CN108507991B - 一种双光子荧光的增强方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双光子荧光的增强方法及其应用，方法包括：将荧光材料和介电微球堆叠组合，得到复合介电结构；将激光源发射的激光通过显微物镜照射到复合介电结构中的介电微球上进行聚焦，得到聚焦后的光源；聚焦后的光源激发荧光材料，实现荧光材料双光子荧光的增强。本发明通过将荧光材料与介电微球结合，制得复合介电结构，通过该结构中的介电微球对光源的聚焦，可以使得在相同激光功率下荧光材料的荧光强度增强100倍左右，相比现有增强双光子荧光的技术，本发明的技术方案具有成本低、工艺简单、适用于大面积固态荧光材料等优点，有效解决了目前荧光材料双光子荧光效率低的问题。

Description

一种双光子荧光的增强方法及其应用

技术领域

本发明涉及光电子技术领域，尤其涉及一种双光子荧光的增强方法及其应用。

背景技术

目前，荧光材料特别是纳米材料的双光子荧光效率往往比较低，这极大地限制了它的实际应用。以往人们通常利用表面等离激元共振等方法来增强光与物质的相互作用过程，从而增加双光子荧光效率。但是，这些方法往往需要利用电子束刻蚀、聚焦离子束刻蚀等微纳加工方法来制备一些复杂的微纳复合结构，一方面这些制备过程工艺复杂，成本也很高，不利于制备低成本、大面积的微纳复合结构；另一方面，贵金属复合结构在可见光波段本身具有较大的光学损耗，不利于光学信号的传导和利用。总而言之，目前的方法和手段工艺复杂，成本很高，对于实际应用仍然具有很大的局限性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种双光子荧光的增强方法及其应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种双光子荧光的增强方法，包括：

步骤1、将荧光材料和介电微球堆叠组合，得到复合介电结构；

步骤2、将激光源发射的激光通过显微物镜照射到所述复合介电结构中的所述介电微球上进行聚焦，得到聚焦后的光源；

步骤3、所述聚焦后的光源激发所述荧光材料，实现所述荧光材料双光子荧光的增强。

本发明的有益效果是：本发明通过将荧光材料与介电微球结合，制得复合介电结构，通过该结构中的介电微球对光源的聚焦，可以使得在相同激光功率下荧光材料的荧光强度增强100左右，相比现有增强双光子荧光的技术，本发明的技术方案具有成本低、工艺简单、适用于大面积固态荧光材料等优点。如果将其应用于双光子荧光显微成像，可以使得需要的激光功率大大降低，对于节约能源、保护样品不被损坏意义重大，有效解决了目前荧光材料双光子荧光效率低的问题。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

进一步，所述复合介电结构中，所述介电微球为单个介电微球或介电微球阵列。

本发明的进一步有益效果是：单个微球或微球阵列都可极大增强荧光材料的双光子荧光强度，因此，应用范围广，可根据实际情况选择使用，方便快捷。其中，单个介电微球或介电微球阵列可通过如下方法制得：取少量介电微球的悬浊液滴在干净的石英衬底上并放置在烘箱里，烘箱温度为70℃，介电微球在液体张力的作用下通过自组装形成单层致密的微球阵列或分散的单个介电微球，在烘箱中保持约10分钟将其完全烘干，根据实际需要，可在石英衬底上获取单个介电微球或介电微球阵列。

进一步，当所述介电微球为单个介电微球时，所述步骤1之前，所述方法还包括：

步骤4、根据预设双光子荧光增强倍数和所述荧光材料，确定微球尺寸和微球材料，并获取所述微球尺寸和所述微球材料对应的所述单个介电微球；

或者，

当所述介电微球为介电微球阵列时，所述步骤1之前，所述方法还包括：

步骤5、根据预设双光子荧光增强倍数和所述荧光材料，确定微球尺寸和微球材料，并获取由所述微球尺寸和所述微球材料对应的多个单个介电微球组成的所述介电微球阵列。

本发明的进一步有益效果是：研究发现，荧光材料的双光子荧光增强倍数与介电微球的尺寸和材料有关，可根据荧光材料和需要的双光子荧光增强倍数，选择合理的微球尺寸和微球材料，应用范围广，工艺简单，成本低，对于增强各种荧光材料的双光子荧光具有重大意义。

进一步，所述介电微球阵列为多个单个介电微球密集排列构成的单层微球阵列。

进一步，所述步骤2包括：

将激光源发射的激光照射到所述复合介电结构中的所述介电微球相对所述荧光材料的一侧上进行聚焦，得到聚焦后的光源。

本发明的进一步有益效果是：以通过介电微球聚焦后的光源能垂直投射到荧光材料上的方式将激光源照射到介电微球上，能够使得聚焦后的光源最大限度的照射到荧光材料，以最大限度地激发荧光材料以增强双光子荧光。

进一步，所述荧光材料的形态为固态。

进一步，所述步骤1包括：

将荧光材料和介电微球间隔堆叠组合或部分接触组合，得到复合介电结构。

本发明的进一步有益效果是：荧光材料和介电微球可以密集组合也可间隔组合，得到的复合介电结构，均能实现成本低、工艺简单、适用于大面积固态荧光材料的双光子荧光增强，应用范围广，对于节约能源、保护样品不被损坏意义重大，有效解决了目前荧光材料双光子荧光效率低的问题。

本发明还提供一种上述双光子荧光的增强方法的应用，所述双光子荧光的增强方法应用于双光子荧光显微成像。

本发明的有益效果是：成本低、工艺简单、适用于大面积固态荧光材料的双光子荧光增强方法，可以实现低功率的双光子荧光成像，对于节约能源、保护样品不被损坏意义重大。

本发明还提供一种双光子荧光成像装置，包括：激光源，共焦显微镜，以及上述复合介电结构；

所述激光源位于所述共焦显微镜的一侧，其发射的激光进入所述共焦显微镜，并由所述共焦显微镜的物镜聚焦，从所述物镜的出光口后方得到聚焦后的第一光源；

所述复合介电结构位于所述物镜的出光口后方，所述第一光源照射到所述复合介电结构中的所述介电微球上进行聚焦，得到聚焦后的第二光源，所述第二光源激发所述复合介电结构中的所述荧光材料，得到增强的双光子荧光；

所述复合介电结构的后方外设微纳样品，所述增强的双光子荧光照射到所述微纳样品上，所述微纳样品反射所述增强的双光子荧光经所述介电微球至所述物镜。

本发明的有益效果是：通过成本低、工艺简单、适用于大面积固态荧光材料的复合介电结构，可以使得双光子荧光成像装置实现低功率的双光子荧光显微成像，对于节约能源、保护样品不被损坏意义重大。

附图说明

图1为本发明一个实施例提供的一种双光子荧光的增强方法的流程框图；

图2为本发明另一个实施例提供的一种双光子荧光的增强方法的流程框图；

图3为本发明另一个实施例提供的一种双光子荧光的增强方法的流程框图；

图4为本发明另一个实施例提供的介电微球/二维钙钛矿复合介电结构的示意性结构图；

图5为本发明另一个实施例提供的单纯二维钙钛矿(上图)和介电微球/二维钙钛矿复合介电结构(下图)的双光子荧光图像对比图；

图6为本发明另一个实施例提供的介电微球/二维钙钛矿复合介电结构(w/t MS)和单纯二维钙钛矿薄片(w/o MS)的双光子荧光光谱对比图；

图7为本发明另一个实施例提供的不同激发功率下介电微球/二维钙钛矿复合介电结构相对于单纯二维钙钛矿薄片的双光子荧光增强倍率图；

图8为本发明一个实施例提供的一种双光子荧光成像装置的示意性结构图；

图9为本发明另一个实施例提供的DVD光盘盘面的光学显微镜图像；

图10为本发明另一个实施例提供的铺有介电微球的DVD盘面光学显微镜图像；

图11为本发明另一个实施例提供的基于介电微球/二维钙钛矿复合介电结构的DVD光盘双光子荧光显微图像。

附图中，各标号所代表的元件列表如下：

1、二维钙钛矿，2、二氧化硅或聚苯乙烯微球，3、激光源，4、共焦显微镜的物镜，5、介电微球，6、荧光材料，7、微纳样品。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例一

一种双光子荧光的增强方法100，如图1所示，包括：

步骤110、将荧光材料和介电微球堆叠组合，得到复合介电结构。

步骤120、将激光源发射的激光通过显微物镜照射到复合介电结构中的介电微球上进行聚焦，得到聚焦后的光源。

步骤130、聚焦后的光源激发荧光材料，实现荧光材料双光子荧光的增强。

由于介电微球的光子喷流效应能够使光束聚焦在亚波长尺度，从而使得聚焦区域的光强大大增加。对于双光子荧光，荧光强度与激发光强的平方成正比，如果利用介电微球将光束聚焦后作为激发源，将大大增强双光子荧光的产生效率。另外，介电微球还能够将荧光材料表面发射的荧光进行重新定向，从而改善荧光的收集效率，使得最终探测到的双光子荧光信号在一定程度上得到增强。

本实施例通过将荧光材料与介电微球结合，制得复合介电结构，通过该结构中的介电微球对光源的聚焦，可以使得在相同激光功率下荧光材料的荧光强度增强百倍，相比现有增强双光子荧光的技术，本发明的技术方案具有成本低、工艺简单、适用于大面积固态荧光材料等优点。如果将其应用于双光子荧光显微成像，可以使得需要的激光功率大大降低，对于节约能源、保护样品不被损坏意义重大，有效解决了目前荧光材料双光子荧光效率低的问题。

实施例二

在实施例一的基础上，复合介电结构中，介电微球为单个介电微球或介电微球阵列。

单个微球或微球阵列都可极大增强荧光材料的双光子荧光强度，因此，应用范围广，可根据实际情况选择使用，方便快捷。其中，单个介电微球或介电微球阵列可通过如下方法制得：取少量介电微球的悬浊液滴在干净的石英衬底上并放置在烘箱里，烘箱温度为70℃，介电微球在液体张力的作用下通过自组装形成单层致密的微球阵列或分散的单个介电微球，在烘箱中保持约10分钟将其完全烘干，根据实际需要，可在石英衬底上获取单个介电微球或介电微球阵列。

实施例三

在实施例一或实施例二的基础上，当介电微球为单个介电微球时，如图2所示，步骤110之前，方法100还包括：

步骤140、根据预设双光子荧光增强倍数和荧光材料，确定微球尺寸和微球材料，并获取微球尺寸和微球材料对应的单个介电微球；

或者，

当介电微球为介电微球阵列时，如图3所示，所步骤110之前，方法100还包括：

步骤150、根据预设双光子荧光增强倍数和荧光材料，确定微球尺寸和微球材料，并获取由微球尺寸和微球材料对应的多个单个介电微球组成的介电微球阵列。

根据微球尺寸和微球材料，选择该微球尺寸和微球材料对应的介电微球悬浊液，取少量该介电微球悬浊液滴在干净的石英衬底上并放置在烘箱里(烘箱温度为70℃)，介电微球在液体张力的作用下通过自组装形成单层致密的微球阵列或分散的单个介电微球，在烘箱中保持约10分钟将其完全烘干，根据实际需要，可在石英衬底上获取单个介电微球或介电微球阵列。

研究发现，荧光材料的双光子荧光增强倍数与介电微球的尺寸和材料有关，可根据荧光材料和需要的双光子荧光增强倍数，选择合理的微球尺寸和微球材料，应用范围广，工艺简单，成本低，对于增强各种荧光材料的双光子荧光具有重大意义。

实施例四

在实施例二或实施例三的基础上，介电微球阵列为多个单个介电微球密集排列构成的单层微球阵列。

实施例五

在实施例一至实施例四中任一实施例的基础上，步骤120包括：

将激光源发射的激光照射到复合介电结构中的介电微球相对荧光材料的一侧上进行聚焦，得到聚焦后的光源。

以通过介电微球聚焦后的光源能垂直投射到荧光材料上的方式将激光源透射到介电微球上，能够使得聚焦后的光源最大限度的照射到荧光材料，以最大限度的激发荧光材料以增强双光子荧光。

实施例六

在实施例一至实施例五中任一实施例的基础上，荧光材料的形态为固态。

实施例七

在实施例一至实施例六中任一实施例的基础上，步骤110包括：

将荧光材料和介电微球间隔堆叠组合或部分接触组合，得到复合介电结构。

需要说明的是，荧光材料和介电微球的堆叠组合形式可以为荧光材料和介电微球接触组合，也可以是荧光材料和介电微球间隔设置组合，其中，间隔的距离可根据介电微球的尺寸选择。总之，通过将荧光材料和介电微球的结合，得到复合介电结构。

荧光材料和介电微球可以接触组合也可间隔组合，得到的复合介电结构，均能实现成本低、工艺简单、适用于大面积固态荧光材料的双光子荧光增强，应用范围广，可以实现低功率的双光子荧光成像，对于节约能源、保护样品不被损坏意义重大，有效解决了目前荧光材料双光子荧光效率低的问题。

例如，一种复合介电结构，将介电微球和二维钙钛矿材料结合，利用介电微球的纳米聚焦和重新定向功能，来增强二维钙钛矿的双光子荧光特性。介电微球/二维钙钛矿复合介电结构的制备分三步进行：

1.制备二维钙钛矿薄片

首先，利用溶液法生长二维钙钛矿材料的单晶，单晶的尺寸可以达到数个毫米。然后，利用机械剥离法将二维钙钛矿单晶剥离成厚度在1微米以下的薄片，并将其转移到干净的衬底上(如PDMS，石英基片等)。

2.制备介电微球阵列

取少量介电微球的悬浊液滴在干净的石英衬底上并放置在烘箱里，烘箱温度为70℃，介电微球在液体张力的作用下通过自组装形成单层致密的微球阵列，在烘箱中保持约10分钟将其完全烘干。

3.制备介电微球/二维钙钛矿复合介电结构

在显微镜下，选择厚度和尺寸合适的二维钙钛矿薄片，然后通过微操作，将制备好的介电微球阵列转移到选择好的二维钙钛矿薄片上面，得到复合介电结构，如图4所示，介电微球/二维钙钛矿复合介电结构，1代表二维钙钛矿，2代表二氧化硅微球或聚苯乙烯微球，二氧化硅微球或聚苯乙烯微球与二维钙钛矿薄膜接触组合，得到复合介电结构。

为了测试介电微球/二维钙钛矿复合介电结构能否增强二维钙钛矿材料的双光子荧光，利用共焦显微测试系统进行了光学测量。一台飞秒激光器(800nm,～8fs,80MHz)输出的激光束作为双光子激发源，经过显微物镜聚焦后照射在样品上，产生的双光子荧光导入到光谱仪进行测量，如图5所示，单纯二维钙钛矿(上图)和介电微球/二维钙钛矿复合介电结构(下图)的双光子荧光图像对比，图中，上图激光只照在二维钙钛矿1材料上，下图激光照在微球上，再聚焦到二维钙钛矿材料上，从图中可看出，介电微球/二维钙钛矿复合介电结构中的二维钙钛矿的双光子荧光强度远远强于单一二维钙钛矿1的双光子荧光强度。如图6所示，介电微球/二维钙钛矿复合介电结构(w/t MS)和单纯二维钙钛矿薄片(w/o MS)的双光子荧光光谱对比，可看出，介电微球/二维钙钛矿复合介电结构(w/t MS)的双光子荧光强度相比较单纯二维钙钛矿薄片(w/o MS)的双光子荧光强度，显著增强。如图7所示，研究了不同激发功率下介电微球/二维钙钛矿复合介电结构相对于单纯二维钙钛矿薄片的双光子荧光增强倍率，从图中可以看出，激发功率在0.06～0.18mw时,介电微球/二维钙钛矿复合介电结构中的二维钙钛矿的双光子荧光强度相较于单纯二维钙钛矿的双光子荧光强度增强100倍左右。

综上，在同样的测试条件下，介电微球/二维钙钛矿复合介电结构的双光子荧光要比单纯的二维钙钛矿薄片增强了100倍左右，通过将介电微球/二维钙钛矿复合介电结构应用于双光子荧光显微成像，使得需要的激光功率降低了2-3个数量级，对于节约能源、保护样品不被损坏意义重大。

实施例八

一种如实施例一至实施例七中任一实施例所述的双光子荧光的增强方法的应用，双光子荧光的增强方法应用于双光子荧光显微成像。

成本低、工艺简单、适用于大面积固态荧光材料的双光子荧光增强方法，可以实现低功率的双光子荧光显微成像，对于节约能源、保护样品不被损坏意义重大。

实施例九

一种双光子荧光成像装置200，如图8所示，包括：激光源3，共焦显微镜4，以及如实施例一至实施例七中任一实施例所述的复合介电结构5,6；激光源位于共焦显微镜的一侧，其发射的激光进入共焦显微镜，并由共焦显微镜的物镜聚焦，从物镜的出光口后方得到聚焦后的第一光源；复合介电结构位于物镜的出光口后方，第一光源照射到复合介电结构中的介电微球上进行聚焦，得到聚焦后的第二光源，第二光源激发复合介电结构中的荧光材料，得到增强了的双光子荧光；复合介电结构的后方外设微纳样品7(图中的虚线同心圆圈代表微纳样品上的微纳结构)，增强的双光子荧光照射到微纳样品上，微纳样品反射增强的双光子荧光经介电微球至物镜，实现微纳样品的双光子荧光成像。

例如，将介电微球/二维钙钛矿复合介电结构转移到DVD光盘上，巧妙结合DVD光盘、二维钙钛矿、介电微球的不同光学功能实现基于双光子荧光的超分辨显微成像：光盘上记录数据的纳米结构(周期740nm,条纹间距320nm)作为显微成像的样品；二维钙钛矿增强的双光子荧光作为照明光源，它耦合到底部的光盘，将盘面上的纳米结构信息提取出来送入介电微球；介电微球作为超透镜一方面将激光聚焦到二维钙钛矿上，使得二维钙钛矿的双光子荧光增强100倍左右，另一方面对载有光盘盘面上纳米结构信息的光学信号进行收集并成像

如图9所示，DVD光盘盘面的光学显微镜图像，如图10所示，铺上介电微球后的DVD盘面光学显微镜图像(白光照明，图中圆圈为介电微球，介电微球上的纹路为光盘上的纹路结构)，如图11所示，基于介电微球/二维钙钛矿复合介电结构的DVD光盘双光子荧光显微图像(双光子荧光照明，图中圆圈为介电微球，介电微球上的纹路为光盘上纳米结构的显微图像)，从图9～图11可以看出，图11的DVD光盘双光子荧光显微图像(光盘纹路)明显比图9和图10的成像(光盘纹路)清晰。

本实施例，通过成本低、工艺简单、适用于大面积固态荧光材料的复合介电结构，可以使得双光子荧光成像装置实现低功率的双光子荧光显微成像，对于节约能源、保护样品不被损坏意义重大。

综上，本发明针对目前纳米材料双光子荧光效率比较低的问题，提出一种低成本、制备工艺简单、可大面积制备的复合介电结构来增强纳米材料的双光子荧光，并将这一复合介电结构应用于双光子荧光显微成像。经过光学测量，发现在同样的测试条件下，介电微球/二维钙钛矿复合介电结构的双光子荧光要比单纯的二维钙钛矿薄片增强了100倍左右。通过将介电微球/二维钙钛矿复合介电结构应用于双光子荧光显微成像，使得需要的激光功率降低了2-3个数量级，对于节约能源、保护样品不被损坏意义重大。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种双光子荧光的增强方法，其特征在于，包括：

步骤1、将荧光材料和介电微球堆叠组合，得到复合介电结构；

步骤2、将激光源发射的激光通过显微物镜照射到所述复合介电结构中的所述介电微球上进行聚焦，得到聚焦后的光源；

步骤3、所述聚焦后的光源激发所述荧光材料发射双光子荧光，使得所述荧光材料的双光子荧光产生效率的增加，实现所述荧光材料所产生的双光子荧光的增强；另外，所述介电微球对所述双光子荧光进行重新定向，所述显微物镜收集由所述荧光材料发射的并经所述介电微球重新定向的双光子荧光，实现所述荧光材料双光子荧光收集效率的增加；进而由于所述产生效率和所述收集效率的增强，实现探测到的双光子荧光的增强；

其中，所述双光子荧光的增强倍数由所述介电微球的尺寸和材料决定；所述荧光材料的形态为固态。

2.根据权利要求1所述的一种双光子荧光的增强方法，其特征在于，所述复合介电结构中，所述介电微球为单个介电微球或介电微球阵列。

3.根据权利要求2所述的一种双光子荧光的增强方法，其特征在于， 当所述介电微球为单个介电微球时，所述步骤1之前，所述方法还包括：

步骤4、根据预设双光子荧光增强倍数和所述荧光材料，确定微球尺寸和微球材料，并获取所述微球尺寸和所述微球材料对应的所述单个介电微球；

或者，

当所述介电微球为介电微球阵列时，所述步骤1之前，所述方法还包括：

步骤5、根据预设双光子荧光增强倍数和所述荧光材料，确定微球尺寸和微球材料，并获取由所述微球尺寸和所述微球材料对应的多个单个介电微球组成的所述介电微球阵列。

4.根据权利要求3所述的一种双光子荧光的增强方法，其特征在于，所述介电微球阵列为多个单个介电微球密集排列构成的单层微球阵列。

5.根据权利要求1至4任一项所述的一种双光子荧光的增强方法，其特征在于，所述步骤2包括：

将激光源发射的激光照射到所述复合介电结构中的所述介电微球相对所述荧光材料的一侧上进行聚焦，得到聚焦后的光源。

6.根据权利要求1至4任一项所述的一种双光子荧光的增强方法，其特征在于，所述步骤1包括：

将荧光材料和介电微球间隔堆叠组合或部分接触组合，得到复合介电结构。

7.一种如权利要求1至6任一项所述的双光子荧光的增强方法的应用，其特征在于，所述双光子荧光的增强方法应用于双光子荧光显微成像，具体应用方法包括：

在如权利要求1 至6 任一项所述的双光子荧光的增强方法中荧光材料相对介电微球的一侧设置微纳样品，之后采用所述增强方法使得所述荧光材料发射双光子荧光并照射到所述微纳样品上，所述微纳样品反射所述双光子荧光并经所述介电微球重新定向传输至显微物镜，实现所述微纳样品上微纳结构的双光子荧光显微成像。

8.一种双光子荧光成像装置，其特征在于，包括：激光源，共焦显微镜，以及如权利要求1至6任一项所述的一种双光子荧光的增强方法中的复合介电结构；

所述激光源位于所述共焦显微镜的一侧，其发射的激光进入所述共焦显微镜，并由所述共焦显微镜的物镜聚焦，从所述物镜的出光口后方得到聚焦后的第一光源；

所述复合介电结构位于所述物镜的出光口后方，所述第一光源照射到所述复合介电结构中的所述介电微球上进行聚焦，得到聚焦后的第二光源，所述第二光源激发所述复合介电结构中的所述荧光材料发射双光子荧光，使得所述荧光材料的双光子荧光产生效率的增加，实现所述荧光材料所产生的双光子荧光的增强；

所述复合介电结构的后方外设微纳样品，所述双光子荧光照射到所述微纳样品上，所述微纳样品反射所述双光子荧光并经所述介电微球的重新定向传输至所述物镜以收集和成像，实现在探测到的双光子荧光的增强下所述微纳样品上微纳结构的双光子荧光显微成像；

其中，所述双光子荧光的增强倍数由所述介电微球的尺寸和材料决定。

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