CN110646402B - 一种超分辨快速扫描的相干拉曼散射成像方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种超分辨快速扫描的相干拉曼散射成像方法,其特点是采用DOE与色散元件组成的衍射光学器件组将聚焦到显微物镜上的单束光斑进行不同角度的偏折后为多个1xN光斑入射在生物样品上,激发更小生物分子的反斯托克斯光经聚光、滤波后由探测器进行采集,实现超分辨快速扫描的相干拉曼散射成像。本发明与现有技术相比具有将单束光斑变为多束光斑,减少了行扫描时间,调节两束光的重合面积为切入点,使更小尺寸的生物分子被激发出反斯托克斯光,极大地提高了CARS显微成像的分辨率和振镜扫描效率,使更小尺寸的生物分子被激发出反斯托克斯光,极大提高了振镜扫描效率,实现超高分辨率的CARS显微成像。

Description

一种超分辨快速扫描的相干拉曼散射成像方法
技术领域
本发明涉及光谱成像技术领域,具体地说是一种超分辨快速扫描的相干拉曼散射成像方法。
背景技术
近些年来,相干反斯托克斯拉曼散射显微成像(CARS)研究已经逐渐成熟,其凭借着高分辨率和灵敏度、免标记、无侵入性和三维成像成为生物研究中不可或缺的一种成像方式,极大的帮助了人们获取生物样品信息,使人们认识了更加丰富的显微世界。随着CARS显微成像在生物研究中的应用变得越来越广泛,提高CARS显微成像的分辨率和成像速率也就变得越来越迫切。在CARS显微成像中,使用了泵浦光和反斯托克斯光两束光,在实验中改变这两束光的波长,使两束光的频率差和不同的样品分子的振动能级相匹配,从而激发出反斯托克斯光。从原理上看,只有当泵浦光和斯托克斯光同时照射到分子上才有可能激发出反斯托克斯光,因此,在空间上,两束光的重合区域决定着CARS成像的分辨率,理论上重合区域越小分辨率越高。
现有技术的相干拉曼散射成像采用逐行扫描,即光斑从样品的第一行最左端扫描到最右端,第一行扫描完之后跳转到第二行开始扫描,循环往复,其扫描效率低,分辨率也不高。因为无法突破衍射极限,所以难以分辨出尺寸更小的生物分子,在医学以及相关的生物应用中存在着较大的局限性。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而设计的一种超分辨快速扫描的相干拉曼散射成像方法,采用DOE与色散元件的CARS显微成像系统,在不改变原始激光的物理特性的前提下,将单束光斑变为多束光斑,减少了行扫描时间,振镜的X轴只需要偏转很小的角度就可以实现扫描一行的目的,扫描完一幅图的时间大幅缩短了,并以调节两束光的重合面积为切入点,极大地提高了CARS显微成像的分辨率和振镜扫描效率,使更小尺寸的生物分子被激发出反斯托克斯光,使看到的图像更加清晰,大幅度提高生物成像的分辨率,使生物样品的细节更加丰富,实现快速扫描并且实现超高分辨率,显著提高了成像的速率和分辨率,方法简便,操作便捷,可靠性高,拓宽了应用领域,尤其为光谱成像领域的应用研究和基础研究提供很大的益处和帮助。
本发明的目的是这样实现的:一种超分辨快速扫描的相干拉曼散射成像方法,包括采用泵浦光和斯托克斯光经合束后通过扩束/准直后进入振镜,再经过扫描透镜/管透镜组将光聚焦到显微物镜的后焦面上并入射到生物样品上,激发的反斯托克斯光由探测器进行采集的CARS显微成像方法,其特点是采用衍射光学元件(DOE)与色散元件组成的衍射光学器件组将聚焦到显微物镜上的单束光斑进行不同角度的偏折后变为多个1xN光斑入射在生物样品上,在更小的生物分子上被激发出的反斯托克斯光经聚光、滤波后由探测器进行采集,实现超分辨快速扫描的相干拉曼散射成像。
所述衍射光学元件(DOE)与不同参数的色散元件组合,调节泵浦光与斯托克斯光重合区域的面积足够小,实现超高分辨的相干拉曼散射成像。
本发明与现有技术相比具有不改变原始激光物理特性的前提下,将单束光斑变为多束光斑,减少了行扫描时间,振镜的X轴只需要偏转很小的角度就可以实现扫描一行的目的,扫描完一幅图的时间大幅缩短了,并以调节两束光的重合面积为切入点,极大地提高了CARS显微成像的分辨率和振镜扫描效率,使更小尺寸的生物分子被激发出反斯托克斯光,使生物样品的细节更加丰富,实现快速扫描并且实现超高分辨率,显著提高了成像的速率和分辨率,方法简便,操作便捷,可靠性高,拓宽了应用领域,尤其为光谱成像领域的应用研究和基础研究提供很大的益处和帮助。
附图说明
图1为光斑经过DOE后的数量变化示意图;
图2为光斑经过DOE和色散元件前后光斑重合面积变化示意图;
图3为光斑经过DOE前后激光光强分布的变化示意图;
图4为CARS显微成像示意图;
图5为正向探测相干拉曼散射成像实施例图;
图6为背向探测相干拉曼散射成像实施例图。
具体实施方式
本发明采用DOE与色散元件组合的衍射光学器件组将单束光斑变为多束光斑,其中不同参数的色散元件与DOE共同作用可以灵活地调节泵浦光和斯托克斯光的重合面积,使其足够小,实现超分辨成像的目的。所述DOE 对单个光斑进行分束后得到多个(1xN)光斑,提高扫描速率。本发明包括 1030nm和790nm的激光源;扩束并准直光束的正负透镜组;消除泵浦光和斯托克斯光色差的透镜(即消色差透镜);选择反射790nm泵浦光和1030nm 斯托克斯光并透过640nm反斯托克斯光的二向色镜;确保从振镜出来的光束不偏离显微物镜并聚焦到管透镜的后焦面上的扫描透镜和管透镜组;扫描振镜;滤波片;PMT探测器以及用来记录并保存采集数据的数据采集卡等构成采集光路的CARS显微成像方法。
本发明利用泵浦光和斯托克斯光同时照射到生物分子上,才有可能激发出反斯托克斯光,而且只有两束光的重合区域才是有效区域。本发明通过 DOE和光学色散元件的双重作用,对泵浦光和斯托克斯光进行不同角度的偏折,可以灵活地使两束光的光斑重合区域的面积变的更小,也就可以分辨出更小的生物分子。所述DOE和光学色散元件组合的衍射光学器件组将泵浦光和斯托克斯光两束激光的光强分布由原来的高斯分布变为现在的具有陡峭的边缘,能量将集中在两束光的重合部分,更容易激发出反斯托克斯光。而且采用了DOE后,在不改变两束光的性质前提下,将单束光斑变为多束光斑,大大减少了行扫描时间,振镜的X轴只需要偏转很小的角度就可以实现扫描一行的目的,扫描一幅图的时间被大幅缩短了。
下面以泵浦光和斯托克斯光通过衍射光学元件(Diffractive OpticalElements,DOE)后的光斑和光强强度的变化,以及DOE利用透镜表面的微纳结构来控制入射光的相位,实现对激光的调制,例如激光分束、激光采样以及 激光整形对本发明作进一步的详细说明。
参阅附图1,采用泵浦光和斯托克斯光经合束/准直以及消色差后,通过振镜进入扫描透镜/管透镜组的一个光斑18的单束光经过衍射光学元件 (DOE)8的分束后变为多个光斑18的多束光,分束后的光束按照一维形状 (1xN)排列,每个光束的直径、相位和入射光束均保持一致,衍射效率在 70%~95%之间,光束直径能量的差别<1%,其相邻光斑的间隔距离由下述(a) 式计算:
L=d*tan(Φ) (a)
式中:d为激光到样品表面的垂直距离;Φ为相邻激光光束的夹角。
参阅附图2a,790nm激光器1-1发出的泵浦光和1030nm激光器1-2发出的斯托克斯光经合束器2出来的单束光通过衍射光学元件(DOE)8时,不同波长的光在DOE中的衍射角不同,则两束激光射出DOE后都会出现不同角度的偏折,由于两束激光的波长相差较大,可能会出现两束激光的光斑 18完全分开的状况,即两光斑18重合区域的面积为零,此时不能满足相干拉曼成像的条件。
参阅附图2b,在衍射光学元件(DOE)8后面设置色散元件9,也会出现两束激光的光斑18重合区域19的面积变的很大。在实际应用中,DOE对泵浦光和斯托克斯光的偏折效果不够灵活,可能会出现两束光的光斑18完全分离或者重合区域19的面积过大,而影响相干拉曼成像。
参阅附图2c,在衍射光学元件(DOE)8后面设置合适参数的色散元件9,可以灵活调节泵浦光和斯托克斯光的光斑18重合区域19的面积。对两束光的重合部分进行微调,使其足够小,突破衍射极限以达到超分辨成像的目的。为满足实验要求,一般设衍射光学元件(DOE)8的折射率为n1,色散元件9的折射率为n2。
参阅附图3a,激光在通过DOE前的光强为高斯分布。
参阅附图3b,激光通过DOE后的光强为具有陡峭的边缘分布,使光强集中在光斑的重合部分,保证光强足够能激发出反斯托克斯光。
参阅附图4,本发明基于四波混频原理,不同于自发拉曼和其他拉曼散射效应,让斯托克斯光和泵浦光的频率差与所要激发的分子拉曼模式相匹配,进而激发反斯托克斯光,图中:Wp为泵浦光;Ws为斯托克斯光;Was为反斯托克斯光;ΩR为被激发分子的能级差。由公式:ωPS=ωASP可以看出,通过调节斯托克斯光和泵浦光的频率差,可以选择激发出不同的拉曼模式,具有很大的灵活性。
下面以相干拉曼散射成像的具体实施方式和操作过程对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
参阅附图5,采用1580nm掺铒激光器1-1和1030nm掺镱激光器光1-2 组成双激光器1的正向探测相干拉曼散射成像系统,所述1580nm掺铒激光器1-1经过一定的非线性作用产生790nm的脉冲激光作为泵浦光,1030nm 掺镱激光器光1-2发生的1030nm脉冲光作为斯托克斯光,两束光经合束器2 的合束后形成一束。由于激光具有一定的发散性,且该相干拉曼散射成像系统的光路较长,即使激光的发散角比较小,激光传输到物镜10入瞳时的光斑面积也有可能变大,本发明采用负透镜3-1与正透镜3-2组成的透镜组3 进行扩束和准直。所述负透镜3-1的焦距为5mm、正透镜3-2的焦距为10mm,透镜组3的扩束倍数为f2/f1=2倍,扩束后的光斑直径由原来的2mm变为大约为4mm,光斑面积小于振镜6的镜面,又恰好能够充满物镜10入瞳。由于不同波长的光经过透镜组3时会有不同的色散和折射系数,导致不同波长的光会有不同的焦点,采用消色差透镜4进行补偿,降低色散的泵浦光和斯托克斯光经反射镜5入射到振镜6的X镜面上,经X镜面的反射又入射到Y 镜面上,最后从振镜6射出。扫描时由于振镜6处于不断运动状态,所以从振镜6射出的光束也处于不断偏转的状态,那么光束可能会偏离物镜10的入瞳,此外,光束通过较长的光程后也可能会由于发散偏离物镜10入瞳。本发明采用扫描透镜/管透镜组7将光束重新聚焦到物镜10的后焦面上,设置在振镜6后的扫描透镜/管透镜组7,确保振镜6以较大的角度扫描光束仍然能够通过物镜10的入瞳。扫描平面表示从振镜6出射的平面,扫描平面位于扫描透镜7-1的前焦点处,扫描透镜7-1的后焦点和管透镜7-2的前焦点处于同一位置,即便振镜6的偏转角度比较大也能保证在管透镜7-2的后焦面形成固定的焦点。通过振镜6的不断扫描,1xN个光斑在生物样品上快速逐行扫描,振镜6的X镜面只需要偏转很小的角度就可以扫完一行,相比现有技术的单个光斑,真正实现了快速扫描的目的。与此同时,泵浦光和斯托克斯光更小的重合面积,能够在更小的生物分子上激发出反斯托克斯光,能够分辨出更小的生物分子,实现了超分辨成像的目的。
将扫描透镜/管透镜组7聚焦的泵浦光和斯托克斯光经衍射光学元件 (DOE)8和色散元件9的分束和整形,通过物镜10入射到载物台15上的生物样品,生物样品被激发的CARS信号经聚光器11进入滤波片12。所述滤波片12采用带通滤波片,其中心波长为650nm,带宽为40nm,滤掉其他光波信号后由PMT探测器13进行收集;所述PMT探测器13将采集的CARS 信号经计算机处理得到CARS图像,并由数据采集卡14进行记录和保存。
实施例2
参阅附图6,1030nm单激光器1、光子晶体光纤振荡器(PCF)2、第一滤波片3、负透镜4、正透镜5、消色差透镜6、振镜7、扫描透镜/管透镜组8、衍射光学元件(DOE)11、色散元件12、物镜13、二向色镜14、第二滤波片15和探测器16组成的背向探测相干拉曼成像系统,所述衍射光学元件(DOE)11与色散元件12组成的衍射光学器件组,使聚焦到物镜13上的光束经不同角度的偏折后入射在生物样品上,激发出更小生物分子的反斯托克斯光经二向色镜14、第二滤波片15后由探测器16进行收集,并由数据采集卡17记录和保存;所述衍射光学元件(DOE)11与不同参数的色散元件12组合,使泵浦光与斯托克斯光的两光斑重合面积足够小,实现超高分辨的相干拉曼散射成像。
所述1030nm单激光器1产生的1030nm的光通入光子晶体光纤(PCF) 2,在PCF中发生四波混频作用,产生的790nm泵浦光、1479nm闲频光与斯托克斯光经第一滤波片3后滤掉1479nm的闲频光后,泵浦光和斯托克斯光经负透镜4、正透镜5和消色差透镜6的扩束、准直后入射到振镜7的X 镜面上,经X镜面的反射又入射到Y镜面上,从振镜7射出的激光经扫描透镜/管透镜组8聚焦的泵浦光和斯托克斯光,通过第一反射镜9和第二反射镜10将聚焦的泵浦光和斯托克斯光进入衍射光学元件(DOE)11和色散元件12。
所述负透镜4的焦距为5mm、正透镜5的焦距为10mm,其扩束倍数为f2/f1=2倍,扩束后的光斑直径由原来的2mm变为大约为4mm,光斑面积小于振镜7的镜面,又恰好能够充满物镜13入瞳。由于不同波长的光经过正/负透镜组时会有不同的色散和折射系数,导致不同波长的光会有不同的焦点,且由消色差透镜6进行补偿,降低色散的泵浦光和斯托克斯光入射到振镜7的X镜面上,经X镜面的反射又入射到Y镜面上,最后从振镜7射出。扫描时由于振镜7处于不断运动状态,以致从振镜7射出的光束也处于不断偏转的状态,光束会偏离物镜13的入瞳,光束通过较长的光程后也会发散偏离物镜13入瞳。采用扫描透镜/管透镜组8将光束重新聚焦到物镜13的后焦面上,设置在振镜7后的扫描透镜/管透镜组8,确保振镜7以较大的角度扫描光束仍然能够通过物镜13的入瞳。从振镜7出射的扫描平面位于扫描透镜8-1的前焦点处,扫描透镜8-1的后焦点和管透镜8-2的前焦点处于同一位置,即便振镜7的偏转角度比较大也能保证在管透镜8-2的后焦面形成固定的焦点。将扫描透镜/管透镜组8聚焦的泵浦光和斯托克斯光经衍射光学元件(DOE)11和色散元件12的分束和整形,最终入射到载物台上的生物样品,被激发出的小生物分子CARS信号由二向色镜14进入第二滤波片15。所述第二滤波片15采用带通滤波片,其中心波长为650nm,带宽为40nm,滤掉其他光波信号后由探测器15进行采集;所述探测器15将收集的CARS 信号经计算机处理得到CARS图像,并由数据采集卡17进行记录和保存。通过振镜7的不断扫描,1xN个光斑在生物样品上快速逐行扫描,振镜7的 X镜面只需要偏转很小的角度就可以扫完一行,相比现有技术的单个光斑,真正实现了快速扫描的目的。与此同时,衍射光学元件(DOE)11与不同参数的色散元件12组合,使泵浦光与斯托克斯光的两光斑重合面积足够小,能够在更小的生物分子上激发出反斯托克斯光,能够分辨出更小的生物分子,实现了超分辨成像的目的。
所述泵浦光和斯托克斯光经衍射光学元件(DOE)11和色散元件12后,已经实现激光分束和理想的光斑重合面积;所述二向色镜14边界波长为 655nm,在光束和二向色镜14成45度角时,若波长大于668nm时,光的反射率达到98%,近乎全反,属于反射区;若波长小于642nm,光的透射率达到96%,属于透过区。泵浦光和斯托克斯光经过二向色镜14的反射,通过物镜13,最后照射倒样品上,激发出的640nm的反斯托克斯光可以透过二向色镜14,并经第二滤波片15的滤波后由探测器16进行采集,其信号发送给数据采集卡17进行保存,采集信号经过计算机处理得到CARS图像。
以上只是对本发明作进一步的说明,并非用以限制本专利,凡为本发明等效实施,均应包含于本专利的权利要求范围之内。

Claims (2)

1.一种超分辨快速扫描的相干拉曼散射成像方法,包括采用泵浦光和斯托克斯光经合束后通过扩束/准直后进入振镜,且经过扫描透镜/管透镜组将光聚焦到显微物镜的后焦面上并入射到生物样品上,激发的反斯托克斯光由探测器进行采集的CARS显微成像方法,其特征在于采用衍射光学元件(DOE)与色散元件组成的衍射光学器件组将聚焦到显微物镜上的单束光斑进行不同角度的偏折后变为多个1xN光斑入射在生物样品上,在更小的生物分子上被激发的反斯托克斯光经聚光、滤波后由探测器进行采集,实现超分辨快速扫描的相干拉曼散射成像。
2.根据权利要求1所述超分辨快速扫描的相干拉曼散射成像方法,其特征在于所述衍射光学元件与不同参数的色散元件组合,调节泵浦光与斯托克斯光重合区域的面积足够小,实现超高分辨的相干拉曼散射成像。
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