高速宽视场相干反斯托克斯拉曼散射显微系统及方法
技术领域
本发明涉及一种高速宽视场相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微系统,可广泛适用于生物学、医学,生物物理以及材料化学等领域的研究。
背景技术
在材料化学以及生物学的研究中,科学家往往需要显微镜具有高空间分辨率的同时还能够检测材料或生物细胞的分子构成。随着各种荧光探针的出现,使用不同的荧光探针可以标记样品内部不同的位置,从而可以探测样品的分子构成。荧光显微镜已经成为化学和生物样品成像的有力工具。但是荧光显微技术存在两个缺点:荧光探针的光漂白效应和荧光探针对样品分子结构的影响。
基于分子内部能级振动特性的成像技术(红外光谱和拉曼光谱),既提供了分子的振动信息,又不用荧光标记,是一种好的选择。但是,红外光的分辨率较低,再加上水在红外波段有较强的吸收,限制了红外光谱在生物样品成像上的应用。将共焦显微技术与拉曼光谱技术结合,对样品进行功能性拉曼光谱成像,称为共焦拉曼显微术。该技术可以避免上述问题,且已经有商业化的产品问世。但是拉曼散射信号强度很低并且难以避免荧光的干扰。如果用来成像,有时需要曝光几个小时。显然不适用于许多需要动态探测的研究。
相干反斯托克斯拉曼散射(Coherent Anti-Stokes Raman Scattering,简称CARS)是一种相干散射过程。如图1(a)所示,与拉曼光谱不同,相干反斯托克斯拉曼散射是一种典型的三阶非线性光学效应,产生CARS需要将两束超短脉冲激光,泵浦光(频率为ωp)和斯托克斯光(频率为ωs),同时汇聚于样品上的一点,当两束光的频率差(ωp-ωs)与样品介质的拉曼频率(Ω)相同时,它们会在介质中进行相干混合产生一束新的反斯托克斯拉曼散射光频(ωas=2ωp-ωs),即CARS信号。CARS信号以其散射强度高、方向性好、背景干扰小,偏振特性等优点。该技术不仅可以对样品进行光谱研究,还可以在无需对样品染色的情况下对样品进行功能性成像,从而成为分子研究的有力工具。
CARS显微具有以下几个优点:
1、由于CARS是基于分子内部振动特性,所以不需要使用外来的荧光探针,不会对样品分子结构造成影响。
2、CARS信号具有较高的强度和很好的方向性,因此具有比普通拉曼散射显微更高的灵敏度。
3、CARS是一种典型的三阶非线性效应,只能在激光的焦点出产生,通过光束扫描可实现样品的三维层析成像。
4、CARS信号要比样品的荧光信号具有更高的频率,即使在较强的荧光背景中也能被探测到。
5、激发样品的CARS信号通常需要使用短脉冲的近红外钛宝石飞秒脉冲激光器,近红外波段的光束在样品中具有较高的穿透深度和很小的热效应。
国外有很多大学和研究所在开展这方面的研究工作。1999年,AndreasZumbusch等人通过使用共线强聚焦模式,首次得到了横向分辨率为307nm的聚苯乙烯小球在3053cm-1处的三维图像;哈佛大学化学生物学系的Xie小组不仅在理论上对CARS显微术进行了研究,而且对前向探测CARS显微术(F-CARS)、背向探测CARS显微术(E-CARS)、偏振激发探测CARS显微术(P-CARS)、多光谱CARS显微术(M-CARS)、时间分辨CARS显微术(Time-resolved CARS)、外差探测CARS显微术(I-CARS)和频率调制CARS显微术(FM-CARS)等做了细致的试验研究。近年来,有大量文章在Nature、Science、PRL、PNAS、APL、OL等著名学术刊物上发表,许多新的探测技术被应用于CARS显微领域。德国马堡大学Motzkus小组使用整形的单个飞秒脉冲实现了CARS显微;新加坡国立大学Huang等人开展了外差偏振CARS显微的研究,芬兰Lappeenranta大学Vartiainen小组与荷兰阿姆斯特丹大学Bonn小组合作,利用软件处理直接消除CARS非共振背景噪声并应用于微流体化学反应的研究。
CARS显微技术可以广泛应用于生物学,化学以及医学领域。在细胞生物学的研究中,可以用来研究不同生物细胞中脂肪分子的分布与浓度;由于CARS显微使用的近红外的激光束在生物组织内有较大的穿透深度,所以还可以用来进行生物组织的三维成像;在化学领域的研究中,可以对各种有机或无机材料薄膜进行分子结构和化学组成的分析与实时成像观察;在医学研究中,CARS显微还可用于肿瘤的成像。
现有的光学显微技术根据探测模式可分为两大类:宽场成像技术和点扫描成像技术。宽场成像技术采用面阵图像传感器(如CCD相机),可以在一个时间点获得一幅完整的二维图像,具有速度快、图像灰度级高等优点。但是由于受样品离焦部分的干扰,普通的宽场成像技术不具有三维层析成像能力。目前大多数的CARS显微都采用点扫描成像方式。使用高度聚焦的激光束对样品逐点扫描,CARS显微属于三阶非线性光学效应,只有在激光焦点处才能产生,激发出的CARS信号被光电倍增管探测收集,并将信号输送到计算机,通过软件重新组合生成一个整体平面的或立体的像。但由采用逐点扫描的成像方式,因此成像速度比宽视场显微要慢很多,不能适用于某些要求高速实时观察的活体光学显微成像。另外,由于激光焦点处极高的光能量密度,逐点扫描完整个样品有可能对活体生物组织带来损伤。在生物学的研究中,很多时候并不需要对样品成三维图像,二维图像就可以满足要求。因此如果可以发明一种高速度,宽视场的CARS显微技术,将会给生物学的研究带来方便。
发明内容
为了解决现有的CARS显微技术成像速度慢、对活体生物组织的光损伤严重等技术问题,本发明提供一种高速宽视场相干反斯托克斯拉曼散射显微系统及方法。
本发明的第一技术解决方案:
一种高速宽视场相干反斯托克斯拉曼散射显微系统,其特殊之处是:包括泵浦激光器1、设置在泵浦激光器1光路上的第一分束器41、斯托克斯光激光器3、设置在斯托克斯光激光器3光路上的第二分束器42、用于调节泵浦激光和斯托克斯光激光时间同步的脉冲同步控制器2、用于调节泵浦激光和斯托克斯光激光空间重合的合束镜5、依次沿重合后的泵浦光和斯托克斯光光路设置的聚焦物镜7、样品台9、探测物镜10、滤光片11、筒镜12、CCD相机13以及计算机14。
上述泵浦激光器为钛宝石激光器或光纤激光器;所述斯托克斯光激光器为OPO激光器或光纤激光器。
上述CCD相机13为电子倍增式CCD相机。
上述速宽视场相干反斯托克斯拉曼散射显微系统还可包括设置在合束镜5和聚焦物镜7之间的反射镜6。
本发明的第二技术解决方案:
一种高速宽视场相干反斯托克斯拉曼散射显微系统,其特殊之处是:包括泵浦激光器1、设置在泵浦激光器1光路上的第一分束器41、斯托克斯光激光器3、设置在斯托克斯光激光器3光路上的第二分束器42、用于调节泵浦激光和斯托克斯光激光时间同步的脉冲同步控制器2、用于调节泵浦激光和斯托克斯光激光空间重合的合束镜5、依次沿重合后的泵浦光和斯托克斯光光路设置的准直镜16和反射镜6、设置在反射镜6反射光路上的显微物镜15和样品台9、依次设置在反射镜6样品台上方的滤光片11、筒镜12、CCD相机13以及计算机14。
上述泵浦激光器为钛宝石激光器或光纤激光器;所述斯托克斯光激光器为OPO激光器或光纤激光器。
上述CCD相机13为电子倍增式CCD相机。
本发明高速宽视场相干反斯托克斯拉曼散射显微方法,包括以下步骤:
1】泵浦光激光器1发射的泵浦光通过脉冲同步控制器2与斯托克斯光激光器3发射的斯托克斯光在时间上同步;
2】在时间上同步的泵浦光和斯托克斯光通过合束镜5在空间上调节重合;
3】将样品8放置在样品台9上;将时间和空间上重合的泵浦光和斯托克斯光弱汇聚在样品8上,使样品产生CARS信号;聚焦光斑直径50-200微米;
4】样品产生的CARS信号经过滤光片11和筒镜12后进入CCD相机13,从而得到清晰的CARS图像。
上述方法还包括调节激光能量的步骤:调节泵浦光激光器1和斯托克斯光激光器3的能量,使作用在样品上的激光能量密度为10-50μJ/cm2。
上述方法还包括检测样品产生的信号是否为CRAS信号的步骤:保持泵浦光和斯托克斯光的功率不变,只改变他们的时间同步状态,当脉冲同步越好时信号越强,或者脉冲同步差或者没有时间同步时信号减弱或消失,则样品产生的信号是CARS信号。
本发明所具有的优点:
1、本发明利用相干反斯托克斯散射信号成像,是一种基于分子内部能级振动特性的成像技术,可以探测样品的化学构成。与普通荧光显微技术相比,具有不需要使用外来的荧光探针,不会对样品分子结构造成影响的优点。
2、本发明使用电子倍增式CCD相机(EMCCD)采集样品的CARS图像,是一种宽场成像技术,具有成像灵敏度高,速度快的优点。
3、本发明使用的激光能量密度低,对生物组织破坏比较小。本发明采用激光弱汇聚方式,作用在样品上的激光焦斑直径大约为150μm。实验中控制激光平均功率,作用在样品上的激光能量密度10-50μJ/cm2,仅为采用点扫描成像方式的CARS显微技术所使用激光能量密度的1/2000。但是可以产生较强的CARS信号,很多情况下并不需要开启电子倍增式CCD相机的电子倍增模式就完全可对单个细胞,甚至单个细胞器进行成像。完全满足大多数生物实验的要求。
4、本发明与点扫描式CARS显微系统相比,具有成像灵敏度高,速度快,样品光损伤小的优点。本发明并且完全可对单个细胞,甚至单个细胞器进行成像。满足大多数活体生物实验的要求。
附图说明
图1(a)是相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)能级图;图1(b)是相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)相位匹配关系;
图2是高速宽视场相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微系统示意图(前向探测);
图3是高速宽视场相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微系统示意图(背向探测);
图4是C.elegans线虫虫卵的CARS成像;其中:(a)明场图像(b)CARS图像;
图5水中移动直径6μm聚苯乙烯小球并进行CARS成像。
具体实施方式
本发明第一种高速宽视场相干反斯托克斯拉曼散射显微系统为前向探测,如图2所示,由泵浦光激光器1(ωp,可选用钛宝石激光器或光纤激光器)、脉冲同步控制器2、斯托克斯光激光器3(ωs,可选用OPO激光器或光纤激光器)、第一分束器41、第二分束器42、合束镜5、多个反射镜6、聚焦物镜7、样品8、样品台9、探测物镜10、滤光片11、筒镜12、电子倍增式CCD相机(EMCCD)13、计算机14组成。
激光器的输出光通过两个分束器41和42分出一小部分(<2%),输入脉冲同步控制器2,脉冲同步控制器2根据分束器的入射光来时间同步两台激光器的输出光脉冲。
泵浦和斯托克斯光必须要做到时间上和空间上的同步,时间同步指两个脉冲时间重合,空间同步指两束光线空间共线(重合),时间同步由脉冲同步控制器2来实现,空间同步由调节合束镜5来实现。
沿光轴方向微调聚焦物镜7将重合后的泵浦光与斯托克斯光弱汇聚(聚焦光斑直径50-200微米)在放置在样品台9上的样品8;
前向CARS信号被探测物镜10收集后经过滤光片11和筒镜12后进入CCD相机13,得到清晰的CARS图像。
本发明第二种高速宽视场相干反斯托克斯拉曼散射显微系统为后向探测,如图3所示,由泵浦光激光器1(ωp,可选用钛宝石激光器或光纤激光器)、脉冲同步控制器2、斯托克斯光激光器3(ωs,可选用OPO激光器或光纤激光器)、分束器4、合束镜5、合束镜6、显微物镜15、样品8、样品台9、准直镜16、滤光片11、筒镜12、电子倍增式CCD相机(EMCCD)13、计算机14组成。
如图3所示,这时只需要使用一个显微物镜7同时用来激发和探测CARS信号。泵浦和斯托克斯光经过合束镜5后,再经过一个准直镜16,由合束镜6反射进入显微物镜15,显微物镜15将泵浦和斯托克斯光弱汇聚在样品8上,调节准直镜16可以改变作用在样品8上的激发光斑直径(光斑直径50-200微米)。
背向CARS信号被显微物镜15收集后经过合束镜6、滤光片11和筒镜12后进入CCD相机13,得到清晰的CARS图像。
本发明高速宽视场相干反斯托克斯拉曼散射显微方法,包括以下步骤:
1】泵浦光激光器1发射的泵浦光通过脉冲同步控制器2与斯托克斯光激光器3发射的斯托克斯光在时间上同步;
2】在时间上同步的泵浦光和斯托克斯光通过合束镜5在空间上调节重合;
3】将时间和空间上重合的泵浦光和斯托克斯光弱汇聚,聚焦光斑直径50-200微米,调节泵浦光激光器1和斯托克斯光激光器3的能量,使作用在样品上的激光能量密度为10-50μJ/cm2;再将样品8放置在样品台上;
4】保持泵浦光和斯托克斯光的功率不变,只改变他们的时间同步状态,当脉冲同步越好时信号越强,或者脉冲同步差或者没有时间同步时信号减弱或消失,则样品产生的信号是CARS信号;
5】样品产生的CARS信号经过滤光片11和筒镜12后进入CCD相机13,从而得到清晰的CARS图像。
具体操作步骤如下:泵浦光激光器1通过脉冲同步控制器2与斯托克斯光激光器3时间同步后,再由合束镜5调节空间重合,重合后的泵浦光与斯托克斯光经过反射镜6后进入聚焦物镜7,聚焦物镜7将重合后的泵浦光与斯托克斯光弱汇聚在样品8上,焦斑直径约为150m。样品8位于样品台9上,通过控制样品台9可以三维移动样品8。由于泵浦光与斯托克斯光会在样品内部发生散射和折射,微观上可以满足产生CARS所需要的相位匹配条件。产生的CARS信号被探测物镜10收集后经过滤光片11、筒镜12后进入电子倍增式CCD相机(EMCCD)13,通过计算机14可以控制电子倍增式CCD相机(EMCCD)13的增益系数、CCD制冷温度以及曝光时间,从而得到清晰的CARS图像。
本发明的理论基础:
CARS是一种典型的三阶非线性光学效应,需要满足相位匹配条件,|kas-(2kp-ks)|l<π,如图1(b)所示,其中,kp,ks,kas分别为泵浦光,斯托克斯光和CARS光的波矢,l是激光与物质的相互作用长度。采用点扫描成像方式的CARS显微技术通常使用高数值孔径(NA)的显微物镜(NA通常大于0.8)来汇聚激光束,激光束可以被汇聚到几百纳米尺度的一个焦点与样品进行相互作用。因此光与物质的相互作用长度l就非常小(只有几百纳米),并且由于高数值孔径物镜的强聚焦作用使得激光焦点附近的光场具有各个角度的光矢量分量,因此在使用点扫描成像技术时,CARS相位匹配条件很容易得到满足。
宽场显微技术通常将激光束弱聚焦为直径几十至几百微米尺度的光斑来照明样品,如果按照高度聚焦光场才能满足相位匹配的理论来分析,宽场显微技术很难满足产生CARS所需要的相位匹配条件。
众所周知,生物实验中用到的绝大多数生物样品都必须处于培养液环境,生物组织与其周围的培养液之间总是存在折射率差异。因此当激光照射生物组织时会发生光的折射或者散射,散射或者折射光的波矢在各个方向都有分量,由于样品组织内光的折射和散射现象的普遍存在。我们认为,泵浦光、斯托克斯光和CARS光的波矢kp,ks,kas在生物组织的内部在微观上尺度下也可以满足相位匹配条件,产生CARS信号。基于这个理论,本发明提出一种高速宽视场CARS显微技术。两束高重复频率(76MHz)同步、重合的脉冲激光(ωp,ωs)弱汇聚于样品上(光斑直径约为150μm),使用电子倍增式CCD相机(EMCCD)作为探测器。实现了33fps的重复频率的动态CARS显微,完全满足一般活体生物样品成像的要求。提高了现有CARS显微技术的成像速度,更适用于活体生物的实验研究。
CARS信号分为前向和背向两种,一般来说前向CARS信号强,主要由较大样品(尺寸微米量级)产生,背向CARS信号弱,主要由小样品产生(尺寸亚微米或纳米量级)。我们提出的高速宽视场相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微装置可以探测前向CARS信号,也可以测量背向CARS信号。
实施例1
图4是本发明装置对C.elegans线虫虫卵的CARS成像实验。实验中的聚焦物镜为10X显微物镜,NA=0.4,探测物镜为40X显微物镜,NA=0.85,标尺10μm,泵浦光激光器选用钛宝石激光器,脉冲宽度3ps,重复频率76MHz,波长700-980nm可调。斯托克斯光激光器选用OPO激光器,脉冲宽度6ps,重复频率76MHz,波长680-990nm可调。实验时调节两激光器的波长差,使之于脂肪分子的CH2键生共振,共振频率2850cm-1。可以清楚地观察到C.elegans线虫虫卵的细胞膜以及内部的脂肪组织。图像对比度很高,EMCCD曝光时间0.5秒。
实施例2
图5是在水中移动直径6μm聚苯乙烯小球并进行CARS成像的实验结果。实验中的聚焦物镜为10X显微物镜,NA=0.4,探测物镜为40X显微物镜,NA=0.85,标尺10μm,泵浦光激光器选用钛宝石激光器,脉冲宽度3ps,重复频率76MHz,波长700-980nm可调。斯托克斯光激光器选用OPO激光器,脉冲宽度6ps,重复频率76MHz,波长680-990nm可调。实验时调节两激光器的波长差,使之于聚苯乙烯分子的CH键发生共振,共振频率3050cm-1。可以清楚地观察到水中移动聚苯乙烯小球的动态过程。可实现33fps的图像采集速率。本发明完全适用于一般活体生物体的成像研究。