CN110068554B - 一种小尺寸等离子纳米颗粒探测的超分辨显微系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小尺寸等离子纳米颗粒探测的超分辨显微系统，其构成主要为第一激光器、滤波单元、第一银反射镜、相位板、第二激光器、偏振相关分束镜、第三激光器、二向色镜、半反半透玻片、振镜单元、显微物镜、位移平台、第二银反射镜、滤光片、第一针孔、光电倍增管、锁相放大器和终端；其中，第一激光器产生的高斯抑制光输入到滤波单元，经滤波单元后高斯抑制光输入到第一银反射镜、相位板，高斯抑制光经相位板产生环形抑制光；锁相放大器控制第二激光器产生高斯调制光，本发明具有低抑制功率、超高分辨率、无光漂白、高信号对比度、极高可重复性、可持久观测的特性，可实现在复杂生物环境中小尺寸等离子体纳米颗粒的显微成像。
Description
技术领域
本发明涉及超分辨显微成像技术领域，具体涉及一种基于小尺寸等离子纳米颗粒非线性特性的全光开关调控技术和锁相放大器弱信号提取技术。
背景技术
等离子体纳米颗粒因其表面存在大量自由振荡电子而具有表面等离子体效应，被广泛应用于光学设备、生物标记、太阳能电池、非易失存储器、纳米技术等领域，同时小尺寸的等离子体纳米颗粒在材料表征、生物显微成像方面具有尺寸小、等离子体效应明显等优势。目前针对小尺寸等离子体纳米颗粒的探测方法主要有三类，第一类主要通过粒子与材料相互作用来进行微小探测，例如利用原子间相互作用力的原子力显微镜(AFM)，电子与物质相互作用的扫描式电子显微镜(SEM)和透射式电子显微镜(TEM)等；第二类方法主要是利用纳米颗粒散射特性进行观测，例如暗场显微成像系统(DFM)；第三类利用荧光物质进行特定标记来间接探测，主要是以受激辐射损耗技术(STED)、光激活定位显微技术(PALM)和结构光照明显微成像技术(SIM)等为主，然而以上几种探测方法在实际应用中存在样品制备要求高(第一类)、探测分辨率低(第二类)、信号不稳定(第三类)等问题。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的不足，提供了一种小尺寸等离子纳米颗粒探测的散射型超分辨显微系统。
本发明的目的通过以下的技术方案实现：
一种基于等离子纳米颗粒探测的超分辨显微系统，包括：第一激光器1、滤波单元2、第一银反射镜3、相位板4、第二激光器5、偏振相关分束镜6、第三激光器8、二向色镜9、半反半透玻片10、振镜单元11、显微物镜12、位移平台13、第二银反射镜14、滤光片15、第一针孔16、光电倍增管17、锁相放大器19和终端21；第一激光器1产生的高斯抑制光输入到滤波单元2，经滤波单元2空间滤波后输入到第一银反射镜3和相位板4，再经相位板4相位调制产生环形抑制光；锁相放大器19输出控制信号控制第二激光器5产生高斯调制光，环形抑制光和高斯调制光经偏振相关分束镜6实现空间重合；第三激光器8产生激发光，所述激发光、经相位板4调制后的环形抑制光、高斯调制光经二向色镜9进行空间重合，合束后激光依次经过半反半透玻片10、振镜单元11，由显微物镜12聚焦在位移平台13的样品上；其中，所述样品为待探测物体，待探测物体上标记有等离子体纳米颗粒；经样品散射后的散射信号依次经过显微物镜12、振镜单元11、半反半透玻片10、第二银反射镜14、滤光片15、第一针孔16后，由光电倍增管17采集；光电倍增管17将采集的散射信号转换成电信号后传输到锁相放大器19，锁相放大器19对电信号进行特性信号提取，并将提取到的信号传输到终端21。
优选地，所述滤波单元2包括两片平凸透镜和一个第二针孔，第二针孔位于两片平凸透镜中间，所述滤波单元2用于对高斯抑制光进行空间滤波。
优选地，所述第一激光器1和第二激光器5均为532nm连续激光器，第三激光器8为561nm脉冲激光器，脉宽为40ps。
优选地，所述振镜单元11包括两面呈倾角放置的高频振动反射镜，用于对入射光在X方向和Y方向的扫描，其中入射光为经半反半透玻片10后的激发光、环形抑制光和高斯调制光。
优选地，所述等离子体纳米颗粒为金纳米颗粒。
优选地，金纳米颗粒的散射强度为Isca＝σsca*Iin，其中Iin为照射到金纳米颗粒上的入射光的强度，σsca为金纳米颗粒的散射截面，与纳米颗粒尺寸的六次方成正比关系。
优选地，所述金纳米颗粒的尺寸为小于或等于20nm。
优选地，所述终端21为电脑。
本发明相对于现有技术具有如下的优点：
本发明提出了一种小尺寸等离子纳米颗粒探测的散射型超分辨显微技术。小尺寸的等离子纳米颗粒具有高稳定性和表面等离子体效应而被广泛应用于生物研究中。相比较于荧光物质，小尺寸等离子纳米颗粒在超分辨显微成像中的应用可以获得高质量的超分辨率图像，同时进一步降低相关领域研究的实验成本，有利于超分辨成像技术在其他领域的进一步应用与发展。此外，本发明的小尺寸等离子纳米颗粒探测的超分辨显微技术还具有无光漂白、高信号对比度、极高可重复性、可持久观测的特性。
本发明所采用的金纳米颗粒尺寸均是小于或等于20nm，对生物样品活性干扰低，易于标记等优点，可更好的反映待测样品的结构细节。
本发明对于散射信号的提取，只与金纳米颗粒被调制的信号有关，与其它基底和生物组织无关，故本发明具有小尺寸纳米颗粒弱散射信号的分离能力，可有效的提升显微图像分辨率和信噪比。
本发明的调制光对散射信号的调制幅度可进行精细调节，有效的解决了金纳米颗粒的反饱和散射效应影响图像分辨率的问题。
本发明是基于金纳米颗粒非线性特性所研究的非荧光超分辨成像技术，具有高分辨率、高稳定性、高信号对比度、无光漂白、极高可重复性和可持久观察等优点，且金纳米颗粒合成工艺成熟，易于标记，具有较好的生物相容性。
附图说明
图1是本发明的小尺寸等离子纳米颗粒探测的超分辨显微系统的结构示意图。
图2(a)是本发明中使用的金纳米颗粒饱和散射曲线图。
图2(b)是本发明中使用的金纳米颗粒散射信号调制曲线图。
图3(a)是本发明使用的20nm金纳米颗粒共聚焦显微图。
图3(b)是根据图3(a)的共聚焦显微图得到的20nm金纳米颗粒的散射强度分布图。
图3(c)是与图3(a)20nm金纳米颗粒共聚焦图像原位对应的超分辨显微图像。
图3(d)是根据图3(c)的超分辨显微图像得到的散射强度分布图。
图4(a)为由本发明中20nm金纳米颗粒标记的生物细胞共聚焦显微图像。
图4(b)为图4(a)中生物细胞在散射型非荧光超分辨显微成像系统中原位对应所得的超分辨显微图像。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
参见图1，一种基于等离子纳米颗粒探测的超分辨显微系统，包括：第一激光器1、滤波单元2、第一银反射镜3、相位板4、第二激光器5、偏振相关分束镜6、第三激光器8、二向色镜9、半反半透玻片10、振镜单元11、显微物镜12、位移平台13、第二银反射镜14、滤光片15、第一针孔16、光电倍增管17、锁相放大器19和终端21；第一激光器1产生的高斯抑制光输入到滤波单元2，经滤波单元2空间滤波后输入到第一银反射镜3和相位板4，再经相位板4相位调制产生环形抑制光；锁相放大器19输出控制信号控制第二激光器5产生高斯调制光，环形抑制光和高斯调制光经偏振相关分束镜6实现空间重合；第三激光器8产生激发光，所述激发光、经相位板4调制后的环形抑制光、高斯调制光经二向色镜9进行空间重合，合束后激光依次经过半反半透玻片10、振镜单元11，由显微物镜12聚焦在位移平台13的样品上；其中，所述样品为待探测物体，待探测物体上标记有等离子体纳米颗粒；经样品散射后的散射信号依次经过显微物镜12、振镜单元11、半反半透玻片10、第二银反射镜14、滤光片15、第一针孔16后，由光电倍增管17采集；光电倍增管17将采集的散射信号转换成电信号后传输到锁相放大器19，锁相放大器19对电信号进行特定信号提取，并将提取到的信号传输到终端21。
其中，第三激光器8产生的激发光经过空间滤波后可直接照射金纳米颗粒上，第一激光器1产生的高斯抑制光经过0-2π涡旋相位板4(VPP)进行相位调制，产生环形调制光束，锁相放大器19输出特定频率的电信号控制第二激光器5产生强度高频调制的高斯调制光，这三束激光通过消偏振分束器(PBS)6和二向色镜9进行空间重合，由显微物镜12聚焦到位移平台13的样品上。经样品散射后的散射信号通过滤波片15和第一针孔16排除掉其它干扰信号后，由光电倍增管17收集。由于所收集到的信号变化频率与锁相放大器19输出的调制频率一致，因此可以利用锁相放大器从收集到的信号中提取出小尺寸的金纳米颗粒的散射信号。
在图1中，7为第一信号传输线，用于传输锁相放大器的输出的调制电信号，18为第二信号传输线，用于传递光电倍增管17输出的电信号，20为第三信号传输线，用于传输锁相放大器提取出的弱信号。振镜单元11，实现对样品X方向和Y方向的快速精确扫描；显微物镜12，用于将三束激光聚焦在待测样品上；位移平台13，主要用于搭载样品，调节XYZ轴方向，将样品移动到可观察区；第一针孔16，在共聚焦显微系统中过滤非焦平面内的干扰信号，从而提高成像分辨率；光电倍增管(PMT)17，将采集的光信号转化成电信号。
在本实施例，所述滤波单元2包括两片平凸透镜和一个第二针孔，第二针孔位于两片平凸透镜中间，所述滤波单元2用于对高斯抑制光进行空间滤波。
在本实施例，所述第一激光器1和第二激光器5均为532nm连续激光器，第三激光器8为561nm脉冲激光器，脉宽为40ps。
在本实施例，所述振镜单元11包括两面呈倾角放置的高频振动反射镜，用于对入射光在X方向和Y方向的扫描，其中入射光为经半反半透玻片10后的激发光、环形抑制光、高斯调制光。
在本实施例，所述等离子体纳米颗粒为金纳米颗粒。金纳米颗粒的散射强度为Isca＝σsca*Iin，其中Iin为照射到金纳米颗粒上的入射光的强度，σsca为金纳米颗粒的散射截面，与金纳米颗粒尺寸的六次方成正比关系。所述金纳米颗粒的尺寸为小于或等于20nm。
在本实施例，所述终端21为电脑。
本实施例的小尺寸等离子纳米颗粒探测的超分辨显微系统的原理如下：
作为生物超分辨显微成像的标记探针，金纳米颗粒因其表面存在大量自由移动的电子，而具有饱和散射的非线性特性。当激发光照射在金纳米颗粒表面时，引起其表面导带电子集体震荡，从而产生局域表面等离子体共振(LSPR)，进一步产生金纳米颗粒的强烈散射。随着激发光的功率逐渐增强，金纳米颗粒的散射光表现为先单调递增，达到极大值之后再单调递减，随后经过极小值，再单调递增，如图2(a)中所示。当激发光照射金纳米颗粒时，可以通过改变抑制光强度来调节激发光对金纳米颗粒产生的散射信号强度，从而实现全光开光调制，如图2(b)所示。
由于该技术在生物显微成像中实用性要求，本实施例需选用小尺寸的金纳米颗粒作为有效的超分辨探针。根据米散射定理，金纳米颗粒的散射强度为Isca＝σsca*Iin，其中Iin为入射光的强度，σsca为金纳米颗粒的散射截面，与纳米颗粒尺寸的六次方成正比。对于小尺寸的金纳米颗粒，其散射强度及信噪比相对较低，因此本发明中引入锁相放大器作为弱信号提取元件，其中锁相放大器可以从复杂的背景噪声中分离出特定频率变化的信号。基于该原理，本发明在原有激发光和环形抑制光的基础上引入另一束特定频率变化的高斯调制光，将激发光产生的待测样品散射信号进行同频调制，从而利用锁相放大器的弱信号处理功能将被调制的弱散射信号提取出来，重构出超分辨图像如图4(b)所示。
本实施例实验过程：
针对金纳米颗粒作为等离子体纳米颗粒探针，首先研究该探针的物理特性，以便选用合适的激光器作为激发抑制光源。本实施例中选用的金纳米颗粒尺寸为20nm，通过紫外可见光分光光度计初步表征，得到其等离子体共振峰在520nm-530nm之间。由于所选用的调制波长越靠近其共振峰，对金纳米颗粒表面等离子共振产生的影响越大，越容易进行调制，因此在选择过程中采用532nm作为调制光波长，选用561nm作为激发光波长。
如图2(a)所示，本实施例进一步研究了532nm激光强度对金纳米颗粒的物理特性的影响，通过逐渐增大入射光的功率密度，可以得出其散射光强变化趋势为先增大后减小，再增大的过程。根据散射截面公式σsca＝Iin/Isca，并结合图2(a)中金纳米颗粒的散射强度变化曲线，可以发现随着入射光功率密度的增大，金纳米颗粒的散射截面先保持不变，后持续减小，再逐渐增大，进一步说明金纳米颗粒表面等离子体共振效应与激发光功率存在一定的非线性关系。
为了更好的表征小尺寸金纳米颗粒的非线性特性，本实例还进一步分析金纳米颗粒表面等离子体共振效应变化对入射光散射强度的影响程度。在实施过程中，选用高斯形态的532nm激光作为抑制光，高斯形态的561nm激光作为激发光，通过分光棱镜将两束光进行空间重合，通过物镜聚焦在玻片中散布的金纳米颗粒上。通过分析抑制光功率密度变化对激发光散射强度的调制，从而得出小尺寸金纳米颗粒表面等离子体共振效应变化对散射强度的调制曲线，如图2(b)所示。实验结果表明，通过改变抑制光功率密度，激发光散射强度可调制深度达到90％左右，实现对金纳米颗粒散射信号的全光开关调制，这对后续小尺寸等离子纳米颗粒超分辨应用具有重要意义。
图3(a)-图3(d)是本实例中散射型超分辨显微系统对小尺寸金纳米颗粒尺寸的表征结果。利用相位板4对高斯抑制光进行相位调制产生环形抑制光斑，再利用锁相放大器19自身时钟频率输出特定频率的信号控制第二激光器5产生强度高频变化的高斯调制光，通过分光棱镜6和滤光片9进行空间重合，共同作用于金纳米颗粒。因此，图3中采用三束光，一束是高斯激发光561nm，一束环形抑制光532nm，一束高斯调制光532nm，其中激发光用于激发金纳米颗粒的散射，环形抑制光用于抑制金纳米颗粒的散射光，高斯调制光以一定频率调制激发的散射光。本实例中所构建的散射型超分辨显微成像系统可有效的消除非金纳米颗粒区域产生的干扰信号，提升光电倍增管17收集信号的信噪比，实现小尺寸金纳米颗粒散射信号的提取。
图4(a)和图4(b)是本发明在生物领域中实际应用的结果，其中图4(a)为20nm金纳米颗粒标记的生物细胞的共聚焦成像图，图4(b)为非荧光超分辨显微成像系统原位对照所得的细胞超分辨显微图像。实验过程中，利用细胞自身内吞效应，将金纳米颗粒包裹进细胞体内，再通过散射型超分辨显微系统对细胞体内的金纳米颗粒进行超分辨成像。实验结果表明，该系统可以较好的提取出了细胞的轮廓信息和金纳米颗粒在体内的分布情况，同时降低了复杂环境对小尺寸金纳米颗粒探测的干扰，极大的提升了成像结果的信噪比。
上述具体实施方式为本发明的优选实施例，并不能对本发明进行限定，其他的任何未背离本发明的技术方案而所做的改变或其它等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种小尺寸等离子纳米颗粒探测的超分辨显微系统，其特征在于，包括：第一激光器(1)、滤波单元(2)、第一银反射镜(3)、相位板(4)、第二激光器(5)、偏振相关分束镜(6)、第三激光器(8)、二向色镜(9)、半反半透玻片(10)、振镜单元(11)、显微物镜(12)、位移平台(13)、第二银反射镜(14)、滤光片(15)、第一针孔(16)、光电倍增管(17)、锁相放大器(19)和终端(21)；
第一激光器(1)产生的高斯抑制光输入到滤波单元(2)，经滤波单元(2)空间滤波后输入到第一银反射镜(3)和相位板(4)，再经相位板(4)相位调制产生环形抑制光；
锁相放大器(19)输出控制信号控制第二激光器(5)产生高斯调制光，环形抑制光和高斯调制光经偏振相关分束镜(6)实现空间重合；
第三激光器(8)产生激发光，所述激发光、经相位板(4)调制后的环形抑制光、高斯调制光经二向色镜(9)进行空间重合，合束后激光依次经过半反半透玻片(10)、振镜单元(11)，由显微物镜(12)聚焦在位移平台(13)的样品上；其中，所述样品为待探测物体，待探测物体上标记有-等离子体纳米颗粒；
经样品散射后的散射信号依次经过显微物镜(12)、振镜单元(11)、半反半透玻片(10)、第二银反射镜(14)、滤光片(15)、第一针孔(16)后，由光电倍增管(17)采集；光电倍增管(17)将采集的散射信号转换成电信号后传输到锁相放大器(19)，锁相放大器(19)对电信号进行特定信号提取，并将提取到的信号传输到终端(21)；
所述等离子体纳米颗粒为金纳米颗粒；
所述金纳米颗粒的尺寸为小于或等于20nm。
2.根据权利要求1所述的小尺寸等离子纳米颗粒探测的超分辨显微系统，其特征在于，所述滤波单元(2)包括两片平凸透镜和一个第二针孔，第二针孔位于两片平凸透镜中间，所述滤波单元(2)用于对高斯抑制光进行空间滤波。
3.根据权利要求1所述的小尺寸等离子纳米颗粒探测的超分辨显微系统，其特征在于，所述第一激光器(1)和第二激光器(5)均为532nm连续激光器，第三激光器(8)为561nm脉冲激光器，脉宽为40ps。
4.根据权利要求1所述的小尺寸等离子纳米颗粒探测的超分辨显微系统，其特征在于，所述振镜单元(11)包括两面呈倾角放置的高频振动反射镜，用于对入射光在X方向和Y方向的扫描，其中入射光为经半反半透玻片(10)后的激发光、环形抑制光和高斯调制光。
5.根据权利要求1所述的小尺寸等离子纳米颗粒探测的超分辨显微系统，其特征在于，金纳米颗粒的散射强度为Isca＝σsca*Iin，其中Iin为照射到金纳米颗粒上的入射光强度，σsca为金纳米颗粒的散射截面，与纳米颗粒尺寸的六次方成正比关系。
6.根据权利要求1所述的小尺寸等离子纳米颗粒探测的超分辨显微系统，其特征在于，所述终端(21)为电脑。
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