CN102998293B - 双光子荧光光镊多通道定量检测装置及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种双光子荧光光镊多通道定量检测装置及检测方法，该检测装置包括近红外激光器发出的近红外激光束经扩束器、分束器、双色分光镜、二维扫描系统射入物镜，经物镜聚集在样品池内形成光镊；来自光镊的近红外散射光经双色分光镜、分束器反射，并由第一聚焦镜聚集后射入近红外光检测器；透过双色分光镜的荧光经第二聚集镜聚集并经分光系统分光后，由荧光检测器检测。本装置可对金属离子、生物分子和病毒粒子等进行实时定量检测，可实现不同量子点标记的多种不同待测物的同时检测。本装置易实现小型化，样品检测方法具有灵敏度高、选择性好、速度快、样品用量少且无需预处理等优点。

Description

双光子荧光光镊多通道定量检测装置及检测方法

技术领域

本发明涉及微纳操作技术领域、光电技术领域和生物化学传感技术领域，具体涉及一种双光子荧光光镊多通道定量检测装置及检测方法。

背景技术

光镊即单光束梯度力光阱，是基于散射力和辐射压梯度力相互作用而形成的能够捕获整个米氏和瑞利散射范围粒子的势阱。对粒子起捕获作用的是梯度力，要想将粒子稳定地束缚在光场势阱中，轴向梯度力必须要克服散射力。所以通常需要使用高数值孔径的显微物镜将激光束高度会聚，从而产生足够强的梯度力来实现粒子的捕获。在生物医学领域，光镊技术往往和光学显微镜技术相结合，实现单个微粒的观察、捕获和操纵，尚未应用于高灵敏定量检测。

和常规的单光子激发荧光不同，双光子荧光采用近红外激光来激发，因此可以避免自发荧光的干扰。但目前双光子荧光技术的应用主要局限于双光子荧光显微镜在生物组织成像方面的研究，尚未实现对液体样品中重要的生物分子和尺寸极小的病毒粒子（~100纳米）的定量检测。此外，双光子荧光显微镜需要采用价格昂贵的飞秒脉冲激光器为激发光源，也限制了该仪器的推广使用。

因此，本发明将光镊技术和双光子荧光技术相结合，实现了对微球捕获的金属离子、生物分子和病毒粒子的定量检测，扩展了光镊技术和双光子激发荧光技术的应用领域。

发明内容

本发明的目的是将光镊技术和双光子荧光技术相结合，提出一种可实时定量检测金属离子、生物分子和病毒粒子等的双光子荧光光镊多通道定量检测装置及检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种双光子荧光光镊多通道定量检测装置，包括：近红外激光器发出的近红外激光束经分束器分成两束，一束经双色分光镜、二维扫描系统射入物镜，经物镜聚集在样品池形成光镊；来自光镊的近红外散射光经双色分光镜、分束器反射，并由第一聚焦镜聚集后射入近红外光检测器；透过双色分光镜的荧光经第二聚集镜聚集后进入分光系统分光后，由荧光检测器检测。

上述近红外激光器和分束器之间依次设有中性密度滤光片、扩束器、和用以调整激光束方向的平面镜组。

为了实现更精确的光镊捕获，可采用感应电机与物镜耦合来驱动物镜沿光轴方向精准移动，所述的感应电机可为步进电机或压电传感器。

上述二维扫描系统为二维扫描检流计振镜。

上述第一聚焦镜的焦平面处设置一带有针孔的挡板，所述的针孔位于第一聚焦镜的焦点处，以排除微球返回近红外散射光以外的其他光的干扰。

上述近红外激光器为近红外调Q纳秒脉冲激光器，也可以使用皮秒脉冲激光器或飞秒脉冲激光器。

上述分光系统为光栅、棱镜或干涉滤光片分光系统。分光系统可采用多色仪。

上述近红外光检测器为点式、线阵或面阵型近红外光检测器，如InGaAs检测器。若采用光栅或棱镜分光系统，则光电检测器为一个线阵或者面阵近红外光检测器；若采用干涉滤光片分光系统，则每通道配置点式近红外光检测器，也可配置线阵或面阵近红外光检测器。近红外光检测器具有将光信号转化成电信号输出的能力。

上述荧光检测器为线阵CCD(电荷耦合器件)、线阵CMOS（互补性金属氧化物半导体器件）、以线阵模式工作的面阵CCD或CMOS、或其他衍生的阵列式感光元器件。

上述样品池为无机高分子材料的透明容器，其体积为100~500微升 。

使用上述双光子荧光光镊多通道定量检测装置的检测方法，包括步骤：

步骤一，利用物镜聚焦近红外激光器产生的满足双光子荧光激发条件的近红外激光束并于样品池中形成光镊；

步骤二，利用感应电机和二维扫描系统操控光镊捕获样品池内微球，同时近红外光检测器检测来自光镊的近红外散射光，所述的微球为采用荧光探针标记的富集待测物的微球；

步骤三，当近红外光检测器检测到的散射光强度达到预设阈值时，证明光镊已捕获到微球，此时二维扫描系统和感应电机停止动作，荧光检测器开始检测来自微球的荧光；

步骤四，根据荧光检测器检测到的荧光强度对待测物进行定量分析。

上述待测物为金属离子、生物分子或病毒粒子。

上述微球为透明的无机微球或透明的高分子微球，无机微球可以是二氧化硅等材料制备的微球，高分子微球可以是聚苯乙烯等材料制备的微球。

上述富集待测物的微球采用如下方法获取：利用微球特异性捕获待测物，并用荧光探针对富集于微球表面的待测物进行标记，形成微球-待测物-荧光探针复合物，即富集待测物的微球。具体可采用双抗夹心免疫反应法来获取富集待测物的微球。所述的荧光探针为荧光染料或纳米量子点。

可采用不同波长的荧光探针分别标记不同的待测物，并将富集不同待测物的微球置于样品池中，来自不同待测物的不同波段荧光经分光仪分光，荧光检测器即可同时检测不同波段的荧光强度，根据不同波段的荧光强度可定量分析不同待测物，从而实现不同待测物的多通道定量检测。

本发明装置无需使用显微镜，仅用显微镜的物镜聚焦近红外激光形成光阱以捕获富集待测物的微球，同时采用不同荧光探针来标记用微球富集的不同待测物，采用分光系统对不同的荧光信号进行分光，并采用多通道荧光检测器同时检测不同荧光信号的强度，实现多色荧光信号的多通道检测。为提高定量检测的准确度，本装置采用激光光镊扫描方式，实现对多个同类微球的捕获和信号检测。

本发明检测方法首先通过双抗夹心免疫反应法，利用微球和荧光探针特异性识别并捕获待测物，形成微球－待测物－荧光探针复合物；然后通过聚焦近红外激光的三维自动扫描系统和采用近红外光检测器定量监测微球表面散射光以捕获复合物微球，同时利用荧光检测器对复合物微球进行双光子荧光探测以实现待测物的定量分析。本发明只探测位于光阱处的复合物微球所产生的双光子荧光，因而溶液中的其他共存物质不产生信号干扰；并且由于探测体积极小，仅为1fL左右，因此本发明可用于超高灵敏定量检测。另外，本发明装置可采用阵列式感光元器件作为荧光检测器，利用量子点的一元激发多元发射的特点，容易实现不同量子点标记的多种不同待测物的同时检测，即可实现多通道检测。

与现有技术相比，本发明具有以下特点和有益效果：

1、本发明将光镊技术和双光子荧光技术结合，提出一种新型的多通道定量检测装置，该装置可对金属离子、生物分子和病毒粒子等进行实时定量检测。

2、本发明易实现小型化，具有灵敏度高、选择性好、速度快、样品用量少且无需预处理，可实现不同荧光探针标记的不同待测物的同时实时检测，检测效率高。

3、本发明装置可采用成本低廉的近红外调Q纳秒脉冲激光器作为激光光源，这样还可降低成本。

附图说明

图1为本发明装置光路及结构示意图； 

图2为工作曲线示意图；

图3为在微球表面富集待测物的示意图。

图中，1-近红外激光器；2-中性密度滤光片；3-扩束器；4，5-平面镜组；6-分束器；7-双色分光镜；8-二维扫描检流计振镜；9、10-透镜；11-近红外光检测器；12-荧光检测器；13-多色仪；14-物镜；15-样品池；16-微球；17-抗-HA 单克隆抗体；18-生物素化的单克隆抗体；19-禽流感病毒；20-量子点-链霉亲和素复合物。

具体实施方式

本发明装置包括近红外激光系统、分光系统、光电检测系统、三维扫描系统四大部分。近红外激光系统用来产生满足双光子荧光的激发条件的近红外激光束，并形成近红外光镊。分光系统用来对不同待测物的不同荧光信号进行分光，本发明中的分光系统为光栅、棱镜或干涉滤光片分光系统，即光元件为光栅、棱镜、或干涉滤光片，并辅以透镜、反射镜和机械固定结构。光电检测系统可以将光信号转化成电信号，从而可用来检测来自微球的近红外散射光和荧光信号，本发明中的光检测系统包括近红外光检测器和荧光检测器，近红外光检测器为点式、线阵或面阵型近红外光检测器，荧光检测器为线阵CCD(电荷耦合器件)、线阵CMOS（互补性金属氧化物半导体器件）、以线阵模式工作的面阵CCD或CMOS、或其他衍生的阵列式感光元器件，可实现多通道光检测。若采用光栅或棱镜分光系统，则近红外光检测器为一个线阵或者面阵近红外光检测器；若采用干涉滤光片分光系统，则每通道配置点式近红外光检测器，也可配置线阵或面阵近红外光检测器。三维扫描系统用来实现多微球的逐一快速捕获和荧光测定，由与物镜耦合的感应电机和二维扫描系统构成。图1为本发明装置的一种具体实施，下面将结合图1对本发明装置做进一步说明。

本发明的近红外激光系统发射近红外激光并产生光镊，由近红外激光器（1）产生的激光束经中性密度滤光片（2）调节激光能量使所得激光束能满足双光子荧光的激发条件，经扩束器（3）扩束并准直为平行光，扩束后的激光束应能充满物镜（14）的后瞳，经扩束器（3）的激光束再经平面镜组（4、5）精确调整方向后射入分束器（6）。

分束器（6）将入射激光束分成能量比为90：10的两束激光，其中能量为90%的一束激光经双色分光镜（7）反射进入二维扫描检流计振镜（8），经二维扫描检流计振镜（8）的严格调整后进入合适数值孔径的物镜（14），经物镜（14）聚焦在样品池（15）底部样品溶液内部形成横向尺寸约1mm（束腰）的光阱，即光镊；其中能量为10%的另一束激光并未利用。参见图1，能量为90%的一束激光束向右传输射入双色分光镜（7），能量为10%的一束激光束向下传输（图中未标出）。采用分束器的目的是在导入近红外激光以形成光阱的同时还反射来自微球的近红外散射光进入近红外光检测器。

来自光镊的近红外散射光经透镜（9）聚焦后进入近红外光检测器（11），透镜（9）的焦平面处设置一带有针孔的挡板，所述的针孔位于透镜（9）的焦点处，以排除散射光以外的其他光的干扰。

本发明中的物镜采用显微镜用的普通物镜即可，物镜的数值孔径一般不小于0.5。本发明中的样品池为材质为无机高分子透明材料的微小容器，如96孔培养板中的单个孔。

双色分光镜（7）为短通滤光片，其可透过可见光，可反射短波近红外光。因此近红外激光束将由双色分光镜（7）反射至物镜（14）聚焦形成光镊；由样品池（15）中微球表面返回的近红外散射光信号也由双色分光镜（7）反射，经分束器（6）、透镜（9）后进入近红外光检测器（11）。同时，来自微球表面的位于可见光区的荧光信号则透过双色分光镜（7），经透镜（10）聚焦后进入多色仪（13）进行分光。由于采用近红外光激发，因此双色分光镜（7）只需将荧光信号透过即可，而无须像常规的单光子激发那样需要对短波长激发光进行分离以排除干扰。

本装置采用二维扫描检流计振镜（8）来实现多微球的逐一快速捕获和荧光测定，且捕获和荧光检测可以同时进行，但二维扫描检流计振镜（8）仅能实现水平二维方向的扫描，为实现光镊在光轴方向（Z方向）移动，本具体实施中将物镜（14）和步进电机耦合，步进电机驱动物镜（14）轴向精密移动，从而实现光镊的轴向精密移动。也可采用压电传感器代替步进电机。因此，本发明通过二维扫描检流计振镜（8）和步进电机实现三维扫描，从而可更精确的进行光镊捕获。

本发明的扫描系统和双光子荧光显微镜的扫描系统有很大区别，后者为实现高分辨成像，在三个方向都需要快速精密移动，并进行高速率信号采集。由于本装置仅仅采集数量有限（一般50～100个）的微球的荧光信号，因此通过二维自动扫描系统即可实现微球的快速捕获和荧光测定，且捕获和检测同步进行。

当样品池内溶液中存在一定浓度的微球－待测物－荧光探针复合物微球，且光阱力足够大时，一旦移动的光阱和某一微球相互靠近，则微球被光阱捕获；可通过近红外光检测器（11）检测到的近红外散射光强度来判断是否捕获微球，当检测到的近红外散射光强度达到预先预先设定阈值时，证明微球被光镊捕获，此时，为保证稳定可靠的荧光测定，扫描系统停止扫描，荧光检测器（12）检测来自微球的荧光强度。当完成一个微球的测定后，扫描系统继续扫描，光镊继续捕获并探测下一个微球，直至完成一定数量微球的荧光检测。

可采用不同波长的荧光探针分别标记不同的待测物，并将富集不同待测物的微球置于样品池中，来自不同待测物的不同波段荧光经分光仪分光，荧光检测器即可同时检测不同波段的荧光强度，根据不同波段的荧光强度可定量分析不同待测物，从而实现不同待测物的多通道定量检测。

本发明可通过测定来自微球的荧光强度对微球表面富集的待测物进行定量分析，具体可采用工作曲线法，工作曲线法是荧光定量检测领域内的常规方法，过程及原理如下：

首先，制备某待测物的免疫微球。然后，按照设定的浓度梯度配制至少6份待测物标准溶液（包括空白溶液），分别采用相同的微球免疫夹心法（所用荧光探针也相同）对该系列待测物标准溶液进行分析，对每份标样均测定至少50个微球的双光子荧光强度，取其平均值，绘制工作曲线，即待测物浓度和荧光强度曲线，该曲线在一定范围内为直线。最后，按照相同方法测定未知样所含相同待测物的荧光强度，根据以上工作曲线计算待测物含量。

图2为工作曲线法定量的示意图，共配制7份待测物标准溶液（含空白溶液），每个标准样品均至少平行测定50个微球荧光，取平均值，同时计算其标准偏差并将其在图中每点上标识出来。该曲线的横坐标为待测物标准溶液浓度，纵坐标为荧光强度，若未知样品中待测物返回的荧光强度在图1的荧光强度范围内，则可根据测定的荧光强度获得其浓度，从而实现对待测物的定量分析。

下面将实施例1～2对本发明检测方法做进一步说明。

实施例1

同一试样中5种甲型流感病毒的多通道定量分析

以聚苯乙烯微球作为载体，采用双抗免疫夹心法对不同甲型流感病毒分别进行富集，具体是以单克隆抗体修饰微球表面，以荧光量子点标记单克隆抗体，具体参见图3。

首先，制备免疫微球。取表面羧基修饰的聚苯乙烯微球（16），采用化学偶联法在其表面偶联H9N2病毒的抗-HA 单克隆抗体（17）得到免疫微球，备用。

1）对H9N2禽流感病毒进行定量检测

在免疫微球上富集H9N2禽流感病毒：在含H9N2禽流感病毒（19）的样品溶液中加入一定浓度（10⁴-10⁶个/mL）的免疫微球中，并加入生物素化的单克隆抗体（18）和量子点-链霉亲和素复合物（20）于37 °C下孵育1h得到富集待测物的微球，所采用的量子点的荧光波长为625nm。

采用本装置测定50-100个微球的双光子荧光信号强度，并用平均值定量；依据所测定的双光子荧光信号强度，采用工作曲线法获取待测物的浓度，从而实现定量检测。

2）同时对H1N1、H3N2、H5N1、H7N1和H9N2禽流感病毒进行定量检测

使用波长分别为545nm、565nm、585nm、605nm和625nm的CdSe/ZnS核壳型量子点来分别标记最有代表性的五种甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H7N1和H9N2，采用上述方法实现五种病毒的多通道定量检测。

实施例2

同一血清样品中5种胃癌标志物的联合检测

采用和实施例1相同的方法制备富集胃癌标志物的聚苯乙烯微球，并分别使用波长为545nm、565nm、585nm、605nm和625nm的CdSe/ZnS核壳型量子点，分别标记同一血清样品中5种胃癌标志物癌胚抗原(CEA)、胃癌抗原MG7-Ag、细胞角蛋白（CK）、血管内皮生长因子（VEGF）和凝血酶(Thrombin)，采用实施例1实现五种病毒的多通道定量检测。

微球对各胃癌标志物蛋白的富集，不局限于双抗体免疫夹心方法，还可以采用核酸适配体等多种特异性好、捕获效率高的其他方案。

Claims (12)

1.一种双光子荧光光镊多通道定量检测装置，其特征在于，包括：

近红外激光器发出的近红外激光束经分束器分成两束，一束经双色分光镜、二维扫描系统射入物镜，经物镜聚集在样品池形成光镊；来自光镊的近红外散射光经双色分光镜、分束器反射，并由第一聚焦镜聚集后射入近红外光检测器；透过双色分光镜的荧光经第二聚集镜聚集后进入分光系统分光后，由荧光检测器检测。

2.如权利要求1所述的双光子荧光光镊多通道定量检测装置，其特征在于：

所述的近红外激光器和分束器之间依次设有中性密度滤光片、扩束器、和用以调整激光束方向的平面镜组。

3.如权利要求1所述的双光子荧光光镊多通道定量检测装置，其特征在于：

所述的物镜与感应电机耦合，以驱动物镜沿光轴方向精准移动。

4.如权利要求1所述的双光子荧光光镊多通道定量检测装置，其特征在于：

所述的第一聚焦镜的焦平面处设置有一带有针孔的挡板，所述的针孔位于第一透镜的焦点处。

5.如权利要求1所述的双光子荧光光镊多通道定量检测装置，其特征在于：

所述的近红外激光器为近红外调Q纳秒脉冲激光器、皮秒脉冲激光器或飞秒脉冲激光器。

6.如权利要求1所述的双光子荧光光镊多通道定量检测装置，其特征在于：

所述的近红外光检测器为点式、线阵或面阵型近红外光检测器。

7.如权利要求1所述的双光子荧光光镊多通道定量检测装置，其特征在于：

所述的荧光检测器为线阵CCD、线阵CMOS、以线阵模式工作的面阵CCD或CMOS、或其他衍生的阵列式感光元器件。

8.使用上述权利要求1～7中任一项所述的双光子荧光光镊的多通道定量检测装置的检测方法，其特征在于，包括步骤：

步骤一，利用物镜聚焦近红外激光器产生的满足双光子荧光激发条件的近红外激光束并于样品池中形成光镊；

步骤二，利用感应电机和二维扫描系统操控光镊捕获样品池内微球，同时近红外光检测器检测来自光镊的近红外散射光，所述的微球为采用荧光探针标记的富集待测物的微球；

步骤三，当近红外光检测器检测到的散射光强度达到预设阈值时，证明光镊已捕获到微球，此时二维扫描系统和感应电机停止动作，荧光检测器开始检测来自微球的荧光；

步骤四，根据荧光检测器检测到的荧光强度对待测物进行定量分析。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于：

所述的待测物为金属离子、生物分子或病毒粒子。

10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于：

所述的微球为透明的无机微球或透明的高分子微球。

11.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于：

所述的微球采用如下方法获取：

利用微球特异性捕获待测物，并用荧光探针对富集于微球表面的待测物进行标记，形成微球-待测物-荧光探针复合物。

12.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于：

所述的样品池中的微球为富集了多种待测物的微球，且不同种待测物分别采用不同波长的荧光探针进行标记。