CN114527102A - 一种基于激光扫描的近红外二区显微成像系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物荧光成像技术领域，提供一种基于激光扫描的近红外二区显微成像系统及方法，其中方法包括：将不同波长的激光光束经过光束偏折及合束后得到合束光；对合束光进行整形得到整形光；对整形光进行相位调制以产生多焦点照明光场；对经过相位调制的整形光进行中继和二维扫描，使得多焦点照明光场在显微物镜的焦平面进行二维扫描，激发样品发出近红外二区波段的荧光信号，并用近红外相机探测该荧光信号及成像。该方案光路系统集成简易，且由于激发波长更长，可实现更深层的成像；对近红外二区染料选择更为灵活。

Description

一种基于激光扫描的近红外二区显微成像系统及方法

技术领域

本发明属于生物荧光成像技术领域，特别是关于一种基于激光扫描的近红外二区显微成像系统及方法。

背景技术

生物荧光成像技术作为生物医学领域必不可少的技术手段已经得到广泛应用，是观察生物组织形态、结构和生命现象的有力工具。目前普遍应用生物荧光成像技术是二十世纪80年代发展起来的激光扫描共聚焦显微镜，它的特点是采用针孔技术排除焦点以外的光信号对图像的干扰，从而大大提高了图像的清晰度和细节分辨能力，具有很高的轴向对比度。由于激光扫描共聚焦显微镜使用的激光范围在488nm～647nm之间，属于可见光范畴，而生物组织对可见光散射大，换言之，可见光在生物样品内的穿透深度浅，最深不超过几百微米，厚标本的信息很难采集；另外，由于生物组织对可见光吸收大，高密度的可见光激发生物样品时更容易引起光毒性和光漂白现象。

为了克服激光扫描共聚焦显微镜的这些缺陷，二十世纪90年代美国康奈尔大学Denk等人提出了双光子激发荧光显微技术。它采用具有高光子密度的近红外激光激发生物样品，由于生物组织对近红外光的吸收少，对生物组织的光毒性减少，并降低了光漂白；同时，生物组织对近红外光的散射比可见光小，容易穿透更深的生物样本，更适合观察厚样本。然而，尽管双光子激光荧光成像技术采用了近红外光源，能够实现对厚生物样本的观察，但是，因采用的荧光染料的发射波长仍然在可见光范围，其在生物组织中依然存在吸收和散射问题，因此难以观察更深层的组织。

综上所述，现有的生物荧光成像至少存在以下问题：近红外二区显微成像系统，系统光路复杂且成像深度和成像分辨率不理想；二维扫描振镜扫描过程中动作冗余，扫描效率低，影响系统时间分辨率；近红外二区显微成像系统波长单一，兼容性低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于激光扫描的近红外二区显微成像系统及方法，其能够解决现有技术中生物荧光成像的技术问题至少之一。

本发明提供了一种基于激光扫描的近红外二区显微成像系统，包括：

多波长激光器模块、光束整形模块、多焦点结构光产生模块、光束中继与扫描模块、成像与探测模块；

所述多波长激光器模块用于输出不同波长的激光光束，并经过光束偏折及合束后得到合束光；

所述光束整形模块用于对所述合束光进行整形得到整形光；

所述多焦点结构光产生模块用于对所述整形光进行相位调制，以最终在所述成像与探测模块中的显微物镜的焦平面产生多焦点照明光场，经过相位调制的所述整形光返回至光束整形模块，经过光束整形模块反射后再进入到所述光束中继与扫描模块；

所述光束中继与扫描模块用于对光束进行中继和二维扫描，使得所述多焦点照明光场在所述显微物镜的焦平面进行二维扫描；

所述成像与探测模块用于接收来自所述光束中继与扫描模块的入射光，激发样品发出近红外二区波段的荧光信号，并探测所述荧光信号并成像。

优选地，所述多波长激光器模块包括：

N个激光器组，N为整数，N≥2：

其中，第一激光器组包括第一激光器、第一带通滤光片、第一反射镜和第一二向色镜，所述第一激光器出射激光穿过所述第一带通滤光片后，被所述第一反射镜反射至所述第一二向色镜的透射面进行透射得到第一波长光束；

第二至第N-1激光器组的每组分别包括第n激光器、第n带通滤光片和第n二向色镜，所述第n激光器出射激光穿过所述第n带通滤光片后，入射至第n-1二向色镜的反射面进行反射得到第n波长光束，n为整数，1<n<N；所述第一波长光束与第二波长光束汇合并共同入射至所述第二二向色镜的反射面进行反射；依次类推，第N-2波长光束与第N-1波长光束汇合并共同入射至第N-1二向色镜的反射面进行反射；

第N激光器组包括第N激光器和第N带通滤光片，所述第N激光器出射激光经所述第N带通滤光片后入射至所述第N-1二向色镜的透射面进行透射，而后与所述第一波长光束、所述第二波长光束、……、第N-1波长光束汇合并共同入射至第N-1二向色镜的反射面进行反射的光束汇合得到所述合束光

优选地，所述光束整形模块包括：

激光扩束器，用于对所述合束光进行准直和扩束；

半波片，用于对扩束后的所述合束光的偏振方向进行调节；

宽带偏振分束器，用于对经过所述半波片的所述合束光分离出特定偏振方向的透射光；

非偏振分束器，用于改变来自所述多焦点结构光产生模块的光束的方向，以使该光束进入到所述光束中继与扫描模块。

优选地，所述多焦点结构光产生模块包括：空间光调制器，用于对所述整形光的空间相位分布进行调制以产生所述多焦点照明光场。

优选地，所述光束中继与扫描模块包括：

第一方向扫描单元，用于对所述光束在所述第一方向进行扫描；

第二方向扫描单元，用于对所述光束在所述第二方向进行扫描，所述第一方向和第二方向正交；

多个中继透镜，用于所述光束的导引和中继。

优选地，所述光束整形模块和所述第一方向扫描单元之间设置有至少两个中继透镜，所述第一方向扫描单元和所述第二方向扫描单元之间设置有至少两个中继透镜，所述第二方向扫描单元和所述成像与探测模块之间设置有至少两个中继透镜。

优选地，所述成像与探测模块还包括：空间滤波器；所述光束整形模块和所述第一方向扫描单元之间设置有两个中继透镜，所述空间滤波器设置在所述两个中继透镜之间，用于滤除零级衍射光。

优选地，所述光束中继与扫描模块采用多焦点阵列并行扫描的模式，在每个焦点阵列中按照“回”字形方式扫描直至完成该焦点阵列区域的扫描。

优选地，所述成像与探测模块包括：

激发及探测单元，包括所述显微物镜，用于聚焦来自所述光束中继与扫描模块的入射光束，以激发所述样品产生所述荧光信号并探测所述荧光信号；

成像单元，包括透镜组和近红外相机，所述荧光信号通过所述透镜组进行成像，所述近红外相机记录所述样品的荧光成像。

本发明还提供了一种基于激光扫描的近红外二区显微成像方法，包括以下步骤：

S1，将不同波长的激光光束经过光束偏折及合束后得到合束光；

S2，对所述合束光进行整形得到整形光；

S3，对所述整形光进行相位调制以最终在显微物镜的焦平面产生多焦点照明光场；

S4，对经过相位调制的所述整形光进行中继和二维扫描，使得所述多焦点照明光场在所述显微物镜的焦平面进行二维扫描；

S5，激发样品发出近红外二区波段的荧光信号，并探测所述荧光信号及成像。

根据本发明实施例的一种基于激光扫描的近红外二区显微成像系统及方法，由于激发波长更长，成像穿透度更深，从而可实现更深层的高分辨率成像效果；通过采用多波长激光器模块及其匹配光路，实现多波长输出，从而可兼容多种近红外二区的荧光染料，提升成像系统对荧光染料的兼容性和灵活性，可满足不同的成像场景需求；通过多焦点结构光产生模块产生多焦点照明光场，通过图像重构后可提升图像分辨率；同时，在光束的二维扫描过程中利用多焦点阵列并行扫描，各个焦点阵列分别按“回”字形扫描，使得扫描效率和速率大大提升，因此系统的时间分辨率显著提高；相对于现有的基于激光共聚焦成像技术，本发明实施例的显微成像系统更为集成灵活，操作及控制更为便捷。

附图说明

图1是本发明实施例的基于激光扫描的近红外二区显微成像系统的功能原理图；

图2是本发明实施例的基于激光扫描的近红外二区显微成像系统的光束中继与扫描模块中的多焦点阵列中单焦点的扫描路径示意图。

附图标记说明：

1-1550nm激光器，2-1300nm激光器，3-980nm激光器，4-第一带通滤光片，5-第二带通滤光片，6-第三带通滤光片，7-第一反射镜，8-第一二向色镜，9-第二二向色镜，10-激光扩束器，11-半波片，12-宽带偏振分束立方，13-非偏振分束立方，14-空间光调制器，15-第一中继透镜，16-空间滤波器，17-第二反射镜，18-第二中继透镜，19-X轴扫描单元，20-第三中继透镜，21-第四中继透镜，22-Y轴扫描单元，23-第五中继透镜，24-第六中继透镜，25-第三二向色镜，26-压电物镜定位器，27-显微物镜，28-三维高精度载物台，29-滤光片，30-套筒透镜，31-近红外相机。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

如图1所示，本发明实施例提供了一种基于激光扫描的近红外二区显微成像系统，包括：多波长激光器模块、光束整形模块、多焦点结构光产生模块、光束中继与扫描模块、成像与探测模块。

其中，多波长激光器模块用于输出不同波长的激光光束，并经过光束偏折及合束后得到合束光；光束整形模块用于对合束光进行整形得到整形光；多焦点结构光产生模块用于对整形光进行相位调制，以最终在成像与探测模块中的显微物镜的焦平面产生多焦点照明光场，经过相位调制的整形光返回至光束整形模块，经过光束整形模块反射后再进入到光束中继与扫描模块；光束中继与扫描模块用于对光束进行中继和二维扫描，使得多焦点照明光场在显微物镜的焦平面进行二维扫描，以实现多焦点照明光场对样品面各个位置的荧光激发；成像与探测模块用于接收来自光束中继与扫描模块的入射光，激发样品发出近红外二区波段的荧光信号，并探测荧光信号及成像。

下面将分模块进行详细描述：

(1)多波长激光器模块：用以输出多波长激光光束，进而激发荧光染料发出荧光。在本实施例中，以输出1550nm、1300nm、1550nm三种不同波长的激光器模块为例进行描述，光路走向具体为：

1550nm激光器1出射激光穿过第一带通滤光片4后，被第一反射镜7反射至第一二向色镜8的后表面(即透射面)进行透射得到第一波长光束。

1300nm激光器2出射激光穿过第二带通滤光片5后，入射至第一二向色镜8前表面(反射面)得到第二波长光束。

1550nm激光器1出射激光在第一二向色镜8的后表面发生透射后，与被第一二向色镜8反射的1300nm激光器2出射的光束汇合并共同入射至第二二向色镜9的后表面(反射面)并发生反射；即第一波长光束与第二波长光束汇合共同入射至第二二向色镜9后表面(反射面)发生反射。

980nm激光器3出射激光经第三带通滤光片6入射至第二二向色镜9的前表面(透射面)并发生透射，而后与被第二二向色镜9后表面(反射面)反射的1500nm激光及1300nm激光的光束汇合得到三种波长的合束光；之后，合束后的光束进入光束整形模块。

在该模块中，各主要部件的作用如下：

1550nm激光器1，1300nm激光器2，980nm激光器3：分别用于输出相应波长高功率单模激光；多波长输出，从而可兼容样品中多种近红外二区的荧光染料，提升系统的兼容性，可满足不同的成像场景需求。

第一带通滤光片4，第二带通滤光片5，第三带通滤光片6：均为窄带通滤光片，用以提高入射激光的单色性。

第一二向色镜8：为长通滤光片，用以光束偏折和光束合束。

第二二向色镜9：为短通滤光片，用以光束偏折和光束合束。

(2)光束整形模块：用于对多波长出射的合束光束进行整形，以确保最佳的相位调制效果。期间，光束的走向具体为：合束后的光束，通过激光扩束器10后均匀性和平行度得到改善，之后先后穿过半波片11、宽带偏振分束器12(在本实施例中为宽带偏振分束立方12)以及非偏振分束器13(在本实施例中为50：50非偏振分束立方13)，最后得到整形光，并入射至多焦点结构光产生模块。

该模块中，各主要部件的作用如下：

激光扩束器10：实现对入射激光的准直与扩束。半波片11：实现对入射激光偏振方向的调节。宽带偏振分束立方12：分离出偏振方向为水平方向的线偏振光(透射光)。50：50非偏振分束立方13：用于接收从多焦点结构光产生模块返回的光束并改变其方向，以使该光束进入到光束中继与扫描模块。

(3)多焦点结构光产生模块：通过对整形光进行相位调制，最终在显微物镜27的焦平面产生预设的多焦点照明光场，在本实施例中，多焦点结构光产生模块的核心部件为空间光调制器14。光束整形模块的整形光入射至空间光调制器14，通过将预先设计的相位图形文件加载于空间光调制器14中，使得整形光的空间相位分布受到调制并发生反射，反射光原路返回至50：50非偏振分束立方13，并被其反射之后进入光束中继与扫描模块。

该模块中，各主要部件及作用如下：

空间光调制器14：具体的可以为反射式相位型空间光调制器，用于实现对入射光的相位调制，产生多焦点照明光场，通过图像重构后可提升图像分辨率。

(4)光束中继与扫描模块：实现对光束进行中继及二维扫描，使得多焦点照明光场在显微物镜27的焦平面进行二维扫描。其中，光路的具体走向为：50：50非偏振分束立方13的反射光(即多焦点照明光场)通过第一中继透镜15、空间滤波器16后，被第二反射镜17反射后穿过第二中继透镜18，入射至X轴扫描单元19；X轴扫描单元19的反射光依次穿过第三中继透镜20及第四中继透镜21后，入射至Y轴扫描单元22；Y轴扫描单元22的反射光依次穿过第五中继透镜23及第六中继透镜24后，进入成像及探测模块。在本实施例中，X轴扫描单元19和Y轴扫描单元22分别为扫描振镜。可选的，X轴扫描单元19和Y轴扫描单元22还可以为声光偏转器。

该模块中，各主要部件及作用如下：

第一中继透镜15、第二中继透镜18、第三中继透镜20、第四中继透镜21、第五中继透镜23及第六中继透镜24：用于光束的导引和中继。由于常见光束中继用的是4f系统，单个4f系统需要有两个透镜；也可用多个4f系统组合，因此每组中继透镜个数为偶数个。

空间滤波器16：经过特殊设计及加工，滤除衍射光束中的零级，改善最终多焦点结构光照明光场的质量。

X轴扫描单元19：实现对入射光束在X方向的扫描。

Y轴扫描单元22：实现对入射光束在Y方向的扫描，X轴和Y轴相互正交。

需要进行特别说明的是，X轴扫描单元19和Y轴扫描单元22在扫描过程中采用多焦点阵列并行扫描的模式，即通过电压控制在每个焦点阵列中按照“回”字形方式迂回扫描直至完成该焦点阵列区域的扫描。具体地，多焦点阵列中单个焦点阵列的扫描如图2所示，其中箭头方向表示扫描过程中的路径；由于多焦点阵列作为一个整体并行扫描，因此点阵中每个单焦点阵列区域的扫描方式是一致的，并且各单焦点阵列区域是同时进行扫描的。在扫描过程中，第一扫描单元与第二扫描单元将进行连续有效的交替扫描，不存在冗余动作，扫描速率将极大提高，系统的时间分辨率大为提高。

(5)成像及探测模块：实现荧光信号的激发及探测；其中，光路的具体走向为：第六中继透镜24的出射光，入射至第三二向色镜25后被反射，反射光穿过压电物镜定位器26后，均匀地充满显微物镜27的入瞳，然后由入瞳进入显微物镜27并被其聚焦于样品面，进而激发标记于生物样品内部的荧光探针，同时生物样品被安置于三维高精度位移台28上；最后，生物样品中被激发出的荧光信号经显微物镜27、压电物镜定位器26原路返回并穿过第三二向色镜25，接着经滤光片29进一步滤除激发光，最后由透镜组30(在本实施例中为套筒透镜30)将荧光信号成像于近红外相机31的探测芯片上，并由近红外相机31记录样品的荧光图像。近红外相机作为由多个像元组成的面阵探测器，具备单点探测器所不具备的空间分辨能力，同时兼顾高灵敏度，高信噪比的特点，且其在近红外二区波段范围内有着较高的量子效率，可实现对荧光信号的高质量探测。

该模块中，各主要部件及作用如下：

第三二向色镜25：反射入射光，并将滤除一部分透射光中的激发光；

压电物镜定位器26：高精度地实现物镜在Z方向的扫描；

显微物镜27：用于聚焦入射光束，以激发样品中荧光信号；

三维高精度位移台28：实现样品在XYZ三个维度的精准移动；

滤光片29：进一步滤除荧光信号中的激发光，保证样品荧光图像效果；

套筒透镜30：用于成像；

近红外相机31：用于探测近红外二区(1000-1700nm)波段的荧光信号。

根据本发明实施例的一种基于激光扫描的近红外二区显微成像系统，由于激发波长更长，成像穿透度更深，从而可实现更深层的高分辨率成像效果；通过采用多波长激光器模块及其匹配光路，实现多波长输出，从而可兼容多种近红外二区的荧光染料，提升成像系统对荧光染料的兼容性和灵活性，可满足不同的成像场景需求；通过多焦点结构光产生模块产生多焦点照明光场，提升光能利用效率，通过图像重构后可提升图像分辨率；同时，在光束的二维扫描中利用多焦点阵列并行扫描，各个焦点阵列分别按“回”字形扫描，使得扫描效率和速率大大提升，系统的时间分辨率显著提高；相对于现有的基于激光共聚焦成像技术，本发明实施例的显微成像系统更为集成灵活，操作及控制更为便捷。

本发明实施例还提供了一种基于激光扫描的近红外二区显微成像方法，所述方法用于基于激光扫描的近红外二区显微成像系统上，包括以下步骤：

S1，将不同波长的激光光束经过光束偏折及合束后得到合束光；

S2，对合束光进行整形得到整形光；

S3，对整形光进行相位调制以产生多焦点照明光场；

S4，对经过相位调制的整形光进行中继和二维扫描，使得多焦点照明光场在显微物镜的焦平面进行二维扫描；

S5，激发样品发出近红外二区波段的荧光信号，并探测荧光信号及成像。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种基于激光扫描的近红外二区显微成像系统，其特征在于，包括：

多波长激光器模块、光束整形模块、多焦点结构光产生模块、光束中继与扫描模块、成像与探测模块；

所述多波长激光器模块用于输出不同波长的激光光束，经过光束偏折及合束后得到合束光；

所述光束整形模块用于对所述合束光进行整形得到整形光；

所述多焦点结构光产生模块用于对所述整形光进行相位调制，以最终在所述成像与探测模块中的显微物镜焦平面产生多焦点照明光场，经过相位调制的所述整形光返回至所述光束整形模块，经过所述光束整形模块反射后再进入到所述光束中继与扫描模块；

所述光束中继与扫描模块用于对光束进行中继和二维扫描，使得所述多焦点照明光场在所述显微物镜的焦平面进行二维扫描；

所述成像与探测模块用于接收来自所述光束中继与扫描模块的入射光，激发样品发出近红外二区波段的荧光信号，并探测所述荧光信号并成像。

2.根据权利要求1所述的基于激光扫描的近红外二区显微成像系统，其特征在于，所述多波长激光器模块包括N个激光器组，N为整数，N≥2：

其中，第一激光器组包括第一激光器、第一带通滤光片、第一反射镜和第一二向色镜，所述第一激光器出射激光穿过所述第一带通滤光片后，被所述第一反射镜反射至所述第一二向色镜的透射面进行透射得到第一波长光束；

第二至第N-1激光器组的每组分别包括第n激光器、第n带通滤光片和第n二向色镜，所述第n激光器出射激光穿过所述第n带通滤光片后，入射至第n-1二向色镜的反射面进行反射得到第n波长光束，n为整数，1<n<N；

所述第一波长光束与第二波长光束汇合并共同入射至所述第二二向色镜的反射面进行反射；依次类推，最终，所述第一波长光束、所述第二波长光束、……、第N-1波长光束汇合并共同入射至第N-1二向色镜的反射面进行反射；

第N激光器组包括第N激光器和第N带通滤光片，所述第N激光器出射激光经所述第N带通滤光片后入射至所述第N-1二向色镜的透射面进行透射，而后与所述第一波长光束、所述第二波长光束、……、所述第N-1波长光束汇合并共同入射至所述第N-1二向色镜的反射面进行反射的光束汇合得到所述合束光。

3.根据权利要求1所述的基于激光扫描的近红外二区显微成像系统，其特征在于，所述光束整形模块包括：

激光扩束器，用于对所述合束光进行准直和扩束；

半波片，用于对扩束后的所述合束光的偏振方向进行调节；

宽带偏振分束器，用于对经过所述半波片的所述合束光分离出特定偏振方向的透射光；

非偏振分束器，用于改变来自所述多焦点结构光产生模块的光束的方向，以使该光束进入到所述光束中继与扫描模块。

4.根据权利要求1所述的基于激光扫描的近红外二区显微成像系统，其特征在于，所述多焦点结构光产生模块包括空间光调制器，用于对所述整形光的空间相位分布进行调制以产生所述多焦点照明光场。

5.根据权利要求1所述的基于激光扫描的近红外二区显微成像系统，其特征在于，所述光束中继与扫描模块包括：

第一方向扫描单元，用于对所述光束在所述第一方向进行扫描；

第二方向扫描单元，用于对所述光束在所述第二方向进行扫描，所述第一方向和第二方向正交；

多个中继透镜，用于所述光束的导引和中继。

6.根据权利要求5所述的基于激光扫描的近红外二区显微成像系统，其特征在于，所述光束整形模块和所述第一方向扫描单元之间设置有至少两个中继透镜，所述第一方向扫描单元和所述第二方向扫描单元之间设置有至少两个中继透镜，所述第二方向扫描单元和所述成像与探测模块之间设置有至少两个中继透镜。

7.根据权利要求6所述的基于激光扫描的近红外二区显微成像系统，其特征在于，所述光束中继与扫描模块还包括：空间滤波器；

所述光束整形模块和所述第一方向扫描单元之间设置有两个中继透镜，所述空间滤波器设置在所述两个中继透镜之间，用于滤除零级衍射光。

8.根据权利要求5所述的基于激光扫描的近红外二区显微成像系统，其特征在于，所述光束中继与扫描模块采用多焦点阵列并行扫描的模式，在每个焦点阵列中按照“回”字形方式扫描直至完成该焦点阵列区域的扫描。

9.根据权利要求1所述的基于激光扫描的近红外二区显微成像系统，其特征在于，所述成像与探测模块包括：

激发及探测单元，包括所述显微物镜，用于聚焦来自所述光束中继与扫描模块的入射光束，以激发所述样品产生所述荧光信号并探测所述荧光信号；

成像单元，包括透镜组和近红外相机，所述荧光信号通过所述透镜组进行成像，所述近红外相机记录所述样品的荧光成像。

10.一种基于激光扫描的近红外二区显微成像方法，其特征在于，所述方法用于如权利要求1-9任一项所述的基于激光扫描的近红外二区显微成像系统上，包括以下步骤：

S1，将不同波长的激光光束经过光束偏折及合束后得到合束光；

S2，对所述合束光进行整形得到整形光；

S3，对所述整形光进行相位调制以最终在显微物镜的焦平面产生多焦点照明光场；

S4，对经过相位调制的所述整形光进行中继和二维扫描，使得所述多焦点照明光场在所述显微物镜的焦平面进行二维扫描；

S5，激发样品发出近红外二区波段的荧光信号，并探测所述荧光信号及成像。

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