CN103913444A - 基于蓝光光镊的单光子激发荧光多通道定量检测装置及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于蓝光光镊的单光子激发荧光多通道定量检测装置及检测方法，该检测装置包括蓝光激光器发出的蓝光激光束，经扩束镜组、双色分光镜射入物镜，经物镜聚集在样品池内形成光镊；光镊捕获用来富集待测成分的微球，来自微球的前向散射光经双色分光镜，并由聚焦镜聚集后射入四象限光电检测器；透过双色分光镜的荧光经聚集镜聚集并经分光系统分光后，由荧光检测器检测。本装置可对金属离子、生物分子和病毒粒子等成分进行实时定量检测，可实现不同量子点或其他荧光标记物标记的多种不同待测物的同时检测。本装置结构简单，检测方法具有灵敏度高、选择性好、速度快、样品用量少且无需预处理等优点。

Description

基于蓝光光镊的单光子激发荧光多通道定量检测装置及检测方法

 

技术领域

本发明属于生物化学传感技术领域，具体涉及一种基于蓝光光镊的单光子激发荧光多通道定量检测装置及检测方法。

背景技术

光镊即单光束梯度力光阱，是基于散射力和辐射压梯度力相互作用而形成的能够捕获整个米氏和瑞利散射范围粒子的势阱。对粒子起捕获作用的是梯度力，要想将粒子稳定地束缚在光场势阱中，轴向梯度力必须要克服散射力。所以通常需要使用较大数值孔径的显微物镜将激光束高度会聚，从而产生足够强的梯度力来实现粒子的捕获。在生物医学领域，光镊技术往往和光学显微镜技术相结合，实现单个微粒的观察、捕获和操纵，但显微光镊装置尚未应用于高灵敏定量检测。

光镊对微粒的捕获主要有两种方式，一种是散射力小于梯度力，微粒被梯度力稳定在溶液之中，形成悬浮的状态，称为三维捕获；另一种捕获方式是先利用梯度力将微粒捕获到光阱中心，然后由于散射力大于梯度力，最终微粒被推向并压在样品池的底部或顶部，这样微粒最终稳定区域就只在样品池的底面或顶面，故称这种方式为二维捕获，对于以正置显微镜为主体光路结构的光镊系统来说，工作距离有限，故常采用较低倍率的物镜，这类物镜提供的光阱力更适合二维捕获，而且二维捕获也更加简便易行。本专利采用二维捕获方式捕获微球，同时采用同一激光光束实现微球表面富集的待测成分的激光诱导荧光定量检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于蓝光光镊的单光子激发荧光多通道定量检测装置。该装置将光镊技术和单光子荧光技术相结合，可实时多通道定量检测多种待测成分（如金属离子、生物分子和病毒粒子等）。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于蓝光光镊的单光子激发荧光多通道定量检测装置，包括功率可调的蓝光激光器，所述蓝光激光器发出的激光束，经过聚焦镜组成的扩束透镜组扩束并准直为平行光，再经过第一双色分光镜进入并覆盖物镜后瞳，经物镜聚集在样品池形成光镊；样品池中待测微球的前向散射光经过第二双色分光镜反射，再由聚焦镜汇聚，照射到四象限光电检测器（QD）上；含有荧光标记物的待测微球发出的荧光穿过物镜和第一双色分光镜，经过反光镜和聚焦镜后，进入分光系统，然后由荧光检测器检测；还包括支撑样品池的电动平台和照明灯。

上述装置，通过四象限光电检测器（QD）检测到的信号值的强弱来判断光阱捕获微粒的情况。

上述蓝光激光器为功率可调的多种类型的小型蓝光连续激光器，波长400nm-500nm。

上述分光系统由光栅、棱镜组成或由干涉滤光片组成。若采用光栅与棱镜的分光系统，荧光检测器为一个线阵或者面阵光电检测器，如线阵CCD、线阵CMOS、以线阵模式工作的面阵CCD或CMOS、或其他衍生的阵列式感光元器件。若采用干涉滤光片，每通道配置点式光电检测器（如光电倍增管和雪崩光二极管），也可配置线阵或面阵光电检测器。本发明中所有光电检测器均具有将光信号转化成电信号输出的能力。

    上述样品池为覆盖盖玻片的载玻片，或无机高分子材料的透明容器，其体积为微升级  。

使用上述基于蓝光光镊单光子激发荧光的多通道定量检测装置的检测方法，包括步骤：

步骤一，利用微米级透明微球特异性捕获待测物，再用荧光探针对富集于微球表面的待测物进行标记，形成微球-待测物-荧光探针复合物，即富集待测物的微球；

步骤二，将富集待测物的微球置于样品池中，利用物镜聚焦蓝光激光器产生的激光束，于样品池中形成光镊；

步骤三，利用电动平台移动样品池，四象限光电检测器同步检测来自样品池的散射光；当，四象限光电检测器检测到散射光强度上升到稳定值时，说明光镊捕获到富集待测物的微球，电动平台停止移动；

步骤四，荧光检测器开始进行荧光检测；根据荧光检测器检测到的荧光强度对待测物进行定量分析。

上述待测物为金属离子、生物分子或病毒粒子等多种可以通过特异性生物亲和或化学偶联方式富集到微球表面的待测成分。

上述微球为透明的无机微球或透明的高分子微球，无机微球可以是二氧化硅等材料制备的微球，高分子微球可以是聚苯乙烯等材料制备的微球。上述微球为微米级的，3-10微米比较适合。

上述富集待测物的微球可采用双抗夹心免疫反应法来获取。所述的荧光探针为荧光染料或纳米量子点。

本方法可用不同荧光探针来标记用微球富集的不同待测物，采用分光系统对不同的荧光信号进行分光，并采用多通道荧光检测器同时检测不同荧光信号的强度，以实现多色荧光信号的多通道检测。

本发明装置采用的光镊捕获和荧光检测平台为正置显微镜，相对于倒置显微镜有结构简单、成本低廉的优点，同时采用了二维捕获方式，降低了对激光光斑质量和聚焦程度的要求，这样可以使用较低放大倍率的物镜，同时也无需搭建三维扫描装置，采用二维电动平台就能满足需求，进一步简化了装置结构，也降低了成本。

本发明的检测方法首先通过双抗夹心免疫反应法，利用微球和荧光探针特异性识别并捕获待测物，形成微球－待测物－荧光探针复合物；然后通过QD检测器定量监测微球表面散射光以捕获复合物微球，同时利用荧光检测器对复合物微球进行单光子荧光探测以实现待测物的定量分析。另外，本发明装置可采用阵列式感光元器件作为荧光检测器，利用量子点的一元激发多元发射的特点，容易实现多通道检测，即实现不同量子点标记的多种不同待测物的同时检测。

与现有技术相比，本发明具有以下特点和有益效果：

1、本发明装置将光镊技术和单光子荧光技术结合，提出一种新型的多通道定量检测装置，该装置可对多种待测成分进行实时定量检测。

2、本发明的检测方法具有灵敏度高、选择性好、速度快、样品用量少且无需预处理。

3、本发明装置可采用成本低廉的半导体蓝光激光器作为光镊的激光光源，对激光光斑质量和聚焦的要求低，因此容易实现。

附图说明

图1为本发明装置结构示意图，其中，1-蓝光激光器，2-聚焦镜，3-聚焦镜，4-第一双色分光镜，5-物镜，6-样品池，7-第二双色分光镜，8-聚焦镜，9-四象限光电检测器，10-照明灯，11-反光镜，12-聚焦镜，13-分光系统，14-荧光检测器。

图2为工作曲线；

图3为实施例1中，在微球表面富集待测物的示意图，其中，15-微球，16-H9N2病毒的抗-HA 单克隆抗体，17-生物素化的单克隆抗体，18-H9N2禽流感病毒，19-量子点-链霉亲和素复合物。

具体实施方式

下面结合图1对本发明装置做进一步说明。

本发明的基于蓝光光镊的单光子激发荧光多通道定量检测装置，包括功率可调的蓝光激光器1，所述蓝光激光器1发出的激光束，经过聚焦镜组成的扩束透镜组扩束并准直为平行光，再经过第一双色分光镜4进入并覆盖物镜5后瞳，经物镜聚集在样品池6形成光镊；样品池中待测微球的前向散射光经过第二双色分光镜7反射，再由聚焦镜8汇聚，照射到四象限光电检测器9（QD）上；含有荧光标记物的待测微球发出的荧光穿过物镜5和第一双色分光镜4，经过反光镜11和聚焦镜12后，进入分光系统13，然后由荧光检测器14检测；还包括支撑样品池的电动平台和照明灯。

第一双色分光镜4反射激光进入合适数值孔径的物镜5，经物镜聚焦在样品池6底部并形成光阱即光镊。来自微球的散射光信号（波长和激光相同）经过第二双色分光镜7反射，再经聚焦镜8汇聚，落射到QD检测器9上。

本发明中的物镜的数值孔径一般大于0.5。本发明中的样品池为可以在正置显微镜下使用的覆盖盖片的载玻片，或材质为无机高分子透明材料的微小容器。

第一双色分光镜4和第二双色分光镜7为长通滤光片，可以透过波长500nm以上的光，反射蓝色激光。因此激光束被第一双色分光镜4反射至物镜5聚焦形成光镊；由样品池6中微球散射的蓝光前向散射光信号经过第二双色分光镜7反射，再由聚焦镜8聚焦落射到QD检测器9。同时，由微球表面返回的位于可见光区的荧光信号则透过第一双色分光镜4，被反射镜11反射，经聚焦镜12聚焦后进入分光系统13进行分光。

本装置采用二维电动平台来实现多微球的逐一快速捕获和荧光测定，且捕获和荧光检测可以同时进行。

当样品池内溶液中存在一定浓度的微球－待测物－荧光探针复合物微球，且光阱力足够时，移动中的某一微球靠近光阱被会被光阱捕获。在这个过程中，QD检测器9全程检测来自微球的蓝光散射光，当其强度达到预先设定的阈值时，电动平台系统停止移动，荧光检测器14检测来自微球的荧光强度。设定的阈值是事先测量出来的，当光镊中有被捕获的粒子的时候，散射光的强度会从零上升到一个值，这个强度值会稳定存在，我们就将这个强度值设定为一个阈值。

当完成一个微球的测定后，电动平台系统继续移动，捕获并探测下一个微球，直至完成一定数量微球的荧光检测。

本发明可通过测定的来自微球的荧光强度对微球表面的富集的待测物进行定量分析，可采用工作曲线法，工作曲线法是荧光定量检测领域内的常规方法，具体如下：

首先，制备某待测物的免疫微球。然后，按照设定的浓度梯度配制至少6份待测物标准溶液（包括空白溶液），分别采用相同的微球免疫夹心法（所用荧光探针也相同）对该系列待测物标准溶液进行分析，对每份标样均测定至少50个微球的单光子荧光强度，取其平均值，绘制工作曲线，即待测物浓度和荧光强度曲线，该曲线在一定范围内为直线。最后，按照相同方法测定未知样所含相同待测物的荧光强度，根据以上工作曲线计算待测物含量。

图2为工作曲线法定量的示意图，共配制7份待测物标准溶液（含空白溶液），每个标准样品均至少平行测定50个微球荧光，取平均值，同时计算其标准偏差并将其在图中每点上标识出来。该曲线的横坐标为待测物标准溶液浓度，纵坐标为荧光强度，若未知样品中待测物返回的荧光强度在图1的荧光强度范围内，则可根据测定的荧光强度获得其浓度，从而实现对待测物的定量分析。

 

下面通过实施例1～2对本发明检测方法做进一步说明。

实施例1

同一试样中5种甲型流感病毒的多通道定量分析

以聚苯乙烯微球作为载体，采用双抗免疫夹心法对不同甲型流感病毒分别进行富集，具体是以单克隆抗体修饰微球表面，以荧光量子点标记单克隆抗体，具体参见图3。

首先，制备免疫微球。取表面羧基修饰的聚苯乙烯微球，采用化学偶联法在其表面偶联H9N2病毒的抗-HA 单克隆抗体得到免疫微球，备用。

1）对H9N2禽流感病毒进行定量检测

在免疫微球上富集H9N2禽流感病毒：在含H9N2禽流感病毒的样品溶液中加入一定浓度（104-106个/mL）的免疫微球中，并加入生物素化的单克隆抗体和量子点-链霉亲和素复合物于37 °C下孵育1小时左右得到富集待测物的微球，所采用的量子点的荧光波长为625nm。

采用本装置测定50-100个微球的单光子荧光信号强度，并用平均值定量；依据所测定的单光子荧光信号强度，采用工作曲线法获取待测物的浓度，从而实现定量检测。

2）同时对H1N1、H3N2、H5N1、H7N1和H9N2禽流感病毒进行定量检测

使用波长分别为545nm、565nm、585nm、605nm和625nm的CdSe/ZnS核壳型量子点来分别标记最有代表性的五种甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H7N1和H9N2，采用上述方法实现五种病毒的多通道定量检测。

 

实施例2

同一血清样品中5种肺癌标志物的联合检测

采用和实施例1相同的方法制备富集胃癌标志物的聚苯乙烯微球，并分别使用波长为545nm、565nm、585nm、605nm和625nm的CdSe/ZnS核壳型量子点，分别标记同一血清样品中5种肺癌标志物：癌胚抗原（CEA ）、细胞角蛋白19片段（CYFRA 21-1）、胃泌素释放肽前体（ProGRP）、鳞状细胞癌相关抗原（SCC-Ag）和组织多肽抗原（TPA ）进行检测，通过多项标志物的联合诊断，可以提高肺癌的阳性率特异度及准确度。采用实施例1实现五种病毒的多通道定量检测。

微球对各肺癌标志物蛋白的富集，不局限于双抗体免疫夹心方法，还可以采用核酸适配体等多种特异性好、捕获效率高的其他方案。

Claims (10)

1.一种基于蓝光光镊的单光子激发荧光多通道定量检测装置，其特征在于，包括功率可调的蓝光激光器，所述蓝光激光器发出的激光束，经过聚焦镜组成的扩束透镜组扩束并准直为平行光，再经过第一双色分光镜进入并覆盖物镜后瞳，经物镜聚集在样品池形成光镊；样品池中待测微球的前向散射光经过第二双色分光镜反射，再由聚焦镜汇聚，照射到四象限光电检测器上；含有荧光标记物的待测微球发出的荧光穿过物镜和第一双色分光镜，经过反光镜和聚焦镜后，进入分光系统，然后由荧光检测器检测；还包括支撑样品池的电动平台和照明灯。

2.如权利要求1所述的检测装置，其特征在于：所述蓝光激光器发出的光波长400nm-500nm。

3.如权利要求1或2所述的检测装置，其特征在于：所述分光系统由光栅、棱镜组成或由干涉滤光片组成。

4.    如权利要求1或2所述的检测装置，其特征在于： 所述样品池为覆盖盖玻片的载玻片。

5.使用权利要求1所述检测装置的检测方法，包括如下步骤：

步骤一，利用微米级透明微球特异性捕获待测物，再用荧光探针对富集于微球表面的待测物进行标记，形成微球-待测物-荧光探针复合物，即富集待测物的微球；

步骤二，将富集待测物的微球置于样品池中，利用物镜聚焦蓝光激光器产生的激光束，于样品池中形成光镊；

步骤三，利用电动平台移动样品池，四象限光电检测器同步检测来自样品池的散射光；当，四象限光电检测器检测到散射光强度上升到稳定值时，说明光镊捕获到富集待测物的微球，电动平台停止移动；

步骤四，荧光检测器开始进行荧光检测；根据荧光检测器检测到的荧光强度对待测物进行定量分析。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述待测物为金属离子、生物分子或病毒粒子。

7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述微球为二氧化硅或聚苯乙烯材料制备。

8.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述微球粒径为3-10微米。

9.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述富集待测物的微球采用双抗夹心免疫反应法来获取。

10.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述的荧光探针为荧光染料或纳米量子点。