KR20220015206A - 바이오 센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 세포를 측정하기 위해 재귀반사 입자를 도입하여 세포의 생명활동을 고정하고 염색과정을 따로 거치지 않더라도 광학신호를 얻을 수 있는 세포측정 장치 및 방법을 제공한다. 재귀반사 기반 세포측정의 활용예시로서 세포 이동 평가를 수행하였으며, 세포의 이동 혹은 생장도중에 재귀반사 입자를 포획하여 세포 내/외부에 존재하는 상태로 이동하도록 유도하며, 이동된 세포들은 재귀반사 광학계에서 비분광식 광원인 백색광에 의해 세포 내부에서 밝은 점 형태로 관측되며 이들 밝은 점의 수를 개수하여 세포수 및 그 존재를 이미지를 얻음으로써 손쉽게 측정할 수 있는 장점이 있다.

Description

바이오 센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 분석 방법{BIOSENSOR, MANUFACTURING METHOD THEREOF AND ANALYSIS METHOD USING THE SAME}

본 발명은 바이오 센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 분석 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 비분광식 백색광 광원과 이에 대해 강한세기의 신호를 반사시키는 재귀반사 입자를 적용하여, 세포 이동 및 세포 침윤 분석을 수행할 수 있는 보이든 챔버, 이의 제조방법 및 이를 이용한 분석 방법에 관한 것이다.

종래의 면역 및 분자비콘을 비롯한 생물학적 분석물질의 광학적 정량 및/또는 정성 분석을 수행하기 위한 방법은 형광 혹은 발광을 일으키는 신호표지자의 신호세기 감지법을 분자단위의 반응에 적용하는 것이었다. 이러한 형태의 분석법은 신호표지자의 종류에 따라 신호 세기, 안정성 등을 고려하여 최적화가 이뤄져 왔으며, 신규한 신호표지자의 개발에 따라 이에 최적화된 광학 분석법 또한 함께 개발되어 오고 있다. 신호표지자의 형태는 유기화합물, 금속착물화합물, 및 이들을 담지한 입자, 퀀텀닷(quantum dot), 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP) 등으로 대표될 수 있으며, 세기, 안정성, 지속시간, 발광 스펙트럼의 형태 등과 같은 특성에 따라 각 분석목표의 요구사항에 맞추어 다양하게 활용되고 있다.

신호표지자는 세포의 이미징 및 관측을 위한 기술 분야에서도 활발히 응용되고 있으며, 세포 내부 소기관 혹은 세포 내 존재하는 특정 물질을 표적 하는 유기형광분자단을 설계하여 형광신호를 얻어 이미징하는 일은 세포를 대상으로 하는 학계에서는 일상적인 루틴(routine)으로 취급받고 있다. 그러나, 상기 세포 구조체 내 세부타겟을 위한 표지로 사용되는 일도 많지만, 일반적으로 세포를 기판과 구분하기 위해 염색을 수행하는 것이 더욱 일반적인 실험방법으로 여겨진다. 예를 들면, 핵 혹은 세포질을 염색하는 발색단 혹은 형광물질은 세포를 표지하여 단위면적에 존재하는 세포의 수를 세는 일에 사용되기도 하며 실험자가 직접적으로 수행하는 때도 있지만 이미지를 만들어 낸 후 PC 소프트웨어를 사용하기도 한다. 이런 과정에서는 세포의 추가적인 생명활동이 필요 없으므로 일반적으로는 생명활동을 정지시키고 세포의 형태적인 특징을 고정할 수 있는 고정용액을 사용한다. 대표적인 물질로는 포름알데히드, 파라포름알데히드, 글루타르알데히드, 메탄올, 에탄올 등 다양한 물질이 사용된다. 세포 고정과정은 발색단 혹은 형관단의 염색과정을 취하기 전에 필수적으로 이뤄지는 과정이다.

이러한 세포 고정과정 및 염색하는 과정을 포함하고 있는 방법들 중 하나인 보이든 챔버 분석법은 보이든 챔버에 기반을 둔 원기둥 형태의 세포 배양 웰(well)이 얇은 기공막(pore membrane)으로 이분된 형태의 구조체를 가지며, 구조체 내부의 상단부에는 세포를 주입하고 하단부에는 상단부 세포들이 자극받아 이동성을 발현토록 유도하는 물질을 포함한 배양액을 주입하여 기공막을 투과한 세포들의 수를 세어 해당 세포 혹은 투입한 이동성 유발물질의 기능을 평가하는 방법이다. 이 외에도 단일막(monolayer)으로 생장 중인 세포에 물리적으로 스크래치(scratch)를 내어 스크래치가 일어나 부분이 얼마나 빠르게 메워지는지 확인하는 방법, 미세유체 칩에서 이동유도물질을 지속해서 노출시켜 몰려든 세포의 수를 정량하는 방법 등의 수단이 개발되어 현재까지 사용되고 있다. 가장 전통적이면서 현재까지도 많이 사용되고 있는 보이든 챔버 분석방식에서는 세포를 부착시킨 기공막의 반대쪽 면으로 얼마나 많은 세포가 이동했는지 세포수로 확인할 필요성이 있고 이를 위해 전통적으로는 초기에 배양한 세포를 면봉을 이용하여 물리적으로 제거한 뒤, 이동한 면의 세포들을 고정하고 발색단으로 염색하여 현미경으로 세포의 수를 세는 것을 수행한다.

보이든 챔버 분석법은 비교적 간단하면서 명쾌한 방식으로 세포의 이동성능을 평가할 수 있어 현재에도 사용되고 이를 위한 수많은 키트가 상용화되었다. 가장 쉽게 접할 수 있는 키트의 대부분은 일반적인 웰플레이트에 트랜스웰이라는 삽입형 거치식 간이 웰을 구성하고 하단부에 멤브레인을 설치하여 트랜스웰에 주입된 세포들이 초기에는 상층부의 멤브레인에만 존재하다가 웰플레이트와 결합하여 화학유인물질을 접하게 되는 경우 멤브레인 반대쪽으로 세포들이 이동한다. 결과적으로 이동한 세포들을 고정하고 염색하여 세포 수를 측정하는 방식으로 제품이 출시되었고 연구자들이 상기의 방식을 이용하고 있다.

그러나 보이든 챔버 분석법을 활용한 세포 이동성능 평가는 정해진 이동시간이 지난 후에 세포를 고정하고 염색한 후 현미경을 통해 확인해야 이동한 세포 수를 측정할 수 있어, 해당 이동시간이 도달하기 이전까지는 세포의 이동여부는 물론 그 정량적인 결과를 확인할 수 없으므로 모니터링이 불가능한 단점이 있다. 또한, 이는 분석 종료 시점에서만 결과 확인이 가능하여 초기 실험설계 과정에서 무의미한 조건탐색 실험이 수반되어야 한다는 단점을 지닌다. 왜냐하면 이동한 세포들의 고정, 염색과정을 필수적으로 도입한 배경에는 트랜스웰 구조물에서 멤브레인 즉 기공막을 기준으로 상/하단면의 구분이 제한되기 때문이다. 예를 들면, 기공막 반대편으로 이동한 세포와 트랜스웰에 초기 투입된 세포들은 얇은 두께의 멤브레인을 사이에 두고 부착되어 세포가 이동하는 도중의 기공막을 투과한 세포들을 명확하게 구분하기 위해서, 발색단 혹은 형광단 염색 과정을 수행한 후 세포수를 관측해야한 다. 이들 한계점을 해결하기 위해 세포 내/외부에 광학표지자를 수식하여 기공막을 투과한 후 하층부로 이동한 세포들을 개수 함으로써 해결하는 방법이 개발되었다.

형광이라는 광학적 현상에 있어 광원에 의해 들뜬상태가 되어 발광파장을 방출하는 형광염료는 그 자체만으로는 안정적이라 할 수 있겠으나, 반응 간에 지속적으로 노출되는 물 분자, 기타 전자전달물질에 의한 소광(quenching), 형광물질 간의 자가소광(self-quenching)과 더불어 일정 세기 이상의 여기광에 의한 광열화(photobleaching) 역시 유도될 가능성이 있어 안정적인 신호검출을 위한 형광물질의 선정에 수많은 시행착오를 겪어야 한다. 따라서 유/무기 분자단 기반의 형광 신호표지자의 경우 갖추어진 여기광 및 발광파장에 따른 광학 필터링과 빛샘 현상을 비롯한 광학장비의 사양에 최적화가 선행되어야 한다는 한계점을 갖는다. 더불어 세포와 같은 생체조직의 화상검출법에 있어 대부분의 유/무기 형광 분자단의 활용이 기피되는데 이는 해당 분자단의 여기광 파장이 400 nm 에 근접한 경우가 대다수이며 세포를 투과한 여기 파장(excitation wavelength)이 핵 내부의 유전물질 (DNA, RNA)를 비롯한 단백질의 변성, 파괴를 유발할 수 있는 자외선 영역이기 때문에 세포의 활성을 화학적으로 고정시킬 목적이 아니라면 살아있는 세포 활성에 관한 연구결과를 얻기 힘들다는 한계점을 지닌다. 앞선 한계점들을 포함하는 종래 형광 및 광학적 세포분석 기법의 세부예시를 들자면 첫 번째로 세포 내 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein) 혹은 루시페레이스(luciferase)를 활용한 관측법이 있다. 이들은 세포 내에서 발현시키기 위해 바이러스성 벡터(viral vector)를 도입하여 (transfection) 실제 세포자체의 활성에 영향을 미칠 수 있는 변인을 추가하는 형태이다. 두 번째로 양자점(quantum dot)을 이용하는 경우, 세포 내 환경이 양자효율을 낮추는 문제 및 양자점을 구성하는 중금속에서 기인한 세포독성을 세포 내부로 도입해야 한다는 문제점을 갖기에 세포의 관측에는 한계를 갖는다.

형광염료들로부터 형광신호 검출을 위해서는 조사된 여기광과 그에 감응하여 형광염료에서 유도되는 형광신호를 분리해내는 것이 우선되어야 하며, 따라서 별도의 발광필터(emission filter)가 필수적이다. 또한, 형광신호의 민감한 검출을 위해서는 광증배관(photomultiplier tube, PMT)과 같은 고가의 수광장비가 필수적이며 이에 더하여 이들 광학부품들 사이의 매우 정교한 배열과 조립을 요구하므로 보다 범용적인 목적으로 세포관측을 수행한다는 목적으로의 장비구현에 있어 제한요인으로 작용한다.

생체물질의 광학적 분석방법은 타겟 분자의 유무를 분석하는데 그치지 않고 생체유래 검체에서 나타나는 생명현상의 관측에 이르기까지 넓게 활용되고 있으며, 이들 장치의 범용적 활용을 위한 단순화는 필수적이다.

따라서 본 발명의 일 목적은 종래의 세포 이미징 및 관측에 사용되는 발색단 및 형광단 표지자들을 지양하고 세포 이동능력 평가의 종료시점에서만 확인할 수 있었던 세포 이동양상을 실시간으로 파악하면서 이를 관측하는데 사용되는 장비의 간소화를 수행하고자 재귀반사 입자를 세포질 내/외부로 수식한 후 화학유발인자에 의해 이동한 세포들을 재귀반사 광학계로 관측함으로써 실시간으로 세포들이 이동하는 모습을 관측하는 동시에 복잡한 광학계를 사용하지 않더라도 재귀반사 신호를 손쉽게 얻을 수 있는 방법론을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법론이 적용된 바이오 센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 분석 방법을 제공하는 것이다.

종래의 수단에서는 이동한 세포의 정량적인 개수를 수행하기 위해 세포의 생명활동을 고정(fixation)하고, 발색/형광물질을 이용한 염색과정(dye staining)을 거쳐 현미경으로 관측하였다. 그러나, 본 발명에서는 재귀반사 입자를 세포의 표지자로 사용함으로써 이동 혹은 침윤 세포들의 생명활동을 고정하지 않는 동시에 염색 혹은 발색과정을 거치지 않고 원하는 시점에 실시간으로 세포의 거동을 관측하고자 하였다. 이를 위해 본 발명에서는 재귀반사 입자를 트랜스웰의 하부층에 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 물질에 혼합하고 기공을 갖는 멤브레인에 코팅하고, 이들 코팅층을 투과한 화학유인물질(chemoattractant)에 의해 코팅층을 지나 기공을 이동하는 와중에 세포질 내부로 재귀반사 입자가 투입되도록 설계하였다. 세포의 세포질 내부로 RJP가 투입된 상태로 화학유인물질에 유도되어 트랜스웰 하단의 멤브레인을 투과한 경우 트랜스웰을 지지하는 하부 구조물 웰(well)로 이동하고 이들 세포는 하단부 표면에 부착하게 된다. 이후, 재귀반사 광학계를 통해 세포 내부에 존재하는 재귀반사 입자 기반 재귀반사 신호를 얻을 수 있다.

본 발명에 따르면, 세포에 수식되는 재귀반사 입자는 종래의 발색단/형광단 염색과정을 거치기 위해 따로 세포를 고정하거나 실험과정을 구성하지 않더라도 세포가 화학유인물질에 반응하여 이동하는 과정 중에 자연스럽게 섭식 혹은 포획하여 세포 내/외부로 재귀반사 입자를 수식할 수 있도록 하여 세포의 생명활동에 지장을 주지 않는 상태에서 표지자를 수식할 수 있다는 장점을 지니며, 살아있는 세포의 이동양상을 실시간으로 모니터링을 수행할 수 있다. 또한, 이들이 이동한 후에도 세포에 존재하여 재귀반사 광학계에 해당 세포들이 담겨있는 웰플레이트를 설치하는 것만으로도 광학현미경을 통해 세포로부터 반사된 재귀반사 신호를 용이하게 이미지 형태로 얻을 수 있고, 이들을 소프트웨어를 이용하여 손쉽게 재귀반사 입자들을 개수함으로써 관측하고자 하는 세포의 정량적인 분석을 수행할 수 있다.

또한, 일반적인 광학 현미경에 극히 단순한 광원장치를 추가함으로써 재귀반사를 유도할 수 있어 기존의 상용화된 시스템에 그대로 적용이 가능하고, 기존 상용화 키트에 재귀반사 입자층을 코팅하는 것만으로도 동일한 효과를 누릴 수 있기 때문에 넓은 범용성을 갖는다. 또한, 세포 이동능 평가시험에서 나타나는 세포의 거동을 시간대별로 관측할 수 있기 때문에 실험을 새로이 접하는 실험자에게 최적화를 수행하도록 강요되지 않는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서를 설명하기 위한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서의 제조방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 3a 및 도 3b는 도 1에 도시된 바이오 센서를 이용한 분석 방법을 설명하기 위한 도면들이다.
도 4는 본 발명의 실험예 1을 설명하기 위한 재귀반사 입자 농도별 세포독성 평가를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실험예 2를 설명하기 위한 광시야 및 재귀반사 설정을 통해 관측한 RJP를 포획한 세포를 나타내는 이미지이다. 도 5의 ①은 광학현미경의 광시야를 통해 관측한 재귀반사 입자를 포획한 RAW 264.7 세포 라인(cell line)의 이미지(200 배율)이고, ②는 재귀반사를 유도하기 위한 백색광원을 조사하여 획득한 재귀반사 입자의 재귀반사 신호 이미지(200 배율)이다.
도 6은 본 발명의 실험예 3을 설명하기 위한 화학유인물질에 의해 하층부로 이동한 세포의 광시야 및 재귀반사 신호 이미지이다. 도 6의 ①은 현미경의 광시야, ②는 현미경의 광시야 광원을 끈 뒤 측면 백색광을 이용한 재귀반사 광학설정, ③은 광시야를 통해 얻은 현미경 이미지(100 배율) 및 ④는 재귀반사 설정을 통해 얻은 현미경 이미지(100 배율)를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 실험예 4를 설명하기 위한 MCP-1 농도증가에 따라 이동된 세포의 수 변화를 나타내는 도면으로, 상단의 검정 이미지는 재귀반사 이미지를 나타내며, 하단의 밝은 이미지는 광시야 이미지를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 실험예 5를 설명하기 위한 실제 세포수와 측정된 RJP 개수의 상관관계를 나타낸 도면이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

세포의 이동성능 분석은 암을 비롯한 질환진단에 주요한 지표가 되며 구체적인 예시로는 암세포 전이능력 분석 혹은 면역세포의 면역원성 활성여부를 판단할 수 있다. 관측 목표 세포의 이동 성능 변화는 세포의 성상변화에 크게 관여되며, 이를 관측함으로써 질환 진단의 지표로 사용될 수 있다.

이를 위한 대표적인 세포 이동성능 평가는 크게 두 가지로 나누어지며 단순히 세포가 화학유인물질 (chemoattractant)에 대한 화학주성을 나타내어 특정 구간을 이동할 수 있는지 확인하는 세포 이동분석 (migration assay)과 세포가 특정 조직을 투과하는 성능을 확인하는 세포 침윤분석 (invasion assay)로 나눠진다.

상기와 같은 두 가지 분석방법을 수행하기 위한 기구부 및 실험절차는 전통적인 보이든 챔버(Boydens chamber)를 이용한 것에서 상처 치유 분석(wound healing assay), 미세유체 칩 (microfluidic chip) 플랫폼 등을 활용한 이동/침윤성능 평가와 같이 여러가지 방식이 있으나 본 발명에서는 보이든 챔버 분석법을 토대로 재귀반사 기반 세포측정 방법론을 도입하였다.

바이오 센서

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서를 설명하기 위한 모식도이다.

도 1을 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서는 트랜스웰 구조물 및 상기 트랜스웰 구조물을 거치하는 웰플레이트의 웰을 포함하는 보이든 챔버, 광원부 및 수광부를 포함할 수 있다.

이하에서는, 상기 보이든 챔버의 트랜스웰 구조물을 "제1 챔버"로, 상기 웰플레이트의 웰을 "제2 챔버"로 지칭한다.

상기 제1 챔버는 관찰하고자 하는 세포를 담을 수 있는 내부공간을 구비하는 구조물로, 상기 제1 챔버는 내부에서 외부로 이동할 수 있도록 관통된 복수개의 미세 기공들을 포함하는 멤브레인 구조의 바닥면. 상기 바닥면으로부터 상부로 연장되어 상기 바닥면과 함께 상기 내부공간을 형성하는 측벽 및 상기 바닥면 상에 형성되고 내부에 재귀반사 입자들을 포함하는 코팅층을 포함할 수 있다.

상기 제1 챔버의 멤브레인 구조의 바닥면은 고분자 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 멤브레인은 폴리스티렌(polystyrene) 및 폴리에틸렌(polypropylene), 폴리카보네이트(polycarbonate) 재질 등과 같은 물질로 형성될 수 있다. 상기 미세 기공은 세포를 통과시키 위해 형성된 구멍(hole)일 수 있고, 상기 미세 기공의 크기는 세포가 상기 제1 챔버에서 외부로 이동할 수 있는 크기라면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 미세 기공의 크기는 약 3 내지 10 ㎛일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 미세 기공의 크기는 약 8 ㎛일 수 있다.

상기 코팅층은 겔(gel)형태의 매트릭스 및 상기 매트릭스 내부에 분산된 상기 재귀반사 입자들을 포함할 수 있다. 상기 매트릭스는 세포독성을 나타내지 않는 생체적합성 물질로 형성될 수 있다. 예를 들어, 상기 매트릭스는 제1형 내지 제4형 콜라겐(collagen type 1~4형), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 젤라틴(gelatin), 폴리락테이트-co-글라이콜릭산(poly(lactic-co-glycolic acid)), 히알루론산 및 세포외기질(Extracellular matrix, ECM) 물질 등으로 형성될 수 있다 일 실시예로, 상기 매트릭스는 세포외기질 물질(ECM)로 형성될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 세포가 특정 영역만을 통해 이동할 수 있도록 하여 세포 이동의 관측 편의성을 제공하기 위해, 상기 코팅층은 세포가 이동할 수 있는 제1 영역 및 세포가 이동할 수 없는 제2 영역을 포함할 수 있고, 이 경우, 상기 재귀반사 입자들은 상기 제1 영역에만 존재할 수 있다. 예를 들면, 상기 제1 영역은 상기 바닥면의 가운데 부분에 위치하고, 상기 제2 영역은 상기 제1 영역을 둘러싸도록 위치할 수 있다.

일 실시예로, 상기 제1 영역 및 상기 제2 영역은 상기 매트릭스를 형성하는 생체적합성 물질의 농도를 조절함으로써 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 제1 영역은 상기 생체적합성 물질이 저농도로 함유된 용액을 이용하여 형성되고, 겔 형태로 존재할 수 있다. 그리고 상기 제2 영역은 상기 생체적합성 물질이 저농도로 함유된 용액을 이용하여 형성되고, 고밀도 겔 또는 고체 상태로 존재할 수 있다.

재귀반사 입자는 입사광을 광원방향으로 반사시키는 재귀반사 현상을 일으키는 입자로, 그 크기보다 작은 파장의 입사광에 대해서 재귀반사 현상을 유도할 수 있다. 또한, 가시광선 파장이 다양하게 존재하는 비분광식 백색광에서도 용이하게 재귀반사를 유도시킬 수 있으며, 세포의 표면 또는 세포 내부에 위치하여도 재귀반사를 유도할 수 있다.

일 실시예로, 상기 재귀반사 입자는 투명한 코어 입자, 상기 코어 입자의 일부를 피복하여 입사광의 전반사를 유도하는 반사층을 포함할 수 있다. 한편 상기 재귀반사 입자는 상기 코어 입자 또는 상기 반사층에 수식되어 관찰하고자하는 세포와 선택적으로 결합할 수 있는 제1 생체인지물질을 더 포함할 수 있다.

상기 코어 입자는 구형의 형상을 가질 수 있다. 본 발명에 있어서 '구형'이라 함은 중심으로부터 표면의 모든 지점까지의 반지름들이 동일한 완벽한 구형뿐만 아니라 최대 반지름과 최소 반지름의 차이가 약 10% 이하인 실질적인 구형체도 포함하는 것으로 정의된다. 상기 코어 입자는 상기 관찰하고자 하는 세포와의 결합 특성, 상기 광원으로부터 조사되는 광의 파장과의 관계, 상기 검출 용액 내에서의 침강 특성 등을 고려하여, 약 500nm 이상 5㎛ 이하, 예를 들면, 약 700㎚ 이상 1㎛이하의 평균 직경을 가질 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자는 입사광을 투과시킬 수 있는 투명 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 코어 입자는 투명 산화물이나 투명 고분자 물질 등으로 형성될 수 있다. 상기 투명 산화물은, 예를 들면, 실리카, 글라스 등을 포함할 수 있고, 상기 투명 고분자 물질은, 예를 들면, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methyl methacrylate)) 등을 포함할 수 있다.

상기 제1 생체인지물질은 관찰하고자하는 세포와 선택적으로 결합할 수 있는 물질로 형성될 수 있고, 관찰하고자하는 세포의 종류에 따라 변경될 수 있다. 예를 들면, 상기 제1 생체인지 물질은 표면 단백질과 특이적 반응을 나타내는 항체 또는 리간드 기능기일 수 있다. 일 실시에에서, 상기 제1 생체인지물질은 코어 입자의 노출면에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다.

한편, 상기 제2 챔버는 제1 챔버로부터 이동한 세포를 담을 수 있는 내부 공간을 구비하고, 상기 제1 챔버를 지지하도록 상기 제1 챔버와 결합될 수 있다. 상기 제1 챔버와 상기 제2 챔버가 결합된 상태에서, 상기 제1 챔버의 적어도 일부, 예를 들면, 바닥면은 상기 제2 챔버의 내부공간 내에 배치될 수 있다.

상기 제2 챔버는 상기 제1 챔버의 바닥면과 이격되게 배치되는 바닥부 및 상기 바닥부로부터 상부로 연장되어 상기 내부공간을 형성하는 측벽을 포함할 수 있다. 일 실시예로, 상기 제2 챔버의 바닥부는 상기 광원부에서 조사된 광을 투과시켜 재귀반사 신호를 얻을 수 있도록, 광이 투과할 수 있는 물질로 형성될 수 있다. 예를 들어, 상기 제2 챔버의 바닥부는 PMMA(Poly(methyl methacrylate)), PC(polycarbonate), PS(polystyrene) 등과 같은 투명한 고분자 재질로 형성될 수 있다. 그러나 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 광이 투과할 수 있는 물질이면 어느 물질이든 사용할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 제1 챔버의 내부공간에는 배양액과 세포가 수용될 수 있고, 상기 제2 챔버의 내부공간에는 배양액과 화학유인물질이 수용될 수 있다. 상기 배양액은 상기 세포의 생장을 저해하지 않는 물질이라면 제한 없이 적용될 수있다. 그리고 상기 화학유인물질은 상기 세포의 이동 능력을 활성화시키는 물질로서, 세포의 이동 능력을 활성화시킬 수 있는 물질이라면 제한 없이 적용될 수 있고, 세포에 따라 변경될 수 있다. 예를 들면, 상기 화학유인물질은 대식세포에 효과가 있는 단핵구 화학주성단백질(monocytechemoattractant protein-1, MCP-1) 등과 같은 물질을 포함할 수 있다.

일 실시예로, 상기 제1 챔버와 상기 제2 챔버가 결합된 상태에서, 상기 화학유인물질(chemoattractant)은 제1 챔버로 확산되어 상기 제1 챔버의 세포들의 이동 능력을 활성화시킬 수 있고, 상기 제1 챔버의 내부공간에 수용된 세포는 상기 멤브레인 구조의 바닥면을 통해 상기 제2 챔버의 내부공간으로 이동할 수 있다. 이 때, 상기 세포는 상기 재귀반사 입자가 내부에 포함된 코팅층을 통과하게 되는데, 상기 세포는 상기 코팅층을 통과하는 동안 섭식 또는 식균 작용을 통해 상기 재귀반사 입자를 내부에 함유한 상태 또는 상기 재귀반사 입자 표면의 제1 생체인지물질과 세포의 선택적 반응에 의해 상기 재귀반사 입자가 표면에 결합된 상태로 상기 제2 챔버의 내부공간으로 이동할 수 있고, 상기 제2 챔버의 내부공간으로 이동한 세포들은 상기 제2 챔버의 바닥부 표면에 부착될 수 있다.

상기 광원부 및 상기 수광부는 상기 제2 챔버 하부에 배치될 수 있다. 상기 광원부는 상기 제2 챔버의 바닥부 방향으로 광을 조사할 수 있고, 상기 수광부는 상기 제2 챔버의 바닥부에 부착된 세포 내에 함유되거나 이의 표면에 결합된 재귀반사 입자에 의해 재귀반사된 광을 수용한 후 상기 재귀반사 입자들에 대한 정량 정보를 생성할 수 있다.

일 실시예로, 상기 광원부의 광원은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 백색광을 생성하는 백색 LED를 포함할 수 있다. 그리고 상기 수광부는 상기 재귀반사된 광에 대한 이미지를 생성할 수 있는 광학 현미경 및 상기 광학 현미경에 의해 생성된 이미지를 분석하여 상기 재귀반사 입자의 수를 계수할 수 있는 이미지 처리장치 등을 포함할 수 있다. 재귀반사된 광의 이미지를 생성할 수 있고, 상기 이미지로부터 재귀반사 입자의 수를 계수할 수 있다면, 상기 수광부의 구성은 특별히 제한되지 않는다. 한편, 상기 수광부는 상기 재귀반사 입자 수의 변화를 실시간으로 계수함으로써, 세포의 이동 정보를 실시간으로 분석할 수 있다.

본 발명의 바이오 센서에 따르면, 관찰 대상인 세포가 상기 제1 챔버의 내부공간으로부터 상기 제2 챔버의 내부공간으로 이동하는 과정에 재귀반사 입자를 섭식하여 내부에 수용하거나 재귀반사 입자와 선택적으로 반응하여 이와 결합될 수 있다. 따라서, 상기 제2 챔버의 내부공간에 위치하는 재귀반사 입자에 광을 조사한 후 재귀반사되는 광을 분석함으로써 상기 세포의 이동을 실시간으로 감지할 수 있다.

바이오 센서의 제조방법

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서의 제조방법을 설명하기 위한 도면이다. 특히, 도 2는 제1 챔버의 바닥면 중 특정 영역을 통해서만 세포의 이동을 유도할 수 있는 코팅층의 형성방법을 설명한다. 이하 설명의 편의를 위해, 상기 코팅층 중 세포가 이동할 수 있는 부분을 투과 영역부라고 하고, 세포가 이동할 수 없는 부분을 찬단 영역부라고 한다.

도 2를 참조하면, 상기 투과 영역부 및 상기 차단 영역부를 구비하는 코팅층을 형성하기 위해, 먼저 도 2의 ① 및 ②에 도시된 바와 같이, 상기 제1 챔버의 바닥면 중 상기 투과 영역부에 대응되는 영역에 디스크를 부착한 후, 상기 디스크에 의해 커버되지 않은 영역에 고농도의 생체적합 물질을 배양액과 혼합하여 준비된 제1 조성물을 도포하여, 상기 차단 영역부를 형성할 수 있다. 이 때, 상기 디스크는 상기 제1 챔버의 바닥면보다 작은 면적을 갖는 원형 플레이트를 구조를 가질 수 있다. 상기 디스크의 재료는 특별히 제한되지 않지만, 상기 제1 챔버의 바닥면에 한시적으로 부착이 가능한 재료인 것이 바람직하다.

일 실시예로, 상기 차단 영역부를 형성하기 위해, 상기 제1 용액을 상기 제1 챔버의 바닥면 중 상기 디스크에 의해 커버되지 않은 영역에 도포한 후 약 2 내지 6℃에서 약 10 내지 14시간 동안 기포를 제거할 수 있고, 이어서, 약 35 내지 40℃의 온도에서 약 1 내지 3시간 동안 상기 도포된 제1 조성물을 겔화할 수 있다.

이어서, 도 2의 ③ 및 ④에 도시된 바와 같이, 상기 디스크를 제거한 후 상기 디스크에 대응되는 공간에 저농도의 생체적합 물질 및 재귀반사 입자들을 배양액과 혼합하여 준비된 제2 조성물을 도포하여 상기 투과 영역부를 형성할 수 있다.

일 실시예로, 상기 투과 영역부를 형성하기 위해, 상기 생체적합 물질, 상기 배양액 및 상기 재귀반사 입자 수용액을 약 25~35 : 850~900 : 90~110의 부피비로 혼합하여 상기 제2 조성물을 준비할 수 있고, 상기 제2 조성물을 상기 제거된 디스크에 대응되는 공간에 도포한 후 약 2 내지 6℃에서 약 10 내지 14시간 동안 기포를 제거할 수 있고, 이어서, 약 35 내지 40℃의 온도에서 약 1 내지 3시간 동안 상기 도포된 제2 조성물을 겔화할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 생체적합성 물질은 ECM을 이용할 수 있다. ECM은 일반적인 세포침윤 분석에서 널리 사용되며 세포외기질을 사용한 코팅은 다른 세포조직의 형태적 특성을 모사한 것으로, 세포독성을 나타내지 않으면서 원하는 물질을 겔(gel) 형태로 코팅 시킬 수 있는 장점이 있다.

상기 제2 조성물에 있어서, 상기 생체적합성 물질은 희석된 농도를 가질 수 있다. 예를 들면, 상기 생체적합성 물질은 약 10 내지 30배 희석된 농도를 가질 수 있다. 고농도의 생체적합성 물질을 사용하여 코팅층을 형성하는 경우에는 세포가 코팅층을 투과하는 것이 매우 어려울 수 있다. 따라서 바람직하게는 상기 생체 적합성 물질은 약 10 내지 30배의 희석된 농도를 가질 수 있다.

상기 배양액은 관측하고자하는 세포를 배양할 수 있는 배양액으로, 상기 세포에 따라 각각 다른 종류의 배양액을 사용할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 배양액은 DMEM(Dulbeccos Modified Eagles Medium) 일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 제1 챔버의 바닥면 상에 상기 투과 영역부 및 상기 차단 영역부를 포함하는 코팅층을 형성한 후 추가적으로 세척 및 건조 과정을 수행할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 세척은 인산완충액 및 초고순도 물(ultrapure water)을 이용하여 수행될 수 있고, 상기 건조는 상온에서 수행될 수 있다.

바이오 센서를 이용한 분석 방법

도 3a 및 도 3b는 도 1에 도시된 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서를 이용한 분석 방법을 설명하기 위한 도면들이다.

도 1과 함께 도 3a 및 도 3b를 참조하면, 먼저 세포 이동 성능 평가를 위해, 세포를 제1 배양액과 함께 제1 챔버의 내부공간에 투입한 후 상기 세포를 배양할 수 있다.

상기 제1 배양액은 화학유인물질의 효과를 증대시키기 위해, 일반적으로 사용하는 세포 생장을 위한 완전 배양액(complete medium)을 이용하는 것이 아닌, 우태혈청(fetal bovine serum, FBS) 등과 같은 혈청(serum)이 제거된 무혈청(serum-free) 배양액을 사용할 수 있다. 이는 화학유인물질의 효과를 극대화하기 위한 것으로 세포 생장을 위한 생장 인자(growth factor)를 포함한 여러 케모카인(chemokine) 인자가 혈청(serum)에 다수 포함되어 있기 때문일 수 있다.

상기 세포의 밀도는 세포의 종류에 따라 변경될 수 있다. 일 실시예로, 상기 세포의 밀도는 12 웰 플레이트 기준 약 5x10⁵ cell/mL 일 수 있다.

이어서, 상기 제2 챔버의 내부공간에 화학유인물질 및 제2 배양액을 투입한 후 상기 배양된 세포를 수용하고 있는 상기 제1 챔버를 상기 제2 챔버와 결합시킬 수 있고, 이 때 적어도 상기 제1 챔버의 바닥면은 상기 제2 챔버의 내부공간에 수용된 제2 배양액 내에 잠길 수 있다.

이와 같이 적어도 상기 제1 챔버의 바닥면은 상기 제2 챔버의 내부공간에 수용된 제2 배양액 내에 잠긴 상태에서 유지시키는 경우, 상기 화학유인물질은 상기 제1 챔버의 내부공간으로 확산될 수 있고, 확산된 상기 화학유인물질에 의해 이동능력이 활성화된 세포가 상기 제1 챔버의 내부공간에서 상기 제2 챔버의 내부공간으로 이동할 수 있다. 이 때, 상기 세포는 상기 코팅층을 통과한 후 상기 제1 챔버의 바닥면에 형성된 기공을 통해 상기 제2 챔버로 이동하게 되고, 상기 세포가 상기 코팅층을 통과하는 동안 상기 코팅층 내부에 있던 재귀반사 입자가 상기 세포 내부로 이동하거나 상기 세포에 결합되어 상기 세포와 함께 상기 제2 챔버로 이동할 수 있다. 예를 들면, 상기 활성화된 세포가 상기 코팅층을 통과하는 과정에서, 상기 세포들은 섭식(uptake) 혹은 면역세포의 경우에는 식균작용(phagocytosis)에 의해 상기 재귀반사 입자를 세포질 내부로 포획할 수 있다. 상기 재귀반사 입자를 포획한 상태에서 상기 제2 챔버의 내공간으로 이동한 세포는 상기 제2 챔버의 바닥부의 표면에 부착될 수 있다.

상기 세포의 이동은 약 6 내지 48 시간 동안 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 세포의 이동은 약 20 내지 28시간 동안 수행될 수 있다. 또한, 상기 세포의 이동은 약 35 내지 38℃의 온도 및 약 3 내지 7% 이산화탄소 조건에서 수행될 수 있다.

이어서, 상기 제2 챔버에 부착된 세포에 광을 조사하여 상기 세포에 결합되어 있거나 상기 세포의 내부에 포획된 재귀반사 입자에 의한 재귀반사를 유도할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 세포에 조사되는 광은 백색광일 수 있다. 상기 광은 상기 제2 챔버의 하부에서 조사되어 상기 제2 챔버의 바닥부를 통해 입사될 수 있고, 상기 재귀반사 입자에 의해 재귀반사된 광은 상기 제2 챔버의 바닥부를 투과하여 상기 수광부에 도달할 수 있다.

이어서, 상기 재귀반사 입자에 의해 재귀반사된 광학 신호를 상기 수광부가 이미지화한 후 이를 통해 상기 재귀반사 입자의 정량분석을 수행할 수 있다. 이 때, 상기 수광부는 광학현미경를 포함할 수 있고, 상기 재귀반사 입자에 대한 정량 분석을 통해 상기 세포의 이동 성능을 분석할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 광원부 및 상기 수광부는 백색 LED 및 일반적인 광학 현미경을 통해 구현할 수 있다. 한편, 상기 수광부에 의해 생성된 광학 이미지에서는, 세포 내/외에 존재하는 재귀반사 입자에 의해 반사된 재귀반사 신호가 빛나는 점 형태로 나타날 수 있고, 이러한 빛나는 점의 수를 이미지 분석 장치를 통해 계수함으로써 상기 제1 챔버에서 상기 제2 챔버로 이동한 세포의 정량 분석이 가능하다. 한편, 상기 광학 이미지에서 상기 빛나는 점의 수를 계수하기 위해, 원본 이미지의 배경 노이즈 수준을 낮추고, 픽셀이 갖는 RGB 수치를 8-비트(8-bit)로 변환하여 상기 세포 내의 재귀반사 입자에 의한 점과 배경(background) 간의 명암 데이터 차이를 비교하여 일정 크기 이상의 픽셀들만을 재귀반사 입자에 의한 점으로 인식하고 인식된 점이 개수를 계산하는 알고리즘을 도입하여 재귀반사 신호의 개수를 측정할 수 있다.

한편, 재귀반사 신호의 측정은 상기 제1 챔버와 상기 제2 챔버가 결합된 상태로 수행될 수도 있고, 상기 제2 챔버를 상기 제1 챔버와 분리한 상태에서 수행될 수도 있다. 예를 들면, 상기 제1 챔버와 상기 제2 챔버가 결합된 상태로 연속적으로 상기 재귀반사 신호를 측정하는 경우, 상기 세포의 이동을 실시간으로 분석할 수 있다.

본 발명에 따르면, 일반적인 광학 현미경에 극히 단순한 광원장치를 추가함으로써 재귀반사를 유도할 수 있어 기존의 시스템에 그대로 적용이 가능하며. 또한, 세포 이동능 평가시험에서 나타나는 세포의 거동을 시간대별로 관측할 수 있기 때문에 실험을 새로이 접하는 실험자에게 최적화를 수행하도록 강요하지 않는 매우 용이한 관측 장치 및 방법을 제공할 수 있다. 기존 상용화 키트에 재귀반사 입자층을 코팅하는 것만으로도 동일한 효과를 누릴 수 있기 때문에 범용성이 매우 넓은 장점이있다.

이하에서, 구체적인 실시예들 및 실험예들을 통해서 본 발명에 대해서 보다 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명의 실시예들은 본 발명의 일부 실시 형태에 불과한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 종래 세포 이미징(imaging) 기술의 신호수득 전략으로 대표되는 흡광현상 또는 형광/발광 기반의 분석시스템이 갖는 복잡한 구성의 광학계를 단순화하는 동시에 실시간 세포 모니터링을 위해 종래 사용되는 흡광물질, 유기형광염료 및 이들이 함침된 입자들과 같은 표지자를 재귀반사 입자(retroreflective Janus particle)로 대체한 재귀반사 기반 세포관측 원리를 개발하고 이를 응용한 새로운 세포 이동성능 평가 방법론을 구현하는 것을 주 내용으로 한다. 세부적으로 세포의 미세거동을 광학적으로 관측하기 위해서는 세포시료를 포름알데히드, 메탄올 또는 글루타르알데히드와 같이 생명활동을 정지시키는 시약을 이용하여 고정(fixation)한 후, 광학적 신호를 얻기 위한 표지자인 유기형광염료, 퀀텀닷, 업컨버젼 나노입자 혹은 발색단을 세포 내부로 침투시켜 (dye staining) 관측하는 것을 일반적으로 수행해 왔다. 그러나, 본 발명에서는 재귀반사 관측법을 활용한 세포 관측을 개발하여 종래의 세포 고정화와 염색과정을 더 단순화시킨 실험절차와 광학계에서 관측하고자 재귀반사 현상을 이용한 세포 관측 원리와 이를 활용한 관측 방법론을 개발하여 세포 이동성능 평가에서 활용을 검증하고자 한다.

실시예 1

본 발명의 실험예를 위한 실시예 1에서는 일 실시예에 따라 제조된 바이오 센서를 이용하여, 대식세포의 이동성능분석을 상정하여 RAW264.7 세포주를 상단부 트랜스웰(제1 챔버)에 투입하고 트랜스웰(제1 챔버)의 멤브레인에 코팅되어있는 재귀반사 입자에 대한 식균작용 (phagocytosis)을 유도하여 화학유인물질에 의해 하단부 웰로 이동한 세포들이 나타내는 재귀반사 신호를 얻어 세포 이동을 분석하였다.

실험예 1: 대식세포 식균작용에 의한 재귀반사 입자 내부 침투효과 확인 및 세포독성 검증

본 발명에서 새로이 도입하는 세포측정용 비분광식 광학 표지자인 재귀반사 입자의 세포독성을 검증하기 위해 다양한 농도의 재귀반사 입자를 배양액에 준비하고, 생장 중인 세포에 투여하여 재귀반사 입자가 갖는 세포독성을 검증하였다. 실시예에서 사용된 세포는 쥐 유래 대식세포주인 RAW264.7 세포 라인(RAW264.7 cell line)으로 웰플레이트(제2 챔버)에 5ㅧ10⁵ cell/mL의 밀도로 6시간 배양 후 재귀반사 입자가 포함된 완전배양액(Dulbecco modified Eagle medium (DMEM), 10% 우태혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린 스트렙토마이신(penicillin streptomycin))을 기존 배양액과 대체하여 24시간 동안 배양하였다. 세포독성 측정은 MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)를 투입하여 정상적으로 생장 중인 세포에 의해 490 nm의 흡광물질을 발생시킬 수 있는 시약을 활용하여 재귀반사 입자를 처리하지 않은 대조군과의 생장률을 비교하였다. 그 결과를 도 4에 나타냈다.

상기 도 4를 참조하면, 대조군 대비 5% 이상의 세포 생장활동의 차이가 나는 배양액 내 재귀반사 입자 농도는 25 ug/mL인 것을 알 수 있다.

이를 통해 이하의 실험예들에서 본 발명에서 사용하는 재귀반사 입자 코팅층의 농도는 10 ug/mL로 지정하였다.

실험예 2: 세포 내 존재하는 재귀반사 입자로부터의 재귀반사 신호 수득

본 발명에서 개발한 재귀반사 기반 세포측정법을 재귀반사 신호검출을 실증하기 위해 현미경에서 신호관측 여부를 평가하는 것으로 실험을 수행하였다. 상기의 실험예 1(도4)에서 나타난 세포 생장을 저해하지 않는 수준의 재귀반사 입자 농도의 최대값은 10 ug/mL으로 나타났으므로, 본 실험예 2에서는 해당 농도를 적용하여 웰플레이트(제2 챔버)에 배양 중인 RAW264.7 세포주에 10 ug/mL 재귀반사 입자를 처리하고 24시간이 지난 후 재귀반사 입자를 포획한 상태의 세포에서 관측되는 광시야(bright filed) 이미지 및 대물렌즈 측면에 비치한 백색광원을 조사하여 얻은 재귀반사 신호를 같은 구간에서 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타냈다.

도 5를 참조하면, ①의 광시야 이미지는 세포 내부에 존재하는 재귀반사 입자가 검정색의 점(dot)으로 나타났으나 ②와 같이 광시야를 제거한 상태에서 측면 백색광원을 조사하여 재귀반사 신호를 얻은 이미지에서는 검정색의 점(dot)으로 보이던 입자들이 밝은 점(dot)의 형태로 나타났다. 이를 통해 세포 내부로 포획된 재귀반사 입자라 하여도 세포 자체의 광간섭 현상이 적어 재귀반사 입자 기반 광학신호가 높은 세기로 현미경의 대물렌즈로 포착되는 것을 알 수 있다. 다만, 재귀반사 입자가 빛을 재귀반사 할 수 있는 배향이 정해져 있는 만큼 확률적으로 세포 내에 존재하는 재귀반사 입자라 하더라도 배향이 올바르게 배치되지 않은 입자의 경우는 재귀반사 설정에서 빛을 반사하지 않는 것으로 나타날 수 있다.

실험예 3: 재귀반사 관측을 이용한 RJP를 포식한 대식세포의 이동 확인

본 실험예 3에서는 재귀반사 입자가 코팅된 트랜스웰(제1 챔버)에 배양된 RAW264.7 세포주가 하층부에 존재하는 화학유인물질인 단핵구 화학주성단백(monocytechemoattractant protein-1, MCP-1)에 의해 이동하여 웰플레이트(제2 챔버) 바닥 기판으로의 이동을 검증하기 위한 실험으로 상층부의 무혈청(serum-free) 배양액은 DMEM(Dulbeccos Modified Eagles Medium)을 사용하였으며, 하층부의 배양액은 DMEM(Dulbeccos Modified Eagles Medium)을 기반으로 1ng/mL MCP-1, 10% FBS(Fetal Bovine Serum)및 1% PS로 구성되었다. 제1 챔버와 제2 챔버의 결합이 이뤄진 뒤, 세포 이동을 관측하기 위해 24시간 동안 세포 이동 시간을 지정하여 세포 배양기에서 배양하며 세포의 이동을 관측하였으며, 그 결과를 도 6에 나타냈다.

도 6을 참조하면, ③에 나타난 광시야 이미지는 웰플레이트(제2 챔버) 하부기판(바닥면)에 이동한 세포를 관측한 이미지이며 트랜스웰(제1 챔버)의 재귀반사 입자를 포함하는 코팅층과 기공을 갖는 멤브레인 구조(8 um pore membrane)를 이동하여 결과적으로 제2 챔버의 하부면(하부기판)으로 낙하한 세포의 모습을 나타낸다. 각 세포에는 까만 점으로 나타난 재귀반사 입자들이 관측되며 이들을 재귀반사 광학설정으로 변경하여 측정하였을 때, ④와 같이 밝은 점들이 세포 내에 존재하는 것으로 존재하는 것을 확인할 수 있어, 세포 이동 성능을 분석할 수 있다.

실험예 4: 대식세포의 이동성능의 화학유인물질 농도 의존성 평가

본 실험예 4에서는 개발된 재귀반사 기반 세포측정법을 일반적인 세포 이동분석에서 사용하는 화학유인물질 농도에 따른 세포 이동 의존성평가로의 활용 가능 여부를 검증하고자 실험을 수행하였다. 웰플레이트(제2 챔버)에 도입된 MCP-1의 농도는 0, 1, 10, 100 ng/mL의 농도로 배양액에 각기 준비하고 트랜스웰(제1 챔버)에 5x10^5 cell/mL의 농도로 RAW264.7 세포주를 배양하여 트랜스웰(제1 챔버)을 웰플레이트(제2 챔버)에 결합하여 이동시킨 결과 아래 도 7과 같이 MCP-1 0 ng/mL - 10 ng/mL 구간에서 24시간 이동한 세포 수의 증가를 광학현미경으로 관측하였고, 그 이미지를 도 7에 나타냈다.

도 7을 참조하면, 세포 내부에 식균작용으로 포획된 재귀반사 입자에 의해 밝은 점으로 나타나는 재귀반사 신호 역시 관측할 수 있었으며, 0에서 10으로 농도가 증가할수록 이미지에 나타나는 점들을 통해 이동된 세포의 수가 증가했다는 것을 확인할 수 있다. 반면, 100 ng/mL 농도를 이용한 경우에는 1, 10 ng/mL 농도를 이용한 각각의 경우보다 이동된 세포의 수가 감소된 것을 확인할 수 있다.

실험예 5: 실제 세포수와 측정된 재귀반사 입자 개수의 상관관계 분석

이어서, 화학유인물질의 증가에 따라 이동한 세포수를 광시야 이미지에서 개수한 결과와 재귀반사 이미지에서 개수된 재귀반사 신호 개수와의 상관관계를 분석하였고, 그 결과를 도 8에 나타냈다.

도 8을 참조하면, 세포수와 측정된 재귀반사 입자 개수는 약 2.2배의 비율로 재귀반사 입자의 수가 많음을 나타내었고, 이를 이용하여 대조군 대비 측정되는 재귀반사 입자의 수를 측정하는 것만으로도 이동된 세포수를 정량할 수 있음을 나타낸다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (1)

1. 세포와 제1 배양액이 수용된 제1 내부공간을 구비하는 제1 챔버;
   상기 세포의 이동 능력을 활성화시키는 화학유인물질과 제2 배양액이 수용된 제2 내부공간을 구비하고, 상기 제1 챔버의 바닥면이 상기 제2 배양액에 잠기도록 상기 제1 챔버와 결합된 제2 챔버;
   상기 제2 챔버 내부로 광을 조사하는 광원부; 및
   상기 제2 챔버 내부로부터 재귀반사된 광에 대한 광학 이미지를 생성한 후 상기 재귀반사 광의 정량 분석을 수행하는 수광부를 포함하고,
   상기 제1 챔버의 바닥면에는 상기 세포가 이동할 수 있는 기공이 형성되고,상기 제1 챔버의 바닥면 상에 광을 재귀반사할 수 있는 재귀반사 입자들을 포함하는 코팅층이 형성된 것을 특징으로 하는, 광학 센서.

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