CN105352936B - 一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法 - Google Patents

一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法 Download PDF

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Abstract

一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法，它涉及一种成像方法。本发明的目的是为了解决现有技术的光学显微成像方法成像时间长，成像光路复杂，对成像结构要求高的问题。本发明将泵浦光、斯托克斯光和探测光共线聚焦于样品，调整泵浦光、斯托克斯光和探测光的聚焦光斑中心的距离使三束光斑边缘相互重叠，形成三束光聚焦光斑的共同重叠区域；向外侧移动泵浦光、斯托克斯光和探测光聚焦光斑中心，减小共同重叠区域的面积。本发明光路结构相对简单，易于实现。

Description

一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像 方法
技术领域
本发明涉及一种成像方法，具体涉及一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法，属于光学显微成像技术领域。
背景技术
长期以来，光学显微成像技术的分辨力受到衍射极限的限制。至今，利用非标记的方法获得突破衍射极限分辨率的方法有两种，一种是利用场增强效应的相干反斯托克斯拉曼散射显微镜，但它要用到尖端场增强，只能对样品表面成像，应用受到很大的限制。另一种方法是受激拉曼显微成像，它使用两束斯托克斯光，一束呈高斯型，另一束呈环形，类似荧光标记的STED方法。但这种方法只能获得分子某一化学键的拉曼谱，单靠此谱来判别样品中的分子种类是困难的，要获得分子的其它拉曼谱，就要求激光器具有宽的调谐范围，更严重的问题是需要很长的测试时间才能获得分子的完整拉曼谱，为获得样品的三维超衍射分辨图像，所需成像时间太长。
相干反斯托克斯拉曼散射(CARS：Coherent Anti-Stokes Raman Scattering)是利用四波混频的三阶非线性效应而产生反斯托克斯光信号的效应，现有技术中通过增加一与泵浦光和斯托克斯光同时共线聚焦于样品的附加探测光，该附加探测光耗尽泵浦光和斯托克斯光在其焦斑周边产生的声子，形成无用的CARS信号，而延迟的探测光中符合相位匹配条件的光子则与焦斑中心区域的声子碰撞形成有用的CARS信号，将无用的CARS信号分离，即可获得超衍射极限的空间分辨率。因采用具有宽带的超连续谱激光作为泵浦光和斯托克斯光，从而获得分子的完整CARS谱信号，实现对整个分子成像。然而，该方法所需的激光波长为4种，光路复杂且对调节机构要求很高，实现起来极为困难；公开号为CN102608100A的专利文献公开了一种“利用光纤产生的四波频信号进行CARS成像的系统及方法”，其将四波混频信号作为CARS成像的探针光，与一束泵浦光和一束斯托克斯光构成三束光聚焦在样品上进行三色CARS成像，解决现有技术的光学显微成像方法成像时间长，成像光路复杂，对成像结构要求高的问题。根据该专利文献，发明人想到，若能够在此技术基础上进一步提高成像分辨率，则会获得突破衍射极限的成像分辨率。
发明内容
本发明的目的是为了解决如何提高泵浦光、斯托克斯光和探测光进行CARS成像的成像分辨率的问题，提供了一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法。
本发明的技术方案是：一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法，包括以下步骤：
步骤一、将泵浦光、斯托克斯光和探测光共线聚焦于样品，调整泵浦光、斯托克斯光和探测光的聚焦光斑中心的距离使三束光斑边缘相互重叠，形成三束光聚焦光斑的共同重叠区域；
步骤二、在步骤一的基础上沿三个不同方向向外侧移动泵浦光、斯托克斯光和探测光聚焦光斑中心，减小所述共同重叠区域的面积；
步骤三、获取由共同重叠区域所产生的反斯托克斯光信号进行成像。
所述泵浦光、斯托克斯光和探测光均为超短激光脉冲。
所述泵浦光、斯托克斯光和探测光的聚焦光斑中心连线的距离近似相等。
所述泵浦光、斯托克斯光和探测光为空心光束。
本发明与现有技术相比具有以下效果：而本发明只需利用三种波长不同的激光，将三束光同时打到样品上，三束光的不需要中心对准，而是呈现三角形，在三束光的共同重叠区域产生的反斯托克斯光信号，发光区域被压缩，实现超分辨成像，产生的CARS光强度高，相比传统的成像方法，光路结构大大简化，实现难度降低，但成像效果更佳。
附图说明
图1是三束光聚焦光斑的位置示意图
图2是三束空心光束聚焦光斑的位置示意图
图中：1.泵浦光，2.斯托克斯光，3.探测光。
具体实施方式
结合附图说明本发明的具体实施方式：
实施例一、一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法，包括以下步骤：
步骤一、将泵浦光1、斯托克斯光2和探测光3共线聚焦于样品，调整泵浦光1、斯托克斯光2和探测光3的聚焦光斑中心的距离使三束光斑边缘相互重叠，形成三束光聚焦光斑的共同重叠区域；
步骤二、在步骤一的基础上沿三个不同方向向外侧移动泵浦光1、斯托克斯光2和探测光3聚焦光斑中心，减小所述共同重叠区域的面积，步骤三、获取由共同重叠区域所产生的反斯托克斯光2信号进行成像。
所述泵浦光1、斯托克斯光2和探测光3均为超短激光脉冲。
所述泵浦光1、斯托克斯光2和探测光3的聚焦光斑中心连线的距离相等，即使三束光的聚焦光斑中心连线呈现等边三角形。
实施例二、本实施例与实施例一的区别在于所述泵浦光1、斯托克斯光2和探测光3为空心光束。
相干反斯托克斯拉曼散射(CARS：Coherent Anti-Stokes Raman Scattering)是利用四波混频的三阶非线性效应而产生反斯托克斯光信号的效应，现有技术通常采用时间分辨CARS，需要四束光是分别打到样品上的，互相之间有一定的延迟，要有相应的延迟装置，增加了光路的繁琐性；由于时间分辨，产生的CARS信号强度是呈数量级下降的，导致探测难度大；在光路上，要保证四束光的中心对的很准，实现难度很大。
本发明的反斯托克斯光信号是由泵浦光1、斯托克斯光2、探测光3共同作用而产生的，将三束光各自偏移一定的位移，三束光的重叠区域则减小，即可控制反斯托克斯光信号仅产生在该重叠区域，从而使得发光的区域变小，对该区域进行显微成像即可获得突破衍射极限的成像分辨力。
三个光斑偏移的越大，重叠的区域自然就越小，即发出CARS信号的区域越小，因此分辨力也就越高。

Claims (3)

1.一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法，包括以下步骤：步骤一、将泵浦光、斯托克斯光和探测光共线聚焦于样品，调整泵浦光、斯托克斯光和探测光的聚焦光斑中心的距离使三束光斑边缘相互重叠，形成三束光聚焦光斑的共同重叠区域；步骤三、获取由共同重叠区域所产生的反斯托克斯光信号进行成像，其特征在于：还包括步骤二，所述步骤二是在步骤一的基础上沿三个方向向外移动泵浦光、斯托克斯光和探测光聚焦光斑中心，减小所述共同重叠区域的面积，发光区域被压缩，实现超分辨成像；步骤一中，三束光的聚焦光斑中心连线呈现等边三角形。
2.根据权利要求1所述的一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法，其特征在于：所述泵浦光、斯托克斯光和探测光均为超短激光脉冲。
3.根据权利要求1所述的一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法，其特征在于：所述泵浦光、斯托克斯光和探测光为空心光束。
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