약 0.15의 굴절률을 갖는 은(Ag), 약 1.0의 굴절률을 갖는 알루미늄(Al), 약 0.4의 굴절률을 갖는 구리(Cu), 약 1.2의 굴절률을 갖는 아연(Zn) 등으로부터 선택된 하나 이상의 금속으로 형성될 수 있다.
한편, 상기 전반사 유도층(112)은 상기 코어 입자(111)와 접착력이 강한 물질로 형성되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상기 코어 입자(111)가 투명 산화물로 형성된 경우, 상기 전반사 유도층(112)은 알루미늄(Al) 또는 구리(Cu)로 형성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 광 투과에 의한 광 누설을 방지하고 상기 광학 표지부(110)의 분산성을 향상시키기 위하여, 상기 전반사 유도층(112)은 약 10 내지 100nm의 두께를 가질 수 있다. 상기 전반사 유도층(112)의 두께가 10nm 미만인 경우, 상기 코어 입자(111) 내부에 입사된 광 중 일부가 상기 전반사 유도층(112)을 투과하여 누설되는 문제점이 발생할 수 있고, 상기 전반사 유도층(112)의 두께가 100nm를 초과하는 경우, 상기 광학 표지부(110)의 중량이 커져 액체 내에서의 상기 광학 표지부(110)의 분산성이 저하되는 문제점이 발생할 수 있다.
상기 수식층(113)은 상기 전반사 유도층(112) 표면 상에 형성될 수 있다. 상기 수식층(113)은 생체물질과의 결합이 용이한 금속 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 수식층(113)은 생체물질에 의한 수식이 용이하고 산화 안정성이 우수한 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag) 등과 같은 귀금속으로 형성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 수식층(113)은 상기 전반사 유도층(112)과 독립된 별개의 층으로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 전반사 유도층(112)이 귀금속이 아닌 금속 물질로 형성된 경우, 상기 수식층(113)은 상기 전반사 유도층(112)을 피복하는 귀금속 물질층일 수 있다. 이와 달리, 다른 실시예에 있어서, 상기 수식층(113)과 상기 전반사 유도층(112)은 일체로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 전반사 유도층(112)이 금(Au), 은(Ag) 등과 같이 상기 코어 입자보다 굴절률이 작은 귀금속으로 형성된 경우, 상기 전반사 유도층(112)은 상기 수식층(113)으로도 기능할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 수식층(113)은 상기 광학 표지부(110)의 액체 내부에서의 분산성 및 응집 방지를 위해 약 10 내지 100 nm의 두께를 가질 수 있다.
상기 생체인지물질(115)은 상기 수식층(113)에 직접 또는 간접적으로 결합되고, 목적 생체물질(10)과 선택적으로 결합할 수 있는 물질로 형성될 수 있다. 상기 생체인지물질(115)은 검출하고자 하는 목적 생체물질(10)에 따라 변경될 수 있고, 단백질, 핵산, 리간드 등으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 목적 생체물질(10)이 항원 물질인 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 항원 물질과 특이적으로 반응하는 항체 또는 압타머(Aptamer) 물질일 수 있고, 상기 목적 생체물질(10)이 유전자 물질인 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 유전자 물질과 상보적인 결합이 가능한 DNA(deoxyribonucleic acid), RNA(ribonucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 등과 같은 핵산 물질일 수 있으며, 상기 목적 생체물질(10)이 세포신호 물질인 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 세포신호 물질과 선택적으로 결합하는 화학적 리간드 물질일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 생체인지물질(115)은 상기 수식층(113)에 직접 결합될 수 있다. 예를 들면, 상기 생체인지물질(115)이 상기 수식층(113)의 금속과 결합할 수 있는 작용기를 구비하는 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 작용기와 상기 수식층(113) 금속의 결합에 의해 상기 수식층(113)에 직접 결합될 수 있다. 일 예로, 상기 생체인지물질(115)이 티올기(-SH)를 포함하는 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 티올기와 상기 수식층(113)의 금속 사이의 결합에 의해 상기 수식층(113)에 직접 결합될 수 있다.
다른 실시예에 있어서, 상기 생체인지물질(115)은 분자 구조 내에 상기 수식층(113)의 금속과 결합할 수 있는 제1 작용기 및 상기 생체인지물질(115)과 결합할 수 있는 제2 작용기를 구비하는 자기조립단분자막(self assembled monolayer)과 같은 중간 반응물을 통해 상기 수식층(113)에 결합될 수 있다. 일 예로, 상기 생체인지물질(115)이 아민기를 포함하는 경우, 상기 중간 반응물로는 말단 또는 분자 구조 내에 상기 수식층(113)의 금속과 결합할 수 있는 티올기 또는 다이설파이드기를 구비하고, 이와 다른 말단 또는 분자 구조 내에 상기 생체인지물질(115)의 아민기와 결합할 수 있는 카복실기, 수신이미드기, 알데하이드기 등을 구비하는 물질이 사용될 수 있다.
한편, 상기 생체인지물질(115)은 상기 수식층(113) 표면에만 결합되고, 상기 코어 입자(111)의 노출 표면에는 결합되지 않도록 형성될 수 있다. 이와 같이, 상기 전반사 유도층(112) 및 수식층(113)에 의해 피복된 코어 입자(111)에 대해 상기 생체인지물질(115)을 위치 선택적으로 형성하는 경우, 하기에서 설명되는 바와 같이 목적 생체물질(10)과 결합된 광학 표지부(110)에 있어서 노출된 상기 코어 입자(111) 부분이 광원부(130)를 향하도록 상기 광학 표지부(110)를 배향시킬 수 있으므로, 보다 강력한 재귀반사 신호를 유도할 수 있고, 그 결과 상기 바이오 센서(100)의 감도를 현저하게 향상시킬 수 있다.
본 발명에 있어서는 상기 생체인지물질(115)의 종류에 따라 다양한 방법으로 상기 생체인지물질(115)을 상기 수식층(113)에만 위치 선택적으로 결합시킬 수 있다. 이에 대해서는 후술한다.
일 실시예에 있어서, 상기 광학 표지부(110)는 도 2b에 도시된 바와 같이 상기 전반사 유도층(112)과 상기 수식층(113) 사이에 배치되고, 자성물질로 형성된 자성층(114)을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 자성층(114)은 철 (Fe), 니켈 (Ni), 망간 (Mn), 이들의 소성체 또는 산화물 등과 같은 자성물질로 형성될 수 있다.
상기 광학 표지부(110)가 상기 자성층(114)을 더 포함하는 경우, 외부에서 자기장을 인가함으로써 상기 광학 표지부(110)의 배향 방향을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 외부 자기장을 이용하여 상기 광학 표지부(110)를 포함하는 혼합물 내에서 상기 광학 표지부(110)만을 용이하게 분리할 수 있다.
상기 생체물질 고정부(120)는 기판(121) 및 상기 기판(121) 상에 배치되고 상기 목적 생체물질(10)과 선택적으로 결합하는 고정 물질(122)을 포함할 수 있다.
상기 고정 물질(122)이 결합될 수 있다면 상기 기판(121)의 재질, 형상 등은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 기판(121)으로는 금(Au) 박막이 표면에 형성된 실리콘 기판, 글라스 기판, 고분자 기판, 종이 기판, 금속 기판 등이 사용되거나 상기 고정 물질(122)이 결합될 수 있도록 표면이 개질된 글라스 기판, 고분자 기판, 종이 기판, 금속 기판 등이 사용될 수 있다.
상기 고정 물질(122)은 상기 목적 생체물질(10)과 선택적으로 결합하는 물질일 수 있다. 상기 고정 물질(122)은 검출하고자 하는 목적 생체물질(10)에 따라 변경될 수 있고, 단백질, 핵산, 리간드 등으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 목적 생체물질(10)이 항원 물질인 경우, 상기 고정 물질(122)은 상기 항원 물질과 특이적으로 반응하는 항체 또는 압타머(Aptamer) 물질 일 수 있고, 상기 목적 생체물질(10)이 유전자 물질인 경우, 상기 고정 물질(122)은 상기 유전자 물질과 상보적인 결합이 가능한 DNA(deoxyribonucleic acid), RNA(ribonucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 등과 같은 핵산 물질일 수 있으며, 상기 목적 생체물질(10)이 세포신호 물질인 경우, 상기 고정 물질(122)은 상기 세포신호 물질과 선택적으로 결합하는 화학적 리간드 물질일 수 있다. 즉, 상기 고정 물질(122)은 상기 생체인지물질(115)과 동일한 물질일 수도 있고, 상기 목적 생체물질(10)과 선택적으로 결합하는 다른 물질일 수도 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 고정 물질(122)은 상기 기판(121)에 직접 결합하거나 자기조립단분자막(self assembled monolayer)과 같은 중간 반응물을 통해 상기 기판(121)에 결합될 수 있다. 예를 들면, 상기 고정 물질(122)은 상기 생체인지물질(115)이 상기 수식층(113)에 결합되는 방식과 동일 또는 유사한 방식으로 상기 기판(121)에 결합될 수 있다.
한편, 상기 생체물질 고정부(120)는 상기 기판(121) 상에 배치되어 상기 기판(121)과 함께 목적 생체물질(10)이 함유된 용액을 수용하고 상부로 개구된 공간을 형성하는 측벽(미도시)을 더 포함할 수 있다. 상기 측벽은 상기 기판(121) 상에 결합된 상기 고정 물질(122)을 둘러싸도록 상기 기판(121) 상에 배치될 수 있다. 상기 기판(121)과 함께 상기 목적 생체물질(10)이 함유된 용액을 수용하는 공간을 형성할 수 있다면, 상기 측벽의 구조, 형상, 재질 등은 특별히 제한되지 않는다.
상기 광원부(130)는 상기 생체물질 고정부(120) 상부에 배치되고, 상기 생체물질 고정부(120)의 수용 공간 내에서 상기 목적 생체물질(10)과 결합된 상기 광학 표지부(110)에 광을 조사하는 광원을 포함할 수 있다. 상기 광원으로는 다양한 파장의 광이 혼합된 광을 생성하는 광원이 사용되거나 특정 파장의 단색 광을 생성하는 광원이 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 수광부(140)는 상기 광원부(130)와 이격되도록 상기 생체물질 고정부(120) 상부에 배치되고, 상기 광원부(130)에서 생성되어 상기 광학 표지부(110)에 조사된 광 중 상기 광학 표지부(110)에 의해 재귀반사된 광을 수용하여 상기 목적 생체물질(10)의 유무, 농도 등에 대한 정보를 분석할 수 있다. 상기 재귀반사된 광을 수용하여 상기 목적 생체물질(10)에 대한 정보를 분석할 수 있다면, 상기 수광부(140)의 구성은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 수광부(140)는 일 실시예로, 상기 재귀반사된 광을 직접 확인할 수 있는 현미경을 포함하거나, 다른 실시예로, 상기 재귀반사된 광 신호를 이미지화하는 화상 생성부 및 상기 화상 생성부에 의해 생성된 화상 정보를 분석하는 화상 분석부를 포함하거나, 또다른 실시예로, 상기 광원부(130)로부터 상기 광학 표지부(110)에 입사하는 입사광과 상기 광학 표지부(110)로부터 재귀반사된 광을 분할하는 광분할부, 상기 광분할부에 의해 분할된 광 신호를 집중하고 확대 할 수 있는 렌즈, 확대된 광신호를 수신하여 이미지화하는 화상 생성부 및 상기 화상 생성부에 의해 생성된 화상 정보를 분석하는 화상 분석부를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 생체물질 고정부(120)의 기판(121)으로부터 거울 반사된 광의 영향을 제거하기 위하여, 상기 광원부(130)는 상기 고정 물질(122)이 결합된 상기 기판(121) 표면의 법선에 대해 약 5 내지 60ㅀ 경사진 방향으로 광을 조사할 수 있다.
한편, 상기 수광부(140)가 상기 광분할부, 상기 화상 생성부 및 상기 화상 분석부를 포함하는 경우, 상기 광원부(130)는 상기 기판(121) 표면의 법선에 대해 약 5 내지 60ㅀ 경사진 방향으로 광을 조사하도록 배치될 수 있고, 상기 광 분할부 역시 상기 기판(121) 표면의 법선에 대해 일정한 각도만큼 경사지게 배치되어 상기 광분할부에서 발생하는 광의 거울 반사 영향을 최소화할 수 있다.
도 3는 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법을 설명하기 위한 순서도이다. 상기 제조방법에 의해 제조되는 상기 광학 표지자는 도 1, 도 2a 및 도 2b에 도시된 광학 표지부(110)와 동일한 구조를 갖는다.
도 1, 도 2a 및 도 2b와 함께 도 3을 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서용 광학 표지자(110)의 제조방법은 코어 입자들(111)을 제조하는 단계(S110); 기판의 표면 상에 상기 코어 입자들(111)을 단층으로 배열시키는 단계(S120); 상기 코어 입자들(111)이 배열된 상기 기판 상에서 제1 금속의 증착 공정 및 제2 금속의 증착 공정을 수행하여 상기 코어 입자들(111)의 표면 일부를 피복하도록 적층된 전반사 유도층(112) 및 수식층(113)을 각각 형성하는 단계(S130); 상기 수식층(113)에 생체인지물질(115)을 결합시키는 단계(S140); 및 상기 생체인지물질(115)이 결합된 상기 광학 표지자(110)를 상기 기판으로부터 분리하는 단계(S150)를 포함한다.
상기 코어 입자들(111)을 제조하는 단계(S110)에 있어서, 상기 코어 입자들(111)은 화학적 방법으로 합성될 수 있다.
일 실시예로, 상기 코어 입자들(111)이 투명 산화물로 형성된 경우, 상기 코어 입자들은 스토버 방법(Stㆆber method) 또는 씨드 성장(seed-growth) 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 도 4는 투명 산화물 코어 입자를 제조하는 방법의 일 실시예를 설명하기 위한 도면으로서, TEOS(Tetraethylorthosilicate)를 이용한 스토버 방법(Stㆆber method)에 의해 실리카 코어 입자들을 제조하는 방법을 설명하고 있다.
다른 실시예로, 상기 코어 입자들(111)이 투명 고분자 물질로 형성된 경우, 상기 코어 입자들(111)은 현탁중합, 분산중합, 유화중합 또는 침전중합 등의 방법으로 제조될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 제조된 상기 코어 입자들(111)은 약 700nm 이상 5㎛ 이하의 평균 직경을 가지는 구형의 형상을 가질 수 있다.
상기 기판의 표면 상에 상기 코어 입자들(111)을 단층으로 배열시키는 단계(S120)에 있어서, 상기 코어 입자들(111)은 도 5에 도시된 바와 같이 랭뮤어-블로드젯막(Langmuir-Blodgett film) 공정을 이용하여 상기 기판 상에 단층으로 배열시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 코어 입자들(111)을 상기 기판 표면 상에 단층으로 배열시키기 위하여, 상기 코어 입자들(111)의 표면을 소수성으로 개질한 후 이들을 물 및 공기의 계면에 단층으로 촘촘하게 배열시켜 상기 물과 공기의 계면에 상기 코어 입자들(111)의 랭뮤어-블로드젯막(Langmuir-Blodgett film)을 형성하고, 이를 상기 기판에 전이시킬 수 있다.
상기 전반사 유도층(112) 및 수식층(113)을 각각 형성하는 단계(S130)에 있어서, 먼저 상기 전반사 유도층(112)을 형성하기 위하여 상기 코어 입자들(111)이 단층으로 배열된 상기 기판 상에 제1 금속의 증착 공정을 수행하고, 이어서 상기 제2 금속의 증착을 수행할 수 있다.
상기 제1 금속 및 제2 금속의 증착은 화학적 기상 증착법(chemical vapor deposition, CVD) 또는 물리적 기상 증착법(physical vaopr deposition, PVD)의 방법으로 상기 기판 상에 증착될 수 있다. 다만, 상기 코어 입자들(111)이 열적 안정성을 낮은 경우에는 상기 화학적 기상 증착법보다는 상대적으로 저온에서 공정이 가능한 물리적 기상 증착법(physical vaopr deposition, PVD)을 이용하여 상기 제1 금속 및 제2 금속을 증착하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상기 제1 금속 및 제2 금속은 열증발 진공증착(Thermal evaporation deposition), 스퍼터링 증착(Sputtering deposition) 또는 이온빔 보조증착(e-beam physical vapor depositio, EBPVD) 등의 방법으로 상기 기판 상에 증착될 수 있다. 상기 제1 금속은 알루미늄(Al), 구리(Cu), 금(Au), 은(Ag) 등 굴절률이 약 1.4 이상인 금속일 수 있고, 상기 제2 금속은 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag) 등과 같은 귀금속일 수 있다.
상기 전반사 유도층(112)을 통한 광 투과를 방지하고 상기 광학 표지자(110)의 액체 내에서의 분산성을 향상시키기 위하여, 상기 제1 금속은 약 10 내지 100nm의 두께로 증착될 수 있다. 그리고 상기 광학 표지자(110)의 액체 내에서의 분산성 및 응집 방지를 위해 상기 제2 금속은 약 10 내지 100 nm의 두께로 증착될 수 있다.
상기와 같이 기판 상에 랭뮤어-블로드젯막(Langmuir-Blodgett film)을 형성하도록 상기 구형의 코어 입자들(111)을 배열시킨 후 상기 제1 및 제2 금속을 증착하는 경우, 상기 제1 및 제2 금속의 증착 두께를 조절함으로써 상기 전반사 유도층(112) 및 상기 수식층(113)을 상기 코어 입자들(111) 표면의 약 30 내지 70%를 피복하도록 형성할 수 있다.
상기 수식층(113)에 생체인지물질(115)을 결합시키는 단계(S140)에 있어서, 상기 생체인지물질(115)은 목적 생체물질(10)과 선택적으로 결합할 수 있는 물질일 수 있다. 예를 들면, 상기 목적 생체물질(10)이 항원 물질인 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 항원 물질과 특이적으로 반응하는 항체 또는 압타머(Aptamer) 물질일 수 있고, 상기 목적 생체물질(10)이 유전자 물질인 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 유전자 물질과 상보적인 결합이 가능한 DNA(deoxyribonucleic acid), RNA(ribonucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 등과 같은 핵산 물질일 수 있으며, 상기 목적 생체물질(10)이 세포신호 물질인 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 세포신호 물질과 선택적으로 결합하는 화학적 리간드 또는 세포 리셉터 물질일 수 있다.
상기 생체인지물질(115)은 상기 수식층(113)에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 구체적으로, 상기 생체인지물질(115)이 상기 수식층(113)의 금속과 결합할 수 있는 작용기를 구비하는 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 작용기와 상기 수식층(113) 금속의 결합에 의해 상기 수식층(113)에 직접 결합될 수 있다. 이와 달리, 상기 생체인지물질(115)은 분자 구조 내에 상기 수식층(113)의 금속과 결합할 수 있는 제1 작용기 및 상기 생체인지물질(115)과 결합할 수 있는 제2 작용기를 구비하는 자기조립단분자막(self assembled monolayer)과 같은 중간 반응물을 통해 상기 수식층(113)에 결합될 수도 있다.
상기 생체인지물질(115)은 상기 수식층(113) 표면에만 결합되고 상기 코어 입자(111)의 노출 표면에는 결합되지 않도록 위치 선택적으로 형성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 생체인지물질(115)이 유전자 물질에 대해 선택적으로 반응하는 DNA, RNA, PNA 등의 핵산 물질인 경우, 도 6에 도시된 바와 같이, (i)티올기(-SH)를 상기 핵산 물질에 도입한 후 도입된 상기 티올기를 통해 상기 핵산 물질을 상기 수식층(113)의 금속에 직접 결합시키거나 (ⅱ)한쪽 말단 혹은 분자 구조 내부에 티올기 또는 다이설파이드기를 구비하고 이와 다른 말단 또는 분자 구조 내에 카복실기, 숙신이미드기, 알데하이드기 등으로부터 선택된 하나 이상의 작용기를 구비하는 자기조립단분자막(self assembled monolayer)을 상기 티올기 또는 다이설파이드기를 이용하여 상기 수식층(113)의 금속에 결합시킨 후 아민기가 도입된 상기 핵산 물질을 상기 자기조립단분자막에 결합시키는 방식으로 상기 핵산 생체인지물질(115)을 상기 수식층(113)에만 결합시킬 수 있다.
다른 실시예에 있어서, 상기 생체인지물질(115)이 세포 신호 물질에 대해 선택적으로 반응하는 화학적 리간드 물질인 경우, 한쪽 말단 혹은 분자구조 내에 다이설파이드기를 구비하고 이와 다른 말단 또는 분자 구조 내에 숙신이미드기 또는 알데하이드기를 구비하는 자기조립단분자막(SAM)을 상기 다이설파이드기와 상기 수식층(113)의 금속 사이의 결합을 통해 상기 수식층(113)의 표면에만 결합시킨 후 상기 자기조립단분자막에 아민 말단의 PAMAM 덴드리머(amine-terminated poly(amidoamine) dendrimer)를 수식하고, 여기에 숙신이미드기가 도입된 상기 화학적 리간드를 결합시킬 수 있다. 도 7은 상기와 같은 방법으로 상기 수식층(113)에 비오틴(Biotin)을 위치 선택적으로 수식하는 방법의 일 실시예를 도시하고 있다.
또다른 실시예에 있어서, 상기 생체인지물질(115)이 항원에 대해 선택적으로 결합하는 항체 단백질 물질인 경우, 항체와 같은 단백질 물질은 핵산이나 화학적 리간드에 비해 코어 입자(111)와 수식층(113)에 대한 비특이적 결합이 매우 강하게 일어나기 때문에 보다 정교한 수식방법이 필요하다. 구체적으로, 도 8에 도시된 바와 같이, 한쪽 말단 혹은 분자구조 내에 다이설파이드기를 구비하고 이와 다른 말단 또는 분자 구조 내에 숙신이미드기를 구비하는 자기조립단분자막(SAM)을 상기 다이설파이드기와 상기 수식층(113)의 금속 사이의 결합을 통해 상기 수식층(113)의 표면에만 결합시킨 후 상기 자기조립단분자막에 아민 말단의 PAMAM 덴드리머(amine-terminated poly(amidoamine) dendrimer)를 수식할 수 있다. 이어서, sulfo-NHS기(N-hydroxysulfosuccinimide group) 및 디아지린기(diazirine group)를 구비하는 가교제(cross-linker)를 상기 PAMAM 덴드리머의 아민기와 상기 가교제의 sulfo-NHS기 사이의 공유결합 형성을 통해 상기 PAMAM 덴드리머에 결합시킨 후 암조건에서 BSA 함유 용액을 처리하여 상기 수식층(113)이 형성되지 않은 상기 코어 입자(111)의 노출 표면을 보호할 수 있다. 그 후, 아민기가 도입된 항체 단백질을 제공한 후 자외선을 조사하여 상기 가교제의 디아지린기(diazirine group)와 상기 항체 단백질의 아민기 사이의 광가교(photo-crosslinking)를 유도함으로써, 상기 항체 단백질을 상기 가교제에 결합시킬 수 있다. 이 경우, 상기 가교제로는 sulfo-NHS-diazirine (SDA), NHS-SS-Diazirine(SDAD), sulfo-NHS-SS-Diazirine (sulfo-SDAD), N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide (ANB-NOS), sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate (sulfo-SANPAH) 등이 사용될 수 있다. 한편, 미반응한 가교제 잔기를 차단하기 위해 에탄올아민(ethanolamine)을 처리한 후 다시 자외선을 조사할 수 있다.
상기 광학 표지자(110)를 상기 기판으로부터 분리하는 단계(S150)에 있어서, 상기와 같이 제조된 광학 표지자(110)는 초음파 처리를 통해 상기 기판으로부터 분리될 수 있다.
한편, 상기 기판으로부터 분리된 광학 표지자(110)에 대해서는, 목적 생체물질과의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 상기 코어 입자(111)의 노출된 표면 및 상기 수식층(113) 표면에 보호막을 형성할 수 있다. 예를 들면, 상기 광학 표지자(110)를 BSA(bovine serum albumin)를 함유하는 인산완충용액에 침지시켜 상기 생체인지물질(115)을 제외한 상기 노출된 코어 입자(111) 표면 및 상기 수식층(113) 표면에 상기 보호막을 형성할 수 있다.
이하에서는 본 발명의 실시예에 대해 상술한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 몇 가지 실시 형태에 대한 것으로서, 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
[실시예 1]
시료들(Sample)로, 구형의 실리카 코어 입자 및 이의 표면 50%를 피복하는 알루미늄 전반사 유도층을 포함하는 제1 입자들이 부착된 카본 테이프(carbon tape), 실리카 코어 입자만으로 이루어진 제2 입자들들이 부착된 카본 테이프(carbon tape) 및 어떠한 입자들도 부착되지 않은 카본 테이프(carbon tape)를 준비하였다. 그리고 이들의 분석을 위해 도 9에 도시된 바와 같은 바이오 센서를 제작하였다. 한편, 알루미늄 전반사 유도층이 피복된 실리카 코어 입자는 상기 코어 입자의 노출면이 상기 광원(Light source)을 향하도록 상기 카본 테이프에 부착되었다.
상기 바이오 센서에 있어서, 광원(Light source), 광 분할기(Beam splitter) 및 상기 시료가 일렬로 배치되었다. 상기 시료들 표면에서 발생하는 거울반사의 영향을 제거하기 위해 상기 시료들은 입사광의 진행방향을 기준으로 오른쪽으로 30ㅀ 경사지게 설치되었고, 상기 광 분할기(Beam splitter)로부터 발생될 수 있는 각종 거울반사들의 영향을 배제하기 위해 상기 광 분할기 역시 상기 입사광의 진행방향을 기준으로 오른쪽으로 25ㅀ 경사지게 설치되었다. 한편, 재귀반사된 광의 광량을 분석하기 위하여 상기 수광부(Optical receiver)로는 휴대용 분광기(spectrometer)를 사용하였다.
상기 광원으로 405 nm 파장의 다이오드 레이저, 532 nm 파장의 다이오드 레이저, 655 nm 파장의 다이오드 레이저 및 백색 LED를 각각 사용하여 상기 시료들 각각에 대해 재귀반사된 광량을 측정하였다.
도면 10은 광원으로 상기 3종류의 다이오드 레이저들을 사용한 경우의 상기 시료들에 대한 재귀반사 광의 분석 결과이고, 도면 11은 광원으로 백색 LED를 사용한 경우의 상기 시료들에 대한 재귀반사 광의 분석 결과이다.
도 10을 참조하면, 알루미늄 전반사 유도층이 피복된 실리카 코어 입자가 부착된 카본 테이프에서 가장 강한 재귀반사 신호가 검출되었고, 입자가 부착되지 않은 카본 테이프에서는 재귀반사 신호가 거의 검출되지 않았다. 구체적으로, 정량적인 분석결과 405 nm, 532 nm, 655 nm의 각 파장에서 알루미늄 전반사 유도층이 피복된 실리카 코어 입자가 부착된 카본 테이프가 순수 실리카 입자가 부착된 카본 테이프에 비해 각각 458%, 246%, 180% 강한 재귀반사 신호를 제공하였다.
도 11을 참조하면, 백색 LED 광원에 대한 재귀반사 신호 분석결과도 다이오드 레이저들 광원의 분석결과와 유사하게, 모든 파장에서 알루미늄 전반사 유도층이 피복된 실리카 코어 입자가 부착된 카본 테이프가 순수 실리카 입자가 부착된 카본 테이프보다 강한 재귀반사 신호를 제공하였다.
이상의 사항을 종합하면, 코어 입자에 전반사 유도층을 피복하는 경우 재귀반사되는 광량을 현저하게 향상시킬 수 있고, 또한, 상기와 같은 입자들은 모든 가시광 영역에서 광학 표지자로 사용이 가능함을 확인할 수 있다.
[실시예 2]
도면 12는 항체단백질(mouse IgG)이 자기조립단분자막(SAM), 덴드리머(dendrimer) 그리고 광 가교(photo-crosslinking) 기법을 통해 수식된 광학 표지자(상단) 및 광 가교(photo-crosslinking) 기법의 사용 없이 자기조립단분자막(SAM)만을 이용하여 수식된 광학 표지자(하단)에 대해 형광이 표지된 anti-mouse IgG를 처리한 후의 형광현미경 사진들이다.
도 12를 참조하면, 항체단백질(mouse IgG)이 자기조립단분자막(SAM), 덴드리머(dendrimer) 그리고 광 가교(photo-crosslinking) 기법을 통해 수식된 광학 표지자에서는 상기 항체가 수식층에만 위치 선택적으로 수식되었으나, 항체단백질(mouse IgG)이 광 가교(photo-crosslinking) 기법의 사용 없이 자기조립단분자막(SAM)만을 이용하여 수식된 광학 표지자에서는 상기 항체가 수식층뿐만 아니라 노출된 실리카 코어 입자 표면에도 수식되었음을 확인할 수 있다. 따라서, 생체인지물질이 항체 단백질인 경우, 광 가교(photo-crosslinking) 기법은 상기 항체 단백질의 위치 선택적 수식에 중요한 역할을 수행함을 알 수 있다.
[실시예 3]
심근경색 바이오마커인 cTnI의에 대한 샌드위치 면역분석(sandwich immunoassay)을 수행하였다. 구체적으로, 아민 반응성(Amine-reactive) 자기조립단분자막(SAM)이 형성된 골드 칩(gold chip) 표면에 cTnI 고정화 항체를 수식하고, 다양한 농도의 cTnI (0 ~ 1000 ng/mL)를 반응시킨 후, 이에 대해 cTnI 검출용 항체가 수식된 광학 표지자를 결합시켰다. 이후 해당 센싱 기판들을 광학현미경 상에서 x5 대물렌즈와 백색 LED광원을 사용하여 화상정보를 수득하였다.
도 13a 및 도 13b는 상기 실험에 대한 실험 결과를 나타내는 이미지들과 그래프이다.
도 13a 및 도 13b를 참조하면, cTnI의 농도가 증가할수록 센싱 기판에 나타나는 광학 표지자의 수가 증가하였으며, 이를 Image J 프로그램으로 계수한 결과 도 13b와 같이 나타났다. 도 13b는 3회 반복 실험 결과를 평균한 결과를 도시한 것이다. 제작된 재귀반사 기반의 cTnI 면역센싱 시스템의 검출민감도는 0.03 ng/mL로 계산되었으며, 이는 심근경색 진단에서 Cut-off level로 알려진 0.1 ng/mL 수준을 만족하는 결과이다. 기존의 cTnI 광학 바이오센서들이 복잡한 분광분석 시스템을 이용하여 cTnI를 검출했던 것과 반대로 본 발명에서 구현된 면역센싱 기법에서는 최소한의 광학계와 비분광 백색광원만을 사용했음에도 임상학적으로 의미있는 바이오마커의 검출을 구현할 수 있었다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (25)

  1. 목적 생체물질과 선택적으로 결합하고, 입사광을 재귀반사시키는 바이오 센서용 광학 표지자에 있어서,
    투명한 코어 입자;
    상기 코어 입자 표면의 일부를 피복하고, 적어도 360nm 내지 820nm의 가시광선 파장 영역에서 상기 코어 입자보다 굴절률이 작은 물질로 형성된 전반사 유도층;
    상기 전반사 유도층 상에 형성된 수식층; 및
    상기 수식층에 결합되고, 상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 생체인지물질을 포함하는 바이오 센서용 광학 표지자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 코어 입자는 구형의 형상을 갖고, 투명한 산화물 또는 투명한 고분자 물질로 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 코어 입자는 실리카(silica), 글라스(glass), 폴리스티렌(polystyrene) 및 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methyl methacrylate))로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 물질로 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 코어 입자는 700nm 이상 5㎛ 이하의 평균 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 전반사 유도층은 상기 코어 입자의 표면 중 약 30% 이상 70% 이하의 면적을 피복하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 코어 입자는 상기 가시광선 파장 영역에서 1.4 이상의 굴절률을 갖는 물질로 형성되고,
    상기 전반사 유도층은 상기 가시광선 파장 영역에서 상기 코어 입자보다 작은 굴절률을 갖는 물질로 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 전반사 유도층은 알루미늄(Al), 구리(Cu), 금(Au), 은(Ag) 및 아연(Zn)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질로 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 전반사 유도층은 10 내지 100nm의 두께를 갖는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 수식층은 백금(Pt), 금(Au) 및 은(Ag)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 물질로 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 수식층은 10 내지 100 nm의 두께를 갖는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 생체인지물질은 단백질, 핵산, 리간드 및 리셉터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 목적 생체물질이 항원 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 항원 물질과 특이적으로 반응하는 항체 또는 압타머(Aptamer) 물질이고,
    상기 목적 생체물질이 유전자 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 유전자 물질과 상보적인 결합이 가능한 핵산 물질이며,
    상기 목적 생체물질이 세포신호 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 세포신호 물질과 선택적으로 결합하는 화학적 리간드 물질 또는 세포 리셉터인 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 전반사 유도층과 상기 수식층 사이에 배치되고, 자성 물질로 형성된 자성층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.
  14. 목적 생체물질을 고정하는 생체물질 고정부;
    상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하고, 조사된 광을 재귀반사시킬 수 있는 광학 표지부;
    상기 광학 표지부에 광을 조사하는 광원부; 및
    상기 광학 표지부에 의해 재귀반사된 광을 수용하는 수광부를 포함하는 바이오 센서.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 광학 표지부는,
    구형의 투명한 코어 입자;
    상기 코어 입자 표면의 일부를 피복하고, 상기 코어 입자보다 굴절률이 작은 물질로 형성된 전반사 유도층;
    상기 전반사 유도층 상에 형성된 수식층; 및
    상기 수식층에 결합되고, 상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 생체인지물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 생체물질 고정부는 기판; 및 상기 기판 상에 배치되고 상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 고정 물질을 포함하고,
    상기 광원은 상기 기판 표면의 법선에 대해 5 내지 60ㅀ 경사진 방향으로 광을 조사하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 수광부는, 상기 광학 표지부에 입사하는 입사광과 상기 광학 표지부로부터 재귀반사된 광을 분할하는 광분할부; 상기 광분할부에 의해 분할된 재귀반사 광 신호를 수신하여 이미지화하는 화상 생성부; 및 상기 화상 생성부에 의해 생성된 화상 정보를 분석하는 화상 분석부를 포함하고,
    상기 광분할부는 상기 기판 표면의 법선과 상기 광원과 동일한 방향으로 0 내지 60ㅀ의 각도를 이루도록 설치된 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
  18. 투명한 코어 입자들을 제조하는 단계;
    기판의 표면 상에 상기 코어 입자들을 단층으로 배열시키는 단계;
    상기 코어 입자들이 배열된 상기 기판 상에서 제1 금속의 증착 공정 및 제2 금속의 증착 공정을 순차적으로 수행하여 상기 코어 입자들의 표면 일부를 피복하도록 적층된 전반사 유도층 및 수식층을 각각 형성하는 단계;
    상기 수식층에 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 생체인지물질을 결합시키는 단계; 및
    상기 코어 입자, 상기 전반사 유도층, 상기 수식층 및 상기 생체인지물질을 포함하는 광학 표지자를 상기 기판으로부터 분리하는 단계를 포함하는 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 투명한 코어 입자들은 TEOS(Tetraethylorthosilicate)를 이용한 스토버 방법(Stㆆber method) 또는 씨드성장법 (Seed-growth method)에 의해 제조된 실리카 코어 입자들을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 기판의 표면 상에 상기 코어 입자들을 단층으로 배열시키는 단계는,
    상기 코어 입자들의 표면을 소수성으로 개질한 후 이들을 물 및 공기의 계면에 단층으로 배열시키는 단계; 및
    상기 기판을 상기 물의 내부에서 상기 공기 방향으로 인출하여 상기 코어 입자들을 상기 기판의 표면에 부착시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 제1 금속 및 상기 제2 금속은 각각 화학적 기상 증착법(chemical vapor deposition, CVD) 또는 물리적 기상 증착법(physical vaopr deposition, PVD)의 방법으로 상기 기판 상에 증착되고,
    상기 제1 금속은 알루미늄(Al), 구리(Cu), 금(Au) 및 은(Ag)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함하며,
    상기 제2 금속은 백금(Pt), 금(Au) 및 은(Ag)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 전반사 유도층이 상기 코어 입자 표면의 30 내지 70%를 피복하도록 상기 제1 금속이 증착되는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법.
  23. 제18항에 있어서,
    상기 목적 생체물질이 항원 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 항원 물질과 특이적으로 반응하는 항체 단백질 또는 압타머(Aptamer) 물질이고,
    상기 목적 생체물질이 유전자 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 유전자 물질과 상보적인 결합이 가능한 핵산 물질이며,
    상기 목적 생체물질이 세포신호 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 세포신호 물질과 선택적으로 결합하는 화학적 리간드 또는 세포 리셉터 물질인 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법.
  24. 제18항에 있어서,
    상기 생체인지물질이 상기 항체 단백질 물질인 경우, 상기 수식층에 상기 생체인지물질을 결합시키는 단계는,
    한쪽 말단 혹은 분자구조 내에 다이설파이드기를 구비하고 이와 다른 말단 또는 분자 구조 내에 숙신이미드기를 구비하는 자기조립단분자막(SAM)을 상기 수식층의 표면에 결합시키는 단계;
    상기 자기조립단분자막에 아민 말단의 PAMAM 덴드리머를 결합시키는 단계;
    sulfo-NHS기(N-hydroxysulfosuccinimide group) 및 디아지린기(diazirine group)를 구비하는 가교제(cross-linker)를 상기 PAMAM 덴드리머에 결합시키는 단계;
    자외선을 조사하여 상기 항체 단백질의 아민기과 상기 가교제의 디아지린기(diazirine group) 사이의 광가교(photo-crosslinking) 시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법.
  25. 제18항에 있어서,
    상기 목적 생체물질과의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 상기 코어 입자의 노출된 표면에 보호막을 형성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법.
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