JP7090930B2

JP7090930B2 - 超解像光学顕微イメージングシステム

Info

Publication number: JP7090930B2
Application number: JP2020148010A
Authority: JP
Inventors: 頼博; 王継光
Original assignee: BEIJING CENTURY SUNNY TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING CENTURY SUNNY TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2019-09-05
Filing date: 2020-09-03
Publication date: 2022-06-27
Anticipated expiration: 2040-09-03
Also published as: JP2021043442A; US20210072525A1; US11506879B2

Description

本発明は、バイオメディカルにおける顕微イメージング分野に関する。より具体的に、本発明は、超解像光学顕微イメージングシステムに関する。

現在、超解像光学顕微イメージング技術には、主に、誘導放出抑制顕微鏡法（ＳＴＥＤ）、光活性化局在性顕微鏡法（ＰＡＬＭ）／確率的光学再構築顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ）、及び構造化照明（ＳＩＭ）の３種類がある。

誘導放出抑制顕微鏡法の場合には、厳密に同軸の２つのレーザ光が必要であり、このうち一方が励起光、他方が損失光となる。そのため、システム構造が複雑化し、構築コストが高騰する。また、当該技術では解像度が損失光の光強度と関連し、光強度が強いほど解像度は高くなる。しかし、損失光の光強度が強すぎると生体試料に余分な光損傷が発生してしまい、このことが当該技術の適用性を制限している。

光活性化局在性顕微イメージング技術／確率的光学再構築顕微イメージング技術の場合には、スペクトル特性を利用して蛍光分子の時間別検出及び中心位置特定を行うことで、高密度蛍光標識サンプルの超解像イメージングを実現する。しかし、当該技術は、活性化－励起－位置特定－漂白過程を大量に繰り返し、膨大な回数のイメージングを行わなければ超解像画像を再構築することができない。そのため、当該技術の使用は極めて大きく制限される。

構造化照明顕微イメージング技術の場合には、縞模様を持つ照明光によってサンプル上にモアレ（Ｍｏｉｒｅｆｒｉｎｇｅｓ）を形成し、サンプル上の蛍光情報をイメージングシステムによりＣＣＤで受信したあと、フーリエ変換によって空間領域と周波数領域を変換することで、超解像画像を取得する。しかし、実際に応用する場合、当該技術は主にＣＣＤの制限を受けるため、視野の大きさと解像度の間でうまくバランスを取ることが難しい。

本発明の目的は、少なくとも上記の課題及び／又は欠点を解消し、少なくとも以下で説明する利点を提供することである。

本発明の更なる目的は、画像の解像度を顕著に向上させることで超解像画像を取得可能な超解像光学顕微イメージングシステムを提供することである。

本発明の上記の目的及びその他の利点を実現するために、環状平行光が通過する二色分光レンズと、二色分光レンズを通過した環状平行光を集束する集束レンズと、環状平行光が集束後に通過することで濾過される共焦点ピンホールと、前記共焦点ピンホールを通過した環状平行光を励起環状平行光にコリメートする可変焦点レンズ群であって、前記励起環状平行光は、走査レンズ及び顕微鏡を順に通過したあと、前記顕微鏡の対物レンズの焦点面に位置するサンプル上に、直径が前記対物レンズの回折限界よりも小さい単一の蛍光励起光スポットを形成する可変焦点レンズ群と、励起したサンプルから発せられた蛍光を受け付けて処理する検出器であって、励起したサンプルから発せられた蛍光が元の経路を戻り、前記顕微鏡、前記走査レンズ、前記可変焦点レンズ群、前記共焦点ピンホール及び前記集束レンズを順に通過したあと、前記二色分光レンズが、サンプルから発せられた蛍光を環状平行光路から分離して前記検出器に偏向させることでサンプルの超解像画像を取得する検出器、を含み、サンプルから発せられた蛍光が前記可変焦点レンズ群を通過したあとに集束して形成されるエアリーディスクは前記共焦点ピンホール以下となり、且つ、前記可変焦点レンズ群から出射される励起環状平行光の内径は、前記可変焦点レンズ群に入射される蛍光のビーム径よりも小さい超解像光学顕微イメージングシステムを提供する。

好ましくは、前記超解像光学顕微イメージングシステムは、更に、レーザ光を出射する光源と、前記光源から出射されたレーザ光が順に通過することでコリメートされた励起光となるコリメートレンズ及び励起フィルタと、励起光が通過することで環状平行光に整形されるビーム整形器、を含む。

好ましくは、前記超解像光学顕微イメージングシステムは、前記ビーム整形器が、順に配列されるビーム変形器、長焦点凸レンズ及び短焦点凸レンズを含む。前記ビーム変形器は励起光を環状平行光に変形し、前記長焦点凸レンズと前記短焦点凸レンズから構成される可変倍率レンズは、環状平行光の直径と厚さを所定の倍数に従って同時に縮小し、所望の環状平行光を取得する。

好ましくは、前記超解像光学顕微イメージングシステムは、前記ビーム変形器が、順に配列される平凹アキシコンレンズと平凸アキシコンレンズを含む。

好ましくは、前記超解像光学顕微イメージングシステムは、前記ビーム変形器が可変環状ダイアフラムである。

好ましくは、前記超解像光学顕微イメージングシステムは、更に、ＸＹ走査型ガルバノミラーを含む。当該ＸＹ走査型ガルバノミラーは、前記可変焦点レンズ群と前記走査レンズの間に設けられ、対物レンズの焦点面に位置するサンプルを点で順に走査する。

好ましくは、前記超解像光学顕微イメージングシステムは、更に、３次元平行移動テーブルを含む。３次元平行移動テーブルには前記サンプルが設置され、前記３次元平行移動テーブルの移動に伴って前記サンプルが移動することで、完全且つ均一にサンプルが走査される。

好ましくは、前記超解像光学顕微イメージングシステムは、前記長焦点凸レンズと前記短焦点凸レンズの焦点が重なる箇所にフィルタピンホールが設けられる。前記フィルタピンホールの直径は、環状平行光が長焦点凸レンズを通過して集束することで形成される主スポットの直径よりも大きく、且つ、環状平行光が前記長焦点凸レンズを通過して集束することで形成される第１サイドローブよりも小さい。

好ましくは、前記超解像光学顕微イメージングシステムは、前記検出器が光電検出器である。前記光電検出器は、励起したサンプルから発せられた蛍光を受け付けて電気信号に変換したあと、コンピュータに伝達することでサンプルの超解像画像を取得する。

好ましくは、前記超解像光学顕微イメージングシステムは、前記検出器がエリアアレイ検出器である。前記エリアアレイ検出器は、励起したサンプルから発せられた蛍光を受け付けてイメージングしたあと、コンピュータに伝達することでサンプルの超解像画像を取得する。前記エリアアレイ検出器の具体的なイメージング過程は次の通りである。

１）励起環状平行光がサンプルに対し相対的に移動する際の走査のステッピング距離は、前記励起環状平行光が前記サンプル上に形成する蛍光励起光スポットの半値幅のｎ分１と等しい。ｎは１よりも大きい偶数である。これにより、全部でｘ×ｙ個の点を走査する。

２）全部でｘ×ｙ枚の５×５又は７×７の画像を取得して、ｘ×ｙ画素の画像を再構築する。

３）再構築画像は、強度を正規化処理した複数のガウススポットを重ねて構成され、半値幅がｎ／２画素である。

４）励起環状平行光が位置（ａ，ｂ）に移動したとき、５×５又は７×７の画像の中心画素の強度が最大であり、且つ、各画素の強度が連続して分布している場合、前記再構築画像は中心位置が（ａ，ｂ）のガウススポットを有する。当該ガウススポットの強度は前記５×５又は７×７の画像の中心画素の強度と等しい。

５）前記再構築画像が、中心位置が（ｃ，ｄ）のガウススポットを有するとともに、その両側のｎ／２以下の画素を隔てた位置にもガウススポットを１つずつ有しており、且つ、当該ガウススポットの強度が、中心位置が（ｃ，ｄ）のガウススポットの強度以上である場合、前記再構築画像から中心が（ｃ，ｄ）に位置するガウススポットを除去する。

好ましくは、前記超解像光学顕微イメージングシステムは、更に、出射フィルタを含む。当該出射フィルタは前記二色分光レンズと前記検出器の間に設けられ、その他の周波数帯の迷光を濾過することで、サンプルから発せられた蛍光のみを通過させる。

好ましくは、前記超解像光学顕微イメージングシステムは、前記可変焦点レンズ群が、位置は可変であるが焦点距離は固定の第１レンズ及び第２レンズの２つから構成される。或いは、前記可変焦点レンズ群は、位置が可変の連続可変焦点レンズから構成される。

本発明は、少なくとも以下の有益な効果を有する。即ち、設置した集束レンズは二色分光レンズを通過した環状平行光を集束し、環状平行光は集束後に共焦点ピンホールを通過する。そして、前記共焦点ピンホールを通過した環状平行光は、可変焦点レンズ群を通過することで励起環状平行光にコリメートされる。これにより取得された励起環状平行光は、走査レンズと顕微鏡を順に通過したあと、前記顕微鏡の対物レンズの焦点面に位置するサンプル上に、直径が前記対物レンズの回折限界よりも小さい単一の蛍光励起光スポットを形成可能である。そのため、演算により再構築しなくても、解像度を少なくとも１．６倍向上させた超解像画像を取得可能である。また、共焦点ピンホールの直径は対物レンズの回折限界以上のため、本発明によれば最大限の光収集効率も維持される。

本発明のその他の利点、目標及び特徴のうち一部は以下の説明から明らかとなり、ほかの部分は当業者が本発明を研究及び実践することで理解される。

図１は、本発明の一実施例における超解像光学顕微イメージングシステムの構造を示す図である。図２は、本発明の他の実施例における超解像光学顕微イメージングシステムの構造を示す図である。図３は、本発明の他の実施例における超解像光学顕微イメージングシステムの構造を示す図である。図４は、本発明の他の実施例における超解像光学顕微イメージングシステムの可変焦点レンズ群の構造を示す図である。図５は、本発明の他の実施例における超解像光学顕微イメージングシステムの可変倍率レンズとフィルタピンホールの構造を示す図である。図６は、従来技術で取得した画像である。図７は、本発明の実施例で取得した画像である。

以下に、当業者が明細書の記載に基づき実施可能となるよう、図面を組み合わせて本発明につき更に詳細に説明する。

なお、本文中で使用する「有する」、「含有する」及び「含む」といった用語は、１又は複数のその他の部材又はそれらの組み合わせの存在又は追加を排除するものではない。

図１に示すように、本発明の一実施例で提供する超解像光学顕微イメージングシステムは、環状平行光が通過する二色分光レンズ８と、二色分光レンズ８を通過した環状平行光を集束する集束レンズ９と、環状平行光が集束後に通過することで濾過される共焦点ピンホール１０と、前記共焦点ピンホールを通過した環状平行光を励起環状平行光にコリメートする可変焦点レンズ群であって、前記励起環状平行光は、走査レンズ１５及び顕微鏡を順に通過したあと、前記顕微鏡の対物レンズ１９の焦点面に位置するサンプル２０上に、直径が前記対物レンズの回折限界よりも小さい単一の蛍光励起光スポットを形成し、前記顕微鏡がチューブレンズ１８と対物レンズ１９を含む可変焦点レンズ群と、励起したサンプルから発せられた蛍光を受け付けて処理する検出器１７であって、励起したサンプルから発せられた蛍光が元の経路を戻り、前記顕微鏡、前記走査レンズ１５、前記可変焦点レンズ群、前記共焦点ピンホール１０及び前記集束レンズ９を順に通過したあと、前記二色分光レンズ８が、サンプルから発せられた蛍光を環状平行光路から分離して前記検出器１７に偏向させることでサンプルの超解像画像を取得する検出器１７、を含む。サンプルから発せられた蛍光が前記可変焦点レンズ群を通過したあとに集束して形成されるエアリーディスクは、前記共焦点ピンホール以下となる。且つ、前記可変焦点レンズ群から出射される励起環状平行光の内径は、前記可変焦点レンズ群に入射される蛍光のビーム径よりも小さい。

設置した集束レンズは二色分光レンズを通過した環状平行光を集束し、環状平行光は集束後に共焦点ピンホールを通過する。そして、前記共焦点ピンホールを通過した環状平行光は、可変焦点レンズ群を通過することで励起環状平行光にコリメートされる。これにより取得された励起環状平行光は、走査レンズと顕微鏡を順に通過したあと、前記顕微鏡の対物レンズの焦点面に位置するサンプル上に、直径が前記対物レンズの回折限界よりも小さい単一の蛍光励起光スポットを形成可能である。そのため、演算により再構築しなくても、解像度を少なくとも１．６倍向上させた超解像画像を取得可能である。

具体的実施形態において、前記超解像光学顕微イメージングシステムは、図１に示すように、更に、レーザ光を出射する光源１と、前記光源から出射されたレーザ光が順に通過することでコリメートされた励起光となるコリメートレンズ２及び励起フィルタ３と、励起光が通過することで環状平行光に整形されるビーム整形器、を含む。

環状平行光を形成し、且つ所望のサイズの環状平行光を取得しやすいよう、図１に示すように、具体的実施形態において、前記超解像光学顕微イメージングシステムでは、前記ビーム整形器が、順に配列されるビーム変形器、長焦点凸レンズ６及び短焦点凸レンズ７を含む。前記ビーム変形器は、励起光を環状平行光に変形する。前記長焦点凸レンズ６と前記短焦点凸レンズ７から構成される可変倍率レンズは、環状平行光の直径と厚さを所定の倍数に従って同時に縮小し、所望の環状平行光を取得する。

具体的には、図１に示すように、具体的実施形態において、前記超解像光学顕微イメージングシステムでは、前記ビーム変形器が、順に配列される平凹アキシコンレンズ４と平凸アキシコンレンズ５を含む。

具体的には、図３に示すように、具体的実施形態において、前記超解像光学顕微イメージングシステムでは、前記ビーム変形器を可変環状ダイアフラム２３とすればよい。

サンプルを完全に走査しやすいよう、図１に示すように、具体的実施形態において、前記超解像光学顕微イメージングシステムはＸＹ走査型ガルバノミラー１３及び１４を更に含む。当該ＸＹ走査型ガルバノミラー１３及び１４は、前記可変焦点レンズ群と前記走査レンズ１５の間に設けられ、対物レンズの焦点面に位置するサンプルを点で順に走査する。

サンプルを完全に走査するために、他の具体的実施形態において、図２に示すように、前記超解像光学顕微イメージングシステムは３次元平行移動テーブル２１を更に含む。３次元平行移動テーブル２１には前記サンプル２０が設置され、前記３次元平行移動テーブルの移動に伴って前記サンプルが移動することで、完全且つ均一にサンプルが走査される。

図５に示すように、具体的実施形態において、前記超解像光学顕微イメージングシステムには、前記長焦点凸レンズ６と前記短焦点凸レンズ７の焦点が重なる箇所にフィルタピンホール２６が設けられている。前記フィルタピンホールの直径は、環状平行光が長焦点凸レンズを通過して集束することで形成される主スポットの直径よりも大きく、且つ、環状平行光が前記長焦点凸レンズを通過して集束することで形成される第１サイドローブよりも小さい。

受け付けた蛍光を素早く処理できるよう、具体的実施形態において、前記超解像光学顕微イメージングシステムでは、前記検出器１７を光電検出器とする。前記光電検出器は、励起したサンプルから発せられた蛍光を受け付けて電気信号に変換したあと、コンピュータに伝達することでサンプルの超解像画像を取得する。

他の具体的実施形態において、前記超解像光学顕微イメージングシステムでは、前記検出器１７をエリアアレイ検出器とする。前記エリアアレイ検出器は、励起したサンプルから発せられた蛍光を受け付けてイメージングしたあと、コンピュータに伝達することでサンプルの超解像画像を取得する。前記エリアアレイ検出器の具体的なイメージング過程は次の通りである。

３）再構築画像は、強度を正規化処理した複数のガウススポットを重ねて構成され、半値幅がｎ／２画素となる。

励起したサンプルから発せられた蛍光中の迷光を濾過するために、具体的実施形態において、図１に示すように、前記超解像光学顕微イメージングシステムは更に出射フィルタ１６を含む。当該出射フィルタ１６は前記二色分光レンズ８と前記検出器１７の間に設けられ、その他の周波数帯の迷光を濾過することで、サンプルから発せられた蛍光のみを通過させる。

図４に示すように、具体的実施形態において、前記超解像光学顕微イメージングシステムでは、前記可変焦点レンズ群が、位置は可変であるが焦点距離は固定の第１レンズ１１及び第２レンズ１２の２つから構成される。或いは、前記可変焦点レンズ群は、位置が可変の連続可変焦点レンズ２５から構成される。

上述したように、本発明の実施例における前記システムによれば、画像の解像度を顕著に向上することで解像度を１．６倍向上させて、超解像画像を取得することが可能である。ここで、図６及び図７を参照する。図６は従来技術で取得した画像であり、図７は本発明の実施例で取得した画像である。これらより、本発明の実施例で得られる画像は鮮明となることが明らかである。

本発明の実施方案は上記のように開示したが、本発明は明細書及び実施形態で列挙したような運用に限らない。本発明は、本発明に適した各種分野への適用が可能である。また、当業者であれば、その他の修正も容易に実現可能である。よって、請求項及び同等の範囲を逸脱することなく限定される一般概念を前提として、本発明は特定の詳細及びここで提示及び記載した図示に限らない。

Claims

励起光が通過することで環状平行光に整形されるビーム整形器であって、
前記ビーム整形器は、順に配列されるビーム変形器、長焦点凸レンズ及び短焦点凸レンズを含み、
前記ビーム変形器は励起光を環状平行光に変形し、
前記長焦点凸レンズと前記短焦点凸レンズから構成される可変倍率レンズは、環状平行光の直径と厚さを所定の倍数に従って同時に縮小し、所望の環状平行光を取得する、前記ビーム整形器と、
前記長焦点凸レンズと前記短焦点凸レンズの焦点が重なる箇所に設けられるフィルタピンホールであって、前記フィルタピンホールの直径は、環状平行光が長焦点凸レンズを通過して集束することで形成される主スポットの直径よりも大きく、且つ、環状平行光が前記長焦点凸レンズを通過して集束することで形成される第１サイドローブよりも小さい、前記フィルタピンホールと、
環状平行光が通過するダイクロイックビームスプリッターと、
前記ダイクロイックビームスプリッターを通過した環状平行光を集束する集束レンズと、
環状平行光が集束後に通過することで濾過される共焦点ピンホールであって、前記共焦点ピンホールの直径は対物レンズの回折限界以上である、前記共焦点ピンホールと、
前記共焦点ピンホールを通過した環状平行光を励起環状平行光にコリメートする可変焦点レンズ群であって、前記励起環状平行光は、走査レンズ及び顕微鏡を順に通過したあと、前記顕微鏡の対物レンズの焦点面に位置するサンプル上に、直径が前記対物レンズの回折限界よりも小さい単一の蛍光励起光スポットを形成する可変焦点レンズ群と、
励起したサンプルから発せられた蛍光を受け付けて処理する検出器であって、励起したサンプルから発せられた蛍光が元の経路を戻り、前記顕微鏡、前記走査レンズ、前記可変焦点レンズ群、前記共焦点ピンホール及び前記集束レンズを順に通過したあと、前記ダイクロイックビームスプリッターが、サンプルから発せられた蛍光を環状平行光路から分離して前記検出器に偏向させることでサンプルの超解像画像を取得する検出器、を含み、
サンプルから発せられた蛍光が前記可変焦点レンズ群を通過したあとに集束して形成されるエアリーディスクは前記共焦点ピンホール以下となり、且つ、前記可変焦点レンズ群から出射される励起環状平行光の内径は、前記可変焦点レンズ群に入射される蛍光のビーム径よりも小さいことを特徴とする超解像光学顕微イメージングシステム。
更に、
レーザ光を出射する光源と、
前記光源から出射されたレーザ光が順に通過することでコリメートされた励起光となるコリメートレンズ及び励起フィルタと、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の超解像光学顕微イメージングシステム。
前記ビーム変形器は、順に配列される平凹アキシコンレンズと平凸アキシコンレンズを含むことを特徴とする請求項１に記載の超解像光学顕微イメージングシステム。
前記ビーム変形器は、可変環状ダイアフラムであることを特徴とする請求項１に記載の超解像光学顕微イメージングシステム。
更に、ＸＹ走査型ガルバノミラーを含み、当該ＸＹ走査型ガルバノミラーは、前記可変焦点レンズ群と前記走査レンズの間に設けられ、対物レンズの焦点面に位置するサンプルを点で順に走査することを特徴とする請求項１に記載の超解像光学顕微イメージングシステム。
更に、３次元平行移動テーブルを含み、３次元平行移動テーブルには前記サンプルが設置され、前記３次元平行移動テーブルの移動に伴って前記サンプルが移動することで、完全且つ均一にサンプルが走査されることを特徴とする請求項１に記載の超解像光学顕微イメージングシステム。
前記検出器は光電検出器であり、前記光電検出器は、励起したサンプルから発せられた蛍光を受け付けて電気信号に変換したあと、コンピュータに伝達することでサンプルの超解像画像を取得することを特徴とする請求項１に記載の超解像光学顕微イメージングシステム。
更に、出射フィルタを含み、当該出射フィルタは前記ダイクロイックビームスプリッターと前記検出器の間に設けられ、その他の周波数帯の迷光を濾過することで、サンプルから発せられた蛍光のみを通過させることを特徴とする請求項１に記載の超解像光学顕微イメージングシステム。
前記可変焦点レンズ群は、位置は可変であるが焦点距離は固定の第１レンズ及び第２レンズの２つから構成されるか、或いは、前記可変焦点レンズ群は、位置が可変の連続可変焦点レンズから構成されることを特徴とする請求項１に記載の超解像光学顕微イメージングシステム。