JP2000356611A - 熱レンズ顕微鏡超微量分析方法とその装置 - Google Patents
熱レンズ顕微鏡超微量分析方法とその装置Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 操作が簡便であり、かつ、測定対象が限定さ
れることのなく、高い分解能による分析が可能となる熱
レンズ顕微鏡超微量分析方法とその装置を提供する。 【解決手段】 光学顕微鏡において、励起光（Ａ）を入
射し、励起光（Ａ）が試料（１０）中に照射されること
により形成される熱レンズに検出光（Ｂ）を入射し、熱
レンズによる検出光（Ｂ）の試料透過後の拡散を測定す
ることにより試料（１０）中の物質を検出を行う熱レン
ズ顕微鏡を用いた超微量分析方法であって、光学的調整
により、試料（１０）中における励起光（Ａ）および検
出光（Ｂ）の焦点位置が一致しないようにする。
れることのなく、高い分解能による分析が可能となる熱
レンズ顕微鏡超微量分析方法とその装置を提供する。 【解決手段】 光学顕微鏡において、励起光（Ａ）を入
射し、励起光（Ａ）が試料（１０）中に照射されること
により形成される熱レンズに検出光（Ｂ）を入射し、熱
レンズによる検出光（Ｂ）の試料透過後の拡散を測定す
ることにより試料（１０）中の物質を検出を行う熱レン
ズ顕微鏡を用いた超微量分析方法であって、光学的調整
により、試料（１０）中における励起光（Ａ）および検
出光（Ｂ）の焦点位置が一致しないようにする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、熱レンズ
顕微鏡超微量分析方法とその装置に関するものである。
さらに詳しくは、この出願の発明は、光学顕微鏡系とし
て熱レンズ顕微鏡を構成し、微小空間内の超微量な試料
物質を高精度に高空間分解能で分析することを可能とす
る超微量分析方法とそのための装置に関するものであ
る。
顕微鏡超微量分析方法とその装置に関するものである。
さらに詳しくは、この出願の発明は、光学顕微鏡系とし
て熱レンズ顕微鏡を構成し、微小空間内の超微量な試料
物質を高精度に高空間分解能で分析することを可能とす
る超微量分析方法とそのための装置に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術とその課題】半導体や生体試料、あるいは
各種の液体試料等の分析や測定を目的として分光分析法
が広く利用されてきている。しかし、これまでの分光分
析法では、微小空間での微量あるいは微小物質を分析す
る場合には、測定条件として真空が必要であったり、電
子ビームやイオンビームの利用等の使用にともなって、
試料が破壊ないし損傷される等の問題があった。また、
溶液あるいは生体組織中等の超微量の試料を扱う場合に
は、光学領域の顕微鏡の使用が必須となるが、高精度で
高い空間分解能での分析が必要とされるこのような光学
領域の顕微鏡として実際的に利用されているのはレーザ
ー蛍光顕微鏡に限られており、このため、分析の対象も
おのずとレーザー蛍光顕微鏡蛍光分子に限られている。
このような事情から、従来では、真空場を必要とするこ
とがなく、非接触、非損傷での分析が可能であって、し
かも分析対象が蛍光分子に限定されることなしに、高精
度で、高い空間分解能での分析が可能とされる光学顕微
鏡の実現が求められていた。
各種の液体試料等の分析や測定を目的として分光分析法
が広く利用されてきている。しかし、これまでの分光分
析法では、微小空間での微量あるいは微小物質を分析す
る場合には、測定条件として真空が必要であったり、電
子ビームやイオンビームの利用等の使用にともなって、
試料が破壊ないし損傷される等の問題があった。また、
溶液あるいは生体組織中等の超微量の試料を扱う場合に
は、光学領域の顕微鏡の使用が必須となるが、高精度で
高い空間分解能での分析が必要とされるこのような光学
領域の顕微鏡として実際的に利用されているのはレーザ
ー蛍光顕微鏡に限られており、このため、分析の対象も
おのずとレーザー蛍光顕微鏡蛍光分子に限られている。
このような事情から、従来では、真空場を必要とするこ
とがなく、非接触、非損傷での分析が可能であって、し
かも分析対象が蛍光分子に限定されることなしに、高精
度で、高い空間分解能での分析が可能とされる光学顕微
鏡の実現が求められていた。
【０００３】そこで、従来より、これらの要求を満たす
ものとして光熱変換現象による熱レンズ効果を利用した
熱レンズ顕微鏡が注目されてきた。しかしながら、実際
には、光学顕微鏡として、つまり、接眼レンズと対物レ
ンズというレンズ構成による光学顕微鏡で熱レンズ顕微
鏡を実現することは極めて困難であった。
ものとして光熱変換現象による熱レンズ効果を利用した
熱レンズ顕微鏡が注目されてきた。しかしながら、実際
には、光学顕微鏡として、つまり、接眼レンズと対物レ
ンズというレンズ構成による光学顕微鏡で熱レンズ顕微
鏡を実現することは極めて困難であった。
【０００４】熱レンズ顕微鏡では、励起光と検出光との
関係を、励起光が試料中に入射されることにより形成さ
れる熱レンズに検出光を入射し、試料透過後の検出光の
拡散から試料物質の検出を行うものとすることが欠かせ
ない。しかし、光学顕微鏡の構成では、励起光と検出光
の焦点位置が一致してしまうことから、上記の関係は、
実現困難であると考えられてきた。
関係を、励起光が試料中に入射されることにより形成さ
れる熱レンズに検出光を入射し、試料透過後の検出光の
拡散から試料物質の検出を行うものとすることが欠かせ
ない。しかし、光学顕微鏡の構成では、励起光と検出光
の焦点位置が一致してしまうことから、上記の関係は、
実現困難であると考えられてきた。
【０００５】もちろん、これまでにもいくつかの工夫が
提案されている。しかし、いずれの場合も、操作が複雑
過ぎるなどの理由から、具体化されなかった。そこで、
この出願の発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされた
ものであり、操作が単純であり、かつ、測定対象が限定
されることなく、高精度で高い空間分解能による分析が
光学顕微鏡の構成で可能となる、新しい熱レンズ顕微鏡
超微量分析方法とその装置を提供することを課題として
いる。
提案されている。しかし、いずれの場合も、操作が複雑
過ぎるなどの理由から、具体化されなかった。そこで、
この出願の発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされた
ものであり、操作が単純であり、かつ、測定対象が限定
されることなく、高精度で高い空間分解能による分析が
光学顕微鏡の構成で可能となる、新しい熱レンズ顕微鏡
超微量分析方法とその装置を提供することを課題として
いる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記
の課題を解決するものとして、第１には、光学顕微鏡に
おいて、励起光を入射し、励起光が試料中に照射される
ことにより形成される熱レンズに検出光を入射し、熱レ
ンズによる検出光の拡散を測定することにより試料中の
物質を検出を行う熱レンズ顕微鏡を用いた超微量分析方
法であって、光学的調整により、試料中における励起光
および検出光の焦点位置が一致しないようにすることを
特徴とする熱レンズ顕微鏡超微量分析方法を提供する。
の課題を解決するものとして、第１には、光学顕微鏡に
おいて、励起光を入射し、励起光が試料中に照射される
ことにより形成される熱レンズに検出光を入射し、熱レ
ンズによる検出光の拡散を測定することにより試料中の
物質を検出を行う熱レンズ顕微鏡を用いた超微量分析方
法であって、光学的調整により、試料中における励起光
および検出光の焦点位置が一致しないようにすることを
特徴とする熱レンズ顕微鏡超微量分析方法を提供する。
【０００７】また、この出願の発明は、第２には、励起
光と検出光の周波数を異なるものとし、色収差のあるレ
ンズを対物レンズとして用いることにより、試料中にお
ける励起光および検出光の焦点位置が一致しないように
する熱レンズ顕微鏡超微量分析方法を、第３には、励起
光または検出光のいずれかを角度を持たせて光学顕微鏡
へ入射することにより、試料中における励起光および検
出光の焦点位置が一致しないようにする熱レンズ顕微鏡
超微量分析方法も提供する。
光と検出光の周波数を異なるものとし、色収差のあるレ
ンズを対物レンズとして用いることにより、試料中にお
ける励起光および検出光の焦点位置が一致しないように
する熱レンズ顕微鏡超微量分析方法を、第３には、励起
光または検出光のいずれかを角度を持たせて光学顕微鏡
へ入射することにより、試料中における励起光および検
出光の焦点位置が一致しないようにする熱レンズ顕微鏡
超微量分析方法も提供する。
【０００８】そして、この出願の発明は、第４には、光
学顕微鏡としての接眼レンズと対物レンズ並びに試料ス
テージを備えた請求項１の方法のための装置であって、
励起光と検出光の光源と、試料中での励起光と検出光の
焦点位置を一致させない光学調整装置と、試料透過光の
集光装置とを有し、励起光と検出光とは接眼レンズに入
射されて対物レンズより試料ステージ上の試料に放射さ
れ、光学調整装置によって励起光と検出光の試料中の焦
点位置は一致しないようにされ、試料透過光は集光装置
により集光されて透過光のうちの検出光のみから分析が
行われることを特徴とする熱レンズ顕微鏡超微量分析装
置を提供する。さらにまた、この出願の発明は、第５に
は、励起光と検出光の周波数を異なるものとした請求項
４の装置であって、色収差のあるレンズを対物レンズと
して光学調整装置を構成している熱レンズ顕微鏡超微量
分析装置を、第６には、第４の発明の装置であって、ビ
ームエキスパンダーにより、励起光または検出光のいず
れかを角度を持たせて光学顕微鏡に入射するようにして
光学調整装置を構成している熱レンズ顕微鏡超微量分析
装置を提供する。
学顕微鏡としての接眼レンズと対物レンズ並びに試料ス
テージを備えた請求項１の方法のための装置であって、
励起光と検出光の光源と、試料中での励起光と検出光の
焦点位置を一致させない光学調整装置と、試料透過光の
集光装置とを有し、励起光と検出光とは接眼レンズに入
射されて対物レンズより試料ステージ上の試料に放射さ
れ、光学調整装置によって励起光と検出光の試料中の焦
点位置は一致しないようにされ、試料透過光は集光装置
により集光されて透過光のうちの検出光のみから分析が
行われることを特徴とする熱レンズ顕微鏡超微量分析装
置を提供する。さらにまた、この出願の発明は、第５に
は、励起光と検出光の周波数を異なるものとした請求項
４の装置であって、色収差のあるレンズを対物レンズと
して光学調整装置を構成している熱レンズ顕微鏡超微量
分析装置を、第６には、第４の発明の装置であって、ビ
ームエキスパンダーにより、励起光または検出光のいず
れかを角度を持たせて光学顕微鏡に入射するようにして
光学調整装置を構成している熱レンズ顕微鏡超微量分析
装置を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】この出願の発明は、上記のとおり
の特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態につ
いてさらに詳しく説明する。なによりもこの出願の発明
では、励起光と検出光の焦点位置を光学的調整によって
一致しないようにすることで、光学顕微鏡系であって、
しかも熱レンズ顕微鏡であることを特徴としている。
の特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態につ
いてさらに詳しく説明する。なによりもこの出願の発明
では、励起光と検出光の焦点位置を光学的調整によって
一致しないようにすることで、光学顕微鏡系であって、
しかも熱レンズ顕微鏡であることを特徴としている。
【００１０】ここで、光学顕微鏡、あるいは光学顕微鏡
系との規定は、接眼レンズと対物レンズとのレンズ構成
を有しているもの、あるいは、さらにはこれに加えて、
対物レンズに対向する試料ステージを有しているものを
意味している。そして、この発明の装置は、前記のとお
り、光学顕微鏡としての接眼レンズと対物レンズ並びに
試料ステージを備えた装置であって、励起光と検出光の
光源と、試料中での励起光と検出光の焦点位置を一致さ
せない光学調整装置と、試料透過光の集光装置とを有
し、励起光と検出光とは接眼レンズに入射されて対物レ
ンズより試料ステージ上の試料に放射され、光学調整装
置によって励起光と検出光の試料中の焦点位置は一致し
ないようにされ、試料透過光は集光装置により集光され
て透過光のうちの検出光のみから分析が行われることを
特徴としている。
系との規定は、接眼レンズと対物レンズとのレンズ構成
を有しているもの、あるいは、さらにはこれに加えて、
対物レンズに対向する試料ステージを有しているものを
意味している。そして、この発明の装置は、前記のとお
り、光学顕微鏡としての接眼レンズと対物レンズ並びに
試料ステージを備えた装置であって、励起光と検出光の
光源と、試料中での励起光と検出光の焦点位置を一致さ
せない光学調整装置と、試料透過光の集光装置とを有
し、励起光と検出光とは接眼レンズに入射されて対物レ
ンズより試料ステージ上の試料に放射され、光学調整装
置によって励起光と検出光の試料中の焦点位置は一致し
ないようにされ、試料透過光は集光装置により集光され
て透過光のうちの検出光のみから分析が行われることを
特徴としている。
【００１１】図１は、この出願の発明に係る熱レンズ顕
微鏡超微量分析方法とその装置の一つの実施の形態を例
示した構成概略図である。この例において、励起光
（Ａ）は励起光源（１）から出力される。励起光源
（１）から出力された励起光（Ａ）は、チョッパ（２）
によって変調される。また、検出光源（３）から出力さ
れた検出光（Ｂ）は、ダイクロックミラー（４）によ
り、変調後の励起光（Ａ）と同軸にて合成される。励起
光（Ａ）と検出光（Ｂ）からなる合成光（Ｃ）は、反射
ミラー（５）によって反射され、接眼レンズ（６）から
光学顕微鏡（７）内部へ入射される。励起光源（１）お
よび検出光源（３）には、たとえば、アルゴンレーザー
光源やヘリウムネオンレーザー光源といった各種レーザ
ー光源が適宜に用いられる。
微鏡超微量分析方法とその装置の一つの実施の形態を例
示した構成概略図である。この例において、励起光
（Ａ）は励起光源（１）から出力される。励起光源
（１）から出力された励起光（Ａ）は、チョッパ（２）
によって変調される。また、検出光源（３）から出力さ
れた検出光（Ｂ）は、ダイクロックミラー（４）によ
り、変調後の励起光（Ａ）と同軸にて合成される。励起
光（Ａ）と検出光（Ｂ）からなる合成光（Ｃ）は、反射
ミラー（５）によって反射され、接眼レンズ（６）から
光学顕微鏡（７）内部へ入射される。励起光源（１）お
よび検出光源（３）には、たとえば、アルゴンレーザー
光源やヘリウムネオンレーザー光源といった各種レーザ
ー光源が適宜に用いられる。
【００１２】光学顕微鏡（７）内部に入射された合成光
（Ｃ）は、対物レンズ（８）より出力され、ステージ
（９）に設置された試料（１０）に照射される。試料内
部においては、合成光（Ｃ）を構成する励起光（Ａ）の
一部により光熱変換現象に基づき熱レンズが形成され、
熱レンズを通過した検出光（Ｂ）は拡散し、光熱変換に
関わらなかった励起光（Ａ）とともに試料中を透過す
る。原理的には励起光（Ａ）も熱レンズの影響を受ける
が、検出光（Ｂ）に比べてわずかである。ステージ
（９）は水平方向、垂直方向に移動することが可能であ
り、水平方向に移動することにより、２次元走査分析が
可能である。
（Ｃ）は、対物レンズ（８）より出力され、ステージ
（９）に設置された試料（１０）に照射される。試料内
部においては、合成光（Ｃ）を構成する励起光（Ａ）の
一部により光熱変換現象に基づき熱レンズが形成され、
熱レンズを通過した検出光（Ｂ）は拡散し、光熱変換に
関わらなかった励起光（Ａ）とともに試料中を透過す
る。原理的には励起光（Ａ）も熱レンズの影響を受ける
が、検出光（Ｂ）に比べてわずかである。ステージ
（９）は水平方向、垂直方向に移動することが可能であ
り、水平方向に移動することにより、２次元走査分析が
可能である。
【００１３】試料（１０）を透過した合成光（Ｃ）は、
ピンホール（１１）を経て集光される。集光された合成
光（Ｃ）は反射ミラー（１２）によってレンズ（１３）
に入力されさらに集光され、フィルタ（１４）へ入力さ
れる。フィルタ（１４）により、合成光（Ｃ）を構成す
る成分としての励起光（Ａ）の成分は遮断され、検出光
（Ｂ）の成分が、フォトダイオード（１５）に入力さ
れ、電気信号に変換される。電気信号は、プリアンプ
（１６）によって増幅されロックインアンプ（１７）に
入力され、チョッパ（２）を制御するチョッパ制御装置
（１８）からのリファレンス信号と併せて計測される。
ロックインアンプ（１７）から出力される計測結果を示
す信号は、コンピュータ（１９）に入力され、試料（１
０）の分析がなされる。
ピンホール（１１）を経て集光される。集光された合成
光（Ｃ）は反射ミラー（１２）によってレンズ（１３）
に入力されさらに集光され、フィルタ（１４）へ入力さ
れる。フィルタ（１４）により、合成光（Ｃ）を構成す
る成分としての励起光（Ａ）の成分は遮断され、検出光
（Ｂ）の成分が、フォトダイオード（１５）に入力さ
れ、電気信号に変換される。電気信号は、プリアンプ
（１６）によって増幅されロックインアンプ（１７）に
入力され、チョッパ（２）を制御するチョッパ制御装置
（１８）からのリファレンス信号と併せて計測される。
ロックインアンプ（１７）から出力される計測結果を示
す信号は、コンピュータ（１９）に入力され、試料（１
０）の分析がなされる。
【００１４】そして、この発明では、熱レンズ顕微鏡超
微量分析を行うために、対物レンズ（８）より試料（１
０）中へ入射される励起光（Ａ）と検出光（Ｂ）の焦点
位置が一致しないようにする。そのための光学調整法と
しては、たとえば励起光（Ａ）と検出光（Ｂ）の周波数
を異なるものとし、色収差のあるレンズを対物レンズ
（８）として用いる方法がある。また、ビームエキスパ
ンダー（２０）を用いて、励起光（Ａ）または検出光
（Ｂ）のいずれに角度を持たせて光学顕微鏡（７）の接
眼レンズ（６）へ入射する方法が挙げられる。後者の方
法については、原理的には励起光（Ａ）と検出光（Ｂ）
のどちらに対してもビームエキスパンダー（２０）を用
いてもよいが、ビームエキスパンダー（２０）を構成す
る光学素子による機械的な振動の発生とより精度の高い
分析のためには検出光（Ｂ）は安定した状態であること
が望ましいことを考慮すると、励起光（Ａ）に対してビ
ームエキスパンダー（２０）を適用することが好まし
い。
微量分析を行うために、対物レンズ（８）より試料（１
０）中へ入射される励起光（Ａ）と検出光（Ｂ）の焦点
位置が一致しないようにする。そのための光学調整法と
しては、たとえば励起光（Ａ）と検出光（Ｂ）の周波数
を異なるものとし、色収差のあるレンズを対物レンズ
（８）として用いる方法がある。また、ビームエキスパ
ンダー（２０）を用いて、励起光（Ａ）または検出光
（Ｂ）のいずれに角度を持たせて光学顕微鏡（７）の接
眼レンズ（６）へ入射する方法が挙げられる。後者の方
法については、原理的には励起光（Ａ）と検出光（Ｂ）
のどちらに対してもビームエキスパンダー（２０）を用
いてもよいが、ビームエキスパンダー（２０）を構成す
る光学素子による機械的な振動の発生とより精度の高い
分析のためには検出光（Ｂ）は安定した状態であること
が望ましいことを考慮すると、励起光（Ａ）に対してビ
ームエキスパンダー（２０）を適用することが好まし
い。
【００１５】以上の特徴について、以下に実施例を示
し、さらに具体的に説明する。
し、さらに具体的に説明する。
【００１６】
【実施例】実施例１ この出願の発明に係る熱レンズ顕微鏡超微量分析の空間
分解能を、図１の構成の装置において、銀薄膜を蒸着し
たガラス基板を用いた分析として評価した。励起光源と
して、アルゴンレーザー光源を用いた。また、検出光源
として、ヘリウムネオンレーザー光源を用いた。励起光
と検出光の焦点位置が一致しないように色収差のあるレ
ンズを対物レンズ（８）として用いた。
分解能を、図１の構成の装置において、銀薄膜を蒸着し
たガラス基板を用いた分析として評価した。励起光源と
して、アルゴンレーザー光源を用いた。また、検出光源
として、ヘリウムネオンレーザー光源を用いた。励起光
と検出光の焦点位置が一致しないように色収差のあるレ
ンズを対物レンズ（８）として用いた。
【００１７】銀薄膜が蒸着されたガラス基板を１方向へ
走査し、透過光の強度を電圧として測定した結果を図２
に示す。図２より明らかなように、銀薄膜端点が信号が
立ち上がっている。これより、この装置の空間分解能が
約１．０μｍであることがわかる。このことから、空間
分解能は、検出光のスポット径に等しく、この出願の発
明に係る熱レンズ顕微鏡超微量分析は、微粒子の検出に
優れた能力を持つことがわかる。実施例２ 熱レンズ信号が吸光度に比例することを利用して、この
出願の発明に係る熱レンズ顕微鏡超微量分析による濃度
分布の定量的な画像化を試みた。
走査し、透過光の強度を電圧として測定した結果を図２
に示す。図２より明らかなように、銀薄膜端点が信号が
立ち上がっている。これより、この装置の空間分解能が
約１．０μｍであることがわかる。このことから、空間
分解能は、検出光のスポット径に等しく、この出願の発
明に係る熱レンズ顕微鏡超微量分析は、微粒子の検出に
優れた能力を持つことがわかる。実施例２ 熱レンズ信号が吸光度に比例することを利用して、この
出願の発明に係る熱レンズ顕微鏡超微量分析による濃度
分布の定量的な画像化を試みた。
【００１８】具体例として、抗生物質トブラマイシンが
尿細管の組織内に取りこまれていく経時変化の画像化を
行った。金コロイドで標識した抗体を用いてトブラマイ
シンを免疫染色した。励起光源として、アルゴンレーザ
ー光源を用いた。また、検出光源として、ヘリウムネオ
ンレーザー光源を用いた。励起光と検出光の焦点位置が
一致しないように色収差のあるレンズを対物レンズとし
て用いた。
尿細管の組織内に取りこまれていく経時変化の画像化を
行った。金コロイドで標識した抗体を用いてトブラマイ
シンを免疫染色した。励起光源として、アルゴンレーザ
ー光源を用いた。また、検出光源として、ヘリウムネオ
ンレーザー光源を用いた。励起光と検出光の焦点位置が
一致しないように色収差のあるレンズを対物レンズとし
て用いた。
【００１９】図３に、定量測定した結果を示した。比較
例として、図４に、同じ測定対象に対する反射型共焦点
レーザー顕微鏡による定量測定結果を示した。図３およ
び図４において、ａ）からｄ）は、それぞれトブラマイ
シンを摂取してから、０時間後、１時間後、４時間後、
８時間後の画像である。トブラマイシンに対する良好な
検量線も得られており、検量線との対比からｂ）、
ｃ）、ｄ）の画像でそれぞれ、組織内に１０ｆｍｏｌ、
５ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌのトブラマイシンが存在してい
ると推定される。また、時間が経つにつれて、トブラマ
イシンが尿細管組織から排出されていく様子も知ること
ができる。
例として、図４に、同じ測定対象に対する反射型共焦点
レーザー顕微鏡による定量測定結果を示した。図３およ
び図４において、ａ）からｄ）は、それぞれトブラマイ
シンを摂取してから、０時間後、１時間後、４時間後、
８時間後の画像である。トブラマイシンに対する良好な
検量線も得られており、検量線との対比からｂ）、
ｃ）、ｄ）の画像でそれぞれ、組織内に１０ｆｍｏｌ、
５ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌのトブラマイシンが存在してい
ると推定される。また、時間が経つにつれて、トブラマ
イシンが尿細管組織から排出されていく様子も知ること
ができる。
【００２０】図３と図４の比較により、共焦点レーザー
顕微鏡による画像（図４）では、標識金コロイドに対応
すると考えられる輝点が離散的に見えるのに対して、こ
の発明の熱レンズ顕微鏡超微量分析による画像（図３）
では、滑らかな連続的な分布が得られている。代謝過程
や組織構造から考えて、トブラマイシンが離散的に分布
することは考えにくく、この発明の熱レンズ顕微鏡超微
量分析による画像の方が正確かつ定量的に分布像を示し
ていると考えられる。実施例３ さらに、この出願の発明に係る熱レンズ顕微鏡超微量分
析を、小型ゲルを用いた短距離電気泳動によるＤＮＡの
高空間分解検出に適用した。
顕微鏡による画像（図４）では、標識金コロイドに対応
すると考えられる輝点が離散的に見えるのに対して、こ
の発明の熱レンズ顕微鏡超微量分析による画像（図３）
では、滑らかな連続的な分布が得られている。代謝過程
や組織構造から考えて、トブラマイシンが離散的に分布
することは考えにくく、この発明の熱レンズ顕微鏡超微
量分析による画像の方が正確かつ定量的に分布像を示し
ていると考えられる。実施例３ さらに、この出願の発明に係る熱レンズ顕微鏡超微量分
析を、小型ゲルを用いた短距離電気泳動によるＤＮＡの
高空間分解検出に適用した。
【００２１】図５はその状態の概要を示したものであ
る。この図５においては、励起光（５１）と検出光（５
２）がゲル（５３）中の試料バンド（５４）に対物レン
ズ（６０）を介して照射される。熱レンズ（５５）が利
用されている。透光した光はピンホール（５６）、フィ
ルター（５７）、集光レンズ（５８）を介して集光さ
れ、透過した検出光のみがフォトダイオード（５９）に
おいて検知されることになる。この検知により分析が可
能とされる。
る。この図５においては、励起光（５１）と検出光（５
２）がゲル（５３）中の試料バンド（５４）に対物レン
ズ（６０）を介して照射される。熱レンズ（５５）が利
用されている。透光した光はピンホール（５６）、フィ
ルター（５７）、集光レンズ（５８）を介して集光さ
れ、透過した検出光のみがフォトダイオード（５９）に
おいて検知されることになる。この検知により分析が可
能とされる。
【００２２】ガラスプレートを用いて、縦２５ｍｍ、横
２８ｍｍ、厚さ８０μｍである小型の不連続ポリアクリ
ルアミドゲル（濃縮ゲル：長さ５ｍｍ、３％Ｔ、３％
Ｃ、緩衝液ｐＨ６．８Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、分離ゲル：長
さ７０ｍｍ、７．５％Ｔ、３％Ｃ、緩衝液ｐＨ８．８Ｔ
ｒｉｓ／ＨＣｌ）を作成した。試料として、１０ｂａｓ
ｅ ｐａｉｒ ｌａｄｄｅｒ（ｂｐｌ）ＤＮＡ試料を用
いた。電極緩衝液には、ｐＨ８．３Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃ
ｉｎｅ溶液を用い、３０〜１２０Ｖ／ｃｍの電場で、３
〜５分間電気泳動分離を行った。ＤＮＡ分離パターンを
銀染色した後、図１に例示した構成の装置を用いて検出
を行った。励起光源として、アルゴンレーザー光源を用
いた。また、検出光源として、ヘリウムネオンレーザー
光源を用いた。励起光と検出光の焦点位置が一致しない
ように色収差のあるレンズを対物レンズとして用いた。
２８ｍｍ、厚さ８０μｍである小型の不連続ポリアクリ
ルアミドゲル（濃縮ゲル：長さ５ｍｍ、３％Ｔ、３％
Ｃ、緩衝液ｐＨ６．８Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、分離ゲル：長
さ７０ｍｍ、７．５％Ｔ、３％Ｃ、緩衝液ｐＨ８．８Ｔ
ｒｉｓ／ＨＣｌ）を作成した。試料として、１０ｂａｓ
ｅ ｐａｉｒ ｌａｄｄｅｒ（ｂｐｌ）ＤＮＡ試料を用
いた。電極緩衝液には、ｐＨ８．３Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃ
ｉｎｅ溶液を用い、３０〜１２０Ｖ／ｃｍの電場で、３
〜５分間電気泳動分離を行った。ＤＮＡ分離パターンを
銀染色した後、図１に例示した構成の装置を用いて検出
を行った。励起光源として、アルゴンレーザー光源を用
いた。また、検出光源として、ヘリウムネオンレーザー
光源を用いた。励起光と検出光の焦点位置が一致しない
ように色収差のあるレンズを対物レンズとして用いた。
【００２３】図６に示すように、実際に得られたＤＮＡ
試料のバンド幅は１００μｍであり、これは従来の大き
さのゲルを用いた場合の約１／１０の幅である。分離に
要した泳動距離は１６ｍｍ、時間は１５分であり、これ
は従来の大きさのゲルを用いた場合の１０倍以上速い。
分離された各試料バンドは、肉眼では約１５００ｂｐま
でしか検出できないが、この出願の発明に係る熱レンズ
顕微鏡超微量分析により２４００ｂｐまでの検出が可能
であった。
試料のバンド幅は１００μｍであり、これは従来の大き
さのゲルを用いた場合の約１／１０の幅である。分離に
要した泳動距離は１６ｍｍ、時間は１５分であり、これ
は従来の大きさのゲルを用いた場合の１０倍以上速い。
分離された各試料バンドは、肉眼では約１５００ｂｐま
でしか検出できないが、この出願の発明に係る熱レンズ
顕微鏡超微量分析により２４００ｂｐまでの検出が可能
であった。
【００２４】以上より、この出願の発明に係る熱レンズ
顕微鏡超微量分析は、優れた空間分解能を有しており、
また、この空間分解能を利用した小型試料の測定も可能
となり、測定時間の短縮に貢献することがわかった。
顕微鏡超微量分析は、優れた空間分解能を有しており、
また、この空間分解能を利用した小型試料の測定も可能
となり、測定時間の短縮に貢献することがわかった。
【００２５】
【発明の効果】この出願の発明により、空間分解能や定
量分析能力に優れ、かつ、生体細胞や組織などのｉｎ−
ｖｉｔｒｏ、ｉｎ−ｖｉｖｏ測定が可能である光学顕微
鏡の構成として、超微量分析顕微鏡が実現する。さら
に、高い空間分解能や定量分析能力を応用することによ
り、試料を小型化し、分析時間を大幅に短縮することや
試料量を低減することも可能となる。
量分析能力に優れ、かつ、生体細胞や組織などのｉｎ−
ｖｉｔｒｏ、ｉｎ−ｖｉｖｏ測定が可能である光学顕微
鏡の構成として、超微量分析顕微鏡が実現する。さら
に、高い空間分解能や定量分析能力を応用することによ
り、試料を小型化し、分析時間を大幅に短縮することや
試料量を低減することも可能となる。
【００２６】また、光熱変換分工法の利点や特徴を有す
ることから、熱拡散率や比熱などの熱物性物理量の分布
測定や超光速時間分解測定などにも応用可能であると考
えられる。以上より、この出願の発明に係る熱レンズ顕
微鏡超微量分析装置が、今後の材料開発や物理化学研
究、生体工学研究などに対して極めて有効な手段となる
ことが期待される。
ることから、熱拡散率や比熱などの熱物性物理量の分布
測定や超光速時間分解測定などにも応用可能であると考
えられる。以上より、この出願の発明に係る熱レンズ顕
微鏡超微量分析装置が、今後の材料開発や物理化学研
究、生体工学研究などに対して極めて有効な手段となる
ことが期待される。
【図１】この出願の発明に係る熱レンズ顕微鏡超微量分
析装置の実施形態を例示した構成概略図である。
析装置の実施形態を例示した構成概略図である。
【図２】この出願の発明の実施例１におけるガラス基板
上銀蒸着膜の１次元走査測定結果を示した図である。
上銀蒸着膜の１次元走査測定結果を示した図である。
【図３】この出願の発明の実施例２において、この出願
の発明に係る熱レンズ顕微鏡超微量分析装置により画像
化された、金コロイド免疫染色した尿細管組織中のトブ
ラマイシン分布像を示した図である。
の発明に係る熱レンズ顕微鏡超微量分析装置により画像
化された、金コロイド免疫染色した尿細管組織中のトブ
ラマイシン分布像を示した図である。
【図４】反射型共焦点レーザー顕微鏡により画像化され
た、金コロイド免疫染色した尿細管組織中のトブラマイ
シン分布像を示した図である。
た、金コロイド免疫染色した尿細管組織中のトブラマイ
シン分布像を示した図である。
【図５】この出願の発明の実施例３における小型ゲルを
用いた短距離電気泳動によるＤＮＡの高空間分解検出を
示す概略図である。
用いた短距離電気泳動によるＤＮＡの高空間分解検出を
示す概略図である。
【図６】この出願の発明の実施例３における測定結果を
示した図である。
示した図である。
Ａ 励起光 Ｂ 検出光 Ｃ 合成光 １ 励起光源 ２ チョッパ ３ 検出光源 ４ ダイクロックミラー ５ 反射ミラー ６ 接眼レンズ ７ 光学顕微鏡 ８ 対物レンズ ９ ステージ １０ 試料 １１ ピンホール １２ 反射ミラー １３ レンズ １４ フィルタ １５ フォトダイオード １６ プリアンプ １７ ロックインアンプ １８ チョッパ制御装置 １９ コンピュータ ２０ ビームエキスパンダー ５１ 励起光 ５２ 検出光 ５３ ゲル ５４ 試料バンド ５５ 熱レンズ ５６ ピンホール ５７ フィルター ５８ 集光レンズ ５９ フォトダイオード ６０ 対物レンズ
Claims (6)
- 【請求項１】 光学顕微鏡において、励起光を入射し、
励起光が試料中に照射されることにより形成される熱レ
ンズに検出光を入射し、熱レンズによる試料透過後の検
出光の拡散を測定することにより試料中の物質の検出を
行う熱レンズ顕微鏡を用いた超微量分析方法であって、
光学的調整により、試料中における励起光および検出光
の焦点位置が一致しないようにすることを特徴とする熱
レンズ顕微鏡超微量分析方法。 - 【請求項２】 励起光と検出光の周波数を異なるものと
し、色収差のあるレンズを対物レンズとして用いること
により、試料中における励起光および検出光の焦点位置
が一致しないようにする請求項１記載の熱レンズ顕微鏡
超微量分析方法。 - 【請求項３】 励起光または検出光のいずれかを角度を
持たせて光学顕微鏡へ入射することにより、試料中にお
ける励起光および検出光の焦点位置が一致しないように
する請求項１記載の熱レンズ顕微鏡超微量分析方法。 - 【請求項４】 光学顕微鏡としての接眼レンズと対物レ
ンズ並びに試料ステージを備えた請求項１の方法のため
の装置であって、励起光と検出光の光源と、試料中での
励起光と検出光の焦点位置を一致させない光学調整装置
と、試料透過光の集光装置とを有し、励起光と検出光と
は接眼レンズに入射されて対物レンズより試料ステージ
上の試料に放射され、光学調整装置によって励起光と検
出光の試料中の焦点位置は一致しないようにされ、試料
透過光は集光装置により集光されて透過光のうちの検出
光のみから分析が行われることを特徴とする熱レンズ顕
微鏡超微量分析装置。 - 【請求項５】 励起光と検出光の周波数を異なるものと
した請求項４の装置であって、色収差のあるレンズを対
物レンズとして光学調整装置を構成している熱レンズ顕
微鏡超微量分析装置。 - 【請求項６】 請求項４の装置であって、ビームエキス
パンダーにより、励起光または検出光のいずれかを角度
を持たせて光学顕微鏡に入射するようにして光学調整装
置を構成している熱レンズ顕微鏡超微量分析装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11168772A JP2000356611A (ja) | 1999-06-15 | 1999-06-15 | 熱レンズ顕微鏡超微量分析方法とその装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11168772A JP2000356611A (ja) | 1999-06-15 | 1999-06-15 | 熱レンズ顕微鏡超微量分析方法とその装置 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003354393A Division JP2004045434A (ja) | 2003-10-14 | 2003-10-14 | 熱レンズ顕微鏡超微量分析方法とその装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000356611A true JP2000356611A (ja) | 2000-12-26 |
Family
ID=15874184
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11168772A Pending JP2000356611A (ja) | 1999-06-15 | 1999-06-15 | 熱レンズ顕微鏡超微量分析方法とその装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000356611A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005257414A (ja) * | 2004-03-10 | 2005-09-22 | Kobe Steel Ltd | 光熱変換測定装置，その方法，及びセル |
| JP2007255993A (ja) * | 2006-03-22 | 2007-10-04 | Kobe Steel Ltd | 分離精製分析装置 |
| WO2007119399A1 (ja) * | 2006-03-22 | 2007-10-25 | Kabushiki Kaisha Kobe Seiko Sho | 分析装置 |
| JP2009068952A (ja) * | 2007-09-12 | 2009-04-02 | Funai Electric Advanced Applied Technology Research Institute Inc | 物質検出装置及び物質検出方法 |
| US7522287B2 (en) | 2005-02-14 | 2009-04-21 | Kobe Steel, Ltd. | Photothermal conversion measurement apparatus, photothermal conversion measurement method, and sample cell |
| JP2011043355A (ja) * | 2009-08-19 | 2011-03-03 | Kobe Steel Ltd | ナトリウムイオン検出試薬、ナトリウムイオン検出方法、及びナトリウムイオン検出装置 |
-
1999
- 1999-06-15 JP JP11168772A patent/JP2000356611A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005257414A (ja) * | 2004-03-10 | 2005-09-22 | Kobe Steel Ltd | 光熱変換測定装置，その方法，及びセル |
| US7522287B2 (en) | 2005-02-14 | 2009-04-21 | Kobe Steel, Ltd. | Photothermal conversion measurement apparatus, photothermal conversion measurement method, and sample cell |
| JP2007255993A (ja) * | 2006-03-22 | 2007-10-04 | Kobe Steel Ltd | 分離精製分析装置 |
| WO2007119399A1 (ja) * | 2006-03-22 | 2007-10-25 | Kabushiki Kaisha Kobe Seiko Sho | 分析装置 |
| JP2009068952A (ja) * | 2007-09-12 | 2009-04-02 | Funai Electric Advanced Applied Technology Research Institute Inc | 物質検出装置及び物質検出方法 |
| JP2011043355A (ja) * | 2009-08-19 | 2011-03-03 | Kobe Steel Ltd | ナトリウムイオン検出試薬、ナトリウムイオン検出方法、及びナトリウムイオン検出装置 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
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